JP2007274907A

JP2007274907A - ミトコンドリア機能活性化物質のスクリーニング方法

Info

Publication number: JP2007274907A
Application number: JP2006101728A
Authority: JP
Inventors: Kazuto Nakada; 和人中田; Junichi Hayashi; 純一林; Osamu Numata; 治沼田; Akitsugu Sato; 晃嗣佐藤
Original assignee: University of Tsukuba NUC
Current assignee: University of Tsukuba NUC
Priority date: 2006-04-03
Filing date: 2006-04-03
Publication date: 2007-10-25

Abstract

【課題】ミトコンドリア機能不全に関連する疾患や病態を改善し、その治療薬となりうるミトコンドリア機能活性化物質を大量かつ迅速にスクリーニングする手段を提供すること。
【解決手段】欠失型ミトコンドリアDNAを有するマウスから採取した精子に被験物質を接触させ、該精子の運動能を回復させた被験物質を選択することを特徴とする、ミトコンドリア機能活性化物質のスクリーニング方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ミトコンドリア機能不全による多様な疾患や病態を改善しうるミトコンドリア機能活性化物質をスクリーニングする方法に関する。

ミトコンドリアは主に酸化的リン酸化によってATPを合成する細胞小器官で、その内部には、独自のゲノムであるミトコンドリアDNA（mtDNA）を複数コピー保有している。近年、特定の欠失突然変異型mtDNAや点突然変異型mtDNAの蓄積がミトコンドリア病（ミトコンドリア脳筋症）と総称される病気の原因になることが明らかにされている。また、糖尿病、アルツハイマー病やパーキンソン病といった神経変性疾患の患者、さらには老化個体からも同様の突然変異型mtDNAの蓄積が報告され、mtDNAの突然変異とそれによる呼吸障害、そして多様な病態発症という一連の関係が注目を集めている。

本発明者らは、野生型mtDNAの塩基配列のうち、塩基番号7,759-12,454までの4696bpを欠失した変異型mtDNAを有するミトマウス（mito-mouse）をミトコンドリア病モデルマウスとして作製した（非特許文献１、特許文献１）。ミトマウスの特徴は、含有する欠失型mtDNA存在割合が80％を超えると全身性のミトコンドリア呼吸機能不全によるエネルギー欠乏状態となり、低体重、高乳酸血症、難聴、網膜異常、精子形成異常、心疾患、筋疾患、腎疾患などの多様な病態を発症する点にある（非特許文献１〜３）。

通常、核ゲノム変異に起因する疾患に対して効果的な薬剤をスクリーニングするためには、該変異を有するモデルマウスに候補物質を種々の濃度で投与するという方法が用いられている。核ゲノム変異モデルマウスは、対立遺伝子の一方が変異遺伝子であるため、これらを交配することにより、正常遺伝子をホモで有するマウス、変異遺伝子をヘテロで有するマウス、変異遺伝子をホモで有するマウスの３種のマウスを大量に得ることが可能であり、薬剤のスクリーニングを行うに十分な数の疾患モデルマウスを確保することが容易である。従って、多くの候補物質を種々の濃度で投与し、その効果を解析することができる。

これに対し、前記のミトマウス（mito-mouse）などのミトコンドリア変異マウスでは、変異型mtDNAの存在割合が個体ごと、さらには臓器ごとにも異なる。したがって、ミトコンドリアDNAの変異に関連する疾患を発症し、その治療薬のスクリーニングを行うに十分な数のモデルマウスを確保することが極めて困難である。従って、上記のようにミトコンドリア変異マウスは多様な病態を呈するものの、大規模かつハイスループットな治療薬のスクリーニングには適しない。

特開2001-197845号公報 K. Inoue, K. Nakada, A. Ogura, K. Isobe, Y.-i. Goto, I. Nonaka, J.-I. Hayashi, Generation of mice with mitochondrial dysfunction by introducing mouse mtDNA carrying a deletion into zygotes, Nature Genet. 26 (2000) 176-181. K. Nakada, K. Inoue, T. Ono, K. Isobe, A. Ogura, Y. Goto, I. Nonaka, J. Hayashi, Inter-mitochondrial complementation: Mitochondria-specific system preventing mice from expression of disease phenotypes by mutant mtDNA, Nature Med. 7 (2001) 934-940. K. Nakada, A. Sato, H. Sone, A. Kasahara, K. Ikeda, Y. Kagawa, H. Yonekawa, J. Hayashi, Accumulation of pathogenic ΔmtDNA induced deafness but not diabetic phenotypes in mito-mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 323 (2004) 175-184.

本発明の課題は、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患や病態を改善し、その治療薬となりうるミトコンドリア機能活性化物質を大量かつ迅速にスクリーニングする手段を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、欠失型mtDNAを有するミトマウス（mito-mouse）から単離した運動能が低下した精子に抗酸化剤であるカテキンを作用させると、濃度依存的にその運動能が回復されることを見出した。カテキン類は、テトラヒメナのミトコンドリア膜電位を濃度依存的に上昇させることが報告されていることから（つくば生物ジャーナル Tsukuba Journal of Biology (2005) 4:TJB200501200100773）、この精子の運動能の回復は、ミトコンドリア膜電位の上昇、すなわちミトコンドリア機能活性化を反映していえる。本発明はかかる知見により完成されたものである。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 欠失型ミトコンドリアDNAを有するマウスから採取した精子に被験物質を接触させ、該精子の運動能を回復させた被験物質を選択することを特徴とする、ミトコンドリア機能活性化物質のスクリーニング方法。
(2) ミトコンドリア機能活性化物質が、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患を治療するための医薬である、(1)に記載のスクリーニング方法。
(3) ミトコンドリア機能不全に関連する疾患が、ミトコンドリアDNAの変異に起因するものである、(2)に記載のスクリーニング方法。
(4) ミトコンドリア機能不全に関連する疾患が、精子形成能及び運動能異常による男性不妊症、低体重、運動障害、骨化異常、網膜異常、難聴、高乳酸血症、糖尿病、腎不全、ミトコンドリア病、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病である、(2)に記載の方法。
(5) 欠失型ミトコンドリアDNAを有するマウスから採取した精子を含む、ミトコンドリア機能活性化物質のスクリーニング用キット。
(6) (1)〜(4)に記載の方法により得られたミトコンドリア機能活性化物質。

本発明によれば、ミトコンドリア変異マウスの精子の運動能を指標として用いるミトコンドリア機能活性化物質のスクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法において指標となる精子は、多くの被験物質を種々の濃度で評価するのに必要な精子サンプル数を調製するのに十分な数を１匹のミトコンドリア変異マウスから採取できる。従って、本発明によれば、大量かつ迅速に候補となる被験物質をスクリーニングすることが可能となる。また、指標の変化は精子の運動能を顕微鏡で観察するだけで捉えることができるので、特別な装置や手順は必要なく、非常に簡便である。

本発明は、欠失型ミトコンドリアDNAを有するマウスから採取した精子に被験物質を接触させ、該精子の運動能を回復させた被験物質を選択することを特徴とする、ミトコンドリア機能活性化物質のスクリーニング方法である。

欠失型ミトコンドリアDNAを導入したマウスとしては、野生型mtDNAの塩基配列のうち、塩基番号7,759-12,454までの4696bpを欠失した変異型mtDNAを有するミトマウス（K. Inoue, et al., Nature Genet. 26 (2000) 176-181）を用いることができる。

精子の採取は、上記マウスの生後12〜25週齢において行うのがよい。マウスより精子を採取するには、摘出した精巣上体尾部を切り、精子をペレット状に湧出させて先端を丸めたキャピラリーでペレットをすくい取る。この時、機械的な刺激は極力与えないことが好ましい。

スクリーニングに用いる精子は上記マウスから採取後すぐのものが好ましいが、採取後、液体窒素等を用いて凍結保存した後、融解したものでもよい。

精子と被験物質との接触は、精子を含有する培養液に被験物質を添加し、一定時間培養することにより行う。培養液中の精子の含有量は、精子の運動能の変化を観察できる限り特に限定はされないが、例えば、1×10^４〜1×10^５個／ml、好ましくは1×10^５個／mlである。1×10^５個／mlより多いと精子濃度が濃すぎて運動精子数の計測が困難であり、また、1×10^４／mlより少ないと、精子と被験物質が作用しない場合があり、データがばらつくおそれがある。精子を含有する培養液の調製は、精子を培養液に添加し、攪拌混合することによって行うが、必要により、希釈や遠心分離を行ってもよい。

被験物質の培養液への添加量は、例えば、上記の精子数を含有する培養液に対し、0.1〜100μg／ml、好ましくは、1.0〜10μg／mlとする。被験物質の添加量は、その種類、精子の運動能の変化によって適宜変更すればよい。また、被験物質の添加量(濃度）としては、１種を設定してもよいが、例えば、希釈系列を作成するなどして複数を設定してもよい。

前記培養に使用する培養液（培地）は、生殖細胞の培養用に用いられるものであれば特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミンを添加したHTF、BO、KSOM、mWM、HECM培地などが挙げられる。前記培養の条件としては、例えば、36〜39℃、95〜98％空気、2〜5％二酸化炭素下、1〜10時間が挙げられる。

精子の運動能の観察は顕微鏡にて行い、その評価方法については特に制限されないが、上記の培養後に運動精子数をカウントし、被験物質を添加した場合の運動精子数と被験物質を添加しない場合の運動精子数とを比較する方法などで行えばよい。そして、被験物質を接触させた場合の運動精子数が、被験物質を接触させない場合の運動精子数と比較して増加させる被験物質を、ミトコンドリア機能活性化物質の候補物質として選択する。運動精子数のカウントは、例えばトーマ血球計算盤を用いて実体顕微鏡下で行う。

また、本発明のスクリーニング方法は、ミトコンドリア機能活性化物質の候補物質の一次スクリーニングとして用い、該スクリーニングにより選択された候補物質は至適濃度にて実際のモデルマウスに投与することでその効果を確認すればよい。

本発明のスクリーニング方法の対象となる被験物質の種類は特に限定されない。例えば、天然に生じる分子(例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸など)；脂質、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体(例えば、ペプチド擬態物など)；及び天然に生じない分子(例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作成した低分子有機化合物)；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。

本発明のスクリーニング方法によって選択されるミトコンドリア機能活性化物質は、ミトコンドリアDNA（mtDNA)が活性酸素種などで損傷を受け、その結果生じた突然変異型mtDNAの蓄積に起因するミトコンドリア機能低下を改善する作用を有する。従って、上記ミトコンドリア機能活性化物質は、ミトコンドリア機能不全に関連する様々な疾患の治療薬や食品（特に特定保健用食品）などの有効成分として利用できる。かかる治療薬は、上記ミトコンドリア機能活性化物質を単体で含んでもよく、あるいは薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、常法により医薬組成物としてもよい。例えば、経口用製剤を調製する場合は、必要に応じて結合剤、崩壊剤、潤滑剤、着色剤などを加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とする。非経口用製剤を調製する場合は、必要によりＰＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加し、常法により注射剤とする。

ミトコンドリア機能不全に関連する疾患は、ミトコンドリアDNA（mtDNA)の変異に起因する疾患であれば特に限定はされないが、例えば、精子形成能及び運動能異常による男性不妊症、低体重、運動障害、骨化異常、網膜異常、難聴、高乳酸血症、糖尿病、腎不全、ミトコンドリア病（ミトコンドリア脳筋症 (MELAS）、慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO)、リー脳症(Leigh脳症)、ミオクローヌスてんかん(MERRF)、ピアソン病（Person病）など）、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病などが挙げられる。

本発明によるスクリーニング方法において指標となる精子は、精子の生存・保存に必要な試薬などを予め組み合わせてキット化することもできる。例えば、キットには、前記の精子、該精子の培養のための培地や容器を少なくとも含んでいればよい。また、該キットには、運動精子数を計測するための器具、陽性や陰性の標準試料、キットの使用方法を記載した指示書等を含めることもできる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
（参考例１）欠失型mtDNAを有するミトマウスの作製
マウス培養細胞から核を除いて得られた細胞質体を、mtDNAを全く持たないマウス培養細胞（ρ0細胞)に電気融合し、マウス体細胞のmtDNAを導入したサイブリット（細胞質雑種）を得た。このサイブリットから、突然変異型mtDNAを持つサイブリットのスクリーニングを繰り返した結果、tRNA^LysからND5（7,759〜12,545）までの4,696 bp を欠失したmtDNA (ΔmtDNA4696)（図１ａ）を30％保有するサイブリット（Cy4696）を単離した(K. Inoue, et al., Nature Genet. 26 (2000) 176-181参照）。Cy4696中におけるΔmtDNA4696の保有量は培養中に増加して安定となった。次に、ΔmtDNA4696を高い割合で（80％程度）含有するCy4696を脱核し、約10個の細胞質体をドナーとして、過排卵処理と交配操作を施したC57BL/6J雌の卵管より回収した前核期胚の囲卵腔にピエゾを用いてインジェクションし、電気融合によってミトコンドリアごとΔmtDNA4696をマウス胚に導入した。この操作胚を24〜28時間培養し、2〜4細胞期の胚を偽妊娠ICRマウスの卵管に移植した。出生予定日に帝王切開により胎児（F0マウス）を摘出し、里親マウスに保育させた。さらに、雌のF0マウスと雄のC57BL/6Jを交配させ、産仔（F1以降）を得、これをミトマウスとした（図１ｂ）。

（実施例１）
参考例１で作製した、野生型mtDNAの塩基配列のうち、塩基番号7,759-12,454までの4696bpを欠失した変異型mtDNAを有するミトマウス（欠失型mtDNAを70％程度含有する個体）の精巣上体を摘出した。

精巣上体尾部に切り目を入れ、精子ドロップを下記表1に示す組成を有するHTF(Human Tubal Fluid)培養液に入れ、37℃にて15分間静置した。運動している精子数を数え、2×10⁵個の運動精子を含むように同培養液を加え、これを精子サンプルとした。

[表１]
HTF 培養液組成
塩化ナトリウム 593.8 mg
塩化カリウム 35 mg
硫化マグネシュウム 4.9 mg
リン酸二水素カリウム 5.4 mg
塩化カルシウム 57 mg
炭酸水素ナトリウム 210 mg
グルコース 50 mg
乳酸ナトリウム 0.34 mg
ピルビン酸ナトリウム 3.7 mg
ペニシリン 7.5 mg
ストレプトマイシン 5 mg
牛血清アルブミン 400 mg
蒸留水(D.D.W) 100mL

シャーレにオイルをはり、その中に精子サンプルを500μlづつ分注した。これに、エピガロカテキン−3−ガレート（EGCG）を0μg/ml, 0.1μg/ml, 1.0μg/ml, 10.0μg/mlの濃度で添加し、運動精子数をEGCG添加45分後、1.5時間後に計測した。結果を図２に示す。EGCG無添加（0μg/ml）では運動精子数はほとんど変化しないが、EGCGを添加した精子サンプルでは、運動精子数が増加した。また、運動能の回復は0.1μg/mlと1.0μg/mlで顕著であり、10.0μg/mlでは回復は見られるものの、前二者よりはその効果が低いことわかった。従って、EGCGによる精子運動能の回復効果は、0.1μg/ml〜1.0μg/mlの濃度が有効であると判断された。

本発明の方法によれば、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患や病態を改善しうるミトコンドリア機能活性化物質を大量かつ迅速に、しかも簡便にスクリーニングすることができる。従って、本発明の方法は、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患の治療用の医薬や食品の開発に有用である。

図１ａは、野生型mtDNAの塩基配列のうち、塩基番号7,759-12,454までの4696bpを欠失した変異型mtDNA(ΔmtDNA4696)の構造を示す。図１ｂは、欠失型mtDNAを有するミトマウスの作製手順を示す。 EGCG添加による運動精子数の経時変化を示す。

Claims

欠失型ミトコンドリアDNAを有するマウスから採取した精子に被験物質を接触させ、該精子の運動能を回復させた被験物質を選択することを特徴とする、ミトコンドリア機能活性化物質のスクリーニング方法。
ミトコンドリア機能活性化物質が、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患を治療するための医薬である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
ミトコンドリア機能不全に関連する疾患が、ミトコンドリアDNAの変異に起因するものである、請求項２に記載のスクリーニング方法。
ミトコンドリア機能不全に関連する疾患が、精子形成能及び運動能異常による男性不妊症、低体重、運動障害、骨化異常、網膜異常、難聴、糖尿病、高乳酸血症、腎不全、ミトコンドリア病、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病である、請求項２に記載の方法。
欠失型ミトコンドリアDNAを有するマウスから採取した精子を含む、ミトコンドリア機能活性化物質のスクリーニング用キット。
請求項１〜４に記載の方法により得られたミトコンドリア機能活性化物質。