CN116559419A - 一种评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，包括如下步骤：将同期的线虫进行分组培养：样品组的培养物中含有化妆品及其原料的待测样品；对照组的培养物中不含待测样品，其他培养条件与样品组一致；对培养后的线虫进行荧光检测，计算得到待测样品对于线虫荧光强度的抑制率，抑制率越大说明待测样品的抗羰基化功效越强。本发明基于线虫模型建立的方法的优势有：实验周期短、能高通量筛选原料；实验耗材成本低；线虫属于低等真核生物，不存在伦理学冲突等。能够实现对样品进行定量分析，数据可视化，能更好直观的展示化妆品/原料的抗羰基化效果。

Description

一种评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法
技术领域
本发明属于化妆品与生物技术领域，涉及一种评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法。
背景技术
蛋白质羰基化被视为氧化应激和衰老的生物标志物，是蛋白质非酶促不可逆的羰基修饰。蛋白质可与不同来源的活性羰基类物质反应，生成蛋白质羰基加合物，也能自身氧化生成蛋白质羰基衍生物。随机体对羰基化蛋白质的降解能力的减弱和羰基化蛋白质的生成速率的加快，导致蛋白质和细胞功能的降低和丧失，加速老年色素的累积，启动或促进老年退行性疾病的生理病理过程，最终加快衰老的进程。诸多研究表明，羰-氨交联启动的蛋白质的交联聚合是老年色素形成的核心生化机制。
目前关于蛋白质氧化损伤羰基化的检测主要有如下几种：蛋白技术相关的科研人员一般先从大小鼠、线虫等动物组织样本提取蛋白，然后通过2，4-二硝基苯肼法测定羰基化蛋白，涉及蛋白提取步骤，操作复杂，而且动物实验个体差异较大，导致测得结果不稳定，误差较大，尤其是线虫本身蛋白含量较低，因此对其羰基化检测比较困难。化妆品领域一般使用细胞实验(检测角质细胞中蛋白酶体的活性)或建立皮肤模型(丙烯醛诱导皮肤模型DNPH染色检测组织羰基化反应)，然而这两种方法成本高且技术门槛高。
因此，如何开发一种简单、高效的蛋白质氧化损伤羰基化的检测方法，并将其用于评价化妆品及其原料中，将为抗羰基化活性原料在产品开发应用方面提供启示和理论参考。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，所述方法包括如下步骤：
将同期的线虫进行分组培养：样品组的培养物中含有化妆品及其原料的待测样品；对照组的培养物中不含待测样品，其他培养条件与样品组一致；对培养后的线虫进行荧光检测，计算得到待测样品对于线虫体内蛋白羰基化的抑制率，抑制率越大说明待测样品的抗羰基化功效越强。
优选地，所述线虫包括秀丽线虫。
优选地，所述线虫包括野生型N2线虫、fzo-1线虫或mev-1线虫中的任意一种。
优选地，所述同期的线虫包括L4期线虫幼虫。
优选地，所述培养的时间为5～10天。
优选地，所述培养物中包括大肠杆菌菌液。
优选地，所述样品组的培养物中，待测样品与大肠杆菌菌液的质量比为(2～10):(90～98)。
所述(2～10)中的具体数值例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等。
所述(90～98)中的具体数值例如90、91、92、93、94、95、96、97、98等。
优选地，所述大肠杆菌菌液由包括如下步骤的方法培养得到：
将大肠杆菌接种于LB液体培养基中，于37℃下培养至OD600为0.4～0.6，即得所述大肠杆菌菌液。
优选地，所述荧光检测的方式包括：利用荧光显微镜在滤光片下拍摄荧光图像，对样品组与对照组的荧光图像中线虫的荧光强度进行相对定量分析。
优选地，所述相对定量分析包括：使用ImageJ软件对图像中线虫肠脂褐质的相对荧光强度进行定量分析。
与常规的对整张图像的荧光进行相对定量的方法不同，本发明使用ImageJ软件对于图像中线虫进行描边，在对此区域进行相对定量分析，这样可以很好的消除背景干扰，定量准确性更好。
优选地，所述滤光片包括DAPI滤光片、FITC滤光片或TEXAS RED滤光片中的任意一种。
优选地，所述DAPI滤光片的激发波长为330～385nm。
优选地，所述FITC滤光片的激发波长为460～490nm。
优选地，所述TEXAS RED滤光片的激发波长为510～550nm。
优选地，所述抑制率的计算方法为：抑制率＝(对照组线虫的荧光强度-样品组线虫的荧光强度)/对照组线虫的荧光强度。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
秀丽隐杆线虫是第一个被完整测序的多细胞真核生物，也是目前唯一所有体细胞发育谱系均被研究清楚的多细胞模式生物。在其近2万个蛋白编码基因中，有60～80％与人类基因同源，细胞凋亡、RNAi和microRNA等生命现象和机制都是首先在线虫中被阐明的。线虫是研究细胞发育、神经系统、衰老与寿命的重要模式生物。肠脂褐素又被称为“老年色素”，是线虫衰老的标志物，在线虫肠道中积累并且能够自发荧光。肠脂褐素已被证明可抑制蛋白酶体并促进细胞内活性氧的形成，在线虫肠道中合成的羰基化蛋白是线虫肠脂褐质的主要成分。随着虫龄增长，肠脂褐质在线虫肠道中积累，线虫荧光强度越大，则表明积累的肠脂褐质越多，则体内羰基化蛋白含量越多。
本发明基于秀丽线虫提出一种评价化妆品抗羰基化活性的方法建立，利用不同化妆品/原料对线虫进行处理，使用荧光显微镜在DAPI通道下拍摄线虫荧光图像，通过ImageJ2测定线虫荧光强度，从而定量线虫衰老程度和蛋白羰基化程度，反映受试样品的抗羰基化活性。本发明期望能为抗羰基化活性原料在产品开发应用方面提供启示和理论参考。
相比于体外实验、细胞实验等，本发明的实验方法基于秀丽线虫模型的优势有：实验周期短、能高通量筛选原料；实验耗材成本低、秀丽线虫可以在短时间内大量生产；秀丽线虫属于低等真核生物，对动物侵害少，不存在伦理学冲突等。
具体的，目前关于蛋白质氧化损伤羰基化的检测主要有如下几种：蛋白技术相关的科研人员一般先从大小鼠、线虫等动物组织样本提取蛋白，然后通过2，4-二硝基苯肼法测定羰基化蛋白，涉及蛋白提取步骤，操作复杂，而且动物实验个体差异较大，导致测得结果不稳定，误差较大，尤其是线虫本身蛋白含量较低，因此对其羰基化检测比较困难。化妆品领域一般使用细胞实验(检测角质细胞中蛋白酶体的活性)或建立皮肤模型(丙烯醛诱导皮肤模型DNPH染色检测组织羰基化反应)，然而这两种方法成本高且技术门槛高。
而本发明的方法能够实现对样品进行定量分析，误差更小，检测的精密度及准确性更好。由于线虫肠脂褐质是线虫的特色标志物，其主要由羰基化蛋白组成，数据可视化更好直观的展示化妆品/原料的抗羰基化效果。将此测试方法应用到化妆品及活性原料的抗羰基化评价中，期望能为抗羰基化原料在产品开发应用方面提供启示和理论参考。
附图说明
图1是对照组与肌肽组在不同荧光通道下5天龄N2线虫肠脂褐质荧光图像以及明场图像。
图2是对照组与肌肽组在不同荧光通道下5天龄N2线虫肠脂褐质的荧光强度对比结果图(反映了不同荧光通道下肌肽对5天龄N2线虫荧光强度的影响)；A为红色荧光对比结果，B为绿色荧光对比结果，C为蓝色荧光对比结果。
图3是对照组与肌肽组在不同荧光通道下10天龄N2线虫肠脂褐质荧光图像以及明场图像。
图4是对照组与肌肽组在不同荧光通道下10天龄N2线虫肠脂褐质的荧光强度对比结果图；A为红色荧光对比结果，B为绿色荧光对比结果，C为蓝色荧光对比结果。
图5是对照组与肌肽组在不同荧光通道下10天龄fzo-1线虫肠脂褐质荧光图像以及明场图像。
图6是对照组与肌肽组在不同荧光通道下10天龄fzo-1线虫肠脂褐质的荧光强度对比结果图；A为红色荧光对比结果，B为绿色荧光对比结果，C为蓝色荧光对比结果。
图7是对照组与肌肽组在不同荧光通道下10天龄mev-1线虫肠脂褐质荧光图像以及明场图像。
图8是对照组与肌肽组在不同荧光通道下10天龄mev-1线虫肠脂褐质的荧光强度对比结果图；A为红色荧光对比结果，B为绿色荧光对比结果，C为蓝色荧光对比结果。
图9是示例性的线虫明场及荧光图像，箭头所指为死亡状态下的线虫，其他线虫为存活状态。
图10是对照组与木棉花组在蓝色荧光通道下10天龄mev-1线虫肠脂褐质荧光图像。
图11是对照组与木棉花组在蓝色荧光通道下10天龄mev-1线虫肠脂褐质的荧光强度对比结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，若无特殊说明，所有的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1-试剂与实验操作
1、基础试剂配置
①1mol/L磷酸钾缓冲液
KH2PO4 108.39g
K2HPO4 35.69g
加水至1L，调pH值至6.0。
②M9缓冲液
加水至1L，121℃灭菌15分钟，宜现用现配。
③LB液体培养基
LB肉汤20g/L
蒸馏水配制，用1mol/L氢氧化钠溶液调至pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
④线虫生长固体培养基(Nematode Growth Medium，NGM)，按1L计
摇匀后，121℃灭菌30分钟，80℃恒温15分钟，然后加入下列溶液(胆固醇过滤除菌，其余高温灭菌)。
⑤裂解液
用4mL蒸馏水溶解0.1g NaOH后和1.4mL NaClO混合均匀(现配现用)。
2、线虫基本操作方法
(1)大肠杆菌OP50的培养
取OP50的菌种于LB平板划线，挑取单菌落于在10mL LB液体培养基中，37℃、200rpm，振荡培养12h，至OD600等于0.4～0.6，用于接种NGM喂养正常组线虫。
(2)E.coli OP50的涂布
在每个NGM平板上加适量的菌液(一般直径60mm平板加150μL)，用无菌的涂布器或玻璃试管底部将菌液均匀地涂布在NGM平板上，注意菌液边缘应距离平板边缘0.5cm左右。涂布好细菌的NGM平板在室温(21～25℃)下过夜后即可使用，如果不是立即使用则应将其置于冷室或4℃冰箱中待用。
(3)3％琼脂糖垫载玻片制备
称取0.6g琼脂糖加热溶于20mL PBS缓冲液，趁热滴加一滴至载玻片上，迅速用另一片载玻片轻轻压平，静置30s后取下上层载玻片即可使用。
3、实验准备
繁殖期(3d～5d龄)野生型秀丽线虫用于同期化。
受试物包含化妆品原料及产品。配制受试物测试溶液时，首选溶剂是M9缓冲液或无菌水，如需用到有机溶剂助溶，可选用二甲基亚砜(DMSO)，溶剂于测试溶液中的浓度要≤2％。：
含样品NGM的配制如下：
——水溶性样品：
样品组：将样品溶解在M9缓冲液或无菌水中配制成一定浓度的母液，取E.coliOP50菌液和样品按(90～98):(10～2)比例混合均匀。
对照组：取E.coli OP50菌液轻缓的打在NGM平板上中央，避光晾干后封膜，4℃保存备用。
——非水溶性样品：
样品组：将样品溶解在DMSO溶液中配制成一定浓度的母液，例如；取E.coli OP50菌液和样品按98:2比例混合均匀，其他配比方式均可。
对照组：取E.coli OP50菌液和DMSO按98:2比例混合均匀进行涂布。
4、实验方法
(1)线虫同期化
用1mL M9缓冲溶液将NGM平板上的年轻成虫反复冲洗两次再转移至无菌2mL离心管中，加入1mL现配的裂解液，充分振荡3min～5min后，在3000rpm转速下离心1min，弃上清。再用1mL M9缓冲液冲洗线虫及以同样条件离心2次，弃上清，余下0.3mL～0.4mL的含虫卵缓冲液。然后用移液枪轻轻吹打混匀虫卵，吸取100μL左右含虫卵的缓冲液滴于NGM平板上靠近OP50的无菌区域。待线虫受精卵基本发育成L4期幼虫，完成同期化。挑取L4期幼虫转移至药物板开展实验。
(2)秀丽线虫肠脂褐质测定
将L4期幼虫转移至含/不含药物的NGM上开始干预，每隔一天需将线虫挑至新鲜含/不含药物板上培养(此操作为避免子代影响及食物不足)。用M9缓冲液清洗经5天龄和10天龄的线虫，吸取少量6mmol/L左旋咪唑滴在3％琼脂糖垫载玻片上，将线虫挑至液滴上，盖上盖玻片。使用荧光显微镜分别在DAPI滤光片(ex：330～385nm)、FITC滤光片(ex：460～490nm)和TEXAS RED滤光片(ex：510～550nm)下拍摄荧光图像以及明场图像(一个视野下可拍摄多条线虫，50×或100×放大倍数)，并使用ImageJ2软件对图像中线虫肠脂褐质的相对荧光强度进行定量分析。实验设置3个平行板，每个培养皿随机挑选至少20条线虫进行拍摄。
实施例2-蛋白质氧化损伤羰基化的检测方法的建立
以肌肽作为样品，来建立蛋白质氧化损伤羰基化的检测方法
实验样品：
肌肽组：用蒸馏水配置1mg/mL母液，取E.coli OP50菌液和肌肽母液按95:5比例混合均匀，用移液枪吸取150μL混合液轻缓地打在每个NGM平板上中央。NGM平板避光晾干后封膜，4℃保存备用。
对照组：取150μL E.coli OP50菌液轻缓的打在NGM平板上中央，避光晾干后封膜，4℃保存备用。
参照实施例1的方法对肌肽组与对照组同步进行线虫同期化与秀丽线虫肠脂褐质测定操作。
不同线虫的实验结果如下：
(1)5天龄野生型N2线虫实验数据
不同荧光通道下5天龄N2线虫肠脂褐质荧光图像以及明场图像见图1。
用ImageJ2对两组荧光强度进行定量分析，结果见图2(A为红色荧光对比结果，B为绿色荧光对比结果，C为蓝色荧光对比结果)，并将数据汇总于表1，抑制率＝(对照组荧光强度-肌肽组荧光强度)/对照组荧光强度×100％。
表1不同荧光通道下肌肽对5天龄N2线虫荧光强度的影响
对照(n＝68) 肌肽(n＝70) 抑制率
红色荧光 2.88±1.77 2.53±1.19 12.15％
绿色荧光 2.69±0.79 2.46±0.78 8.62％
蓝色荧光 4.72±1.63 3.60±1.80 23.80％
从数据来看，0.05mg/mL肌肽对5天龄线虫红色和绿色自发荧光强度抑制效果不显著(p＞0.05)，但能显著降低蓝色自发荧光强度(p＜0.001)，抑制率达23.80％。
(2)10天龄线虫实验数据
(2.1)野生型N2线虫
不同荧光通道下线虫肠脂褐质荧光图像以及明场图像见图3。
用ImageJ2对两组荧光强度进行定量分析，结果见图4(A为红色荧光对比结果，B为绿色荧光对比结果，C为蓝色荧光对比结果)，并将数据汇总于表2。
表2不同荧光通道下肌肽对10天龄N2线虫荧光强度的影响
对照(n＝71) 肌肽(n＝67) 抑制率
红色荧光 5.29±1.20 4.18±0.94 20.97％
绿色荧光 3.86±1.13 2.57±0.77 33.39％
蓝色荧光 10.44±2.24 6.30±2.28 39.62％
(2.2)fzo-1(tm1133)线虫
不同荧光通道下线虫肠脂褐质荧光图像以及明场图像见图5。
用ImageJ2对两组荧光强度进行定量分析，结果见图6(A为红色荧光对比结果，B为绿色荧光对比结果，C为蓝色荧光对比结果)，并将数据汇总于表3。
表3不同荧光通道下肌肽对10天龄fzo-1线虫荧光强度的影响
对照(n＝70) 肌肽(n＝72) 抑制率
红色荧光 5.48±1.56 3.83±0.80 30.01％
绿色荧光 4.73±1.52 2.89±0.80 38.95％
蓝色荧光 11.09±2.35 6.53±1.80 41.15％
(2.3)mev-1(kn1)线虫
不同荧光通道下线虫肠脂褐质荧光图像以及明场图像见图7。
用ImageJ2对两组荧光强度进行定量分析，结果见图8(A为红色荧光对比结果，B为绿色荧光对比结果，C为蓝色荧光对比结果)，并将数据汇总于表3。
表4不同荧光通道下肌肽对10天龄mev-1线虫荧光强度的影响
对照(n＝75) 肌肽(n＝72) 抑制率
红色荧光 5.65±2.72 3.46±1.24 38.76％
绿色荧光 3.66±2.25 1.87±0.52 48.91％
蓝色荧光 12.69±4.82 6.11±1.88 51.89％
从数据来看，肌肽能显著抑制10天龄mev-1线虫肠脂褐质的积累，抑制率达38～51％，具有很强的抗羰基化活性，高于其他线虫。从5天龄和10天龄线虫荧光强度图中，可以看到线虫蓝色荧光强度均大于红色荧光和绿色荧光，且蓝色荧光能更好显示组间差异。
此外，在实验过程中发现，一方面，线虫荧光值越大，背景干扰越少，另一方面，线虫肠脂褐质荧光分布在肠道，而当线虫死亡时，通体会产生弥漫性蓝色荧光，俗称“死亡荧光”，示例性图像如图9所示，箭头所指为死亡状态下的线虫，其他线虫为存活状态，可以看出，蓝色荧光通道下，死亡线虫的荧光显著强于存活状态的线虫，因此在实验中线虫若出现激增的蓝色荧光可辨识该样本是否已经死亡从而剔除。
线虫中线粒体的活动和活性氧水平是影响衰老的重要因素，影响线粒体功能的突变体中(如mev-1)氧化磷酸化水平较低，具有缩短寿命、增强氧化损伤和降低氧化损伤耐受性特性。mev-1线虫比N2野生型线虫体内的羰基化蛋白积累更多。
与5天龄线虫肠脂褐质积累抑制率相比，肌肽作用10天发挥的抗羰基化活性更强。考虑到该方法的应用范围，建议检测样品作用10天后线虫的肠脂褐质荧光强度。
综上，本方法的建立以蓝色荧光DAPI滤光片(ex：330～385nm)来判定10天龄mev-1线虫肠脂褐质的自发荧光强度。
实施例3-蛋白质氧化损伤羰基化的检测方法用于检测化妆品及原料
利用实施例2建立的蛋白质氧化损伤羰基化的检测方法来检测化妆品原料：木棉花提取液的抗蛋白质氧化损伤羰基化活性。
实验样品：
木棉花组：取E.coli OP50菌液和超分子木棉花提取液按90:10比例混合均匀，用移液枪吸取150μL混合液轻缓地打在每个NGM平板上中央。NGM平板避光晾干后封膜，4℃保存备用。
对照组：取150μL E.coli OP50菌液轻缓的打在NGM平板上中央，避光晾干后封膜，4℃保存备用。
对木棉花组与对照组同步进行线虫同期化与秀丽线虫肠脂褐质测定操作，其中以蓝色荧光DAPI滤光片(ex：330～385nm)来判定10天龄mev-1线虫肠脂褐质的自发荧光强度，其他操作参照实施例1。
对照组与木棉花组在蓝色荧光通道下10天龄mev-1线虫肠脂褐质荧光图像见图10。用ImageJ2对两组荧光强度进行定量分析，结果见图11，并将数据汇总于表1，抑制率＝(对照组荧光强度-木棉花组荧光强度)/对照组荧光强度×100％。
表5木棉花对10天龄mev-1线虫肠脂褐质荧光强度的影响
数据显示：10％木棉花能显著抑制线虫肠脂褐质的积累，抑制率达50％以上，具有很强的抗羰基化活性(p＜0.0001)。因此可为超分子木棉花原料应用到祛黄提亮等宣称的化妆品中提供理论依据。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将同期的线虫进行分组培养：样品组的培养物中含有化妆品及其原料的待测样品；对照组的培养物中不含待测样品，其他培养条件与样品组一致；对培养后的线虫进行荧光检测，计算得到待测样品对于线虫荧光强度的抑制率，抑制率越大说明待测样品的抗羰基化功效越强。
2.如权利要求1所述的评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，其特征在于，所述线虫包括秀丽线虫。
3.如权利要求1或2所述的评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，其特征在于，所述线虫包括野生型N2线虫、fzo-1线虫或mev-1线虫中的任意一种。
4.如权利要求1～3中任一项所述的评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，其特征在于，所述同期的线虫包括L4期线虫幼虫。
5.如权利要求1～4中任一项所述的评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，其特征在于，所述培养的时间为5～10天。
6.如权利要求1～5中任一项所述的评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，其特征在于，所述培养物中包括大肠杆菌菌液；
优选地，所述样品组的培养物中，待测样品与大肠杆菌菌液的质量比为(2～10):(90～98)；
优选地，所述大肠杆菌菌液由包括如下步骤的方法培养得到：
将大肠杆菌接种于LB液体培养基中，于37℃下培养至OD600为0.4～0.6，即得所述大肠杆菌菌液。
7.如权利要求1～6中任一项所述的评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，其特征在于，所述荧光检测的方式包括：利用荧光显微镜在滤光片下拍摄荧光图像，对样品组与对照组的荧光图像中线虫的荧光强度进行相对定量分析。
8.如权利要求7所述的评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，其特征在于，所述滤光片包括DAPI滤光片、FITC滤光片或TEXAS RED滤光片中的任意一种。
9.如权利要求8所述的评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，其特征在于，所述DAPI滤光片的激发波长为330～385nm；
优选地，所述FITC滤光片的激发波长为460～490nm；
优选地，所述TEXAS RED滤光片的激发波长为510～550nm。
10.如权利要求1～9中任一项所述的评价化妆品及其原料的抗羰基化功效的方法，其特征在于，所述抑制率的计算方法为：抑制率＝(对照组线虫的荧光强度-样品组线虫的荧光强度)/对照组线虫的荧光强度。
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