CN117660656B - 与胃癌预后相关的菌群标志物及其应用 - Google Patents
与胃癌预后相关的菌群标志物及其应用 Download PDFInfo
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供与胃癌预后相关的菌群标志物及其应用,包括:链球菌anginosus作为胃内菌群标志物在制备预测胃癌预后情况的产品中的应用,链球菌anginosus作为胃内菌群标志物在制备预测体内肿瘤免疫微环境的产品中的应用,非疾病诊断或治疗目的的检测链球菌anginosus表达水平的试剂在制备预测CD8+T淋巴细胞变化的产品中的应用。利用本发明的检测链球菌和/或其代谢物的试剂可用于制备预测胃癌预后的产品,也可用于制备预测体内肿瘤免疫微环境或CD8+T淋巴细胞变化的产品,从而实现对胃癌预后及体内肿瘤免疫微环境的检测,代表性好,结果可靠。
Description
技术领域
本发明提供一种生物检测技术领域,具体涉及一种与胃癌预后相关的菌群标志物及其应用。
背景技术
胃癌(GC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,是癌症相关死亡的第四大原因。众所周知,幽门螺杆菌(HP)感染在这一过程中起着初始作用。尽管全球超过50%的人口感染了HP,但只有大约1-3%的感染者最终会发展为GC4。更重要的是,根除HP治疗GC的效果参差不齐。大多数研究表明,它成功地阻止了胃炎的发展。然而,在某些前瞻性试验中,成功根除HP并没有减少GC的发生率。从这个角度来看,HP可能只是触及了胃微生物群在肿瘤发展中所起作用的表面。
随着聚合酶链反应(PCR)技术和宏基因组学的不断进步,越来越多的研究表明,胃确实含有强大的微生物群。Coker等人已经证明,与癌前阶段相比,Parvimonas micra、Dialister pneumosintes、Slackia exigua和Peptostreptococcus stomatis在胃癌微生物组中显著增加,随着疾病进展形成了更强的共生网络。Sung等人发现,在根除HP一年后,主要由Peptostreptococcus和Streptococcus组成的一群口腔细菌与萎缩和肠变性的发展和持续存在有关,表明非HP胃微生物群在胃癌前病变的进展和持续性中的重要作用。另一项研究证实,与慢性胃炎相比,胃癌患者展现出微生物多样性的减少、幽门螺杆菌丰度的下降,以及包括属Phyllobacterium和Achromobacter以及Xanthomonadaceae和Enterobacteriaceae科在内的变形菌门类群的富集。由此可见,对GC中胃微生物群的全面评估对于阐明它们在GC的发生和发展中的作用是必要的。
前述背景技术知识的记载旨在帮助本领域普通技术人员理解与本发明较为接近的现有技术,同时便于对本发明的发明构思及技术方案的理解,应当明确的是,在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日前已公开的情况下,上述背景技术不应当用于评价本申请技术方案的新创性。
发明内容
技术问题
为了解决上述问题,本发明的目的在于提供一种与胃癌预后相关的菌群标志物及其应用,利用本发明的检测链球菌和/或其代谢物的试剂可用于制备预测胃癌预后的产品,也可用于制备预测体内肿瘤免疫微环境或CD8+T淋巴细胞变化的产品,从而实现对胃癌预后及体内肿瘤免疫微环境的检测,代表性好,结果可靠。
即,本发明包括下述方案。
非疾病诊断或治疗目的的检测链球菌anginosus表达水平和/或其代谢物的试剂在制备预测胃癌预后情况的产品中的应用。
链球菌anginosus作为胃内菌群标志物在制备预测体内肿瘤免疫微环境的产品中的应用。
链球菌anginosus作为胃内菌群标志物在制备预测CD8+T淋巴细胞变化的产品中的应用。
非疾病诊断或治疗目的的检测链球菌anginosus表达水平的试剂在制备预测体内肿瘤免疫微环境的产品中的应用。
非疾病诊断或治疗目的的检测链球菌anginosus表达水平的试剂在制备预测CD8+T淋巴细胞变化的产品中的应用。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可以相互组合,得到具体实施方式。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品,涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
有益效果
根据本发明,通过本申请发明人进行的深入研究,提供与胃癌预后相关的菌群标志物及其应用,结果发现链球菌anginosus和/或其代谢物与胃癌的预后相关,还发现链球菌anginosus表达水平与体内肿瘤免疫微环境及CD8+T淋巴细胞变化相关,显示链球菌anginosus是一种胃癌高危细菌,因此本发明提供的微生物标志物可有效地预测胃癌的预后情况,为胃癌的预后情况预测提供了参考依据,为未来胃癌的诊治提供一个有前景的靶点和方向。
本发明为实现上述目的而采用了上述技术方案,弥补了现有技术的不足,设计合理,操作方便。
附图说明
为让本发明的上述和/或其他目的、特征、优点与实例能更明显易懂,下面将对本发明的具体实施方式中所需要使用的附图进行简单的介绍,显然地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域技术人员来讲,在不付出创造性劳动的情况下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1表示GC肿瘤和配对正常样本中的微生物组组成;
图2表示GC中肿瘤微生物组成的Shannon指数多样性;
图3表示GC中肿瘤微生物组成的Simpson指数多样性;
图4表示主坐标分析(PcoA)图上可视化的β多样性模式;
图5表示6个已确定的胃肿瘤微生物组簇的属水平系统型分布;
图6表示不同胃肿瘤微生物组簇的总生存概率分析;
图7表示qPCR实验检测SA在胃癌组织及相应正常组织中的差异表达(其中N表示正常组织,C表示胃癌组织);
图8表示Kaplan-Meier分析高表达与低表达SA胃癌患者的生存差异;
图9表示SA与CD8+T淋巴细胞表达的相关性分析;
图10表示肿瘤组织HE染色、SA的FISH检测、肿瘤组织中CD8+T淋巴细胞的免疫组织化学检测的代表性图像;
图11表示MNU诱导GC模型中小鼠的体重示意图;
图12表示MNU诱导GC模型中小鼠胃黏膜肿瘤形成的代表性图像;
图13表示MNU诱导GC模型中小鼠肿瘤形成率的差异;
图14表示小鼠异种移植实验中每组肿瘤大小的图像;
图15表示小鼠异种移植实验中每组的肿瘤体积;
图16表示流式细胞术代表性图像(所有实验均重复3次;*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001)。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当替换和/或改动工艺参数实现,然而特别需要指出的是,所有类似的替换和/或改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品和制备方法已经通过较佳实例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和制备方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
应当值得说明的是,本发明所要保护的技术方案不包括任何涉及疾病的诊断或治疗的内容,而仅仅涉及检测相关微生物或其代谢产物的试剂在制备相关产品中的应用。
为了便于理解本发明的实施例,首先对本发明实施例中可能涉及的缩略语和关键术语进行解释说明或定义:GC:胃癌;16S rRNA:16S rRNA-seq,16S核糖体RNA测序;HP:幽门螺杆菌;PCR:聚合酶链反应;SA:anginosus,链球菌;TIME:肿瘤免疫微环境;GSEA:基因集富集分析;DEGs:差异表达基因;FISH:荧光原位杂交;MNU:N-甲基亚硝脲;EDU:5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶;PBMCs:外周血单个核细胞;ADI:精氨酸脱氨酶;L-CAV:L-卡那瓦硫酸盐;CFR:头孢曲松;DAPI,即4',6-二脒基-2-苯基吲哚,是一种能够与DNA强力结合的荧光染料,常用于荧光显微镜观测。
本发明所述“抗体”,是指能够结合存在于抗原上的表位的免疫球蛋白分子。所述术语意图不仅涵盖完整免疫球蛋白分子,如单克隆和多克隆抗体,而且也涵盖双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗特发性(抗ID)抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、融合蛋白和前述各物的包含具有所需特异性的抗原识别点的任何修饰形式。
本发明中所述的“试剂盒”,不仅包含用于特异性检测所述微生物标志物的引物、探针、反义寡核苷酸、适体或抗体等,还包括一种或多种适用于分析方法的其他成分组合物、溶液或装置。在本发明的一个具体实施方式中,所述包含对所述微生物标志物具有特异性的引物的试剂盒可以是含有用于进行PCR等的扩增反应的基本元件的试剂盒。例如,用于PCR的试剂盒可以包括试管或其他合适的容器、反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTP)、酶(如Taq聚合酶和逆转录酶)、脱氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNAse)抑试剂、DEPC-水、或无菌水等。
本发明中所述的“产品”,可以用来利用获取自受试者的生物样本来检测与各种目标细菌有关的核酸。可以根据本领域常规技术人员所熟知的任何方法将该目标细菌有关的核酸(DNA或RNA)从所述样本中分离出来。可以通过标准步骤来获取生物样本并且可以直接使用所述生物样本,或者可以在适于该类型的生物样本的条件下储存该生物样本以备后续检测使用。
在本申请中,我们最初对GC肿瘤组织及其相应的正常邻近组织进行了16S核糖体RNA测序(16S rRNA-seq),以全面分析胃癌肿瘤中的微生物群,还进行了转录组和代谢组分析,以研究微生物群与宿主转录调控之间的复杂关系,阐明微生物群在调控肿瘤免疫微环境(TIME)的代谢重塑中的作用。发现链球菌anginosus(SA)的高表达预示着胃癌的不良预后,因此,本申请基于此提供了下述方案。
链球菌anginosus作为胃内菌群标志物在制备预测体内肿瘤免疫微环境的产品中的应用。
链球菌anginosus作为胃内菌群标志物在制备预测CD8+T淋巴细胞变化的产品中的应用。
非疾病诊断或治疗目的的检测链球菌anginosus表达水平的试剂在制备预测体内肿瘤免疫微环境的产品中的应用。
非疾病诊断或治疗目的的检测链球菌anginosus表达水平的试剂在制备预测CD8+T淋巴细胞变化的产品中的应用。
优选的,所述检测链球菌anginosus表达水平包括采取宏基因组测序、16S rRNA测序、qPCR定量检测的至少一种方法。
优选的,所述检测链球菌anginosus表达水平的试剂包括检测链球菌anginosus的探针、引物或抗体的至少一种。
优选的,所述试剂包括样本DNA提取用试剂、宏基因组测序用试剂、16S rRNA测序用试剂或qPCR定量检测用试剂的至少一种。
优选的,所述引物为检测链球菌anginosus的16SrRNA的引物。
优选的,所述产品包括试剂盒、试纸或芯片的至少一种。
更优选,所述产品包括试剂盒。
以下详细描述本发明
1、临床样本的收集和准备。本研究包括来自浙江省肿瘤医院2013年1月至2018年12月的335名患者(290个肿瘤(T)样本和319个肿瘤邻近正常(N)组织,其中274个为配对样本)的样本。浙江省肿瘤医院研究伦理委员会批准了本研究(编号:IRB-2023-791),所有患者均提供了书面知情同意书。知情同意书明确告知患者,所有临床信息如年龄、性别和TNM分期将用于学术研究和发表。这些患者均为新诊断的胃癌患者,接受了手术切除,且未接受过包括化疗、放疗、靶向治疗或生物治疗在内的此疾病治疗。被发现有两种或两种以上恶性肿瘤的患者被排除。
肿瘤组织和配对的正常组织是在手术切除时从同一患者中收集的。值得注意的是,正常组织样本是从相应肿瘤部位周围约2cm的区域收集的。样本大小约为0.5×0.5cm,大多数病例收集了四到五个肿瘤标本和正常组织。用于代谢组学分析的组织标本在-80℃冰箱中冷缺血时间不超过30min。用于16S rRNA测序和转录组分析的组织标本在4℃下浸泡在RNA保护液中过夜,然后冷冻在-80℃冰箱中。从每个标本的顶部和底部获得的组织切片由一位资深的认证病理学家复核,以确认这些组织为肿瘤或正常组织。顶部和底部切片平均要包含60%的肿瘤细胞核,坏死率不超过20%,才被认为适合本研究。
2、16S rRNA测序。使用E.Z.N.A. Tissue DNA Kit (D3396-01; Omega,Norcross, Georgia, USA)按照制造商的说明提取微生物DNA。使用Qubit 2.0荧光计(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)定量DNA,并使用琼脂糖凝胶电泳估计分子大小。使用靶向16S rRNA基因的高变区V3-V4区域的引物对提取的DNA样本进行扩增。正向引物为5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'(SEQ ID NO:1),反向引物为5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'(SEQID NO:2)。使用AxyPrep PCR Clean-up Kit(AP-PCR-500G; Corning, NY, USA)分离、提取和纯化PCR产物,并使用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂(P7581, Thermo Scientific,Waltham, MA, USA)进行定量。质量确定合格后,将文库在LC-Bio Co., Ltd进行Novaseq测序仪上进行2×250bp双端测序。
使用Ward层次聚类分析对样本进行分类。通过vegan R包1评估Shannon指数的Alpha多样性。通过使用vegan R包1计算Bray-Curtis距离并使用ape R包进行主坐标分析(PCoA),对样本簇之间的Beta多样性进行分析。使用survival R包进行Kaplan-Meier生存分析。
3、RNA-seq检测。在108例食管胃交界部癌症(AEG)病例的配对肿瘤组织和邻近正常组织(NATs)中进行了mRNA测序(RNA-seq)。使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad,CA, USA)按照生产商的程序从RNA保护溶液中的肿瘤组织和NATs中分离总RNA。使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop, Wilmington, DE, USA)量化每个样本的RNA数量和纯度。RNA完整性通过Agilent 2100评估,RIN>7.0。对于mRNA测序,使用TruSeq试剂盒(Illumina)在1微克经DNase I处理的总RNA上准备文库,并在LC-Bio Technology Co., Ltd.(杭州,中国)的Illumina HiSeq X Ten机器上进行150bp配对末端测序,遵循供应商推荐的协议。
我们使用HISAT2(https://daehwankimlab.github.io/hisat2/,版本:hisat2-2.0.4)包将所有样本的读取与<研究物种>参考基因组对齐,该包首先根据每个读取附带的质量信息移除部分读取,然后将读取映射到参考基因组。HISAT2允许每个读取进行多次比对(默认最多20次),并在将读取映射到参考基因组时最多允许两个错配。HISAT2构建潜在剪接结合点的数据库,并通过将先前未映射的读取与假定结合点的数据库进行比较来确认这些结合点。每个样本的映射读取使用StringTie(http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/,版本:stringtie-1.3.4d)以默认参数组装。然后,合并所有样本的转录组以使用gffcompare软件(http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/gffcompare.shtml,版本:gffcompare-0.9.8)重建全面的转录组。生成最终转录组后,使用StringTie和ballgown(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ballgown.html)估算所有转录本的表达水平,并通过计算FPKM(每百万映射读取的转录本每千碱基片段)值来进行mRNAs的表达丰度。
通过DESeq2鉴定差异表达基因(DEGs)。FC≥2和调整后的p值<0.05的基因被视为统计学上显著的DEGs。使用基因集富集分析(GSEA)阐明富集的功能途径和模块,以调整后的p值<0.05和|NES|>1作为显著性阈值。利用CIBERSORT预测免疫细胞浸润丰度。使用Wilcoxon检验检查样本组之间的差异。
4、代谢组学检测。样本从-80℃冰箱中取出,在冰上解冻,并用80%甲醇缓冲液提取代谢物。简单来说,用0.5mL预冷的80%甲醇提取50毫克样本。然后在-20℃下存放提取混合物30min。经过20,000g离心15min后,上清液转移到新的管中并真空干燥。样本用100μL 80%甲醇重新溶解,并在-80℃下保存,以备LC-MS分析之用。此外,通过将每个提取混合物的10μL混合,还制备了混合的QC样品。然后按随机顺序对提取的样本进行机器分析排序。QC样品在样品前、中、后插入,以评估实验技术重复性。样品经历质谱正离子和负离子扫描。所有样品均按照机器指令由LC-MS系统获取。首先,所有色谱分离均使用UltiMate 3000 UPLC系统(Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)进行。使用ACQUITY UPLC T3柱(100mm×2.1mm,1.8μm, Waters, Milford, USA)进行反相分离。柱箱维持在40℃。高分辨率串联质谱仪TripleTOF 6600(SCIEX, Framingham, MA, USA)用于检测从柱中洗脱的代谢物。Q-TOF在正离子和负离子模式下运行。帘气设为30PSI,离子源气体1设为60PSI,离子源气体2设为60PSI,接口加热器温度为500℃。对于正离子模式,离子喷雾电压浮动设为5000V。对于负离子模式,离子喷雾电压浮动设为-4500V。质谱数据以IDA模式获取。TOF质量范围从60到1200Da。调查扫描在150ms内获取,如果超过每秒100计数(counts/s)的阈值,并具有1+电荷态,则收集多达12个生产扫描。动态排除设置为4秒。在获取过程中,每20个样品校准一次质量准确度。此外,为了评估整个采集过程中LC-MS的稳定性,在每10个样品之后都会采集一个质量控制样品(所有样品的混合物)。
质谱原始数据使用Proteowizard的MSConvert软件转换为可读的mzXML格式。使用XCMS软件进行峰值提取,并进行峰值提取质量控制。随后,使用CAMERA进行加合物和离子注释,以及使用metaX软件进行初步鉴定。分别使用质谱一级信息进行鉴定,并将质谱二级信息与自建标准化合物数据库进行匹配。通过Wilcoxon检验鉴定差异表达的代谢物。FC≥1.3和调整后p值<0.05的代谢物被视为统计学上显著。
4.1、从胃癌组织中分离单个细菌的培养组学方法。将胃组织块从-80℃冰箱取出,在冰上解冻,然后放入无菌研钵中。加入无菌PBS并研磨至混合物成为均匀的匀浆。将匀浆转移到10mL无菌离心管中。取1mL匀浆进行1:10梯度稀释(稀释梯度从1到107)。选择104、105、106和107的稀释梯度,并从每个稀释梯度中取500μL涂布在平板上(每个梯度设置一个重复)。所有平板在30℃下孵育48h,然后转移到37℃并孵育另外48h。观察细菌生长,挑选形态不同的菌落,并接种到新鲜的哥伦比亚血琼脂平板上(M0028B,山东拓普生物工程有限公司)。将每个平板分为六个部分,并在每个部分接种一次,给每个部分编号。在37℃下孵育48h。观察生长情况,并初步排除生长相同的编号。将形态不同的菌落转移到不同的哥伦比亚血琼脂平板上,并在37℃下孵育48h。取部分细菌生长,提取DNA,并使用27F和1429R作为引物进行PCR扩增。将扩增产物发送到桑瑞生物科技进行测序。将测序结果与NCBI数据库比对,以分离和保存单一细菌种。
4.2、细菌培养及SA的总代谢产物(SAM)。通过胃癌组织培养组学获得的SA在脑心融合肉汤(BHI)(华凯微生物技术有限公司,广州,中国)中于37℃培养。当SA培养至1×109CFU/mL时,将细菌培养基在12000rpm下离心15min,收集上清液,并通过0.22μm孔径的滤器过滤,以获得SAM。
4.3、细胞系和细胞培养。包括AGS和MKN1在内的人类胃癌细胞系,以及小鼠MFC细胞系由科博尔生物科技有限公司(南京,中国)提供。AGS、MKN1和MFC细胞在含有10%胎牛血清(FBS,Gibco,大岛,美国)和1%青霉素/链霉素(Kino Co.,Ltd.,杭州,中国)的RPMI 1640培养基(Kino生物与药物技术有限公司,杭州,中国)中培养,温度为37℃,5%CO2条件下的细胞培养箱中培养。这两种细胞系经短串联重复鉴定,并且细菌和真菌污染测试均为阴性。
5、MNU induced spontaneous胃癌模型。实验分为三组,每组包括12只4-6周龄的雄性C57小鼠:对照组、MNU组和MNU+SA组。首先,使用N-甲基-N-硝基脲(MNU)对24只小鼠进行胃癌诱导。诱导过程包括在他们的饮用水中加入120ppm浓度的MNU,持续一周,然后一周普通水饮用,构成一个周期。这个过程重复了五次,MNU诱导总持续时间为5周,整个研究总持续时间为10周。诱导期后,引入单菌干预。对照组和MNU组给予PBS,而MNU+SA组通过口腔灌胃给予SA,剂量为1×109CFU/天,每周三次,每次0.2mL。这种给药持续了连续12周,之后每4周灌胃一次。整个实验持续了44周,期间对照组和MNU+SA组各死亡2只小鼠,MNU组死亡1只小鼠。整个实验期间每周记录体重,实验完成后,收集血液、胃、肠及其他器官进行进一步分析。
6、MFC细胞系皮下移植肿瘤模型。实验包括5组,每组6只6-8周龄的雄性615小鼠,共30只。这些组别包括对照组、低剂量SA组、高剂量SA组、低剂量SA+头孢曲松(CFR)组和高剂量SA+CFR组。皮下接种MFC胃癌细胞(2.5×105/50μL)约一周后形成肿瘤。肿瘤形成后,根据肿瘤大小将小鼠随机分组。对照组接受50μL PBS的肿瘤内注射,低剂量SA组接受50μL细菌悬液(5×106CFU,浓度为1×108CFU/mL)的肿瘤内注射,高剂量SA组接受50μL细菌悬液(5×107CFU,浓度为1×109CFU/mL)的肿瘤内注射,低剂量SA+CFR组接受50μL细菌悬液(5×106CFU,浓度为1×108CFU/mL)的肿瘤内注射并结合口腔灌胃200mg/kg CFR,高剂量SA+CFR组接受50μL细菌悬液(5×107CFU,浓度为1×109CFU/mL)的肿瘤内注射并结合口腔灌胃200mg/kg CFR,每天一次。每隔一天监测肿瘤大小和体重,实验持续15天或直到肿瘤超过1500mm3。实验完成后,收集血液和肿瘤组织进行进一步分析。
7、染色和免疫组化。如先前描述,进行了苏木精-伊红染色和免疫组化。简要来说,所有组织进行甲醛固定、乙醇脱水、二甲苯透明化和石蜡包埋。使用染色试剂盒(Art. ZLI-9609 ZSGB-BIO Corp.,上海,中国)进行组织切片染色。免疫组化染色中,样品与这些抗体孵育,包括CD8(目录号:ab17147),Ki-67(目录号:ab15580),N-钙粘蛋白(目录号:ab76011)和波形蛋白(目录号:ab20346),均来自abcam(剑桥,英国)。然后将其与生物素标记的山羊兔IgG和辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素孵育1h。随后用200倍放大的倒置显微镜拍摄苏木精-伊红染色和免疫组化。
8、透射电镜(TEM)实验。大约1×106的AGS和MKN1细胞接种在6孔板中,并与细菌共培养2h(MOI=10)。细胞消化后,使用2.5%戊二醛固定。随后,用1%的锇酸固定液进一步固定细胞,逐渐在递增的乙醇浓度系列中脱水,嵌入环氧树脂。切割50-70nm的切片,用2%的荧光酸铀和铅柠檬酸盐染色,使用JEM-2100plus透射电子显微镜成像。
9、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EDU)实验。对于细菌和细胞的共培养,MKN1和AGS分别接种在24孔板中,密度为每孔5×103细胞。过夜孵育后,与SA共培养2h(MOI=0, 10, 25,50),然后切换为完整的1640培养基进行3天的进一步培养。对于代谢物的共培养,MKN1和AGS分别接种在24孔板中,密度为每孔5×103细胞。过夜孵育后,细胞在含有1% BHI或1%SAM的低血清RPMI 1640培养基中培养3天。使用BeyoClick™ EdU-594细胞增殖检测试剂盒(Biyuntian Biotechnology Co.,Ltd.,上海,中国)评估细胞增殖,并使用倒置荧光显微镜在200倍放大下捕获图像。
10、创伤愈合实验。对于细菌和细胞的共培养,MKN1和AGS分别接种在细胞培养插入物(Ibidi, Munich, Germany)中,密度为1×105细胞/室。过夜孵育后,使用无菌镊子去除细胞培养插入物,然后用PBS清洗三次,与SA共培养2h(MOI=0, 10, 25, 50)。对于代谢物的共培养,MKN1和AGS分别接种在1×105细胞/室中。过夜孵育后,使用无菌镊子去除细胞培养插入物,然后用PBS清洗三次。细胞在含有1%BHI或1%SAM的低血清RPMI 1640培养基中培养。使用CKX53 Olympus倒置荧光显微镜在0h和24h拍摄图像。
11、Transwell Invasion (Matrigel)实验。对于细菌和细胞的共培养,MKN1和AGS细胞接种在6孔板的每孔中1×106细胞,并与SA共培养2h(MOI=0, 10, 25, 50)。移除含有细菌的培养基,用PBS清洗细胞三次。使用胰蛋白酶消化细胞,随后离心。分别调整MKN1 1×105细胞/mL和AGS 2×105细胞/mL的细胞浓度,使用无FBS的RPMI 1640培养基。使用Transwell腔室(Corning),向上腔室加入200μL细胞悬液,向下腔室加入700μL含有10%胎牛血清的培养基。24h后,从培养箱中取出腔室。用棉签移除上腔室的细胞,下腔室的细胞则用4%的甲醛固定,用结晶紫染色,使用CKX53 Olympus倒置荧光显微镜(200倍)拍摄图像。对于代谢物共培养,细胞用胰蛋白酶消化、离心,并将细胞浓度调整至MKN1 1×105细胞/mL和AGS 2×105细胞/mL,使用无血清的基础培养基。使用Transwell腔室(Corning),向上腔室加入200μL细胞悬液,向下腔室加入700μL含有10%胎牛血清的培养基。处理24h(对照、1%BHI、1%SAM)后,从培养箱中取出腔室。其他步骤与细菌和细胞共培养测试类似。
12、流式细胞仪。从健康个体采集全血,使用Ficoll-Paque密度梯度离心(SigmaAldrich, GE17-1440-03)分离PBMCs。然后将1×105PBMCs植入24孔板,将Transwell腔室(0.4um孔径)放入24孔板中。在Transwell腔室上腔室加入100μL,下腔室加入700μL含有10%FBS的培养基。然后,将SA添加到腔室的上部隔室中,刺激PBMCs 48h。之后,用APC标记的小鼠抗人CD8(BD Bioscience, 566852)和FITC标记的小鼠抗人CD3(BD Bioscience,555916)在染色缓冲液(BD Bioscience, 554656)中对PBMCs进行染色,并使用流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)进行分析。
13、质谱成像技术。将胃癌组织切片从-80℃冰箱中取出,放置在干燥器中在室温下干燥15min。采用基于3-硝基苯肼(3-NPH)衍生化的预处理方法,涉及将3-NPH(175mM,Sigma)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基异脲酸盐水合物(EDC,105mM,Sigma)和吡啶(溶于2.5%甲醇)喷洒在组织切片上,以增强对氨基酸类小分子的灵敏度。基质涂覆为9-氨基吖啶(9-AA,10mg/mL,Sigma)。衍生化和基质应用过程均使用自动基质升华装置(iMLayer:SHIMADZU,Shimadzu Corporation)进行。涂有基质的载玻片随后使用成像质谱显微镜(iMScope QT:SHIMADZU,Shimadzu Corporation)进行分析,对目标代谢物(精氨酸和鸟氨酸)的衍生化产物进行离子提取。衍生化精氨酸的目标离子为M+H+,m/z 310.1622,衍生化鸟氨酸的目标离子为M+K+,m/z 306.0969。成像数据使用IMAGEREVEAL MS软件(SHIMADZU,Shimadzu Corporation)处理。同时,组织切片在不同放大倍数下进行光学拍摄,肿瘤组织在5倍目标镜下可以观察到清晰的显微图像。成像质谱显微镜(iMScope QT:SHIMADZU,Shimadzu Corporation)的详细设置如下:激光:355nm YAG激光;分析模式:正离子;像素间距:10μm×10μm;激光斑点直径:10μm;激光能量:70(范围0-100);激光次数:200次;扫描频率:5000Hz;扫描范围:m/z 70-500;探测器电压:2.40kV。
14、FISH检测。将石蜡切片进行脱蜡,分别在二甲苯中浸泡两次,每次10min。随后分别在100%、85%和75%乙醇中重水化3min,接着PBS中3min。然后在0.2mol/L盐酸中37度孵育12min。用PBS清洗标本3min。将标本在槲皮素中37度孵育12min,接着在溶菌酶中同样温度孵育另外12min。用PBS清洗标本两次,每次5min。将切片风干。预杂交时,提前30min将杂交液从冰箱取出以使其恢复至室温,将液体加入切片并在杂交仪中55℃孵育1h。将探针以1:50的比例用细菌杂交液稀释,85℃变性3min,然后在37℃平衡5min。取出预杂交的切片,去除多余液体,确保探针完全覆盖组织。在37℃的杂交仪中过夜孵育。用2XSSC(含0.1%NP-40)清洗切片三次,每次5min。通过乙醇梯度脱水并用DAPI封片。在荧光显微镜下观察结果。链球菌属FISH探针标记FITC:5'-ATCCTGCGTTCTACTTGC-3'(SEQ ID NO:3)。
15、结果
在16S rRNA-seq中,所有测序样本均显示出细菌读数的存在,其配置文件显示出样本特异性的微生物组异质性,如图1所示,并且在所鉴定的细菌类群中,幽门螺杆菌在总丰度上成为最丰富的属,所有样本中有显著差异。为了深入了解GC中肿瘤微生物组的组成特征,使用Shannon指数和Simpson指数计算了α多样性,示于图2和图3,这一指标显示出肿瘤微生物组α多样性较高与患者预后改善之间的显著关联。
基于前30个属的丰度,使用无监督聚类方法将肿瘤样本分为六簇,使用Bray-Curtis距离计算β多样性,如图4所示,成功地在PCoA1和PCoA2上区分这些簇。每个簇都以不同的特定属的丰富度为特征,如图5所示,得知其中三个簇表现出丰富的属均占总丰度的15%以上:幽门螺杆菌、假单胞菌和链球菌,分别占第II簇、第III簇和第IV簇细菌的84.06%、47.93%和19.80%。为了了解这些新发现的簇在临床上的相关性,我们比较了不同簇中胃癌患者的总体生存情况,如图6可知,在各簇中观察到了显著不同的结果,与其他簇的患者相比,第III簇和第IV簇的患者总体生存率较差,这表明假单胞菌和链球菌可能促进了胃癌的进展。
为了进一步阐明微生物群在胃癌的发生和发展中的作用,我们从10名特定簇(即第III和第IV簇)的患者中培养了癌组织,分离并鉴定出五种细菌:链球菌anginosus(SA)、链球菌halitosis、芽孢杆菌koreensis、李斯特菌monocytogenes和伯克霍尔德菌属。发现SA在胃癌组织中与正常组织相比显著上调,示于图7。基于图8的表现,可以得知SA的高表达预示着胃癌的不良预后。
此外,为了明确SA在胃癌的肿瘤免疫微环境(TIME)中的调节作用,我们使用免疫组化和荧光原位杂交(FISH)技术观察细菌种群与CD8+T淋巴细胞表达之间的相关性。如图9和10所示,我们发现在SA表达较高的组中CD8+T细胞显著减少,因此可知链球菌anginosus(SA)是与胃癌中的肿瘤生成和浸润性CD8+T细胞减少相关的风险因素。
使用N-甲基亚硝脲(MNU)诱导的自发性胃癌模型来观察SA对胃癌发生的影响,如图11结果显示,与对照组相比,MNU模型组和MNU结合SA干预组的小鼠体重显著减轻。此外,如图12和图13所示,MNU模型组胃癌的肿瘤形成率为36.36%,而MNU结合SA干预组为80%,是MNU模型组的两倍多。SA的干预可以促进胃癌的发展,MNU和SA都可以导致小鼠胃粘膜损伤,从而影响其营养状态,最终导致体重减轻。
使用小鼠移植肿瘤模型来观察SA对胃癌的增殖、侵袭和转移特性的影响,使用小鼠来源的MFC细胞构建了小鼠移植肿瘤模型,并进行了低剂量和高剂量的SA干预。如图14和图15的结果表明,低剂量和高剂量的SA均可促进肿瘤增殖,肿瘤体积与对照组相比显著增加,而在抗生素干预后,这一效应被逆转。此外,通过FISH,我们观察到SA干预后肿瘤内SA显著增加,而在抗生素干预后大部分SA被消除。免疫组化结果表明,在SA干预组中CD8+T淋巴细胞显著减少,代表增殖的Ki-67和代表侵袭和转移的N-钙粘蛋白和波形蛋白显著增加,所有这些现象在抗生素干预后均被逆转。结果表明,SA可能同时调节CD8+T淋巴细胞和肿瘤细胞在TIME中,从而促进胃癌的发生和发展。
此外,我们在体内观察了SA对TIME中CD8+T淋巴细胞的调节。为了观察CD8+T淋巴细胞的分化,我们收集了健康个体的外周血单个核细胞(PBMCs)并与SA及其代谢物共培养。如图16的结果表明,SA可以抑制人外周血PBMCs中CD8+T淋巴细胞的分化。总之,SA及其代谢物可以促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。同时,SA还可以抑制CD8+T淋巴细胞的分化,导致肿瘤细胞的免疫逃逸,可能进一步促进肿瘤生长。考虑到PBMCs中CD8+T淋巴细胞的分化受到抑制,SA对肿瘤细胞和CD8+T淋巴细胞在TIME中的同时调节可能受其精氨酸代谢途径的影响,这最终可能促进胃癌的发生和发展。
综上所述,发现并证实,SA(链球菌anginosus)在胃癌的发生和发展中扮演着关键角色。研究发现SA的高表达预示着胃癌的不良预后。因此,SA可能成为胃癌治疗的一个有前景的靶点。也即是,链球菌anginosus可作为胃内菌群标志物应用于制备预测体内肿瘤免疫微环境的产品中,链球菌anginosus还可作为胃内菌群标志物应用于制备预测CD8+T淋巴细胞变化的产品中,非疾病诊断或治疗目的的检测链球菌anginosus表达水平的试剂可应用于制备预测CD8+T淋巴细胞变化的产品中等均成为可能。上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术,故在此不再详细赘述。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例,但是对本领域熟练技术人员来说,只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
虽然上述具体实施方式已经显示、描述并指出应用于各种实施方案的新颖特征,但应理解,在不脱离本公开内容的精神的前提下,可对所说明的装置或方法的形式和细节进行各种省略、替换和改变。另外,上述各种特征和方法可彼此独立地使用,或可以各种方式组合。所有可能的组合和子组合均旨在落在本公开内容的范围内。上述许多实施方案包括类似的组分,并且因此,这些类似的组分在不同的实施方案中可互换。虽然已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本发明,但本领域技术人员应理解,本发明可超出具体公开的实施方案延伸至其它的替代实施方案和/或应用以及其明显的修改和等同物。因此,本发明不旨在受本文优选实施方案的具体公开内容限制。
本发明未尽事宜均为公知技术。
Claims (12)
1.非疾病诊断或治疗目的的检测链球菌anginosus丰度的试剂在制备预测胃癌预后情况的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:
所述检测链球菌anginosus丰度包括采取宏基因组测序、16SrRNA测序、qPCR定量检测的至少一种方法。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:
所述试剂包括检测链球菌anginosus的探针、引物或抗体的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:
所述引物为检测链球菌anginosus的16SrRNA的引物。
5.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:
所述试剂包括样本DNA提取用试剂、宏基因组测序用试剂、16SrRNA测序用试剂或qPCR定量检测用试剂的至少一种。
6.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:
所述产品包括试剂盒、试纸或芯片的至少一种。
7.非疾病诊断或治疗目的的检测链球菌anginosus丰度的试剂在制备预测胃癌中的肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞变化的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:
所述检测链球菌anginosus丰度包括采取宏基因组测序、16SrRNA测序、qPCR定量检测的至少一种方法。
9.根据权利要求7或8所述的应用,其特征在于:
所述检测链球菌anginosus丰度的试剂包括检测链球菌anginosus的探针、引物或抗体的至少一种。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:
所述引物为检测链球菌anginosus的16SrRNA的引物。
11.根据权利要求7或8所述的应用,其特征在于:
所述试剂包括样本DNA提取用试剂、宏基因组测序用试剂、16SrRNA测序用试剂或qPCR定量检测用试剂的至少一种。
12.根据权利要求7或8所述的应用,其特征在于:
所述产品包括试剂盒、试纸或芯片的至少一种。
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Citations (5)
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- 2024-02-01 CN CN202410142798.7A patent/CN117660656B/zh active Active
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Publication number | Publication date |
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CN117660656A (zh) | 2024-03-08 |
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