CN113975395A - 用于检测癌症复发风险的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于降低已接受癌症治疗的个体的癌症复发风险的方法和组合物。其至少部分地基于肠道微生物群的受限级分与癌症复发风险降低相关联的发现，所述肠道微生物群包括以下细菌：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌和短优真杆菌。

Description

用于检测癌症复发风险的方法和组合物
本申请是申请日为2016年9月2日、申请号为201680063917.3、发明名称为“用于检测癌症复发风险的方法和组合物”的专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请案主张2015年9月4日申请的美国临时申请第62/214,604号、2015年12 月9日申请的美国临时申请第62/265,327号和2016年2月22日申请的美国临时申请第 62/298,258号的优先权，所主张的每一个的优先权和是中的每一个的内容以其全文并入 在本文中。
技术领域
本发明涉及诊断个体具有癌症复发的较高或较低风险的组合物和方法，和用于治疗 所述个体的组合物和方法。
背景技术
哺乳动物的胃肠道密集地定殖有与其宿主以共生方式共存的数百种微生物物种。统 称为微生物群的微生物影响众多的宿主健康方面，包括营养物代谢、肠组织的体内稳态、 先天性和适应性免疫反应的发展，且更一般而言防御肠感染。细菌通过接触依赖性和可 溶因子介导的抑制直接以及间接通过调节和诱导宿主免疫反应来拮抗肠道致病菌，但个 别细菌对于定植抗特异性病原体的抗性的作用尚未充分了解。
已报告，肠菌丛的改变会影响移植物抗宿主病(GVHD)，且与菌血症和异源造血干细胞移植(allo-HSCT)后的总体存活相关联。allo-HSCT后的主要死亡病因为复发、GVHD 和感染。鉴定与allo-HSCT后的复发相关联的肠菌丛的组分将允许在具有复发风险的特 异性患者群体中进行治疗性干预。
发明内容
申请者已发现，出人意料地，HSCT后的癌症复发风险与存在和/或不存在特异性细菌群组相关联。因此，本发明涉及用于测定个体癌症复发的可能性的方法和组合物，以 及用于降低具有风险的患者的复发风险的方法和组合物。在某些非限制性实施例中，本 发明进一步提供治疗测定为具有较高或较低的癌症复发风险的个体的方法。
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种测定细菌或其芽孢在来自已诊断患有癌 症或具有患癌症风险的个体的样本中存在的方法。在某些非限制性实施例中，个体在测定细菌在样本中存在之前或之后已接受癌症治疗，例如造血干细胞移植(HSCT)，如异 源干细胞移植(allo-HSCT)。
在某些非限制性实施例中，在个体样本中检测以下细菌指示降低的癌症复发风险： 咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、微小微单胞菌(Parvimonas micra)、肠氨基 酸球菌(Acidaminococcus intestini)、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、人粪梭菌(Clostridium glycyrrhizinilyticum)、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌(Desulfosporosinuslacus)、 两形真杆菌(Eubacterium biforme)、人粪厌氧球菌(Anaerofustisstercorihominis)、非乳 解假支杆菌(Pseudoramibacter alactolyticus)、黑色消化球菌(Peptococcus niger)、玫瑰 色装甲菌(Armatimonas rosea)、产酸糖酵菌(Saccharofermentans acetigenes)、大芬戈 尔德菌(Finegoldia magna)、马赛乐维拉菌(Levyella massiliensis)、巴恩斯鸡粪菌 (Gallicola barnesae)、非糖消化默多克菌(Murdochiella asaccharolytica)、短优真杆菌 (Eubacterium brachy)、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，所检测的细菌或其芽孢为淤泥真杆菌、黑色消化球菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、产酸糖酵菌、玫瑰色装甲菌、其组合或包含前述细菌 中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，所检测的细菌或其芽孢为淤泥真杆菌或包含淤泥真杆菌 的集群。
在某些非限制性实施例中，所检测的细菌为微小微单胞菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的 任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，细菌或其芽孢包含与通过SEQ ID NO:1-12或SEQ IDNO:1-17中的任一个描述的核酸序列具有约85与100％一致性之间的16S rRNA序列。
在某些非限制性实施例中，个体样本为粪便样本或肠微生物群样本。在某些非限制 性实施例中，来自第一个体的样本中的细菌丰度指示，当细菌丰度大于来自已癌症复发的第二个体的样本中的所述细菌水平或大于参考水平，例如存在于肠微生物群中的细菌水平(高于所述细菌水平指示降低的癌症复发风险)时，降低的癌症复发风险。
在某些非限制性实施例中，检测来自第一个体的样本中的以下细菌丰度低于来自尚 未癌症复发的第二个体的样本中的细菌丰度指示第一个体具有更高的癌症复发风险：咽 峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降 硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲 菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、 短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。在某些非限制性实施例 中，来自第一个体的样本中的丰度低于参考水平指示第一个体具有更高的癌症复发风 险，例如存在于肠微生物群中的细菌水平，低于所述细菌水平指示具有更高的癌症复发 风险。
在某些非限制性实施例中，检测个体样本中的屎肠球菌指示更高的癌症复发风险。 在某些非限制性实施例中，个体样本为粪便样本或肠微生物群样本。在某些非限制性实 施例中，来自第一个体的样本中的细菌丰度指示，当细菌丰度大于来自尚未癌症复发的第二个体的样本中的所述细菌丰度或大于参考水平，例如存在于肠微生物群中的细菌水平(高于所述细菌水平指示具有更高的癌症复发风险)时，具有更高的癌症复发风险。
在某些非限制性实施例中，检测来自第一个体的样本中的屎肠球菌丰度低于来自已 癌症复发的第二个体的样本中的细菌丰度指示第一个体具有较低的癌症复发风险。在某 些非限制性实施例中，来自第一个体的样本中的丰度低于参考水平指示第一个体具有较 低的癌症复发风险，例如，存在与肠微生物群中的细菌水平，低于所述细菌水平指示降低的癌症复发风险。
在某些非限制性实施例中，检测粪便样本或肠微生物群样本中的一或多个细菌丰度 的方法在活体外在样本上进行。
在某些非限制性实施例中，本发明的方法进一步包含当个体已测定具有更高的癌症 复发风险时向个体给药癌症疗法。
在某些非限制性实施例中，疗法包含向个体给药益生菌，其中益生菌包含咽峡炎链 球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产 酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真 杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，疗法包含向个体给药益生元，其中益生元包含一或多个 药剂，例如增加以下细菌的生长和存活的营养补充物：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪 厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德 菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前 述细菌中的任何一或多个的集群。在某些非限制性实施例中，益生元包含不充分吸收的 复合碳水化合物、寡糖、菊糖类果聚糖或阿拉伯糖基木聚糖中的一或多个。
在某些非限制性实施例中，疗法包含向个体给药益生素，其中益生素包含一或多个 药剂，如由以下细菌表达的蛋白质：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤 泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解 假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、 巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或 多个的集群。在某些非限制性实施例中，益生素包含来自以下细菌培养物的介质：咽峡 炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫 弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、 产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优 真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。在某些非限制性实施例中， 益生素包含短链脂肪酸，如丁酸或类似酸；或二级胆汁酸。
在某些非限制性实施例中，疗法包含给药对屎肠球菌具有特异性的抗生素。在某些 非限制性实施例中，抗生素包含青霉素、万古霉素和/或利奈唑胺抗生素。在某些非限制性实施例中，抗生素选择性地绕开咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥 真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假 支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、 巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或 多个的集群。
在某些非限制性实施例中，疗法包含向个体给药以下细菌的重组细胞：咽峡炎链球 菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖 酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、 其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。在某些非限制性实施例中，重组细菌 表达抗生素抗性基因。
在某些非限制性实施例中，疗法包含手术、放疗、化疗、免疫疗法、干细胞疗法或其它细胞疗法或其组合，所述细胞疗法如给药嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR修饰的 T细胞)和/或抗原特异性T细胞。
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种如本文所描述的组合物和其治疗性用途，包含选自由以下组成的群的一或多个经分离细菌或其芽孢：咽峡炎链球菌、微小微 单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆 菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大 芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌或短优真杆菌、其组合 或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。在一些非限制性实施例中，细菌呈用于向个 体给药的调配物形式。在某些非限制性实施例中，细菌呈药物调配物形式。在某些非限 制性实施例中，细菌为重组细菌，例如表达抗生素抗性基因的重组细菌。
在某些非限制性实施例中，组合物被调配成用于经口、鼻饲或直肠给药。在某些非限制性实施例中，组合物进一步包括益生细菌和/或酵母菌、益生元、益生素或抗生素。 在某些非限制性实施例中，组合物调配为液体、悬浮液、干燥粉末、片剂、胶囊或食品 产品。在某些非限制性实施例中，细菌或其集群为重组细菌或其子代，其可包括编码赋 予对重组细菌的抗生素敏感性或抗性的蛋白质的一或多种外源性核酸。
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种降低癌症复发风险或增加患有癌症复发 的个体的存活率的方法，包含向需要这种治疗的个体给药有效量的组合物，所述组合物包含咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产 芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰 色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多 克菌或短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。
在本发明的各种非限制性实施例中，细菌可以营养或休眠态形式或呈芽孢、或其混 合物形式给药。
在一些非限制性实施例中，本公开提供一种用于降低癌症复发的一或多种症状和/ 或临床体征的严重程度的方法，包含向需要这种治疗的个体给药有效量的以下物质：如 本文中所描述的一或多个重组细胞或其子代；组合物，包含咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、 人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈 尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌或短优真杆菌、其组合或包 含前述细菌中的任何一或多个的集群；如本文中所描述的益生菌、益生元、益生素和/ 或抗生素；手术；放疗；化疗；免疫疗法；干细胞疗法；细胞疗法及其组合，其中症状 和/或临床体征选自由以下组成的群组：存在癌细胞、癌细胞增殖、肿瘤生长、存在肿瘤、 肿瘤体积、可检测量的微小残留病或其组合。
本发明进一步提供套组，包含咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假 支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、 巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌或短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或 多个的集群。在某些非限制性实施例中，试剂盒进一步包含含关于使用细胞或组合物以 治疗或预防癌症复发的信息的说明书。在某些非限制性实施例中，说明书包含以下中的 至少一个：治疗剂的描述；用于治疗或预防癌症复发或其症状的剂量方案和给药；注意 事项；警告；指示；计数指示；过剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/ 或参考。说明书可直接印刷在容器(当存在时)上，或作为施加于容器的标记，或作为 在容器中提供或随着容器提供的独立书页、手册、卡片或文件夹。
本发明进一步提供用于诊断个体具有增加的癌症复发风险的套组，包含用于检测肠 微生物群样本中的一或多个细菌丰度的一或多个药剂，其中一或多个细菌选自由以下组 成的群组：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉 克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、屎肠球菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑 色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪 菌、非糖消化默多克菌、或短优真杆菌和包含前述细菌中的任何一或多个的集群。
本公开进一步提供组合物，包含一或多个经分离细菌或其芽孢、或包含如本文中所 描述的所述一或多个细菌的集群，其用于降低癌症复发风险和/或增加从个体的癌症复发 存活的可能性。在某些非限制性实施例中，个体在测定细菌在样本中存在之前或之后已接受癌症治疗，例如造血干细胞移植(HSCT)，如异源干细胞移植(allo-HSCT)。异源 干细胞移植(allo-HSCT)可为T细胞添加的allo-HSCT。
在某些非限制性实施例中，组合物为可以对降低个体中的屎肠球菌的存在有效的量 和/或降低个体中的屎肠球菌毒素的量给药。
在某些非限制性实施例中，个体具有增加的癌症复发风险，其中来自个体的肠微生 物群样本的以下细菌中的一或多个的水平低于细菌参考水平：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、 人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈 尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌或短优真杆菌，或包含前述 细菌中的任何一或多个的集群。替代地或另外，来自个体的肠微生物群样本的屎肠球菌 水平大于细菌参考水平。
在某些非限制性实施例中，用于降低癌症复发风险和/或增加从个体的癌症复发存活 的可能性的组合物进一步包含分析来自个体的肠微生物群样本且测定以下存在于肠微 生物群样本中的细菌中的一或多个的水平：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、 非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐 维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌或短优真杆菌，或包含前述细菌中的任何一 或多个的集群；和在样本中的一或多个细菌水平低于细菌参考水平时，向个体给药治疗 有效量的组合物。
在某些非限制性实施例中，用于降低癌症复发风险和/或增加从个体的癌症复发存活 的可能性的组合物进一步包含分析来自个体的肠微生物群样本且测定存在于肠微生物 群样本中的屎肠球菌水平，和在样本中的屎肠球菌水平大于细菌参考水平时，向个体给药治疗有效量的组合物。
在某些非限制性实施例中，本公开提供一种用于诊断为具有增加的癌症复发风险的 个体的癌症疗法中的组合物，其中来自个体的肠微生物群样本的一或多个以下细菌的水 平低于细菌参考水平：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人 粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑 色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪 菌、非糖消化默多克菌或短优真杆菌，或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。另外 或替代地，来自个体的肠微生物群样本的屎肠球菌水平大于细菌参考水平。癌症疗法可 包括手术、放疗、化疗、免疫疗法、干细胞疗法和/或细胞疗法，或可涉及向个体给药益 生细菌和/或酵母菌、益生元、益生素或抗生素。
附图说明
图1展示细菌性多样性在1年时间段内的定量，其使用来自309例患者通过16S基因测序进行的大便样本组合物分析之后的逆Simpson指数。
图2展示在一年观测时间段内细菌性属与复发或与复发风险的相关性。细菌的相关 性通过Cox单变量回归来定量。沿竖轴的位置指示统计显著性。
图3展示在多变量调整风险因素之后细菌性丰度与复发之间的相关性。调整Cox回归模型的调节强度、移植源(脊髓与未经修饰的/T细胞添加成年人)和疾病风险指数。
图4A到图4B展示(A)微小微单胞菌丰度与较低的复发风险相关联；和(B)通 过Mann-Whitney存活通过对数秩的散点图，指示微小微单胞菌为防止复发的候选生物 标记。
图5展示微小微单胞菌丰度与复发之间的相关性，指示微单胞菌的最佳区分能力是 在常规(T细胞添加)非脊髓移植物之后。
图6展示微小微单胞菌丰度与复发之间的相关性，指示微单胞菌的最佳区分能力是 在高强度调节方案之后。
图7展示微小微单胞菌、咽峡炎链球菌和屎肠球菌的丰度与复发之间的相关性。
图8展示细菌分类群与一年的GVHD相关的死亡之间的相关性。细菌分类群与GVHD相关的死亡的相关性通过Cox单变量回归测定。
图9展示由实例2描述的466个个体群体在allo-HSCT后的36个月内的复发率。
图10展示OTU在>10％中的>0.01％的丰度阈值，考虑所述OTU以分析与如实例2 中所描述的复发或复发缺乏的其相关性的。OTU的总数视为194。
图11展示在466个患者群体的234例患者探究子组中使用Cox回归模型化的所考虑的194个OTU与复发水平之间的相关性。
图12A到图12B展示在466个患者群体的探究和验证子组中的肠氨基酸球菌丰度与复发之间的相关性，其中在回归模型中细菌丰度的截止阈值为3.4×10-5。这个截止值 产生约85％的细菌低丰度(其与复发相关)和15％高丰度(其与复发缺乏相关)。
图13展示在多变量调整之后肠氨基酸球菌丰度与复发之间的相关性。
图14A到图14B展示接受T细胞添加移植的患者中的肠氨基酸球菌丰度与复发之间的相关性，其中图14A展示相对于若干因素的相关性，且图14B展示肠氨基酸球菌丰 度与复发之间的逆相关性。
图15A到图15B展示各种肠微生物群以及其与复发和GVHD相关的死亡的相关性 的散点图。
图16展示各种肠微生物群，包括肠球菌、氨基酸球菌和布劳特氏菌(Blautia)，与复发和GVHD相关的死亡缺乏的相关性。
图17展示氨基酸球菌丰度与总存活、GVHD相关的死亡和复发缺乏之间的相关性。
图18A到图18B为时间加权平均丰度计算的示意图，其中图18A为其中没有样本 是获自在采样周期之前的周和/或之后的周的患者的图，且图18B为其中至少一个额外 样本是获自在采样周期之前的周和/或之后的周的患者的图。
图19展示在实例3的群体中的肠微生物多样性与复发/POD的时间之间的相关性。
图20A到图20D展示crOTU的多变量p值相对于复发/POD的危险比率的火山图(图20A)。图20B展示相对于复发/POD的危险比率绘制的crOTU单变量p值。图20C提供 OTU的多变量p值相对于复发/POD的危险比率的火山图。图20D展示相对于复发/POD 的危险比率绘制的OTU单变量p值。
图21提供在探究组(n＝271)中的通过Cox模型的微生物群特征的丰度与复发/POD的相关性。
图22A到图22C提供在allo-HCT之后在整个群体(图22A，n＝541)中、在探究群 体(图22B，n＝271)中和在验证群体(图22C，n＝270)中使用原因特异性Cox成比例 危险回归进行的crOTU 1614与复发/POD的风险的单变量和多变量相关性。crOTU 1614 视为对数转换连续变量(多变量I)、视为存在与不存在的二进制变量(多变量II)或视 为丰度库的有序分类变量(多变量III)中的任一个。
图23展示，探究和验证组中的复发/POD的累积发病率在不存在crOTU 1614的情况下更高。
图24提供描绘crOTU(蓝色数字)和OTU的crOTU 1614的进化分支图。列举与 NCBI16S参考序列的百分比一致性和其登录号。右侧上的条指示分类科成员。底部的 小型表列举crOTU 1614中的四个主要物种的分类学分类。
图25提供四个主要物种的相对贡献(平均丰度)相对于所有患者中的总crOTU1614 丰度的饼形图。
图26A到图26B展示，在实例3的患者群体中，当通过crOTU 1614丰度分层时，crOTU与低复发/POD累积风险相关联(图26A)。图26B提供四个层中的2年crOTU 1614 的平均丰度(顶部)和累积复发/POD发病率(底部)。
图27展示，RDRI使实例3的群体中的患者的复发/POD风险分层。
图28提供在肠存在crOTU 1614与复发/POD的临床风险因素(即，RDRI、移植源 和调节强度)组合的竞争性风险存在下的原因特异性一致性指数。
图29展示在allo-HCT之后三周大便样本中的crOTU 1614存在与总存活、复发/POD的累积发病率、2-4级急性GVHD的累积发病率和移植相关的死亡(TRM)之间的相关 性。十七个患者已在标志天21之前发展2-4级GVHD，且排除在这个图之外。
图30描绘患者子组中的crOTU 1614存在与复发/POD根据移植源、调节强度、HLA匹配程度、RDRI和疾病类型的相关性，其中灰盒大小与子组中的患者数量成比例。
图31A到图31E描绘根据crOTU 1614的存在和移植源的复发/POD的累积发病率，其中图31A为整个群体的图，图31B为T细胞添加移植物的图，图31C为未经修饰的 PBSC/BM(T细胞添加)移植物的图，图31D为脊髓(T细胞添加)移植物的图，且图 31E为T细胞消耗的移植物的图。
图32展示基于在allo-HCT之前(HCT前)每患者收集的单一样本，未经修饰的PBSC/BM移植物的接受者(n＝143)的crOTU丰度与复发/POD之间的相关性。
图33展示基于在allo-HCT之前(HCT前)每患者收集的单一样本，所有移植源的 接受者(n＝469)的crOTU丰度与复发/POD之间的相关性。
图34展示如通过图26B、图32和图33描绘的在整个研究期间使用的丰度库的分 类边界。
具体实施方式
本发明涉及用于测定患有癌症的个体在治疗之后(例如在allo-HSCT之后)将遭受癌症复发的风险的方法，以及用于降低癌症复发风险的方法和组合物，以及用于增加个 体从癌症复发存活的可能性的组合物和方法。为了清楚描述起见，但不作为限制，本章 节分成以下小节：
(i)测定癌症复发风险的方法；
(ii)治疗性细菌；
(iii)重组细胞；
(iv)药物组合物；
(v)治疗方法；以及
(vi)试剂盒。
以下为与本发明相关的术语：
本文中的“个体(individual/subject)”或“患者”为脊椎动物，如人类或非人动物， 例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、灵长类、农畜、竞技动物、啮齿动物和宠物。非人动物个体的非限制性实例包括啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和天竺鼠；家兔； 狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；以及非人类灵长类，如猿和猴。
如本文中使用的术语物质的“有效量”为足以实现有益或所需结果的量，包括临床结果，且因此“有效量”取决于其应用的上下文。在给药组合物以降低癌症复发风险和 /或给药组合物以降低癌症复发的至少一个体征或症状的上下文中，本文中所描述的组合 物的有效量为足以治疗和/或改善癌症复发以及减少症状和/或降低癌症复发的可能性的量。降低可为降低癌症复发症状的严重程度或癌症复发可能性10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。有效量在一或多次给药中给药。
如本文中所使用且在所属领域中充分理解的，“治疗”是一种用于获得有益或所要结果，包括临床结果的方法。出于这个主题的目的，有益或所需临床结果包括但不限于 缓解或改善一或多个体征或症状，减轻疾病程度，稳定(即，没有恶化)疾病状态，预 防疾病、延迟或减缓疾病进展，缓解疾病(例如癌症缓解)和/或改善或缓和疾病状态。 降低可为并发症、体征或症状的严重程度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％、95％、98％或99％。“治疗”还可以意味着存活期与未接受治疗时的预期存 活期相比延长。“治疗”还可以指降低癌症复发的可能性。
术语“表达载体”用于表示其中整合有适当大小的另一核酸序列片段的直链或环状核酸分子。这类核酸片段可包括提供转录由核酸序列片段编码的基因的额外片段。额 外片段可包括但不限于：启动子、转录终止子、增强子、内部核糖体进入位点、非翻译 区、聚腺苷酸化信号、可选标记、复制起点和如所属领域中已知的这类片段。表达载体 通常源于质粒、粘粒、病毒载体和酵母菌人工染色体；载体通常为含有来自若干来源的 核酸序列的重组分子。
术语“可操作地连接”当应用于核酸序列时，例如在表达载体中，指示被布置以使得序列协作地起作用以实现其intended预期目的的序列，即，启动子序列允许通过连接 的编码序列进行的转录开始直到终止信号为止。
“核酸分子”为单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中各核苷酸上的3'和5'端通过磷酸二酯键连接。聚核苷酸可由脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基组成。聚核苷 酸包括DNA和RNA，且可在活体外合成产生或从天然来源分离。
如本文所使用，术语“启动子”表示在基因内可结合到转录因子和/或RNA聚合酶以便控制相关联编码序列的表达的区。启动子通常但不总是位于翻译起始密码子的上 游，基因的5'非编码区中。基因的启动子区可包括充当可识别核酸结合蛋白的序列特异 性核酸结合域的结合位点的一或多个共有序列。然而，这类结合位点还可位于启动子外 的区中，例如在位于内含子中的增强子区中或编码序列的下游。
“调节基因”为涉及控制一或多个其它基因的表达的基因。
“集群”或“相关细菌的集群”可包括与rRNA序列、相似性和/或进化距离相关的 两个或更多个细菌物种或菌株，所述rRNA序列例如16S rRNA(例如16S rDNA序列的 可变区，如V1、V2、V3、V4或V5)。举例来说，在节点(分支点)定义为集群的系统 发生树中，附属于既定节点的树尖处的OTU限定这类集群的成员。这类集群或者可称 为“相关操作分类单位的集群”或“crOTU”。在某些非限制性实施例中，crOTU中的 细菌物种呈现小于或等于70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％16S rRNA一致性。在某些非限制性实施例中，crOTU中的细菌物种呈现至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％16S rRNA一致性。
在某些非限制性实施例中，crOTU中的细菌物种包含与由SEQ ID NO:1-12或SEQID NO:1-17中的任一个描述的一或多个核酸序列的一致性，其中一致性水平在约80与100％之间，在85与100％之间，在90与100％之间，在95与100％之间，在97与100％ 之间，在80与97％之间，在80与95％之间，在80与90％之间，在80与85％之间，和 其间的值，例如约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、 95、96、97、98、99或100％。在一些实施例中，一致性水平(包括端点)在80与100％ 之间，在85与100％之间，在90与100％之间，在95与100％之间，在97与100％之间， 在80与97％之间，在80与95％之间，在80与90％之间，在80与85％之间，和其间的 值，例如80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99或100％。在某些非限制性实施例中，百分比一致性对应于SEQ ID NO:1-12 或SEQ ID NO:1-17中的任一个的V4-V5可变区。
在某些非限制性实施例中，crOTU中的细菌物种通过OTU序列的相关性基于最小进化树修剪重建(SPR)和最大似然最近邻点交换(NNI)测定，如Price等人，《公共 科学图书馆》(PLoS One)，2010；5(3):e9490所描述，其以全文引用的方式并入本文中。
“益生菌”为当消耗、摄取或以其它方式向个体给药时向个体提供健康益处或为非病原性的微生物或微生物群组，例如减少在癌症治疗后的复发可能性。如本文中所使用，术语益生菌可用于描述例如益生细菌和/或益生酵母菌，且可包括本文中所描述的细菌以及其它细菌。
“益生元”为促进一或多个细菌或酵母菌生长、增殖和/或存活的物质。如本文中所使用，术语益生元可用于描述例如营养补充物，包括植物纤维，或不充分吸收的复合碳 水化合物、寡糖、菊糖类果聚糖或阿拉伯糖基木聚糖中的一或多个。
“益生素”为源于益生菌生物体的物质。如本文中所使用，术语益生素可用于描述例如由一或多个细菌或酵母菌表达的蛋白质、一或多个细菌或酵母菌的代谢产物、或来 自一或多个细菌或酵母菌菌株培养物的介质。
如本文中所使用，术语“癌症复发”是指在治疗后在一段时期的改善之后，例如在癌症或其体征和症状存在下在一段时期的减少之后，癌症或癌症的体征和症状的恢复或再现。在某些非限制性实施例中，“癌症复发”是指在至少1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10或更多个周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、12个月或更多、或 至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多的改善时期之后，癌症或其体征和症状 的恢复或再现。在某些实施例中，改善时期在约3周与2年之间。
在某些非限制性实施例中，癌症复发通过测量通过特定疾病标准的疾病(POD)复发或进展的时间来测定。当流式细胞测量术、放射或分子结果通过开始疗法、输注供体 淋巴细胞或撤消免疫抑制在临床上起作用时，微小残留病的检测记为复发/POD事件。
5.1测定癌症复发风险的方法
在某些非限制性实施例中，本发明提供测定诊断患有癌症的个体在癌症治疗之后是 具有较高还是具有较低的癌症复发风险的方法。
在某些非限制性实施例中，测定为具有较高癌症复发风险的个体更经常地受监测且 在治疗后监测针对复发的延长时间段，且可除造血干细胞移植以外或作为其替代方案给 药治疗性方案，如在本文中进一步描述。
癌症的非限制性实例包括但不限于急性白血病、慢性白血病、淋巴恶性肿瘤、浆细胞病症和骨髓增生赘瘤。
在某些非限制性实施例中，癌症治疗包含造血干细胞移植(HSCT)。在某些非限制性实施例中，造血干细胞移植包含来自不同于所治疗患者的供体的异源干细胞 (allo-HSCT)。在某些非限制性实施例中，造血干细胞移植包含来自正治疗的患者自身 的干细胞。
在某些非限制性实施例中，癌症治疗包含异源脐带血移植或异源脊髓干细胞移植。
在某些非限制性实施例中，癌症治疗包含T细胞添加的移植或T细胞消耗的移植。
在某些非限制性实施例中，癌症治疗包含骨髓移植。
在某些非限制性实施例中，方法包含测定指示降低的癌症复发风险的个体肠微生物 群样本中的一种细菌、OTU或集群(在本文中也称为“细菌(bacterium)”)的丰度。 在某些非限制性实施例中，细菌选自由以下组成的群组：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、 肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪 厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德 菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前 述细菌中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，所检测的细菌为淤泥真杆菌、黑色消化球菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、产酸糖酵菌、玫瑰色装甲菌、其组合或包含前述细菌中的任何 一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，所检测的细菌为淤泥真杆菌或包含淤泥真杆菌的集群。
在某些非限制性实施例中，所检测的细菌为微小微单胞菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的 任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，在治疗个体之前，例如在HSCT之前，检测细菌。
在某些非限制性实施例中，在治疗个体之后，例如在HSCT之后，检测细菌。在某 些非限制性实施例中，当在治疗后检测细菌时，以下细菌中的一或多个的任何水平的检 测指示降低的癌症复发风险：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆 菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆 菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩 斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个 的集群
在某些非限制性实施例中，在个体中检测以下细菌的丰度大于在癌症疗法之后已癌 症复发的第二个体的肠微生物群样本中的所述细菌的丰度指示降低的癌症复发风险：咽 峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降 硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲 菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、 短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，在个体中检测以下细菌的丰度大于在癌症疗法之后尚未 癌症复发的第二个体的肠微生物群样本中的所述细菌的丰度指示降低的癌症复发风险： 咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装 甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、 短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，在个体中检测以下细菌的丰度低于在癌症疗法之后已癌 症复发的第二个体的肠微生物群样本中的所述细菌的丰度指示更高的癌症复发风险：咽 峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降 硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲 菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、 短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，在个体中检测以下细菌的丰度低于在癌症疗法之后尚未 癌症复发的第二个体的肠微生物群样本中的所述细菌的丰度指示更高的癌症复发风险： 咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装 甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、 短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，本发明的方法包含测定个体的肠微生物群样本中存在的 以下额外一个细菌的丰度：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、 黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡 粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集 群，其中当个体的微生物群中的一或多个细菌的丰度或量大于细菌参考水平时，个体诊 断或鉴定为具有减少的癌症复发风险。在一些非限制性实施例中，细菌参考水平为存在 于肠微生物群中的细菌丰度，所述细菌例如咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球 菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、 非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐 维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的 任何一或多个的集群，高于所述水平指示降低的癌症复发风险，如由所属领域中的医学 医生或技术人员所测定。
在一个非限制性实例中，这类参考水平为患有癌症的尚未癌症复发或具有降低的癌 症复发风险的个体的微生物群中的所述细菌的丰度。
在某些非限制性实施例中，这类参考水平为未诊断患有癌症或具有降低的患癌症风 险的健康个体的微生物群中的所述细菌的丰度。
在某些非限制性实施例中，这类参考水平为包含本文中所描述的额外一个细菌或包 含所述一或多个细菌的集群的个体的肠微生物群样本中的总细菌丰度百分比。在某些非 限制性实施例中，参考细菌水平在约0.10与50％之间，在约0.15与45％之间，在约0.5与40％之间，在约1与35％之间，在约1.5与30％之间，在约2与30％之间，在约2.5 与25％之间，在约3与20％之间，在约3.5与15％之间，在约4与10％之间，在约4.5 与8％之间，在约5与6％之间，和其间的值。
在某些非限制性实施例中，本发明的方法包含测定个体的肠微生物群样本中存在的 以下额外一个细菌的丰度：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、 黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡 粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集 群，其中当个体的微生物群中的一或多个细菌的丰度或量低于细菌参考水平时，个体诊 断或鉴定为具有更高的癌症复发风险。在一些非限制性实施例中，细菌参考水平为肠微 生物群中存在的细菌丰度，所述细菌例如咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、 淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳 解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉 菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何 一或多个的集群，低于所述水平指示更高的癌症复发风险，如由所属领域中的医学医生 或技术人员所测定。
在一个非限制性实例中，这类参考水平可为患有癌症的已患有癌症复发或具有更高 的癌症复发风险的个体的微生物群中的所述细菌的丰度。
在某些非限制性实施例中，本发明的方法包含测定指示增加的癌症复发风险的个体 的肠微生物群样本中的细菌丰度。在某些非限制性实施例中，细菌为屎肠球菌。
在某些非限制性实施例中，检测个体中的屎肠球菌丰度大于在癌症疗法之后已癌症 复发的第二个体的肠微生物群样本中的所述细菌丰度指示增加的癌症复发风险。
在某些非限制性实施例中，检测个体中的屎肠球菌丰度大于在癌症疗法之后尚未癌 症复发的第二个体的肠微生物群样本中的所述细菌丰度指示增加的癌症复发风险。
在某些非限制性实施例中，检测个体中的屎肠球菌丰度低于在癌症疗法之后已癌症 复发的第二个体的肠微生物群样本中的所述细菌丰度指示降低的癌症复发风险。
在某些非限制性实施例中，检测个体中的屎肠球菌丰度低于在癌症疗法之后尚未癌 症复发的第二个体的肠微生物群样本中的所述细菌丰度指示降低的癌症复发风险。
在某些非限制性实施例中，本发明的方法包含测定个体的肠微生物群样本中存在的 屎肠球菌丰度，其中当个体的微生物群中的屎肠球菌的丰度或量大于细菌参考水平时，个体诊断或鉴定为具有增加的癌症复发风险。在一些非限制性实施例中，细菌参考水平 为存在于肠微生物群中的屎肠球菌的丰度，高于所述水平指示具有更高的癌症复发风 险，如由所属领域中的医学医生或技术人员测定。
在一个非限制性实例中，这类参考水平可为患有癌症的已癌症复发或具有增加的癌 症风险的个体的微生物群中的所述细菌的丰度。
在某些非限制性实施例中，本发明的方法包含测定个体的肠微生物群样本中存在的 屎肠球菌丰度，其中当个体的微生物群中的屎肠球菌的丰度或量小于细菌参考水平时，个体诊断或鉴定为具有降低的癌症复发风险。在一些非限制性实施例中，细菌参考水平 为存在于肠微生物群中的屎肠球菌丰度，低于所述水平指示具有降低的癌症复发风险， 如由所属领域中的医学医生或技术人员测定。
在一个非限制性实例中，这类参考水平可为患有癌症的尚未癌症复发或具有降低的 癌症复发风险的个体的微生物群中的所述细菌丰度。
在一个非限制性实例中，这类参考水平可为尚未诊断患有癌症或具有降低的患癌症 风险的健康个体的微生物群中的所述细菌丰度。
在某些非限制性实施例中，细菌为包含淤泥真杆菌的细菌集群。这类细菌集群可包 含来自优杆菌科和消化球菌科的物种，包括但不限于人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌和黑色消化球菌。在某些非限制性实施例中，集群可进一步包括玫瑰色装甲菌和/或产酸糖酵菌。在某些非限制性实施例中，集群可包含大于约40％、大于约50％、大于约60％或 大于约65％淤泥真杆菌。在某些非限制性实施例中，集群可包括约10％到约20％的人粪 厌氧球菌和黑色消化球菌中的每一个。
在某些非限制性实施例中，本发明的方法包含测定个体的肠微生物群样本中存在的 包含淤泥真杆菌的细菌集群的丰度，其中当个体的微生物群中的包含淤泥真杆菌的细菌 集群的丰度或量大于细菌参考水平时，个体诊断或鉴定为具有减少的癌症复发风险。在一些非限制性实施例中，细菌参考水平为存在于肠微生物群中的包含淤泥真杆菌的细菌集群的丰度，高于所述水平指示具有更小的癌症复发风险，如由所属领域中的医学医生 或技术人员测定。在一个非限制性实例中，这类参考水平可为患有癌症的已癌症复发或 具有减少的癌症复发风险的个体的微生物群中的所述细菌丰度。
在某些非限制性实施例中，本发明的方法包含个体的肠微生物群样本中存在的包含 淤泥真杆菌的细菌集群的丰度，其中当个体的微生物群中的包含淤泥真杆菌的细菌集群 的丰度或量小于细菌参考水平时，个体诊断或鉴定为具有增加的癌症复发风险。在一些非限制性实施例中，细菌参考水平为存在于肠微生物群中的包含淤泥真杆菌的细菌集群的丰度，低于所述水平指示具有增加的癌症复发风险，如由所属领域中的医学医生或技 术人员测定。
在某些非限制性实施例中，微生物群样本为粪便样本或肠内含物样本，例如直肠拭 子。
在某些非限制性实施例中，存在于样本中的细菌的丰度或量通过测量存在于样本中 的细菌核酸(例如16S rRNA)的丰度或量测定。
在某些非限制性实施例中，存在于样本中的细菌的丰度或量通过以下来测定：细菌 DNA的鸟枪法测序、细菌所携带的特异性基因的PCR扩增、由细菌特异性表达地转录 物的定量PCR、细菌检测的基于抗体的方法、细菌代谢物的代谢组学检测、细菌蛋白质 的蛋白质组检测和/或通过培养微生物群样本的方法。
在某些非限制性实施例中，在个体已接受癌症治疗(例如allo-HSCT)之后至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31或更多天，从个体收集微生物群样本。在某些非 限制性实施例中，在个体已接受癌症治疗之后至多1、2、3、4或更多周，或直到1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月，从个体收集微生物群样本。在某些非 限制性实施例中，在个体接收癌症治疗之前至多1、2、3、4、5、6、7或更多天，或至 多1、2、3、4或更多周，或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月，从个体收集微生物群样本。
5.2治疗性细菌
在某些非限制性实施例中，本文中所描述的组合物包含一或多个治疗性细菌或其芽 孢，例如咽峡炎链球菌(例如33397)、微小微单胞菌(例如ATCC 33270)、肠氨基酸球 菌(例如DSM 21505)、淤泥真杆菌(例如ATCC 8486)、人粪梭菌(例如JCM 13369)、 拉克丝产芽孢降硫弯曲菌(例如DSM 15449)、两形真杆菌(例如DSM 3989)、人粪厌 氧球菌(例如DSM17244)、非乳解假支杆菌(例如ATCC 23263)、黑色消化球菌(例 如DSM 20475)、玫瑰色装甲菌(例如DSM 23562)、产酸糖酵菌(例如JCM 14006)、 大芬戈尔德菌(例如ATCC 29328)、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌(例如ATCC 49795)、 非糖消化默多克菌(例如ATCC BAA-1631)、短优真杆菌(例如ATCC 33089)、其组合 或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含咽峡炎链球菌，例如ATCC(美国典型培养物保藏中心)保藏号33397；或与来自所述咽峡炎链球菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过基因库登录号NR_118289.1(SEQ ID NO:13)所描述)或一或 多个16S rDNA序列的可变区(如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少 99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含微小微单胞菌，例如ATCC保藏号33270；或与来自所述微小微单胞菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过基因 库登录号NR_114338.1(SEQ ID NO:12)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可变区 (如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含淤泥真杆菌，例如ATCC保藏号8486、51976或10825；或与来自所述淤泥真杆菌的一或多个16S rDNA序列(例如 如通过基因库登录号NR_113248.1(SEQ ID NO:1)所描述)或一或多个16S rDNA序 列的可变区(如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含两形真杆菌，例如ATCC保藏号27806；或与来自所述两形真杆菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过基因库登 录号NR_044731.2(SEQ ID NO:14)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可变区(如 V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含肠氨基酸球菌，例如DSMZ(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)保藏号DSM 21505；或与来自所述肠氨基酸球菌的一或多个16S rDNA序列(例 如如通过基因库登录号NR_041894.1(SEQ ID NO:15)所描述)或一或多个16S rDNA 序列的可变区(如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细 菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含人粪梭菌，例如DSMZ保藏号DSM 17593；或与来自所述人粪梭菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过基因库登 录号NR_112553.1(SEQ ID NO:16)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可变区(如 V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含拉克丝产芽孢降硫弯曲菌，例 如DSMZ保藏号DSM 15449；或与来自所述拉克丝产芽孢降硫弯曲菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过基因库登录号NR_042202.1(SEQ ID NO:17)所描述)或一或 多个16SrDNA序列的可变区(如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少 99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含人粪厌氧球菌，例如DSMZ保藏号DSM 17244；或与来自所述人粪厌氧球菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过 基因库登录号NR_027562.1(SEQ ID NO:3)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可 变区(如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含非乳解假支杆菌，例如ATCC保藏号23263；或与来自所述非乳解假支杆菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过 基因库登录号NR_112097.1(SEQ ID NO:6)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可 变区(如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含黑色消化球菌，例如DSMZ保藏号DSM 20475；或与来自所述黑色消化球菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过 基因库登录号NR_029221.1(SEQ ID NO:2)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可 变区(如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含玫瑰色装甲菌，例如DSMZ保藏号DSM 23562；或与来自所述玫瑰色装甲菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过 基因库登录号NR_113009.1(SEQ ID NO:5)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可 变区(如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含产酸糖酵菌，例如日本微生物 保藏中心(Japan Collection of Microorganisms；JCM)保藏号14006；或与来自所述产酸 糖酵菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过基因库登录号NR_115340.1(SEQ ID NO:4)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可变区(如V4区)具有至少90％、至少95％、 至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含大芬戈尔德菌，例如ATCC保藏号29328；或与来自所述大芬戈尔德菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过基因 库登录号NR_113383.1(SEQ ID NO:7)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可变区 (如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含马赛乐维拉菌；或与来自所述 马赛乐维拉菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过基因库登录号NR_133039.1(SEQID NO:9)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可变区(如V4区)具有至少90％、至 少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含巴恩斯鸡粪菌，例如ATCC保藏号49795；或与来自所述巴恩斯鸡粪菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过基因 库登录号NR_040843.1(SEQ ID NO:10)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可变区 (如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含非糖消化默多克菌，例如ATCC 保藏号BAA-1631；或与来自所述非糖消化默多克菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过基因库登录号NR_116331.1(SEQ ID NO:8)所描述)或一或多个16S rDNA序 列的可变区(如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在某些非限制性实施例中，一或多个治疗性细菌包含短优真杆菌，例如ATCC保藏号ATCC 33089；或与来自所述短优真杆菌的一或多个16S rDNA序列(例如如通过基因 库登录号NR_118779.1(SEQ ID NO:11)所描述)或一或多个16S rDNA序列的可变区 (如V4区)具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的细菌。
在本发明的各种非限制性实施例中，细菌可以营养或休眠态形式或呈芽孢、或其混 合物形式给药。
在某些非限制性实施例中，本文中所描述的治疗性细菌可经修饰，例如通过将一或 多种外源性核酸引入到细菌中，从而产生重组细菌。这类核酸可包含例如抗生素抗性基因和/或抗生素敏感基因。这类重组细菌可如本文中所描述来制备。
在某些非限制性实施例中，咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支 杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴 恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多 个的集群，可呈经纯化细菌或其芽孢或其它祖细胞形式给药，或替代地可呈各细菌类型 的混合物中的组分给药，所述混合物任选地包括额外细菌的一或多个物种或集群，例如 益生细菌、益生酵母菌、益生元、益生素和/或抗生素。
在非限制性实施例中，本发明提供如本文中所描述的药物组合物和其治疗性用途， 包含以下细菌的这类形式：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、 黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡 粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集 群；且任选地包括额外细菌的一或多个物种或集群，例如益生细菌、益生酵母菌、益生 元、益生素和/或抗生素。细菌可呈液体、悬浮液、干燥(例如冻干)粉末、片剂、胶囊 或栓剂的形式给药，且可经口、鼻饲或经直肠给药。在某些非限制性实施例中，细菌呈 食品产品形式给药，例如酸奶食品产品(yogurt food product)。在某些非限制性实施例 中，“食品产品”意味着打算用于由人类或非人动物食用的产品或组合物。这类食物产 品包括任何食物、饲料、点心、食物补充物、液体、饮料、处理剂、玩具(咀嚼和/或可 食用玩具)、膳食取代物或膳食替代物。
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种组合物，包含经分离的咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两 形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵 菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、 其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。在一些非限制性实施例中，细菌呈用 于向个体给药的调配物形式。
在其它非限制性实施例中，组合物包含选自由以下组成的群组的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五或十六种细菌：咽峡炎链球 菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、 两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖 酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌和短优真杆菌。
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种组合物，包含经分离咽峡炎链球菌、经分离微小微单胞菌、经分离肠氨基酸球菌、经分离淤泥真杆菌、经分离人粪梭菌、经分 离拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、经分离两形真杆菌、经分离人粪厌氧球菌、经分离非乳解 假支杆菌、经分离黑色消化球菌、经分离玫瑰色装甲菌、经分离产酸糖酵菌、经分离大 芬戈尔德菌、经分离马赛乐维拉菌、经分离巴恩斯鸡粪菌、经分离非糖消化默多克菌和 /或经分离短优真杆菌。
在一些非限制性实施例中，所述细菌为咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、 非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐 维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌和短优真杆菌中的一或多种；但替代或额外 细菌可包含于本文中所描述的组合物中，例如可天然存在的细菌，在包含咽峡炎链球菌、 微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两 形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵 菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌或短优真杆菌中 的任何一或多个的集群中的细菌，或经以表达咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸 球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、 非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐 维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌和/或短优真杆菌蛋白的细菌。
5.3重组细胞
本发明提供如本文中所描述的治疗性组合物和其治疗性用途，其降低癌症复发风险，和/或增加从个体的癌症复发存活的可能性。这类治疗性组合物可包含例如治疗性细菌、小分子、多肽或核酸分子。
在某些非限制性实施例中，治疗性组合物降低屎肠球菌毒素的量，和/或抑制个体中 的屎肠球菌的增殖和/或生长。
在一些非限制性实施例中，治疗性组合物包含以下细菌的重组细胞：咽峡炎链球菌、 微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵 菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌或短优真杆菌、 其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，治疗性组合物包含重组细胞或其子代，例如表达由以下 细菌内源性表达的一或多个蛋白质的重组细胞：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球 菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马 赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌或短优真杆菌、其组合或包含前述细菌 中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，由重组细胞或其子代表达抗生素抗性基因减少由暴露于 所述抗生素引起的对重组细胞的生长或存活的抑制，所述抗生素如但不限于，选自由以下组成的群组的抗生素：β-内酰胺抗生素、克林达霉素(clindamycin)、头孢菌素(cephalosporin)、喹诺酮抗生素(quinolone antibiotic)、左氧氟沙星(levofloxacin)、氟 喹诺酮(fluoroquinolone)、巨环内酯抗生素(macrolide antibiotic)、甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)和磺酰胺抗生素(sulfonamide antibiotic)。在其它非限制性实施例中，重 组细胞对除前述抗生素以外的抗生素具有抗性。
在某些非限制性实施例中，由重组细胞表达抗生素敏感基因增加由暴露于所述抗生 素引起的对重组细胞的生长或存活的抑制。在某些非限制性实施例中，这类抗生素可包括但不限于选自由以下组成的群组的抗生素：β-内酰胺抗生素、克林达霉素、头孢菌素、 喹诺酮抗生素、左氧氟沙星、氟喹诺酮、巨环内酯抗生素、甲氧苄氨嘧啶和磺酰胺抗生 素。在其它非限制性实施例中，重组细胞对除前述抗生素以外的抗生素敏感。
在某些非限制性实施例中，本文中所描述的重组细胞表达增加调节个体的复发风险 的代谢物的合成和分泌的一或多个重组基因，所述代谢物例如咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、 人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈 尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌或短优真杆菌蛋白，所述蛋 白降低个体的癌症复发风险。
将核酸递送到个体或细胞(例如肠微生物群的细菌细胞)中，在个体或细胞(个体的肠微生物群的细菌细胞)直接暴露于核酸或核酸携载载体的情况下可为直接的，或在 细胞(例如宿主细胞，如肠微生物群的经分离的细菌细胞)在活体外首先用核酸转化接 着移植到个体中的情况下为间接的。这两种方法分别地已知为原位或离体基因疗法。
对于基因疗法的方法的一般综述，参见Kron和Kreppel,《现代基因疗法》(CurrGene Ther)12(5):362-73(2012)；Yi等人《当前基因疗法》11(3):218-28(2011)；Goldspiel等 人《临床药学》(Clinical Pharmacy)12:488-505(1993)；Wu和Wu,《生物疗法》(Biotherapy) 3:87-95(1991)；Tolstoshev,《与毒理学年评》(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)32:573-596 (1993)；Mulligan,《科学》(Science)260:926-932(1993)；Morgan和Anderson,《生物 化学年评》(Ann.Rev.Biochem.)62:191-217(1993)；以及May,《蒂布技术》(TIBTECH) 11(5):155-215(1993)。可使用的通常重组DNA技术领域中已知的方法描述于Ausubel 等人(编)《现代分子生物学实验技术》(CurrentProtocols in Molecular Biology),纽约 John Wiley&Sons(1993)；和Kriegler,《基因转移和表达(Gene Transfer and Expression)》，《实验室手册》(A Laboratory Manual),纽约Stockton Press(1990)中。
在某些非限制性实施例中，在活体内通过所属领域中已知的任何方法给药所得重组 细胞之前，可将核酸引入到细胞(例如细菌宿主细胞)中，所述方法包括但不限于转染、电穿孔、微注射、脂转染、磷酸钙介导的转染、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体的 侵染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。 将外来基因引入到细胞中的众多技术为所属领域中已知的(参见例如Loeffler和Behr, 《酶学方法》(Meth.Enzymol)217:599-618(1993)；Cohen等人,《酶学方法》217:618-644 (1993)；Cline,《药理治疗学》(Pharmac.Ther)29:69-92m(1985))，且可根据本公开来 使用，前提是接受者细胞的必需发育学和生理学功能未被破坏。通常，转移方法包括将 选择标记转移到宿主细胞。接着，将放置在选择下以分离已吸收转移基因且表达所述转 移基因的那些宿主细胞。接着，将那些宿主细胞递送到患者中。
可将所得重组细胞或其子代通过所属领域中已知的各种方法递送到患者中。设想使 用的细胞的量取决于所需效果、患者状态等，且可本领域的技术人员决定。
在某些非限制性实施例中，术语“载体”和“表达载体”意味着可通过其将DNA 或RNA序列(例如外来基因)引入到宿主细胞中以使宿主转型且促进所引入的序列表 达(例如转录与翻译)的媒介物。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。如本文所使用，“治 疗性载体”是指向动物且确切地说向人类给药可接受的载体。
载体通常包括将外来DNA插入到其中的传递药剂的DNA。将一个DNA片段插入 到另一DNA片段中的常用方法涉及使用称为限制性酶的酶，所述酶在称为限制位点的 特定位点(特定核苷酸组)处裂解DNA。一般而言，在载体DNA的一或多个限制位点 处插入外来DNA，且接着通过载体与传递载体DNA一起携载到宿主细胞中。已插入或 添加DNA的DNA片段或序列(如表达载体)还可称为“DNA构筑体”。常用载体类 型为“质粒”，所述质粒一般为自主双链DNA分子，通常起源于细菌，可接纳额外(外 来)DNA且可引入到适合宿主细胞中。质粒载体可含有编码DNA和启动子DNA，且 具有适合于插入外来DNA的一或多个限制位点。编码DNA为编码特定蛋白质或酶的特 定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA为起始、调节或以其它方式调节或控制编码 DNA的表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可来自相同基因或来自不同基因， 且可来自相同或不同生物体。已描述用于在各种真核和原核宿主中复制和/或表达的大量 载体，包括质粒和真菌载体。非限制性实例包括pKK质粒(Clonetech)、pUC质粒、pET质粒(Novagen,Inc.，威斯康星州麦迪逊)、pRSET质粒(Invitrogen，加利福尼亚州圣地 亚哥)、pCDNA3质粒(Invitrogen)、pREP质粒(Invitrogen)或pMAL质粒(New EnglandBiolabs，马萨诸塞州贝弗利)，和使用本文中公开或列举的方法或相关领域的技术人员 已知的其它方法的许多适当宿主细胞。重组克隆载体通常包括用于克隆或表达的一或多 个复制系统、用于在宿主中选择的一或多个标记(例如抗生素抗性)和一或多个表达盒。
适合载体包括例如噬菌体、粘粒、质粒、裸DNA、DNA脂质复合物和通常用于所 属领域中已描述用于在各种真核和原核宿主中表达的重组媒介物，且可用于基因疗法以 及简单蛋白表达。
5.4药物组合物
在某些非限制性实施例中，本公开提供如本文中所描述的药物组合物和其治疗性用 途，其包括如本文中所描述的治疗性组合物，例如如本文中所描述的治疗性细菌。这类药物组合物可进一步包括至少一种其它药剂，如稳定化化合物或额外治疗剂，例如益生菌、益生元、益生素和/或抗生素；且可以任何无菌生物相容的药物载剂形式给药，所述 生物相容性药物载剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、甘油、聚乙二醇和水。组 合物可呈液体或冻干或冷冻干燥形式。在一些非限制性实施例中，调配物包括具有适合 pH值和离子强度的稀释剂(例如缓冲液，如Tris、柠檬酸盐、乙酸盐或磷酸盐缓冲液)； 增溶剂，如聚山梨醇酯(例如
Figure BDA0003263576410000251
))；载剂，如人类血清白蛋白或明胶。在一些情 况下，可包括并不影响组合物中的生物体的存活力的防腐剂。防腐剂的实例包括硫柳汞； 对羟基苯甲酸酯；苯甲基氯化铵或苯甲醇；抗氧化剂，如抗坏血酸或偏亚硫酸氢钠；和 其它组分，如赖氨酸或甘氨酸。特定组合物的选择将取决于多种因素，包括正治疗的病 况、给药途径和所需药物动力学参数。适合于药物组合物的组分的更广泛调查见于《雷 明顿氏药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)第18版，A.R.Gennaro版，宾 夕法尼亚州伊斯顿Mack(1980)。
在某些非限制性实施例中，本公开的方法和组合物被发现用于降低个体的癌症复发 风险，和/或增加患有癌症复发的个体的存活机会。这类治疗性细菌以药学上可接受的载 剂形式向患者给药。最终选择的给药途径将取决于多种因素，且可由本领域的技术人员确定。
在某些非限制性实施例中，本公开的药物组合物可使用所属领域中熟知的药学上可 接受的载剂以适合于经口、鼻饲或直肠给药的剂量调配。这类载剂使药物组合物能调配成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液及其类似物，用于由待治疗的 患者口服、经直肠或经鼻摄取。在一些非限制性实施例中，调配物包含被调配成用于肠 胃递送的胶囊或片剂，例如肠溶包衣胶囊或丸剂。
在某些非限制性实施例中，适用于本公开的药物组合物包括含有有效实现预期目的 的量的活性成分的组合物。量将根据个体不同而变化，且将取决于多种因素，包括患者的整体身体条件，例如癌症复发的严重程度和程度、癌细胞生长和/或肿瘤生长。
在某些非限制性实施例中，可给药本公开的组合物以用于预防性和/或治疗性治疗。 举例来说，在替代性非限制性实施例中，本公开的药物组合物以足以治疗、预防和/或改 善癌症复发的量给药，例如治疗、预防和/或改善癌细胞生长和/或癌细胞存在和/或肿瘤 生长和/或肿瘤存在和/或肿瘤体积。医学领域中众所周知，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括疾病或病况的阶段、疾病或病况的严重程度、患者大小(patient's size)、体表面积、年龄、待给药的特定化合物、性别、给药的时间和途径、一般健康状况和与 同时给药的其它药物的相互作用。
因此，在某些非限制性实施例中，可单独，或与用于治疗或预防癌症复发或其症状的一或多种其它药物、核苷酸序列、生活方式改变等组合，或呈与赋形剂或其它药学上 可接受的载剂混合的药物组合物形式，向患者给药治疗性细菌。
调配物的一次或多次给药可取决于患者所需和所耐受的剂量和频率来给定。在某些 非限制性实施例中，调配物应提供足以有效治疗、预防或改善如本文中所描述的癌症复发或其症状或并发症的量的活性剂。
5.5治疗方法
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种降低个体的癌症复发风险和/或降低屎肠 球菌毒素的量和/或抑制屎肠球菌的增殖和/或生长的方法，包含向需要这种治疗的个体 给药有效量的本文中所描述的组合物，例如重组细胞和/或包含一或多种治疗性细菌的组 合物，例如咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、 玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化 默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。
需要这种治疗或组合物的个体包括已癌症复发的个体和/或已测定具有更高的癌症 复发风险的癌症患者，如本文中所描述。
具有更高的癌症复发风险的个体包括已接受造血干细胞移植(HSCT)(例如异源或自身的HSCT)、骨髓移植和/或脐带血或脊髓干细胞移植的个体。在某些非限制性实施 例中，移植为T细胞添加的移植。在某些非限制性实施例中，移植为T细胞消耗的移植。
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种用于降低癌症复发风险和/或改进从癌症 复发存活的可能性的方法，包含向需要这种治疗的个体给药有效量的本文中所描述的组 合物或治疗性细菌，例如咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、 黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡 粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集 群。
在某些非限制性实施例中，本文中所描述的组合物或治疗性细菌的有效量为减少个 体的屎肠球菌毒素量和/或抑制屎肠球菌的增殖和/或生长的量。
增加从癌症复发存活的可能性是指降低癌细胞生长、和/或癌细胞增殖、和/或肿瘤 生长、和/或肿瘤体积、和/或肿瘤存在、和/或可检测量的微小残留病。癌症复发的严重程度减弱或从癌症复发存活的可能性增加，可产生癌症的症状或体征的改善，所述症状 或体征例如但不限于体重减轻、发热、疲乏和/或疼痛。
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种降低个体的癌症复发风险、和/或增加从 癌症复发存活的机会、和/或降低屎肠球菌毒素的量、和/或抑制屎肠球菌的增殖和/或生 长的方法，包含向需要这种治疗的个体给药有效量的益生菌。在某些非限制性实施例中， 益生菌包含咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、 玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化 默多克菌或短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。在某些非限 制性实施例中，益生菌包含再引入到个体中的内源性菌群(例如自身的粪便微生物群移 植)。
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种降低个体的癌症复发风险、和/或增加从 癌症复发存活的机会、和/或降低屎肠球菌毒素的量、和/或抑制屎肠球菌的增殖和/或生 长的方法，包含向需要这种治疗的个体给药有效量的益生元。在某些非限制性实施例中， 益生元促进个体中的以下细菌的生长、增殖和/或存活：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪 厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德 菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前 述细菌中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，疗法包含向个体给药益生元，其中益生元包含一或多个 药剂，例如增加以下细菌的生长和存活的营养补充物：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪 厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德 菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前 述细菌中的任何一或多个的集群。在某些非限制性实施例中，益生元包含不充分吸收的 复合碳水化合物、寡糖、菊糖类果聚糖或阿拉伯糖基木聚糖中的一或多个。
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种降低个体的癌症复发风险、和/或增加从 癌症复发存活的机会、和/或降低屎肠球菌毒素的量、和/或抑制屎肠球菌的增殖和/或生 长的方法，包含向需要这种治疗的个体给药有效量的益生素。在某些非限制性实施例中， 益生素包含由以下细菌表达的一或多个药剂(如蛋白质)：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、 人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈 尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包 含前述细菌中的任何一或多个的集群。在某些非限制性实施例中，益生素包含细菌代谢 物，例如促进抗炎效果的代谢物。在某些非限制性实施例中，益生素包含来自以下细菌 培养物的介质：咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、 拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球 菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖 消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。在某些 非限制性实施例中，益生素包含短链脂肪酸，如丁酸或类似酸；或二级胆汁酸。
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种降低个体的癌症复发风险、和/或增加从 癌症复发存活的机会、和/或降低屎肠球菌毒素的量、和/或抑制屎肠球菌的增殖和/或生 长的方法，包含向需要这种治疗的个体给药有效量的抗生素。在某些实施例中，，抗生素对屎肠球菌具有选择性。在某些非限制性实施例中，抗生素并不靶向以下细菌：咽峡 炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫 弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、 产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优 真杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群。举例来说，在某些非限制性 实施例中，本发明的方法包括与以下细菌的重组细胞一起向个体给药抗生素：咽峡炎链 球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲 菌、两形真杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产 酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真 杆菌、其组合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群；其中重组细胞表达抗生素抗性 基因使得细胞对与重组细胞一起给药的抗生素具有抗性。在某些非限制性实施例中，抗 生素包含青霉素、万古霉素和/或利奈唑胺抗生素。
在某些非限制性实施例中，本发明提供一种降低个体的癌症复发风险、和/或增加从 癌症复发的存活机会、和/或降低屎肠球菌毒素的量、和/或抑制屎肠球菌的增殖和/或生 长的方法，包含向需要这种治疗的个体给药有效量的癌症疗法，所述癌症疗法例如去除癌性细胞或组织的手术、放疗、化疗、免疫疗法(例如但不限于针对于CTLA-4、PD-1、 CD52和/或CD20的抗体；以及如干扰素和白介素的细胞因子)、干细胞疗法和/或细胞 疗法(例如但不限于CAR修饰的T细胞和其它抗原特异性T细胞)。
在某些非限制性实施例中，这类方法包含测定存在于诊断患有癌症的个体的肠微生 物群样本中的额外一个细菌的丰度，所述细菌例如咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、人粪厌氧 球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈尔德菌、 马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌或短优真杆菌、其组合或包含前述细 菌中的任何一或多个的集群；其中当个体的微生物群的一或多个细菌的丰度或量低于细 菌参考水平时，个体诊断或鉴定为具有更高的癌症复发风险。在一些非限制性实施例中， 细菌参考水平为存在于肠微生物群中的细菌的丰度，所述细菌例如咽峡炎链球菌、微小 微单胞菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真 杆菌、人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、 大芬戈尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组 合或包含前述细菌中的任何一或多个的集群；低于所述水平指示具有更高的癌症复发风 险，如由所属领域中的医学医生或技术人员所测定。
在某些非限制性实施例中，这类方法包含测定存在于诊断患有癌症的个体的肠微生 物群样本中的屎肠球菌细菌的丰度，其中当个体的微生物群中的细菌的丰度或量大于细 菌参考水平时，个体诊断或鉴定为具有更高的癌症复发风险。在一些非限制性实施例中， 细菌参考水平为存在于肠微生物群中的细菌(例如屎肠球菌)的丰度，高于所述水平指示具有更高的癌症复发风险，如由所属领域中的医学医生或技术人员所测定。
在某些非限制性实施例中，测定为具有更高的癌症复发风险的个体可对于治疗之后 的复发更频繁地监测和/或监测延长时间段，且可给药除造血干细胞移植以外或作为其替 代例的治疗性方案，例如但不限于去除癌性细胞或组织的手术、放疗、化疗、免疫疗法(例如但不限于针对于CTLA-4、PD-1、CD52和/或CD20的抗体；以及如干扰素和白介 素的细胞因子)、干细胞疗法和/或细胞疗法(例如但不限于CAR修饰的T细胞和其它 抗原特异性T细胞)。
5.6试剂盒
本发明所公开的主题提供用于诊断个体具有更高或降低的癌症复发风险的试剂盒， 其中试剂盒包含用于检测以下细菌的存在的一或多个药剂：咽峡炎链球菌、微小微单胞 菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、 人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈 尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包 含前述细菌中的任何一或多个的集群。在某些非限制性实施例中，药剂包含对所述细菌 具有特异性的核酸引物。在某些非限制性实施例中，核酸引物对16S rRNA测序具有特 异性。
本发明所公开的主题提供用于治疗具有更高的癌症复发风险的个体或患有癌症复 发的的试剂盒。在某些非限制性实施例中，试剂盒包含本文中所描述的一或多个治疗性组合物或细胞，例如选自由以下组成的群组的治疗性细菌：咽峡炎链球菌、微小微单胞 菌、肠氨基酸球菌、淤泥真杆菌、人粪梭菌、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌、两形真杆菌、 人粪厌氧球菌、非乳解假支杆菌、黑色消化球菌、玫瑰色装甲菌、产酸糖酵菌、大芬戈 尔德菌、马赛乐维拉菌、巴恩斯鸡粪菌、非糖消化默多克菌、短优真杆菌、其组合或包 含前述细菌中的任何一或多个的集群。
在某些非限制性实施例中，试剂盒包含给药治疗性组合物或细胞的说明书。说明书 可包含关于使用组合物或细胞以降低癌症复发风险或增加从癌症复发存活的可能性的信息。在某些非限制性实施例中，说明书包含以下中的至少一个：治疗性组合物或细胞 的描述、剂量方案和给药、注意事项、警告、指示、计数指示、过剂量信息、不良反应、 动物药理学、临床研究和/或参考。说明书可直接印刷在包含细胞的容器(当存在时)上， 或作为施加于容器的标记、或作为在容器中提供或随着容器提供的独立书页、手册、卡 片或文件夹。
6.实例
参考以下实例将较佳地理解本发明所公开的主题，所述实例作为本发明的例示性提 供但不作为限制。实例1-3描述与降低癌症患者的重叠群体的癌症复发风险相关联的肠菌群的鉴定。
实施例1：某些肠菌群与癌症患者的癌症复发风险相关联
方法
在当前的实例中，应用生物标记探究方法，且进行接受未经修饰的(T细胞添加)同种异体移植的160个成人的回顾性观测分析。患者预期性地参与粪便生物样品采集方案。对于此分析，我们选择在allo-HSCT后首个3周期间已提供至少一个样品的患者。 这个同期群的主要疾病为AML(37％)、非霍奇金淋巴瘤(33％)、ALL(8％)、MDS(7％)、 CLL(6％)、霍奇金氏淋巴瘤(6％)、CML(2％)和骨髓增生肿瘤(2％)。患者的平均 年龄为52岁(范围21-75)。其用消融(17％)、降低强度(64％)和非清髓性(19％) 方案调节。其接受来自脐带血(46％)、无关成人(33％)或相关成人(22％)的移植物。 在成人移植物中，92％来自外周血液，且8％来自骨髓。这个患者群组为“患者菌群同期 群”。
亦分析309个成人患者的第二群组。表1描述这个同期群的主要疾病、以及所接受的同种异体移植类型和调节方案。
表1：309个成人患者群体的癌症和处理情况
Figure BDA0003263576410000311
通过如先前描述的16S rRNA深度测序的qPCR产生对各大便样本中的细菌物种的普查(Jenq等人《生物学骨髓移植》(Biol Bone Marrow Transplant)21:1373-1383 2015)。简言之，对于各大便样品，使用苯酚-氯仿提取技术通过机械破坏(珠击打)基于先前描 述的方案来纯化DNA。使用454 GS FLX Titanium平台(454《生命科学》(Life Sciences)， 康涅狄格州布兰福德)分析来自患者菌群同期群的样本，以对细菌16S rRNA基因的 V1-V3区进行测序。
使用mothur 1.34版对序列数据进行编译和处理，筛选和过滤品质，且接着使用Greengenes参考数据库的改进形式分类到物种水平上。使用具有97％相似性的操作分类单位的逆Simpson指数和Shannon多样性指数定量微生物多样性。进行分类丰度比较， 以使用线性判别分析效应大小分析，使用如由开发人员的初始文章中所描述的2.0的对 数线性判别分析截止值，鉴定在异源造血干细胞移植之后的癌症复发的生物标记。
细菌丰度随着时间推移的曲线下面积用作各患者累积暴露于各细菌分类单元的测 量。使用效应大小的线性判别分析(LEfSe；例如Segata等人《基因组生物学》(GenomeBiology),2011)，评价以频率>1％存在的各患者的细菌分类群与在allo-HSCT后第一年 内疾病的复发或进展结果的相关性。
结果
通过Cox单变量回归定量细菌与复发风险的相关性。在分类中，与复发风险相关联的最显著地为人类口腔菌群的成员，包括咽峡炎链球菌、微小微单胞菌、淤泥真杆菌和 放线菌(Actinomyces)(图2)。在通过中值丰度使患者分层之后，我们发现，具有较高 丰度的这种细菌的那些患者在移植之后复发较低(p＝0.0014)。具有较高丰度的微小微 单胞菌的患者在移植之后复发也较低(图2、图4A、图4B和图7)。微小微单胞菌为革 兰氏阳性厌氧性球菌，“消化链球菌”，通常见于牙斑中的口腔物种，且可刺激巨噬细 胞产生TNF-α、IL-6和IL8，和刺激NF-kB上游的NOD2受体(Marchesan,《分子口腔 微生物学》(Molecular OralMicrobiology)2015年第31卷,第3期,2016年6月,第 243-258页)。微小微单胞菌也产生Fc结合蛋白。微小微单胞菌与接受T细胞添加、非 脊髓移植物(图5和图7)和在清髓性调节(图6)之后的患者的缺乏复发具有最佳的 相关性。另外，分别具有较高丰度的肠氨基酸球菌和咽峡炎链球菌的患者(图7)也具 有较低的复发比率。我们还鉴定了与增加的复发风险相关联的细菌，如屎肠球菌(p＝ 0.0103)(图2和图7)。此外，某些细菌与降低的GVHD相关死亡风险相关联，例如嗜 粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)和考拉杆菌(Phascolarctobacterium)；与 增加的GVHD相关死亡风险相关联，例如两形真杆菌和弱长单胞菌(Dysgonomonas)， 如通过Cox单变量回归所测定(图8)。
将这些细菌评估为调整与这个同期群中的复发相关联的以下三个因素的多变量Cox 模型中的生物标记：细化疾病风险指数(Refined Disease Risk Index，RDRI或DRI，Armand 等人《血液》(Blood)2014年6月5日；123(23):3664-71)、调节强度和移植源(脐带血与成人供体)；且图3展示，细菌丰度预测在进行这些调整后的复发。
咽峡炎链球菌预测在调整所有三个因素的多变量模型中复发(HR 0.39，95％CI0.16-0.96，p＝0.041)。屎肠球菌预测在调整RDRI和调节强度的模型中复发，但在另外 调整移植源的模型中不复发。
申请人先前报告，低细菌多样性与在allo-HSCT后减少的总体存活相关联(Taur等人,《血液》2014年8月14日；124(7):1174-82)。如上文所描述，在来自309个患者的 大便样本通过16S基因测序进行的组合物分析之后，使用相反Simpson多样性指数(p> 0.1)来定量细菌多样性。出人意料地，在本研究中，申请人并为发现细菌多样性与癌症 复发之间的相关性。(图1)。
因此，这个回顾性分析的结果已鉴定出allo-HSCT后的复发与肠菌群中的某些细菌 物种或OTU的丰度之间的相关性。因此，这些数据证明，这类物种或OTU的检测可用 于评价已用HSCT进行癌症治疗的患者是否具有增加的癌症复发风险。
实例2：癌症患者的肠菌群中的肠氨基酸球菌丰度与降低的癌症复发风险相关联
方法
在三个周内采集接受异源造血干细胞移植(allo-HSCT)的613个成人癌症患者的2,391个每周粪便样本，且如实例1所描述进行分析以测定存在于样本中的细菌水平。 在此实例中，对细菌16S rRNA基因的V4-V5区进行测序。从allo-HSCT后第0-21天采 集样本。将147个患者排除在研究之外，使得分析最终466个患者的同期群。466个患 者同期群的特征提供于表2中。同期群在allo-HSCT后36个月内呈现26％的癌症复发 率(图9)。
表2：466个成人患者群体的癌症和治疗情况
Figure BDA0003263576410000331
结果
来自这些实验的数据进一步支持尽管肠菌群多样性预测在allo-HSCT之后的总体存 活，但其并不预测复发的探究。细菌丰度随着时间推移的曲线下面积用作各患者累积暴露于各细菌分类单元的测量。在所有样本中鉴定出2,018个操作分类单元(OTU)。仅考 虑在10％患者中以>0.01％丰度存在的OUT(图10)。将患者具有相等分布的复发事件的 分成探究和验证组(n＝232和n＝234)。使用Cox回归模型，评价194个OTU的丰度-AUC 在探究组中与复发的相关性(图11)。在探究组中系统地选择3.4×10-5的截止阈值，以 使p值降到最低(Camp，《临床癌症研究》2004)，接着将其应用于验证组。这个截止值 产生约85％低丰度细菌(其与复发相关)和15％高丰度(其与复发的缺乏相关)。肠氨 基酸球菌丰度在探究和验证组两个中鉴定为与较低复发相关联(图12A和图12B)。
在调整与这个同期群的复发相关联的以下三个因素的多变量Cox模型中，肠氨基酸 球菌评估为生物标记：细化疾病风险指数(RDRI，Armand等人《血液》2014)、调节强 度和移植源。肠氨基酸球菌预测调整RDRI的多变量模型的复发(图13)。此外，肠氨 基酸球菌与较低复发的相关性主要与T细胞添加移植(图14A和图14B)相关联。因此， 肠氨基酸球菌的存在可用于选择对于患者的适当治疗。举例来说，在其肠菌群中具有高 水平的肠氨基酸球菌存在的患者在用T细胞添加移植治疗时具有降低的复发风险。因此， 在其肠菌群中具有增加水平的肠氨基酸球菌存在的患者为用T细胞添加移植治疗的候选 项(与其它形式的移植相反，如T细胞消耗的移植)。
此外，各种肠微生物群也与复发和GVHD相关的死亡相关联(图15A和图15B)。 特定来说，肠球菌与GVHD相关的死亡和复发相关联(图16)，氨基酸球菌与GVHD 相关的死亡和复发的缺乏相关联(图16和图17)，布劳特氏菌与复发和GVHD相关的 死亡的缺乏相关联(图16)。
实例3：癌症患者肠菌群中的包括淤泥真杆菌的细菌集群的丰度与降低的疾病进 展和癌症复发风险相关联
方法
采集接受异源造血干细胞移植(allo-HSCT)的541个成人癌症患者的粪便样本，且使用16S核糖体测序进行测序。患者预期性地参与粪便生物样品采集方案。各患者具 有在allo-HSCT后首个21天内采集的所测序样本。541个患者同期群的特征描述于表3 中。在两年分析期间，存在138个复发/POD事件(发病率25.5％)。
包括先前已接受自身干细胞移植的患者。排除患有非恶性适应症的患者和胡哪有不 可通过细化疾病风险指数分类的罕见疾病的患者(Armand等人《血液》2014； 123:3664-71)。所排除患者详述于表4中。调节方案通过清髓强度分类(Bacigalupo等 人《生物血液骨髓移植》(Biol Blood Marrow Transplant)2009；15:1628-33)。
表3：541个成人患者群体的癌症和治疗情况
Figure BDA0003263576410000341
Figure BDA0003263576410000351
表4：参与流。
Figure BDA0003263576410000352
在2009年8月29日采集第一个大便样本。将具有采集直到2015年5月14日的可 评价样本的患者考虑对于此研究。从公共机构临床研究数据库获得临床数据。在2015 年6月与2015年10月之间通过人工审核电子医疗记录来分析初级结果。对于已在两年 追踪内将其护理转移到移植中心外的患者，通过与病患的主治医生电话采访来评定结 果。对于本文中报告的变量没有缺少数据。
在研究期间，877个成人入住移植中心以进行第一allo-HCT。在这些中，562个患者(64.1％)具有在采样周期期间采集的可评价大便微生物群样本，所述采样周期如 allo-HCT后的三个周所限定。移植后样本为本实例的焦点，因为认为在将移植物暴露于 微生物群期间的时段有利于检测与GVT相关联的因素。选择采样周期的持续时间，因 为直到移植后三个周的可获得样本的相对均一性。这些562个患者评定为合格。如详述 于表4中，排除21个患者。因此，分析同期群由541个患者组成。
在无添加剂的情况下将大便样本冷冻存储。从来自541个患者的2,303个大便样本(平均4.3个/患者)提取DNA。在Illumina MiSeq平台上使基因组16S核糖体RNA V4-V5 可变区扩增和测序，如先前描述。(Jenq等人《生物血液骨髓移植》(Biol Blood MarrowTransplant)2015；21:1373-83；Taur等人《血液》2014；124:1174-82)。在2,303个大便 样本中，在紧接在allo-HCT后的三周采样周期期间采集1,186个样本，且在采样周期前 或后的周的期间(“侧翼”周期)采集另外648个样本。来自这些1,834个样本(平均 3.4个/患者)的序列数据用于计算时间加权平均细菌丰度(图18A和图18B)。在各时 段期间采集的样本数量详述于表5中。
表5：各时段中采集的样品数量
Figure BDA0003263576410000361
将具有>97％一致性的品质过滤的序列分到相对NCBI 16S核糖体RNA序列数据库分类到物种水平(Release版，2015年12月4日)的OTU(参见Edgar《自然方法》(NatureMethods)2013；10:996-8)。(参见Tatusova等人《关于原核基因组处理和工具(AboutProkaryotic Genome Processing and Tools)》.《NCBI手册》(NCBI Handbook)[Internet]. 第2版：美国国家生物技术信息中心(美国)；2014)。使用梯形方法(图18A)，使用 类似于先前描述的那些的度量值计算各患者的时间加权平均OTU丰度(
Figure BDA0003263576410000362
等人《妇科肿瘤学》(Gynecol Oncol)2005；97:529-34；Oudard等人《临床肿瘤学》(J Clin Oncol)2004；22:9579)。对于420个(77.6％)患者，至少一个额外样本是从采样周期前和/或后 的周获得(即，647个侧翼样本)。对于这些患者，侧翼样本用于将丰度载体内插到采样 周期边界(图18B)。在单个样本的移植前分析中，当每患者可获得多于一个样本时， 将最接近于-10天采集的样本选用于分析。在整个研究期间，丰度是指在移植采样周期 后三周内的对数转换的时间加权平均值，除单个移植前样本分析中所指示的以外。将存 在或不存在微生物群特征分析为二进制变量，其中任何丰度的截止值>0。
构筑系统发生树以导出相关OTU的集群(crOTU)。使用Quantitiative InsightsInto Microbial Ecology(QIIME)软件包(参见Caporaso等人《自然方法》2010；7:335-6)中的FastTree算法(参见Price等人《分子生物学与进化》(Mol Biol Evol)2009；26:1641-50) 由成功比对的数据集中的3,952个(总4,100个的96.4％)OTU的序列比对构筑系统发生树。同一门的成员分组在一起，指示树广泛地与标准分类一致。
所得树含有3,951个节点，中的每一个表示相关OTU集群(即，crOTU)。各crOTU 丰度计算为其成员OTU的丰度的总和。这个方法优于标准分类的潜在优点可包括：(1) 改良细菌分类，由于16S rRNA序列相似性可为比表现型性状更佳的进化接近性的测量； 以及(2)比如目、科和属的标准分类水平更细的细菌群组分辨率。
统计分析
研究的初级结果为通过特定疾病标准的疾病的复发或进展(POD)的时间。当流式细胞测量术、放射或分子结果临床上受疗法的起始、供体淋巴细胞的输注或免疫抑制的 撤消影响时，将微小残留病的检测记为复发/POD事件。
allo-HCT后的死亡原因根据一致标准指定。(参见Copelan等人《生物血液骨髓移植》2007；13:1469-76)。在整个研究期间，将标志分析应用于考虑从微生物群采样周期 结束开始的时间对事件；将具有标志天21的结果的患者从所述结果分析排除。使用R 软件进行统计分析。(参见R核心团队、R：《统计计算的语言和环境(A Language and Environmentfor Statistical Computing)》澳大利亚维也纳：统计计算的R基金会；2015)。
将541个患者同期群按移植的中值日期2013年2月13的时间前后暂时分成探究 (n＝271)和验证(n＝270)组。时间验证已视为分割生物标记分析的单一-中心数据集的 最严格的方法。(参见Altman等人《BMJ》2009；338:b605)。在探究组中，存在85个复 发/POD事件(31.3％)，且在验证组中存在63个复发/POD事件(发病率23.3％)。在探 究组中，使用原因特异性Cox成比例危险多变量回归模型，评价满足在>10％的患者中 >0.01％的丰度过滤标准的微生物群特征与复发/POD的相关性。调整多变量模型的 RDRI、调节强度和移植源。原因特异性Cox成比例危险多变量回归模型用于评定微生 物群与结果之间的相关性。
在竞争性风险存在下使用R包“pec”计算原因特异性一致性机率。(参见Wolbers等人《生物统计学》(Biostatistics)(英格兰牛津)2014；15:526-39)。使用竞争性风险方法测定复发/POD、移植相关的死亡和GVHD的累积发病率。考虑用于复发/POD的竞争 性风险为无复发/POD的死亡。移植相关的死亡的竞争性风险为复发。GVHD的竞争性 风险为无GVHD的复发和死亡。检查两年追踪后存活的患者。使用竞争性风险累积发病 率函数绘制时间对事件曲线。除当另外指示时以外，使用原因特异性成比例危险评定统 计显著性。多测试不进行调整。在验证组(顶部crOTU、次最佳crOTU和顶部个别OTU) 中进行三个测试。
结果
凭经验定义的相关细菌组(crOTU)比表示个别物种的操作分类单元(OTU)与临 床结果具有更强的相关性。在多变量模型中，包含大部分淤泥真杆菌的crOTU的存在与 较少复发相关联(HR 0.54，CI 0.38-0.78，p＝0.001)。这种相关性在T细胞添加的同种 异体移植的接受者中最明显。
这些数据指示，crOTU的存在可用于评价接受HSCT的个体的癌症复发风险，其中来自个体的肠微生物群样本中高水平的crOTU 1614和/或1790的存在指示个体具有降低的复发风险。此外，信息可用作用于选择个体的适当HSCT疗法的方法的一部分。举例 来说，淤泥真杆菌或包含淤泥真杆菌的crOTU(例如crOTU 1614)的存在指示，接受 或预期接受HSCT的患者在其接受T细胞添加的同种异体移植时将具有更低的癌症复发 风险。
微生物群特征
根据先前观测，如通过逆Simpson指数评定的肠微生物多样性为与复发/POD的时间相关联(p＝0.16)(参见图19)。(参见Taur等人《血液》2014；124:1174-82)。
为了评定特定细菌子组是否可与复发/POD的时间相关联，定义crOTU以评价与临床结果的相关性。为了通过进化距离将OTU分组，凭经验由在整个同期群中鉴定的所 有OTU的序列比对构筑系统发生树，如上文所描述。分析限于在≥10％患者中超过≥0.01％ 的丰度阈值的分类单元。
探究组中微生物群与复发/POD的时间的相关性
评价208个OTU和1,343个crOTU的探究组中丰度与复发/POD的时间之间的相关性。图21提供具有最低多变量P值的10个crOTU。对于各crOTU，列举最丰富物种以 及区别于邻近crOTU的crOTU的罕见物种。加括号的数字指示所命名物种中与特定 crOTU相关联的OTU的数量。接着，调整多变量模型的RDRI、调节强度和移植源。单 变量(图20A和图20C)或多变量(图20B和图20D)Cox模型中的p≤0.01的规则用 于鉴定与复发/POD的时间相关联的强力候选项。探究组中与复发/POD风险最紧密相关 联的候选项为crOTU 1614(多变量HR0.84，CI 0.73-0.96，p＝0.01)，一种包含大部分 淤泥真杆菌以及其它相关物种的集群(图21)。
因此，在一些非限制性实施例中，评价crOTU 1614的一或多个成员，例如淤泥真杆菌。
验证
评价探究组中所鉴定的顶部候选项crOTU的其与验证组中的结果的相关性的再现性。crOTU 1614的丰度显著地与验证组中的降低的复发/POD风险相关联(HR＝0.82， CI0.71-0.95，p＝0.009，图22C)。这个相关性在多变量调整调节强度、移植源和RDRI 之后仍然显著(HR＝0.82，CI＝0.70-0.96，p＝0.01，图22C)。
根据存在或不存在crOTU 1614将探究和验证组中的患者分层。存在定义为任何可检测的量(即，>0的任何丰度)。在探究(HR＝0.49，CI＝0.30-0.82，p＝0.006)和验 证组(HR＝0.52，CI＝0.31-0.87，p＝0.01)两个中，肠存在crOTU 1614与降低的复发 /POD风险相关联(图23)。在具有和不具有这个细菌群组的患者中的复发/进展的两年 累积发病率分别为33.8％和19.8％。在探究组(HR＝0.46，CI＝0.27-0.78，p＝0.004， 图22B)和验证组(HR＝0.54，CI＝0.31-0.92，p＝0，图22C)两个中，这种相关性在 调整RDRI、移植源和调节强度之后仍然显著。
crOTU 1614的组合物(图24)包括30个OTU(各扩增子包含约250bp)，其中5、 7和1个分别鉴定为淤泥真杆菌、人粪厌氧球菌和非乳解假支杆菌，其所有均为优杆菌 科的成员。另外15个OTU鉴定为黑色消化球菌，一个相关消化球菌科的成员。在整个 同期群中，crOTU 1614的大部分(67％)丰度可归于淤泥真杆菌，其中人粪厌氧球菌和 黑色消化球菌(各15％)的比重较低(图25)。因此，主要由淤泥真杆菌和其它相关细 菌组成的物种集群(即，crOTU成员)与降低的复发/POD风险相关联。
判别能力
将探究和验证组组合以进行进一步探究分析。crOTU 1614在422(78％)/541患者中存在，其中平均丰度为0.16％，最大丰度为8％。当分层为四个丰度库时，在同期群 中观测到逐渐降低的复发/POD风险(p＝0.001，图26A和图26B)，且这种相关性在多 变量调整之后仍然显著(p＝0.004，图22B)。丰度以剂量依赖性方式与较低复发/POD 相关联(图26A)。
如表6中所展示，根据存在或不存在crOTU 1614对患者的临床特征的检查证实在疾病类型、调节强度和移植源中均无显著差异。
表6.基于crOTU 1614的存在的患者的特征
Figure BDA0003263576410000401
在不存在肠crOTU 1614的患者中存在中等数的较高风险RDRI分值(p＝0.02)，且在调整多变量模型中的RDRI时相关性仍然显著(HR＝0.54，CI＝0.38-0.78，p<0.001， 图22A到图22C)。存在crOTU 1614的患者年龄稍微较大(与51.7岁相比，平均54.4 岁，p＝0.04)。在三个RDRI类别中的每一个内评定crOTU 1614与复发/POD风险之间 的相关性。在RDRI高患者(HR＝0.45，CI＝0.25-0.81，p＝0.008)和RDRI-中间患者 (HR＝0.52，CI＝0.33-0.83，p＝0.006)中，肠存在crOTU 1614与较低复发/POD风险 相关联(图27)。然而，在RDRI低患者中不存在相关性(HR＝2.16，CI＝0.28-16.95， p＝0.46)。
为了评价crOTU 1614关于复发/POD的已知临床风险因素的判别能力，使用一致性指数(C指数)，其中值越接近于1指示准确度越高(图28)。(参见Wolbers等人《生 物统计学》2014；15:526-39)。crOTU 1614的判别能力(C指数＝0.572)类似于RDRI的 (C指数＝0.569)。crOTU 1614、RDRI、移植源和调节强度的组合(C指数＝0.650)产生 比单独三个临床因素(C指数＝0.619)中等更强的判别能力。这个程度的预测能力类似 于为在allo-HCT后的其它结果所建立的模型(参见Sorror等人《临床肿瘤学》2014； 32:3249-56)，且指示肠微生物群生物标记可添加到目前已知的复发/POD的临床风险评 定。
移植参数和其它结果
肠存在crOTU 1614与总存活的增加(HR＝0.65，CI＝0.47-0.90，p＝0.008，图29)和降低的复发/POD的累积发病率(图29)相关联。crOTU与急性GVHD(2-4级，HR ＝0.81，CI＝0.56-1.17，p＝0.27)和移植相关的死亡(HR＝1.0，CI＝0.63-1.59，p＝0.99， 图29)均无显著地相关联。鉴于在研究下的群体的异源性，crOTU 1614与根据移植源、 调节强度、HLA匹配程度、RDRI和疾病类型的患者子组中的复发/POD的相关性(图 30)。
相对于疾病类型，crOTU 1614与降低的复发/POD风险的相关性在患有AML(HR＝0.56，CI＝0.32-0.96，p＝0.04)和多发性骨髓瘤(HR＝0.29，CI＝0.12-0.67，p＝0.004) 的患者中显著，且对于其它疾病类型在统计学上不显著。对于移植源(图29和图30)， crOTU1614与降低的复发/POD风险的相关性在T细胞添加移植(HR＝0.40，CI＝ 0.24-0.65，p<0.001)的接受者中，具体地说在未经修饰的PBSC/BM移植的接受者(HR ＝0.40，CI＝0.23-0.69，p＝0.001)中显著。在T细胞消耗的移植的接受者(HR＝0.66， CI＝0.39-1.11，p＝0.12)和脊髓移植的接受者(HR＝0.38，CI＝0.11-1.32，p＝0.13， 图29)中均未观测到显著相关性。
移植前样本
如前述所展示，复发风险的生物标记适用于评定和治疗用HSCT治疗的患者。这类生物标记在移植前提供关于复发风险的信息时具有额外的效用，例如制定作为对于患者使用何种治疗范围的过程的决策的一部分。在未经修饰的PBSC/BM(T细胞添加的)移 植的crOTU 1614的相关性最明显的172个接受者中，143个患者(83％)也具有在干细 胞输注之前三周中采集的样本。基于在allo-HCT前三周期间采集的单一大便样本中的 crOTU 1614丰度，将这些患者分层为四个库。如果多于一个样本是从allo-HCT前三周 获得，那么选择最接近于第-10天采集的样本用于分析。最高丰度库中的患者与合并的 三个较低丰度组相比具有更低的复发/POD风险(HR＝0.28，CI＝0.10-0.80，p＝0.02， 图32)。移植前样本中降低的复发/POD风险与crOTU 1614之间的类似但较低的统计学 上显著相关性，也在所有移植源类型的具有移植前可获得样本的469个接受者中观测到 (图33，HR＝0.63，CI＝0.40-1.09，p＝0.06)。因此，在allo-HCT之前或之后，肠存在 crOTU 1614或crOTU 1614生物体的子组可用作移植后复发/POD风险的生物标记。图 34展示在整个研究期间使用的丰度库的分类边界，如由图26B、图32和图33所描绘。
讨论
在这个回顾性观测的单一中心研究中，研究对于此分析类型组装的迄今为止最大的allo-HCT患者同期群的肠微生物群组合物。探究-验证方法用于鉴定特定肠细菌子组的丰度与allo-HCT后降低风险复发/POD之间的相关性(图23)。
这个生物标记与降低的复发/POD风险的相关性在含有T细胞和其它成熟淋巴细胞的移植物的接受者中最强(图30)。在这些患者中，相比于T细胞消耗的移植物的接受 者，可能有更高的供体细胞介导的GVT活性作用，这表明肠微生物群的组合物可调节 GVT活性。
与GVT活性相关联的肠细菌群组组要由淤泥真杆菌组成，一种厌氧性非孢子形成革兰氏阳性杆菌，人类肠微生物群的常见成员。(参见Rajilic-Stojanovic等人《欧洲微生物学会联合会微生物学评论》(FEMS Microbiol Rev)2014；38:996-1047)。
此外，考虑随着丰度的时间加权平均值的累积微生物暴露允许更多的样本所/包括的 患者，以潜在地减小通过仅单一时间点取样而可能出现的偏差。此外，经验导出的crOTU 组合进化相关的OTU的丰度，如通过16S序列相似性所测定。(表5)。传统OTU水平 的分析的一个限制是单一物种的相关强度有时分布在多个OTU中。另一方面，在如属 或科的较高分类水平的分析中，在数十或数百的OTU分组在一起时潜在相关性可能丢 失。在此实例中鉴定的crOTU含有大部分优杆菌科的成员(图24)，其中其它科的比重 较小，但其并不包括存在于数据集中的优杆菌科的15个其它物种中的任一种。实际上， 当将OTU分组为标准分类分级时，作为整体的真杆菌属和优杆菌科与复发/POD均不具 有显著相关性。值得注意的是，表示淤泥真杆菌的主要OTU与较低的复发风险相关联。 这说明将OTU分组为凭经验导出的系统发生组在微生物群与临床结果之间的相关性研 究中的效用。此外，这些数据展示，16S rRNA序列相似性可为比表现型性状更佳的进 化接近性测量。
实例4：在动物模型中通过给药包含治疗性细菌的组合物而降低癌症复发的方法
通过实例1-3描述肠微生物群的某些成员与异源造血细胞移植(例如当T细胞存在于移植物中时)后的降低的复发风险之间的相关性。本实例描述一种测定肠菌群中的所 述细菌可加强移植相对于肿瘤(GVT)和移植相对于白血病(GVL)活性的方法。在这 类模型中，GVT或GVL也将通过抗生素和通过将所述细菌再引入到肠微生物群中而强 化，所述细菌例如淤泥真杆菌和/或微小微单胞菌。
方法
1.抗生素治疗对于小鼠模型中的GVT活性的效果
在一个GVT模型中，在将荧光素酶表达肿瘤细胞和具有或不具有T细胞的T细胞 消耗的错配骨髓(BM)注射到小鼠中之后，可通过生物发光成像连续监测肿瘤负荷。 将小鼠B细胞淋巴瘤A20和含有荧光素酶表达构筑体的小鼠T细胞淋巴瘤EL4的的衍 生物静脉内以限制性连续稀释液注射到小鼠中，以定义在2-4周中使50％的动物致死的 剂量。接着，用这个浓度的细胞与具有或不具有T细胞的T细胞消耗的错配骨髓(BM) 一起注射小鼠，且接着用抗生素根据两个不同方案中的一个(广谱肠净化或限定谱的) 处理。在用抗生素处理之后，通过活体内生物发光成像、存活分析和通过组织学分析 GVT。将以两个不同方式操纵小鼠的肠菌群。第一个是用口服万古霉素和氨苄西林 (ampicillin)来肠广谱净化。第二个是通过使用具有限定谱的药物更改菌群的组成。由 于淤泥真杆菌和微小微单胞菌两个均为厌氧菌，所以将氨曲南(aztreonam)的效果(其 不含厌氧性活性)与亚胺培南(imipenem)(其具有强效厌氧性活性)相比。
因此，本实验将测定淤泥真杆菌和微小微单胞菌的存在是否能降低存在于GVT小鼠模型中的肿瘤。
2.肠淤泥真杆菌和微小微单胞菌对于GVT活性的效果
标准实验模型的一个缺点是肿瘤细胞系的临床相关性受到患者中其与GVT反应之间的关键差异的限制。作为替代例，研发混合系白血病(MLL)相关的急性骨髓性白血 病(AML)的移植相对于白血病(GVL)的实验模型。涉及MLL基因的重组尤其与移 植研究相关，因为其在疗法相关的AML中为高度普遍的，具有较差的临床预后，且为 异源移植的指示。(DiMartino等人《血液学英国期刊》(British Journal of Haematology) 106,614-626(1999))。在用肠去污抗生素处理之后，通过用反转录转染再现常见MLL 移位的MLL-AF9融合构筑体的GFP表达骨髓细胞注射小鼠(Stubbs等人《白血病》 (Leukemia)22,66-77(2007)；以及Krivtsov等人《自然》(Nature)442,818-822(2006))， 随后错配移植具有或不具有T细胞的T细胞消耗的BM，来诱导AML。这个高风险继 发性白血病模型利用具有限定遗传缺陷的新鲜产生的白血病，且比在活体外传代肿瘤细 胞系更紧密地反映临床疾病。肿瘤进展将通过移植结果和指示外周血液、脾和骨髓中的 白血病的GFP荧光来监测。
接下来，C57BL/6小鼠携带细胞系衍生的淋巴瘤(用于GVT分析)或MLL-AF9诱 导的AML(用于GVL分析)将用口服万古霉素和氨苄西林处理，接着通过经口管饲细 菌来定殖且稍后移植MHC不同的B10.BR骨髓和T细胞。首先使用可商购的淤泥真杆 菌和微小微单胞菌菌株。将在小鼠中评价的结果包括通过荧光素酶表达肿瘤的生物发光 或GFP表达白血病的流式细胞测量术的肿瘤负荷、存活和第14和21天的组织组织学。
因此，本实验将测定淤泥真杆菌和微小微单胞菌的存在是否可降低GVT和GVL小鼠模型中的肿瘤存在。
在本实例的所有前述小鼠研究中，实验将包括10只小鼠/组，且将重复至少两次。卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)方法将用于评估小鼠移植研究中的总存活，且基于排列 的logrank测定将比较处理组中的存活。对于各实验，总共10只小鼠/组将提供检测5 的比值参数的80％能力。
***
虽然已详细地描述了本发明所公开的主题和其优点，但是应理解，可以在不脱离如 所附权利要求书所界定的本发明的精神和范围的情况下对本发明做出多种改变、替代和 更改。此外，本申请的范围并不意欲限于本说明书中描述的过程、机器、产品、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施例。所有技术特征均可以这类特征的所有可能组合形 式单独组合。如所属领域的普通技术人员将容易地从本公开理解，可根据本发明所公开 的主题使用本发明所公开的主题、过程、机器、产品、物质组成、手段、方法或步骤、 当前存在或稍后待研发的执行与对应本文所描述实施例基本上相同的功能或实现基本 上与其相同的功能结果。因此，所附权利要求书意欲在其范围内包括这类过程、机器、 产品、物质组成、手段、方法或步骤。
在本文中列举的专利、专利申请公开案产品描述和方案，出于所有目的，其公开内容以其全文引用的方式并入本文中。
序列表
<110> 纪念斯隆-凯特琳癌症中心
<120> 用于检测癌症复发风险的方法和组合物
<130> 072734.0414
<150> 62/214,604
<151> 2015-09-04
<150> 62/265,327
<151> 2015-12-09
<150> 62/298,258
<151> 2016-02-22
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1484
<212> DNA
<213> 淤泥真杆菌
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggtatgc ttaacacatg caagtcgaac 60
gagaaggttt tgatggatcc ttcgggtgac attagaactg gaaagtggcg aacgggtgag 120
taacgcgtgg gtaacctgcc ctatggaaag gaatagcctc gggaaactgg gagtaaagcc 180
ttatattatg gttttgtcgc atggcaagat catgaaaact ccggtgccat aggatggacc 240
cgcgtcccat tagctagttg gtgagataac agcccaccaa ggcgacgatg ggtaaccggt 300
ctgagagggc gaacggtcac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag 360
cagtggggaa tattgcgcaa tgggggcaac cctgacgcag caataccgcg tgagtgaaga 420
aggttttcgg atcgtaaagc tctgttattg gggaagaaga atgacggtac ccaatgagga 480
agtcccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggggacaag cgttgtccgg 540
aatgactggg cgtaaagggc gcgtaggcgg tctattaagt ctgatgtgaa aggtaccggc 600
tcaaccggtg aagtgcattg gaaactggta gacttgagta ttggagaggc aagtggaatt 660
cctagtgtag cggtgaaatg cgtagatatt aggaggaaca ccagtggcga aggcggcttg 720
ctggacaaat actgacgctg aggtgcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct 780
ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttgggg aaactcagtg ccgcagttaa 840
cacaataagc attccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg 900
gggacccgca caagcagcgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
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aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaacccc tgcctttagt tgccagcatt aagttgggca ctctagaggg actgccgtag 1140
acaatacgga ggaaggtggg gacgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggtctg aacagagggc cgcgaagccg cgaggtgaag caaatccctt 1260
aaaacagatc ccagttcgga ttgcaggctg caactcgcct gcatgaagtt ggagttgcta 1320
gtaatcgcgg atcagaatgc cgcggtgaat gcgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccacga gagttggcaa cacccgaagc ctgtgagaga accgcaagga ctcagcagtc 1440
gaaggtgggg ctagtaattg gggtgaagtc gtaacaaggt aacc 1484
<210> 2
<211> 1393
<212> DNA
<213> 黑色消化球菌
<400> 2
gcctaataca tgcaagtcga acggacgagg aaagagacct cttcggagtg acctttcccg 60
agttagtggc ggatgggtga gtaacgcgtg agtgacctgc ccagcagtgg ggaataacag 120
tgagaaatca ttgctaatac cgcatatctt acaagtgctt catggtacct gtaagaaaga 180
cggccttcgt gctgtcgctg ttggatggac tcgcgtctga ttagccagtt ggtggggtaa 240
cggcctacca aagcaatgat cagtagccgg cctgagaggg tgaacggcca cattgggact 300
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cggctaacta tgtgccagca gccgcggtaa aacatagggg gcaagcgttg tccggaatca 540
ctgggcgtaa agggcgcgca ggcggtctgt taagtcagat gtgaaaggtt agggctcaac 600
cctgaacgtg catctgatac tggcagactt gagtatggaa gaggtaagtg gaattcctag 660
tgtagcggtg aaatgcgtag atattaggag gaacaccagt ggcgaaggcg acttactggg 720
ccataactga cgctgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780
tccacgccgt aaacgatggg tactaggtgt cggaggtttc aagaccgtcg gtgccgcagt 840
taacacaata agtaccccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg 900
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gacgcaacgc gaagaacctt 960
accaagactt gacatcctgc tgccgagtga tgtaatgtca cttttccttc gggacagcag 1020
agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttgtcgt cagttgccat cattaagttg ggcactctga cgagactgcc 1140
gcagacaatg cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgtcttggg 1200
ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaga gggcagcgaa ggagcgatcc ggagccaatc 1260
tcacaaagcc gatcccagtt cggattgcag gctgcaactc gcctgcatga agtcggaatg 1320
cgtagtaatc gcaggtcagc atactgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380
ccgtcacacc acg 1393
<210> 3
<211> 1462
<212> DNA
<213> 人粪厌氧球菌
<400> 3
tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgaa cgagaaactt ataaatgatc cttcgggtga 60
atctataagc ggacagtggc gaacgggtga gtaacgcgta ggtaaccaac ctcatgcagg 120
gggatagccc agggaaactt ggattaaacc cgcataagac cacagcaccg catggtgcag 180
gggtaaaaac tccggtggca tgagacggac ctgcgtctta ttaggtagtt ggtgaggtaa 240
cggctcacca agccaacgat gagtagccga cctgagaggg tgatcggcca cattgggact 300
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcgca atgggggaaa 360
ccctgacgca gcaacgccgc gtgagcgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgtcttt 420
ggggaagata atgacggtac ccaaggagga agctccggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt agggagcaag cgttgtccgg attcactggg cgtaaagagc acgtaggcgg 540
ttaattaagt caggtgtgaa agttttcggc tcaaccggaa aagtgcactt gaaactggat 600
aacttgagta tcggagaggt aagcggaatt cctagtgtag cggtgaaatg cgtagagatt 660
aggaagaaca ccggtggcga aggcggctta ctggacgata actgacgctg aggtgcgaaa 720
gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatacta 780
ggtgttgggg taactcagtg ccgcagttaa cacattaagt attccgcctg gggagtacgc 840
tcgcaagagt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcagcgg agcatgtggt 900
ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcccttgac cgcctaagag 960
attaggcttt ccttcgggac aaggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1020
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgtttagtta ctaacattca 1080
gttgaggact ctagacagac tgcccttgaa agagggagga aggtggggac gacgtcaaat 1140
catcatgccc cttacgacct gggctacaca cgtgctacaa tggtctgtac agagggttgc 1200
gaagcagtga tgctaagcta atctcaaaaa gcagatctca gttcggattg caggctgcaa 1260
ctcgcctgca tgaagtcgga gttgctagta atcgcgaatc agaatgtcgc ggtgaatgcg 1320
ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag ttggtaacac ccgaagccag 1380
tgagctaacc attaggaggc agctgtcgaa ggtgggatca gtaattgggg tgaagtcgta 1440
acaaggtagc cgtatcggaa gg 1462
<210> 4
<211> 1510
<212> DNA
<213> 产酸糖酵菌
<400> 4
ttgatcctgg ctcaggatga acgctggcgg cgtgcctaac acatgcaagt cgagcggaga 60
tgagaagagt acttgtacga atttcatctt agcggcggac gggtgagtaa tgcgtgagga 120
acctgccttt cactggggaa taacatcgag aaatcggtgc taataccgca taaagtcgcg 180
agatcgcatg gttttgcgac caaaggagca atccggtgaa agatggactc acgtccgatt 240
aggtagttgg tgaggtaacg gcccaccaag cctacgatcg gtagccgaac tgagaggttg 300
atcggccaca ttgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 360
attgggcaat gggcgaaagc ctgacccagc aacgccgcgt gaaggaagaa ggtcttcgga 420
ttgtaaactt ctttgatcag ggacgaaaga aatgacggta cctgaagaac aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gatttactgg 540
gtgtaaaggg cgtgtaggcg gttctgcaag tcagatgtga aattcccggg cttaacccgg 600
gcgctgcatc tgaaactgca ggacttgagt actggagagg atagtggaat tcctagtgta 660
gcggtaaaat gcgtagatat taggaggaac accagtggcg aaggcggcta tctggacagt 720
aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgaatact aggtgtaggg ggtatcgact ccccctgtgc cgcagctaac 840
gcaataagta ttccacctgg ggagtacggc cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcagtgga ttatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggacttgaca tcccttgacc ggcatagaga tatgcctttc cttcgggaca aggagagcag 1020
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaaccccta ttgccagttg ccatcattca gttgggaact ctggcgatac tgccgtggac 1140
aacacggagg aaggtgggga cgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgtcc tgggctacac 1200
acgtaataca atggcaacga cagagggcag ctactccgcg aggacaagcg aatccctaaa 1260
cgttgtctca gttcggattg caggctgcaa ctcgcctgca tgaagtcgga attgctagta 1320
atggcaggtc agcatactgc cgtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380
accatgagag tctgcaatac ccgaagtcag tagtctaacc gcaaggggga cgctgccgaa 1440
ggtagggccg ataattgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg 1500
gatcacctcc 1510
<210> 5
<211> 1438
<212> DNA
<213> 玫瑰色装甲菌
<400> 5
gacgaacgct gcggcgtgcc taagaaatgc aagtcgaacg gacagtggct tcggttactg 60
ttagtggcga acggtcgcgt aacacgtaag aaacctgcct cgaagcgggg gacaacagtc 120
cgaaaggact gctaataccg catgtggcca gtcgggggca tccccgattg tctaaagatt 180
tatcacttcg agatggtctt gcggcctatc agctagttgg tggggtaacg gcctaccaag 240
gcgacgacgg gtagctggtc tgagaggacg atcagccgga ttgggactga gatacggccc 300
agactcctac ggggggcagc aattaggaat cttgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc 360
gacgccgcgt gaaggatgaa ggttctcgga tcgtaaactt cttttaagtg ggaagaaatt 420
tgacggtacc acttgaataa gccccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 480
gggggcgagc gttgtccgaa gttactgggc gtaaagcgcg cgtaggcggt ttcttaagtc 540
tggggtgaaa ggttcaacgc tcaacgtgaa cagtgccttg gatactggga gacttgagtt 600
agggagaggg tagtagaatt cctggtgtag cggtgaaatg cgtagatatc aggaggaata 660
ccaatggcga aggcagctac ctggcctata actgacgctg aggtgcgaaa gcgtggggag 720
caaacgggat tagatacccc ggtagtccac gccctaaacg atgagtgcta gatgtaagag 780
gtatcgaccc ctcttgtgtc gtcgctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggcc 840
gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggatt 900
aattcgtcac taaccgaaga accttaccca ggtttgacat cctaggaacc ctgatgaaag 960
ttgggggtgc tcgcaagaga gcctagagac aggtgttgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020
cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct caccgtatgt tggcagcgta 1080
aagtcggcaa ctcttacgga actgcccgtg caagcgggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1140
gtcggcatgg cccttacgcc tggggcttca cacatgctac aatgggtggc aacaaagggc 1200
tgctaaaccg tgaggtcaag caaatcccaa aaatccatcc tcagttcgga ttgtaggctg 1260
caactcgcct acatgaagcc ggaatcgcta gtaaccgcag gtcagctaaa ctgcggtgaa 1320
tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcaagtcacc tgaattgtct gcacccgaag 1380
ccggtggcca aactcgcaag agatggagcc gtctaaggtg tggggagtaa gggggact 1438
<210> 6
<211> 1480
<212> DNA
<213> 非乳解假支杆菌
<400> 6
taagtcaaaa agaacagttt gatcatggct caggacgaac gctggcggta tgcttaacac 60
atgcaagtcg aacgagaagt tttttattga ccttcggggg atataagaga cagacagtgg 120
cgaacgggtg agtaacgcgt gggcaaccta cctatcggag cgggatagcc tcgagaaatc 180
gggagtaaaa ccgcataaca cagcagaatc gcatgacttt gctgtcaaaa ctccggtgcc 240
gatagatggg cccgcgtctg attagctagt tggtaaggta agggcttacc aaggcaacga 300
tcagtagccg gtctgagagg gcgaacggcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc 360
tacgggaggc agcagtgggg aatattgcgc aatgggggca accctgacgc agcaataccg 420
cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttat tggggaagaa gcagtgacgg 480
tacccaatga ggaagtcccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggggac 540
gagcgttgtc cggaatcact gggcgtaaag ggcgcgtagg cggttttata agtcagatgt 600
gaaaggtacc ggctcaaccg gtgacgtgca tttgaaactg taagacttga gtactgaaga 660
ggcaagcgga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagat attaggaaga acaccggtgg 720
cgaaggcggc ttgctgggca gatactgacg ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcgaacag 780
gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaata ctaggtgttg gcgaataagt 840
cagtgccgga gttaacacaa taagtattcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac 900
tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc agcggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 960
gcgaagaacc ttaccaggcc ttgacatcct ctgagcgcaa tagagatatt gctttccctt 1020
cggagacaga gagacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080
taagtcccgc aacgagcgca acccctgtca ttagttgcca tcattgagtt gggcactcta 1140
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tatggcctgg gctacacacg tgctacaatg gtctgaacaa agggaagcga aggagcgatt 1260
cggagcgaat ctcataaaac agatcccagt tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg 1320
aagatggagt tgctagtaat cgcggatcag aatgtcgcgg tgaatgcgtt cccgggtctt 1380
gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtc ggtaacaccc gaagccagtg agacaaccgg 1440
aaggagtcag ctgtcgaagg tgggatcggt aattggggtg 1480
<210> 7
<211> 1483
<212> DNA
<213> 大芬戈尔德菌
<400> 7
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60
gggatttagt agacagaagc ttcggtggaa gattactaat gagagtggcg aacgggtgag 120
taacgcgtga gcaacctgcc tatgacagtg ggatagcctc gggaaaccgg gattaatacc 180
gcataaaatc gtagaaacac atgttttaac ggtcaaagat ttatcggtca tagatgggct 240
cgcgtctgat tagctagttg gtgagataac agcccaccaa ggcgacgatc agtagccggt 300
ctgagaggat gaacggccac attggaactg agacacggtc caaactccta cgggaggcag 360
cagtggggaa tattgcacaa tgggggaaac cctgatgcag cgacgccgcg tgaacgaaga 420
aggtattcgt atcgtaaagt tctgtcctat gggaagataa tgacagtacc atagaagaaa 480
gctccggcta aatacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta tggagcgagc gttgtccgga 540
attattgggc gtaaagggta cgcaggcggt ttaataagtc gaatgttaaa gatcggggct 600
caaccccgta aagcattgga aactgataaa cttgagtagt ggagaggaaa gtggaattcc 660
tagtgtagtg gtgaaatacg tagatattag gaggaatacc agtagcgaag gcgactttct 720
ggacacaaac tgacgctgag gtacgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cgtaaacgat gaatgctagg tgttgggggt caaacctcgg tgccgaagtt 840
aacacattaa gcattccgcc tggggagtac gcacgcaagt gtgaaactca aaggaattga 900
cggggacccg cacaagcagc ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta 960
ccagggcttg acatgtgggt gaaaggtata gagatatacc cctctcttta tgagacatcc 1020
atacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccctatact tagttaccag cgagtaaagt cggggactct aagtagactg 1140
ccgatgacaa atcggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgccct ttatgtcctg 1200
ggctacacac gtgctacaat ggttggtaca gagggaagct atatagtgat ataatgcaaa 1260
actccaaagc caatcccagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggagt 1320
tgctagtaat cgcggatcag aatgtcgcgg tgaatgcgtt cccgggtctt gtacacaccg 1380
cccgtcacac catgggagtt gataataccc gaagcctgtg acctaattga ggagcagtcg 1440
aaggtaggat tgatgactgg ggtgaagtcg taacaaggta acc 1483
<210> 8
<211> 1362
<212> DNA
<213> 非糖消化默多克菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (643)..(643)
<223> n为a、c、g、t
<400> 8
aacgagaatg tactgacgga tccttagggt gaagatagta caggacagtg gcggatgggt 60
gagtaacgcg taagaaacct gcctttcaca ccgggatagc agctggaaac ggctattaat 120
accggatgac actttttccc cgcatgagga agaggttaaa gaatttcggt gaaagatggt 180
cttgcgtctg attagctagt tggtggggta acggcctacc aaggcgacga tcagtagccg 240
gcctgagagg gtgtacggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc 300
agcagtgggg aattttgcac aatggaggaa actctgatgc agcgacgccg cgtgaacgaa 360
gaaggtcttc ggattgtaaa gttctgtcct gggtgaagat aatgacggta actcaggagg 420
aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggggcga gcgttgttcg 480
gaattattgg gcgtaaaggg tacgtaggcg gtttgttaag tttggcgtta aatcacgggg 540
ctcaaccccg ttcagcgttg aaaactggca aacttgagta gtagagggga cagtggaatt 600
cctagtgtag cggtgaaatg cgtagagatt aggaagaata ccngtggcga aggcgactgt 660
ctggatacat actgacgctc aggtacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct 720
ggtagtccac gccctaaacg atgagtgcta ggtgtcgggt gtcaaagctc ggtgccgccg 780
ttaacacatt aagcactccg cctggggagt acgcacgcaa gtgtgaaact caaatgaatt 840
gacggagacc cgcacaagta gcggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct 900
taccagggct tgacataaca gtgacgggtt aagagattaa ccgttccctt cggggacact 960
gctacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1020
aacgagcgca acccttgtcg ttagttgcca gcattgagtt ggggactcta gcgagactgc 1080
cggtgataaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgccctt tatgtcctgg 1140
gctacacacg tgctacaatg gccgaaaaca gcgtgaagca acctcgtgag agcaagcgaa 1200
ccacgaaaag tcggtctcag ttcggactgt aggctgcaac tcgcctacac gaagtcggag 1260
ttactagtaa tcgcgaatca gcatgtcgcg gtgaatgcgt tcccgggtct tgtacacacc 1320
gcccgtcaca ccatggaagt tggtaatacc cgaagccgct ga 1362
<210> 9
<211> 1489
<212> DNA
<213> 马赛乐维拉菌
<400> 9
tagagtttga tcctggctca ggataaacgc tggcggcgtg cgtaacacat gcaagtcgaa 60
cgagaatgtg ctgacggatc cttagggtga agatagcaca ggacagtggc ggatgggtga 120
gtaacgcgta agaaacctgc ctttcacacc gggatagcag ctggaaacgg ctattaatac 180
cggatgacac tttttccccg catgaggaag aggttaaaga atttcggtga aagatggtct 240
tgcgtctgat tagctagttg gtggggtaac ggcctaccaa ggcgacgatc agtagccggc 300
ctgagagggt gtacggccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag 360
cagtggggaa ttttgcacaa tggaggaaac tctgatgcag cgacgccgcg tgaacgaaga 420
aggtcttcgg attgtaaagt tctgtcctgg gtgaagataa tgacggtaac tcaggaggaa 480
gccccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggggcgagc gttgttcgga 540
attattgggc gtaaagggta cgtaggcggt ttgttaagtt tggcgttaaa tcacggggct 600
caaccccgtt cagcgttgaa aactggcaaa cttgagtagt agaggggaca gtggaattcc 660
tagtgtagcg gtgaaatgcg tagagattag gaagaatacc ggtggcgaag gcgactgtct 720
ggatacatac tgacgctcag gtacgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cctaaacgat gagtgctagg tgtcgggtgt caaagcccgg tgccgccgtt 840
aacacattaa gcactccgcc tggggagtac gcacgcaagt gtgaaactca aaggaattga 900
cggggacccg cacaagtagc ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960
ccagggcttg acataacagt gacgggttaa gagattaacc gttcccttcg gggacactgc 1020
tacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttgtcgtt agttgccagc attaagttgg ggactctagc gagactgccg 1140
gtgataaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccttta tgtcctgggc 1200
tacacacgtg ctacaatggc cgaaaacagc gtgaagcaac ctcgtgagag caagcgaacc 1260
acgaaaagtc ggtctcagtt cggactgtag gctgcaactc gcctacacga agtcggagtt 1320
actagtaatc gcgaatcagc atgtcgcggt gaatgcgttc ccgggtcttg tacacaccgc 1380
ccgtcacacc atggaagttg gtaatacccg aagccgctga gcgaacctat gacgcaggcg 1440
tcgaaggtag gatcaatgac tggggtgaag tcgtaacaag gtagccgta 1489
<210> 10
<211> 1357
<212> DNA
<213> 巴恩斯鸡粪菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(55)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (493)..(496)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (888)..(895)
<223> n为a、c、g、t
<400> 10
cgaacgctgg cggcgtgatn aaaacatgca agtcgaacga tcacccttcc atttntctat 60
tcggagagat tgaggagcgg gttaggggag aggggttgaa taacgtgtga gccaccctgt 120
ctaaacaagg ggatagcctc gggactccgg gatttattcc gtatgagacc ccgccttccc 180
atgtagaaga ggttcaaaga ttttatcggt ttaagatggg ctcgcgtctg attagctagt 240
tggtgagata aaagcccacc aagtcaacga tcagtaaccg gcttgagaga gtgaacggtc 300
acattggaca ctgagacacg gtccaaactc ctcagggagg cagcagtggg gaatattgca 360
caatggggga aaccctgatg cagcgacgcc gcgtgagcga tgaaggaatt cgtttcgtaa 420
agctctgtcc taggggaaga taatgacagt acccttggag gaagccccgg ctaaatacgt 480
gcgcagcagc cgnnnnttac gtatggggcg agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg 540
gtacgtaggc ggtttcataa gtcagatgta aaagcgtggg gctcaacccc ataaagcatt 600
tgaaactgtg gaacttgagt agtggagagg aaagtggaat tcctagtgta gcggtgaaat 660
gcgtagatat taggaggaat accagtggcg aaggcgactt tctggacaca aactgacgct 720
gaggtacgaa agcatgggga gcacacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac 780
gatgaatgct aggtgtcggg ggtcaaacct cggtgccgca gttaacacag taagcattcc 840
gcctggggag tacggtggca acactgaaac tcaatggatc aaatgaannn nnnnnggccc 900
gcgcaagcag cggagcatgt ggtttatttc gatgcaacgc gaagaacctt accaggactt 960
gacatataga tgaaagatct agagatagat ccctctcttc ggagacagct atacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcac 1080
cccctatagc tagttaccag cacttcgggt ggggactcta gttagactgc cgatgataaa 1140
tcggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgccctt tatgtcctgg gctacacacg 1200
tgctacaatg gtcggtacag agggcagcga gactgtgaag ttaagcgaat ctcagaaagc 1260
cgaccccagt tcggattgca ggcttgcaac tcgcctgcat gaagtcggag ttggtagtaa 1320
tcgcagatca gaatgctgcg gtgaatgctt gccgctc 1357
<210> 11
<211> 1438
<212> DNA
<213> 短优真杆菌
<400> 11
gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc gagaagtttt gaaaagattc 60
ttcggatgaa atttaaaatg gaaagcggcg gacgggtgag taacgcgtag gcaaccatac 120
aaagggatag catttggaaa cgaatattaa taccttatga aacttaacta gtgcatgcta 180
ggtaggtcaa agatttatcg gtatgggatg ggcctgcgtc tgactgccct tagctagttg 240
gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatc agtagccgac ctgagagggt gaacggccac 300
attggaactg agacacggtc caaactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa 360
tgggggaaac cctgatgcag caacgccgcg tgaacgatga aggcctttgg gtcgtaaagt 420
tctgttctag gtgatgaaaa ctgacagtaa cctaggagaa agccccggct aactccgtgc 480
cagcagccgc ggtaatactg gagggggcaa gcgttatccg gaattattgg gcgtaaaggg 540
tacgtaggtg gccttttaag cgtagggtat aaggcaatgg ctcaaccatt gttcgcccta 600
tgaactggaa ggcttgagtg caggagagga aagcggaatt cctagtgtag cggtggaatg 660
catagatatt aggaggaaca tcagcggcga aggcggcttt ctggactgca actgacactg 720
aggtacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780
atgagcacta ggtgtcgggg tcgtaaggct tcggtgccgt agttaacgca ttaagtgctc 840
cgcctgggga gtacgcacgc aagtgtgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag 900
cagcggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgagaacc ttaccaggac ttgacatcct 960
tctgaccggt ctttaatagg acctttcttt tgacagaaga gacaggtggt gcatggttgt 1020
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcatt 1080
agttgccatc attaagttgg gcactctagt gagactgccg gggacaactc ggaggaaggt 1140
ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgttctgggc tacacacgtg ctacaatggc 1200
tggtacaaag agaagcaaga ccgcaaggtg gagcaaagct caaaaaccag ccccagttcg 1260
gattgtaggc tgaaactcgc ctacatgaag tcggagttgc tagtaatcgc agatcagaat 1320
gctgcggtga atgcgttccc gggtcttgta cacaccgccc gtcacaccat ggaagttggg 1380
ggcgcccaaa gttggcagat aaatatgcta cctaaggtga aaccaatgac tggggtga 1438
<210> 12
<211> 1487
<212> DNA
<213> 微小微单胞菌
<400> 12
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60
gtgatttttg tggaaattct ttcgggaatg gaaatgaaat gaaagtggcg aacgggtgag 120
taacacgtga gcaacctacc ttacacaggg ggatagccgt tggaaacgac gattaatacc 180
gcatgagacc acagaatcgc atgatatagg ggtcaaagat ttatcggtgt aagaagggct 240
cgcgtctgat tagctagttg gaagggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc agtagccggt 300
ctgagaggat gaacggccac attggaactg agacacggtc caaactccta cgggaggcag 360
cagtggggaa tattgcacaa tggggggaac cctgatgcag cgacgccgcg tgagcgaaga 420
aggttttcga atcgtaaagc tctgtcctat gagaagataa tgacggtatc ataggaggaa 480
gccccggcta aatacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta tggggcgagc gttgtccgga 540
attattgggc gtaaagggta cgtaggcggt tttttaagtc aggtgtgaaa gcgtgaggct 600
taacctcatt aagcacttga aactggaaga cttgagtgaa ggagaggaaa gtggaattcc 660
tagtgtagcg gtgaaatgcg tagatattag gaggaatacc ggtggcgaag gcgactttct 720
ggacttttac tgacgctcag gtacgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cgtaaacgat gaatgctagg tgttgggagt caaatctcgg tgccgaagtt 840
aacacattaa gcattccgcc tggggagtac ggtggcaaca ctgaaactca aaggaattga 900
cggggacccg cacaagcagc ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960
ccaaggcttg acatatagtt gagttattga gaaattgata agtccctcgg gacaactata 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttatcttcag ttgccagcac gtagaggtgg gaactctgga gagactgccg 1140
atgacaaatc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccttta tgtcttgggc 1200
tacacacgtg ctacaatggt tggtacaacg agaagcgaga tagagatgtt aagcgaaact 1260
ctaaaaacca atctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggagttg 1320
ctagtaatcg cgaatcagaa tgtcgcggtg aatgcgttcc cgggtcttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca tgggagttgg caatacccga agccgccgat ctaaccgcaa ggaggaaggc 1440
gtcgaaggta gggttaatga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtaacc 1487
<210> 13
<211> 1478
<212> DNA
<213> 咽峡炎链球菌
<400> 13
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtaggac gcacagttta taccgtagct 60
tgctacacca tagactgtga gttgcgaacg ggtgagtaac gcgtaggtaa cctgcctatt 120
agagggggat aactattgga aacgatagct aataccgcat aacagtatgt aacacatgtt 180
agatgcttga aagatgcaat tgcatcgcta gtagatggac ctgcgttgta ttagctagta 240
ggtagggtaa tggcctacct aggcgacgat acatagccga cctgagaggg tgatcggcca 300
cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttcggca 360
atggggggaa ccctgaccga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg gatcgtaaag 420
ctctgttgtt aaggaagaac gagtgtgaga atggaaagtt catactgtga cggtacttaa 480
ccagaaaggg acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt cccgagcgtt 540
gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggttag aaaagtctga agtgaaaggc 600
agtggctcaa ccattgtagg ctttggaaac tgtttaactt gagtgcagaa ggggagagtg 660
gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggag gaacaccggt ggcgaaagcg 720
gctctctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat 780
accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tgggtccttt ccgggactca 840
gtgccgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc 900
aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 960
gaagaacctt accaggtctt gacatcccga tgctatttct agagatagga agtttcttcg 1020
gaacatcggt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattgtt agttgccatc attaagttgg gcactctagc 1140
gagactgccg gtaataaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200
tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggc tggtacaacg agtcgcaagc cggtgacggc 1260
aagctaatct ctgaaagcca gtctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa 1320
gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380
acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaaccgtaa 1440
ggagccagcc gcctaaggtg ggatagatga ttggggtg 1478
<210> 14
<211> 1487
<212> DNA
<213> 两形真杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (120)..(120)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (242)..(242)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (341)..(342)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (579)..(579)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (928)..(929)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (933)..(933)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (968)..(968)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1229)..(1229)
<223> n为a、c、g、t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1385)..(1385)
<223> n为a、c、g、t
<400> 14
caaatggaga gtttgatcct ggctcaggat naacgctggc ggcatgccta atacatgcaa 60
gtcgaacgag aggaaggaaa gcttgctttt ctgaatctag tggcgaacgg gtgagtaacn 120
cgtaggtaac ctgcccatgt gcccgggata acttctggaa acggatgcta aaaccggata 180
ggtagcagac aagcatttga ctgctattaa agtggctaag gccatgaaca tggatggacc 240
tncggtgcat tagctagttg gtgaggtaac ggcccaccaa ggcgacgatg catagccggc 300
ctgagagggc ggacggccac attgggactg agacacggcc nnaactccta cgggaggcag 360
cagtagggaa ttttcgtcaa tggggggaac cctgaacgag caatgccgcg tgagtgagga 420
aggtcttcgg atcgtaaagc tctgttgtaa gagaaaaacg acattcatag ggaatgatga 480
gtgagtgatg gtatcttacc agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 540
acgtaggtgg cgagcgttat ccggaatgat tgggcgtana gggtgcgtag gtggcagaac 600
aagtctggag taaaaggtat gggctcaacc cgtactggct ctggaaactg ttcagctaga 660
gaacagaaga ggacggcgga actccatgtg tagcggtaaa atgcgtagat atatggaaga 720
acaccggtgg cgaaggcggc cgtctggtct gttgctgaca ctgaagcacg aaagcgtggg 780
gagcaaatag gattagatac cctagtagtc cacgccgtaa acgatgagaa ctaggtgttg 840
ggggaataac tcagtgccgc agttaacgca ataagttctc cgcctgggga gtatgcacgc 900
aagtgtgaaa ctcaaaggaa ttgacggnng ccngcacaag cggtggagta tgtggtttaa 960
ttcgaagnaa cgcgaagaac cttaccaggc cttgacatcc cttgcagagr tatagagata 1020
tatccgaggt taacaaggag acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080
gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtgatat gttactaaca ttgagttgag 1140
gactcatatc agactgccgg tgataaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca 1200
tgccccttat ggcctgggct acacacgtnc tacaatggcg tctacaaaga gcggcaagcc 1260
tgtgaaggca agcgaatctc ataaaggacg tctcagttcg gattgaagtc tgcaacccga 1320
cttcatgaag ctggaatcgc tagtaatcgc gaatcagcat gtcgcggtga atacgttctc 1380
gggcnttgta cacaccgccc gtcaaaccat gggagttggt aatgcccgaa gccggtggca 1440
taacctttcg aggagtgagc cgtcgaaggc aggaccgatg actgggg 1487
<210> 15
<211> 1439
<212> DNA
<213> 肠氨基酸球菌
<400> 15
gcggagactt atttcggtaa gttcttagtg gcgaacgggt gagtaacgcg tgggcaacct 60
gccctccagt tggggacaac attccgaaag ggatgctaat accgaatgtg ctccctcctc 120
cgcatggagg agggaggaaa gatggcctct gcttgcaagc tatcgctgga agatgggccc 180
gcgtctgatt agctagttgg tggggtaacg gctcaccaag gcgatgatca gtagccggtc 240
tgagaggatg aacggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 300
agtggggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa 360
ggtcttcgga ttgtaaaact ctgttgttag ggacgaaagc accgtgttcg aacaggtcat 420
ggtgttgacg gtacctaacg aggaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 480
acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gagcatgtag gcgggctttt 540
aagtctgacg tgaaaatgcg gggcttaacc ccgtatggcg ttggatactg gaagtcttga 600
gtgcaggaga ggaaagggga attcccagtg tagcggtgaa atgcgtagat attgggagga 660
acaccagtgg cgaaggcgcc tttctggact gtgtctgacg ctgagatgcg aaagccaggg 720
tagcaaacgg gattagatac cccggtagtc ctggccgtaa acgatggata ctaggtgtag 780
gaggtatcga ccccttctgt gccggagtta acgcaataag tatcccgcct ggggactacg 840
atcgcaagat tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagtatgtgg 900
tttaattcga cgcaacgcga agaaccttac caaggcttga cattgagtga aagacctaga 960
gataggtccc tcccttcggg gacacgaaaa caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020
tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ctatcctatg ttaccagcgc 1080
gtaatggcgg ggactcatag gagactgcca gggataactt ggaggaaggc ggggatgacg 1140
tcaagtcatc atgcccctta tgtcttgggc tacacacgta ctacaatggt cggcaacaaa 1200
gggcagcgaa accgcgaggt ggagcaaatc ccagaaaccc gaccccagtt cggatcgtag 1260
gctgcaaccc gcctacagtg aagttggaat cgctagtaat cgcaggtcag catactgcgg 1320
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgaaagtt ggtaacaccc 1380
gaagccggtg agataacctt ttaggagtca gctgtctaag gtggggccga tgattgggg 1439
<210> 16
<211> 1493
<212> DNA
<213> 人粪梭菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (207)..(207)
<223> n为a、c、g、t
<400> 16
agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60
gaagcacttt accggatttc ttcggaatga aagttttgtg actgagtggc ggacgggtga 120
gtaacgcgtg ggtaacctgc ctcatacagg gggataacag ttagaaatga ctgctaatac 180
cgcataagac cacaggaccg catggtncgg tggtaaaaac tccggtggta tgagatggac 240
ccgcgtctga ttagctagtt ggtaaggtaa cggcttacca aggcgacgat cagtagccga 300
cctgagaggg tgaccggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca 360
gcagtgggga atattgcaca atgggggaaa ccctgatgca gcgacgccgc gtgagcgatg 420
aagtatttcg gtatgtaaag ctctatcagc agggaagaat taggacggta cctgactaag 480
aagcaccggc taaatacgtg ccagcagccg cggtaatacg tatggtgcaa gcgttatccg 540
gatttactgg gtgtaaaggg agcgtagacg gagaggcaag tctgatgtga aaacccgggg 600
ctcaaccccg ggactgcatt ggaaactgtt tttctagagt gtcggagagg taagtggaat 660
tcctagtgta gcggtgaaat gcgtagatat taggaggaac accagtggcg aaggcggctt 720
actggacgat gactgacgtt gaggctcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 780
tggtagtcca cgccgtaaac gatgactgct aggtgtcggg aggcaaagcc tttcggtgcc 840
gcagcaaacg caataagcag tccacctggg gagtacgttc gcaagaatga aactcaaagg 900
aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 960
accttacctg cccttgacat ccggctgacc ggcgagtaat gtcgcctttc cttcgggaca 1020
gccgagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1080
cgcaacgagc gcaaccctta tctttagtag ccagcatttc ggatgggcac tctagagaga 1140
ctgccaggga taacctggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatggg 1200
cagggctaca cacgtgctac aatggcgtaa acaaagggag gcaagcctgc gagggtgagc 1260
aaatcccaaa aataacgtct cagttcggat tgtagtctgc aactcgacta catgaagctg 1320
gaatcgctag taatcgcgaa tcagaatgtc gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac 1380
accgcccgtc acaccatggg agttggtaac gcccgaagtc agtgacccaa ccgtaaggag 1440
ggagctgccg aaggtgggac cgataactgg ggtgaagtcg taacaaggta acc 1493
<210> 17
<211> 1553
<212> DNA
<213> 拉克丝产芽孢降硫弯曲菌
<400> 17
gatcctggct caggacgaac gctggcggcg tgcctaacac atgcaagtcg aacggagaat 60
ttcaataagt ttacttagag aagtttttag tggcggacgg gtgagtaacg cgtgggtaac 120
ctacccataa agccgggaca acccttggaa acgagggcta ataccggata atctttgatg 180
ttggcatcaa ggttaaagga aaggtggcct ctgaagatgc taccgattat ggatggaccc 240
gcgtctgatt agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatca gtagccggcc 300
tgagagggtg aacggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 360
agtggggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gtatgatgaa 420
ggtcttcgga ttgtaaagta ctgtctttgg ggaagaatga ctgatttgaa aatattgagt 480
cagtatgacg gtacccaagg aggaagcccc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 540
acgtaggggg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggattttt 600
aagtctggtg tgaaagatca gggctcaacc ctgagagtgc atcggaaact ggagatcttg 660
aggacaggag aggaaagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga tatgtggagg 720
aacaccagtg gcgaaggcga ctttctggac tgtaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg 780
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgctgta aacgatgagt gctaggtgta 840
gagggtatcg accccttctg tgccgcagtt aacacaataa gcactccgcc tggggagtac 900
ggccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 960
gtttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatccacag aatcctaagg 1020
aaacttggga gtgcccttcg gggagctgtg agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1080
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccctgtgtt tagttgctaa 1140
cgcgtaatgg cgagcactct agacagactg ccggtgataa accggaggaa ggtggggatg 1200
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgtcttg ggctacacac gtgctacaat ggccggtaca 1260
gacggaagcg aagccgcgag gtgaagccaa tccgagaaag ccggtctcag ttcggattgc 1320
aggctgcaac tcgcctgcat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcaggtca gcatactgcg 1380
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgaaagt ctgcaacacc 1440
cgaagccggt gaggtaaccc gaaagggagc tagccgtcga aggtggggcc gatgattggg 1500
gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtatcgga aggtgcggct ggatcacctc ctt 1553

Claims (26)

1.一种药物组合物，包含一或多个经分离细菌或其芽孢，其中所述经分离细菌或其芽孢包含与由SEQ ID NO:1-17中的任一个描述的核酸序列具有约85与100％一致性之间的16S rRNA序列，且进一步包含生物相容的药物载剂。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述经分离细菌或其芽孢包含由SEQ IDNO:1-17中的一或多个描述的16S rRNA序列，或包含与SEQ ID NO:1-17中的一个或多个具有约97％一致性的16S rRNA序列。
3.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述经分离细菌或其芽孢选自由以下组成的群组：咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、微小微单胞菌(Parvimonas micra)、肠氨基酸球菌(Acidaminococcus intestini)、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、人粪梭菌(Clostridium glycyrrhizinilyticum)、拉克丝产芽孢降硫弯曲菌(Desulfosporosinus lacus)、两形真杆菌(Eubacterium biforme)、人粪厌氧球菌(Anaerofustis stercorihominis)、非乳解假支杆菌(Pseudoramibacteralactolyticus)、黑色消化球菌(Peptococcus niger)、玫瑰色装甲菌(Armatimonasrosea)、产酸糖酵菌(Saccharofermentans acetigenes)、大芬戈尔德菌(Finegoldiamagna)、马赛乐维拉菌(Levyella massiliensis)、巴恩斯鸡粪菌(Gallicola barnesae)、非糖消化默多克菌(Murdochiella asaccharolytica)、短优真杆菌(Eubacterium brachy)和包含前述细菌中的任何一个或多个的集群。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述组和物被调配成用于经口、鼻饲或直肠给药，
其中所述组合物任选地包含益生细菌、益生酵母菌或其组合；益生元；益生素；抗生素；或其组合，以及
其中所述组合物任选地为液体、悬浮液、干燥粉末、锭剂、胶囊或食品产品。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述一或多个经分离细菌或其芽孢为重组细菌或其子代，其中所述重组细菌或芽孢任选地包含编码赋予对所述重组细菌或芽孢具有抗生素敏感性或抗性的蛋白质的一或多种外源性核酸。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述一或多个经分离细菌或其芽孢以能降低给药所述组合物的个体的癌症复发的风险的量存在。
7.一种用于降低癌症复发的风险和/或增加从个体的癌症复发存活的可能性的方法，包含向需要这种治疗的个体给药有效量的根据权利要求1到6中任何一项所述的药物组合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述个体已进行造血干细胞移植(HSCT)，其中所述HSCT任选地为异源造血干细胞移植(allo-HSCT)，且其中所述allo-HSCT任选地为T细胞添加的allo-HSCT。
9.根据权利要求7到8中任一项所述的方法，其中所述组合物以对降低所述个体中的屎肠球菌的存在有效的量和/或降低个体中的屎肠球菌毒素的量给药。
10.根据权利要求7到9中任一项所述的方法，进一步包含鉴定具有癌症复发风险的个体，所述方法包含：
从个体获得肠微生物群样本，且测定存在于所述肠微生物群样本中的根据权利要求1到3中任何一项所述的一或多个细菌或其芽孢的水平；
将所述样本中的所述一或多个细菌或其芽孢的水平与参考细菌水平进行比较；以及
当所述样本中的所述一或多个细菌或其芽孢的水平低于细菌参考水平时向个体给药所述组合物。
11.根据权利要求7到9中任一项所述的方法，进一步包含鉴定具有癌症复发风险的个体，所述方法包含：
从个体获得肠微生物群样本，且测定存在于所述肠微生物群样本中的屎肠球菌的水平；
将所述样本中的所述细菌的水平与参考细菌水平进行比较；以及
当所述样本中的所述细菌的水平大于细菌参考水平时向个体给药所述组合物。
12.一种诊断具有癌症复发风险的个体的方法，包含
从个体获得肠微生物群样本，且测定存在于所述肠微生物群样本中的根据权利要求1到3中任何一项所述的一或多个细菌或其芽孢的水平；
将所述样本中的所述一或多个细菌或其芽孢的水平与参考细菌水平进行比较；以及
当所述样本中的所述一或多个细菌或其芽孢的水平低于细菌参考水平时将所述个体诊断为具有癌症复发风险。
13.一种诊断具有癌症复发风险的个体的方法，包含
从个体获得肠微生物群样本，且测定存在于所述肠微生物群样本中的屎肠球菌的水平；
将所述样本中的所述细菌的水平与参考细菌水平进行比较；以及
当所述样本中的所述细菌的水平大于细菌参考水平时将所述个体诊断为具有癌症复发风险。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述个体已进行造血干细胞移植(HSCT)，其中所述造血干细胞移植任选地为异源造血干细胞移植(allo-HSCT)，且其中所述allo-HSCT任选地为T细胞添加的allo-HSCT。
15.根据权利要求12到14中任一项所述的方法，进一步包含向诊断为具有癌症复发风险的个体给药癌症疗法，
其中所述癌症疗法任选地包含手术；放疗；化疗；免疫疗法；干细胞疗法；细胞疗法；益生细菌、益生酵母菌或其组合；益生元；益生素；抗生素；或其组合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述益生细菌包含根据权利要求1到3中任何一项所述的一或多个细菌或其芽孢。
17.一种试剂盒，包含根据权利要求1到6中任何一项所述的组合物。
18.一种用于诊断个体具有癌症复发风险的试剂盒，包含用于检测肠微生物群样本中的根据权利要求1到3中任何一项所述的一或多个细菌或其芽孢的丰度的一或多个药剂。
19.一种根据权利要求1到6中任何一项所述的组合物，其用于减少癌症复发的风险和/或增加从个体的癌症复发存活的可能性，其中所述个体任选地已进行造血干细胞移植(HSCT)，其中所述造血干细胞移植任选地为异源造血干细胞移植(allo-HSCT)，且其中所述allo-HSCT任选地为T细胞添加的allo-HSCT。
20.根据权利要求19使用的组合物，其中所述组合物可以对降低所述个体中的屎肠球菌存在的有效的量和/或降低所述个体中屎肠球菌毒素的量给药。
21.根据权利要求19使用的组合物，其中所述个体具有癌症复发的风险，其中来自所述个体的肠微生物群样本的根据权利要求1到3中任何一项所述的一或多个细菌或其芽孢的水平低于细菌参考水平，或
其中来自所述个体的肠微生物群样本的屎肠球菌的水平大于细菌参考水平。
22.根据权利要求19使用的组合物，包含
分析来自个体的肠微生物群样本，且测定存在于所述肠微生物群样本中的根据权利要求1到3中任何一项所述的一或多个细菌或其芽孢的水平，和
当所述样本中的所述一或多个细菌或其芽孢的水平低于细菌参考水平时，向个体给药治疗有效量的所述组合物。
23.根据权利要求19使用的组合物，包含
分析来自个体的肠微生物群样本，且测定存在于所述肠微生物群样本中的屎肠球菌的水平，和
当所述样本中的屎肠球菌的水平大于细菌参考水平时，向个体给药治疗有效量的所述组合物。
24.一种诊断具有癌症复发风险的个体的活体外方法，包含在来自所述个体的肠微生物群样本中检测低于细菌参考水平的根据权利要求1到3中任何一项所述的一或多个细菌或其芽孢的水平，或
包含在来自所述个体的肠微生物群样本中检测大于细菌参考水平的屎肠球菌的水平。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述个体已进行造血干细胞移植(HSCT)，其中所述造血干细胞移植任选地为异源造血干细胞移植(allo-HSCT)，且其中所述allo-HSCT任选地为T细胞添加的allo-HSCT。
26.一种用于个体的癌症疗法的组合物，其中所述癌症疗法选自由以下组成的群组：手术、放疗、化疗、免疫疗法、干细胞疗法和/或细胞疗法，
其中所述组合物任选地包含益生细菌、益生酵母菌或其组合；益生元；益生素；抗生素；或其组合，
其中所述个体具有癌症复发风险，其中来自所述个体的肠微生物群样本的根据权利要求1到3中任何一项所述的一或多个细菌或其芽孢的水平低于细菌参考水平，或
其中所述个体具有癌症复发风险，其中来自所述个体的肠微生物群样本的屎肠球菌的水平大于细菌参考水平。
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