CN113106042A - 预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂、制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂、制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物制剂领域，特别是涉及预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂、制剂及其制备方法和应用。本发明通过适宜比例的枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌和溶纤维丁酸弧菌复配，使菌株之间形成主次分明、功能互补、环境共生的协同体，复配后的菌剂消化道定植能力强，能迅速增殖形成有益微生物菌群优势，抑制或杀死有害微生物菌株，形成有益微生物占绝对优势的微生态内环境，从而有效预防乳鸽念珠菌病。本发明的微生物菌剂对乳鸽内源性念珠菌制率为79.5％～83％，显著降低鸽念珠菌病自然发病率；对鸽念珠菌的防治率达到97.5％～98.33％，显著降低抗生素使用率。

Description

预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂、制剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及微生物制剂领域，特别是涉及预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂、制剂及其制备方法和应用。
背景技术
肉鸽念珠菌病是由念珠菌属念珠菌，尤其是白色念珠菌引起的一种真菌病。念珠菌广泛存在于自然界，同时也存在于正常家禽及人的皮肤和粘膜上，可以与机体长期共生，正常情况下不致病；当机体免疫力低下或菌群失调时可转化为致病菌，引起机体病理性反应，是一种典型的条件性致病菌。该病原菌既可侵犯皮肤和黏膜，又能累及内脏；通常按照发病部位分类，最常见的两种综合征为黏膜皮肤念珠菌病(例如口咽念珠菌病、鹅口疮或食管炎)和侵袭性或深部器官念珠菌病(例如念珠菌血症、肝脾念珠菌病或心内膜炎)。
鸽念珠菌病以上消化道损害为特征，多数在嗉囔部形成灰白色假膜；幼鸽发病率高，对幼鸽的危害比较大；如遇饲养管理不良、应激、鸽乳转换等情况，可突然暴发，造成大批死亡，严重影响肉鸽生产经济效益。
鸽念珠菌病临床防治比较困难，是一直困扰肉鸽养殖业健康发展的技术难题。主要原因：一是大部分感染属于内源性感染，即自身口咽部、消化道、生殖道等处的念珠菌，正常菌群因内、外环境改变和机体免疫功能下降而转为致病菌，从而引起的感染。二是目前普遍缺乏正规途径、合法生产、具备抗念珠菌或真菌功效的兽药产品供兽医临床使用。三是就化学药物防治而言，制霉菌素、克霉唑等抗真菌药物对念珠菌具有防治作用，但并没有兽医临床应用许可，即使使用也属违规违法；同时，由于乳鸽饲养周期短，药物残留控制要求严，食品安全性要求高，化学药物对乳鸽念珠菌病的防治并不是首选方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂、制剂及其制备方法和应用。本发明提供的预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂可以快速形成益生菌优势菌群，抑制念珠菌等内源性致病菌生长繁殖，有效预防乳鸽念珠菌病。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂，包括以下重量份的组分：枯草芽孢杆菌35～50份、罗伊氏乳杆菌25～35份、嗜热链球菌10～18份和溶纤维丁酸弧菌10～18份；
所述枯草芽孢杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL，所述罗伊氏乳杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL，所述嗜热链球菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL，所述溶纤维丁酸弧菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL。
本发明还提供一种预防鸽形目念珠菌病的制剂，包括以下重量份的组分：上述的微生物菌剂85～88份和免疫增强剂2～2.8份。
优选的，所述免疫增强剂包括桃金娘脂多糖和/或野牡丹多糖。
优选的，当所述免疫增强剂为桃金娘脂多糖和野牡丹多糖时，所述桃金娘脂多糖和野牡丹多糖的重量比为(1.6～2):(1～1.4)。
优选的，所述制剂的剂型包括口服液；当所述剂型为口服液时，所述制剂还包括稳定剂，所述稳定剂与微生物菌剂的重量比为(1.9～4):(85～88)；
所述稳定剂包括氯化钠、β-环糊精或泊洛沙姆中的一种或多种。
优选的，当所述稳定剂为氯化钠和泊洛沙姆时，所述氯化钠和泊洛沙姆的重量比为(1.5～3):(1～2.5)。
优选的，所述制剂的pH值为6.5～7。
本发明还提供了上述预防动物念珠菌病的制剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述微生物菌剂、免疫增强剂、稳定剂和水混合后，调节pH值为6.5～7，得到预防动物念珠菌病的制剂；所述稳定剂和水的重量比为(1.9～4)：(2.5～7.6)。
本发明还提供了上述预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂或上述预防鸽形目念珠菌病的制剂在制备防治鸽形目念珠菌病药物中的应用；所述鸽形目包括鸽属动物。
优选的，所述鸽属动物包括乳鸽。
有益效果：
本发明提供一种预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂，包括以下重量份的组分：枯草芽孢杆菌35～50份、罗伊氏乳杆菌25～35份、嗜热链球菌10～18份和溶纤维丁酸弧菌10～18份；所述枯草芽孢杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL，所述罗伊氏乳杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL，所述嗜热链球菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL，所述溶纤维丁酸弧菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL。本发明通过适宜比例的枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌和溶纤维丁酸弧菌复配，使菌株之间形成主次分明、功能互补、环境共生的协同体，复配后的菌剂消化道定植能力强，能迅速增殖形成有益微生物菌群优势，抑制或杀死有害微生物菌株，形成有益微生物占绝对优势的微生态内环境，从而有效预防乳鸽念珠菌病。本发明的微生物菌剂对乳鸽内源性念珠菌制率为79.5％～83％，显著降低鸽念珠菌病自然发病率；对鸽念珠菌的防治率达到97.5％～98.33％，显著降低抗生素使用率。
附图说明
图1为应用例1中不同组别对幼鸽生长性能的影响的柱状图；
图2为应用例1中不同组别处理对幼鸽上消化道念珠菌定植数量的影响的柱状图；
图3为应用例1中不同组别处理对幼鸽上消化道念珠菌病发病率的影响的柱状图；
图4为应用例1中不同组别处理对幼鸽血清免疫球蛋白的影响的柱状图；
图5为应用例1中不同组别处理对幼鸽NDV抗体的影响的柱状图；
图6为应用例2中不同组别处理对幼鸽血清免疫球蛋白的影响的柱状图；
图7为应用例2中不同组别处理对幼鸽免疫器官指数的影响；
图8为应用例3中不同组别处理对幼鸽上消化道念珠菌定植数量的影响的柱状图；
图9为应用例3中不同组别处理对幼鸽上消化道念珠菌病发病率的影响的柱状图。
具体实施方式
本发明提供一种预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂，包括以下重量份的组分：枯草芽孢杆菌35～50份、罗伊氏乳杆菌25～35份、嗜热链球菌10～18份和溶纤维丁酸弧菌10～18份；所述枯草芽孢杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL，所述罗伊氏乳杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL，所述嗜热链球菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL，所述溶纤维丁酸弧菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL。
如无特殊说明，本发明对所述微生物菌剂中的各组分来源没有限定，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明所述微生物菌剂包括35～50重量份的枯草芽孢杆菌，优选为45～50份，最优选为50份；本发明所述枯草芽孢杆菌优选包括含有枯草芽孢杆菌的发酵液，所述枯草芽孢杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL。本发明对所述含有枯草芽孢杆菌的发酵液的制备没有限定，采用本领域技术人员所熟知的制备方法即可。
本发明所述微生物菌剂包括25～35重量份的罗伊氏乳杆菌，优选为25～30份，最优选为25份；本发明所述罗伊氏乳杆菌优选包括含有罗伊氏乳杆菌的发酵液，所述罗伊氏乳杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL。本发明对所述含有罗伊氏乳杆菌的发酵液的制备没有限定，采用本领域技术人员所熟知的制备方法即可。
本发明所述微生物菌剂包括10～18重量份的嗜热链球菌，优选为11～15份，更优选为12份。本发明所述嗜热链球菌优选包括含有嗜热链球菌的发酵液，所述嗜热链球菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL。本发明对所述含有嗜热链球菌的发酵液的制备没有限定，采用本领域技术人员所熟知的制备方法即可。
本发明所述微生物菌剂包括10～18重量份的溶纤维丁酸弧菌，优选为10～15份，更优选为10份。本发明所述溶纤维丁酸弧菌优选包括含有溶纤维丁酸弧菌的发酵液，所述溶纤维丁酸弧菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL。本发明对所述含有溶纤维丁酸弧菌的发酵液的制备没有限定，采用本领域技术人员所熟知的制备方法即可。
本发明通过适宜比例的枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌和溶纤维丁酸弧菌复配，使菌株之间形成主次分明、功能互补、环境共生的协同体，复配后的菌剂消化道定植能力强，能迅速增殖形成有益微生物菌群优势，抑制或杀死有害微生物菌株，形成有益微生物占绝对优势的微生态内环境，从而有效预防乳鸽念珠菌病。
本发明还提供一种预防鸽形目念珠菌病的制剂，包括以下重量份的组分：上述的微生物菌剂85～88份和免疫增强剂2～2.8份。
本发明所述预防鸽形目念珠菌病的制剂包括85～88重量份的上述微生物菌剂，优选为85份。
本发明所述预防鸽形目念珠菌病的制剂包括2～2.8重量份的免疫增强剂，优选为2.5份。在本发明中，所述免疫增强剂优选包括桃金娘脂多糖和/或野牡丹多糖，更优选为桃金娘脂多糖和野牡丹多糖，所述桃金娘脂多糖和野牡丹多糖的重量比优选为(1.6～2.0):(1～1.4)，更优选为2:1。
本发明所述桃金娘脂多糖是从天然植物桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa)成熟根、茎、叶中提取、分离、纯化得到，是类脂和多糖结合在一起的生物大分子化合物，是构成植物体细胞壁的重要成分。本发明对所述桃金娘脂多糖的制备方法没有限定，采用本领域技术人员所熟知的制备方法即可。本发明所述桃金娘脂多糖能快速增强动物机体的非特异性免疫能力，提高机体对疾病、应激等的抵抗能力。
本发明所述野牡丹多糖是从从野牡丹科植物野牡丹(Melastomacandidum D.Don)成熟果实中提取、分离、纯化得到。本发明对所述野牡丹多糖的制备方法没有限定，采用本领域技术人员所熟知的制备方法即可。本发明所述野牡丹多糖可以通过调节巨噬细胞细胞因子的分泌量、细胞内酶的活性来调节巨噬细胞功能，还可以通过促进淋巴细胞增殖，改善淋巴细胞亚群结构，从而增强机体免疫功能。
本发明将桃金娘脂多糖与野牡丹多糖在适宜比例下复配，能明显增强机体局部免疫力、黏膜免疫力，提高消化系统疾病抵抗力和疾病康复能力。
本发明将所述微生物菌剂与免疫增强剂在适宜比例下复配，不仅能迅速增殖形成有益微生物菌群，抑制或杀死有害微生物菌株，形成有益微生物占绝对优势的微生态内环境，从而有效预防乳鸽念珠菌病，而且还可以增强机体免疫能力，减少乳鸽饲养期间抗生素的使用或滥用，提高乳鸽食品安全性与产品品质，提高肉鸽产业综合经济效益与社会效益。
在本发明中，所述制剂的剂型优选包括口服液；当所述剂型为口服液时，所述制剂优选还包括稳定剂，所述稳定剂与微生物菌剂的重量比优选为(1.9～4):(85～88)，更优选为2:85；所述稳定剂优选包括氯化钠、β-环糊精或泊洛沙姆中的一种或多种；当所述稳定剂为氯化钠和泊洛沙姆时，所述氯化钠和泊洛沙姆的重量比优选为(1.5～3):(1～2.5)，更优选为3:2；所述制剂的pH值优选为6.5～7。本发明对所述稳定剂各组分的来源没有限定，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明将适宜比例的稳定剂与微生物菌剂复配，不仅能保存微生物菌株的活性，保障制剂稳定性和有效性，同时还能协同增强微生物菌剂在上消化道定植能力，加快益生菌微生态内环境形成，从而进一步提高乳鸽念珠菌病的预防效果。
本发明还提供了上述预防动物念珠菌病的制剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述微生物菌剂、免疫增强剂、稳定剂和水混合后，调节pH值为6.5～7，得到预防动物念珠菌病的制剂；所述稳定剂和水的重量比为(1.9～4)：(2.5～6)。
在本发明中，所述混合的方式优选包括将稳定剂与水混合后，再与免疫增强剂混合，得到混合液；将所述混合液与微生物菌剂混合；所述水优选包括纯化水。
在本发明中，所述调节pH的试剂优选包括磷酸氢二钠和/或柠檬酸钠，更优选为磷酸氢二钠。
在本发明中，调节pH值后优选还包括将调节pH值后的溶液定容。
本发明还提供了上述预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂或上述预防鸽形目念珠菌病的制剂在制备防治鸽形目念珠菌病药物中的应用，所述鸽形目包括鸽属动物，所述鸽属动物优选包括乳鸽。
本发明提供的预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂或预防鸽形目念珠菌病的制剂不仅可以快速形成益生菌优势菌群，抑制念珠菌等内源性致病菌生长繁殖，有效预防鸽形目念珠菌病，而且还可以减少乳鸽饲养期间抗生素的使用或滥用，提高乳鸽食品安全性与产品品质，提高肉鸽产业综合经济效益与社会效益。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂、制剂及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂，该微生物菌剂的制备：
由广西德林生物工程有限公司分别制备有效活菌数≥5×109CFU/mL的枯草芽孢杆菌发酵液、有效活菌数≥5×109CFU/mL的罗伊氏乳杆菌发酵液、有效活菌数≥1×108CFU/mL的嗜热链球菌发酵液和有效活菌数≥1×108CFU/mL的溶纤维丁酸弧菌发酵液；
将50g所述枯草芽孢杆菌发酵液、25g所述罗伊氏乳杆菌发酵液、12g嗜热链球菌发酵液和10g溶纤维丁酸弧菌发酵液混合，得到所述微生物菌剂。
实施例2
一种与实施例1相似的发酵菌液，区别在于，将45g所述枯草芽孢杆菌发酵液、30g所述罗伊氏乳杆菌发酵液、12g嗜热链球菌发酵液和10g溶纤维丁酸弧菌发酵液混合，得到所述微生物菌剂。
实施例3
一种与实施例1相似的发酵菌液，区别在于，将35g所述枯草芽孢杆菌发酵液、30g所述罗伊氏乳杆菌发酵液、17g嗜热链球菌发酵液和15g溶纤维丁酸弧菌发酵液混合，得到所述微生物菌剂。
实施例4
一种预防鸽形目念珠菌病的制剂，该制剂由以下组分组成：850g实施例1制备的微生物菌剂、16.5g桃金娘脂多糖、8.5g野牡丹多糖、15g氯化钠、10g泊洛沙姆和99g纯化水。
该预防鸽形目念珠菌病的制剂的制备：
将氯化钠和泊洛沙姆溶解于99g纯化水中，然后加入桃金娘脂多糖和野牡丹多糖，搅拌均匀，得到混合溶液；
将所述混合溶液与微生物菌剂混合，用磷酸氢二钠调节pH值为6.5～7，得到预防鸽形目念珠菌病的制剂。
实施例5
一种预防鸽形目念珠菌病的制剂，该制剂由以下组分组成：880g实施例2制备的微生物菌剂、14.52g桃金娘脂多糖、7.48g野牡丹多糖、20g氯化钠、5gβ-环糊精和73g纯化水。
该预防鸽形目念珠菌病的制剂的制备方法同实施例4。
实施例6
一种预防鸽形目念珠菌病的制剂，该制剂由以下组分组成：880g实施例3制备的微生物菌剂、12.73g桃金娘脂多糖、6.27g野牡丹多糖、20g氯化钠、7g泊洛沙姆和74g纯化水。
该预防鸽形目念珠菌病的制剂的制备方法同实施例4。
对比例1
一种微生物菌剂，所述微生物菌剂为广西德林生物工程有限公司生产的枯草芽孢杆菌发酵液，所述发酵液中枯草芽孢杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL。
对比例2
一种微生物菌剂，所述微生物菌剂为广西德林生物工程有限公司生产的罗伊氏乳杆菌发酵液，所述发酵液中罗伊氏乳杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL。
对比例3
一种微生物菌剂，所述微生物菌剂为广西德林生物工程有限公司生产的嗜热链球菌发酵液，所述发酵液中嗜热链球菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL。
对比例4
一种微生物菌剂，所述微生物菌剂为广西德林生物工程有限公司生产的溶纤维丁酸弧菌发酵液，所述发酵液中溶纤维丁酸弧菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL。
应用例1
选取银王鸽产鸽480对和同批孵化出雏的幼鸽1920只，每对产鸽哺育4只幼鸽，乳鸽称量初始体重后随机分成8个试验组，每组60对产鸽和240只幼鸽；每组6个重复，每个重复10对产鸽和40只幼鸽；从幼鸽第2日龄开始试验。试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别为复合制剂Ⅰ组(实施例4制备的制剂)、复合制剂Ⅱ组(实施例5制备的制剂)、复合制剂Ⅲ组(实施例6制备的制剂)，每只幼鸽分别口腔滴服实施例4～6制备的制剂0.1ml，每日1次，连续使用5日；试验Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组、Ⅶ组分别为枯草芽孢杆菌组(对比例1制备的微生物菌剂)、罗伊氏乳杆菌组(对比例2制备的微生物菌剂)、嗜热链球菌组(对比例3制备的微生物菌剂)和溶纤维丁酸弧菌组(对比例4制备的微生物菌剂)，每只幼鸽分别口腔滴服对比例1～4制备的微生物菌0.1ml，每日1次，连续使用5日；试验Ⅷ组为空白对照组，每只幼鸽口腔滴服生理盐水0.1ml，每日1次，连续使用5日；幼鸽第7日龄时，进行新城疫(ND)疫苗(Lasota)点眼免疫，每只1羽份。试验期至幼鸽20日龄。
饲养管理
试验在南宁市顶哈肉鸽养殖农民专业合作社进行，鸽舍为3层垂直式鸽笼，每笼饲养1对亲鸽和4只幼鸽，喂料方式为行走式自动饲喂机，分6:30～8:30、10:30～11:30、14:30～15:30和17:30～19:00四个时间段定时饲喂，自动饮水，光照、温控、卫生等按常规饲养管理，每天观察记录肉鸽精神状态和采食情况。饲喂相同基础日粮与保健砂；基础日粮组成及营养水平见表1。
表1基础日粮与营养水平(wt.％；MJ/Kg)
原料 含量 营养水平 含量
玉米 32.0 代谢能 13.1
豌豆 23.0 粗蛋白质 16.3
高粱 4.5 粗纤维 3.0
小麦 5.5 钙 1.02
肉鸽颗粒饲料 35.0 磷 0.65
测试指标与方法
采用SPSS20.0统计软件进行方差分析，Duncan's法进行组间差异性比较，试验数据以(平均值±标准差)表示。
生长性能测定：分别于1日龄和20日龄对乳鸽进行称重，计算各组平均日增重，测定结果见表2和图1。
表2不同组别对幼鸽生长性能的影响(单位:g/d)
组别 平均日增重
实施例4 19.87±1.21
实施例5 19.46±1.37
实施例6 18.92±1.30
对比例1 17.18±1.28
对比例2 17.33±1.19
对比例3 17.29±1.03
对比例4 17.26±1.06
空白对照组 16.92±1.22
由表2和图1可知，与枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、溶纤维丁酸弧菌单方制剂和对照组比较，本发明制备的制剂显著提高了幼鸽日平均增重(P﹤0.05)；枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、溶纤维丁酸弧菌单方制剂均具有一定提高幼鸽日平均增重的效果，但与对照组比较差异不显著。
念珠菌载量测定：于第10日龄，以重复为单位，每个重复随机选取4只幼鸽，利用无菌棉拭子沾湿生理盐水后于口咽部进行标本采集；另外选取2只接近平均体重的幼鸽屠宰，剪开嗉囊，剥离食物，利用无菌棉拭子沾湿生理盐水后采集嗉囊标本。每份采集标本用生理盐水定量稀释，接种科玛嘉念珠菌显色培养基，置于30℃生化培养箱培养24～48h，进行念珠菌总数测定，测定结果见表3和图2。
消化道念珠菌病例检测：试验期间，对罹患鸽口疮、口腔溃疡、嗉囊酸臭肿胀等疑似念珠菌病的病例进行病理学解剖、采集病变部位进行念珠菌分离与鉴定，综合确诊消化道念珠菌病例，测定结果见表3和图3。
表3不同组别处理对幼鸽上消化道念珠菌载量和发病率的影响
Figure BDA0003075470940000111
由表3和图2可知，与枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、溶纤维丁酸弧菌单方制剂比较，本发明提供的制剂显著减少幼鸽上消化道念珠菌载量(P﹤0.01)；与对照组比较，枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、溶纤维丁酸弧菌单方制剂显著减少幼鸽上消化道念珠菌分离载量(P﹤0.01)，但减少效果显著低于本发明提供的制剂(P﹤0.01)。
由表3和图3可知，与枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、溶纤维丁酸弧菌单方制剂比较，本发明提供的制剂显著降低幼鸽上消化道念珠菌病发病率(P﹤0.05)；与对照组比较，枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、溶纤维丁酸弧菌单方制剂显著降低幼鸽上消化道念珠菌病发病率(P﹤0.05)，但降低效果显著低于本发明提供的制剂(P﹤0.05)。
血清免疫指标的测定：于第20日龄，每个重复选取2只接近于平均体重的幼鸽，翅下静脉采血，分离血清，-30℃保存备用。采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)的含量，测定结果见表4和图4，用血凝抑制试验测定新城疫免疫抗体滴度，测定结果见表5和图5。
表4不同组别处理对幼鸽血清免疫球蛋白的影响
Figure BDA0003075470940000121
表5不同组别处理对幼鸽NDV抗体的影响
Figure BDA0003075470940000122
由表4和图4可知，20日龄时，与枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、溶纤维丁酸弧菌单方制剂、对照组比较，本发明提供的制剂显著提高血清IgA、IgG的含量(P﹤0.05)。
由表5和图5可知，20日龄时，本发明提供的制剂NDV免疫抗体滴度显著高于枯草芽孢杆菌组、罗伊氏乳杆菌组、、嗜热链球菌组、溶纤维丁酸弧菌组、对照组(P﹤0.05)。
应用例2
选取30日龄银王肉鸽70只，雌雄各半，体重相近(500g±20g)，分成7个试验组，每组10只；从30日龄开始试验。试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别为微生物菌剂Ⅰ组(实施例1制备的制剂)、微生物菌剂Ⅱ组(实施例2制备的制剂)、微生物菌剂Ⅲ组(实施例3制备的制剂)，Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组分别为复合制剂Ⅰ组(实施例4制备的制剂)、复合制剂Ⅱ组(实施例5制备的制剂)、复合制剂Ⅲ组(实施例6制备的制剂)，每只鸽分别口腔滴服实施例1～6制备的制剂0.15ml，每日1次，连续使用5日；试验Ⅶ组为空白对照组，每只鸽口腔滴服生理盐水0.15ml，每日1次，连续使用5日；试验期20日。
饲养管理
试验在南宁市顶哈肉鸽养殖农民专业合作社进行，鸽舍为3层垂直式鸽笼，每笼饲养5只青年鸽，喂料方式为行走式自动饲喂机，分6:30～8:30、10:30～11:30、14:30～15:30和17:30～19:00四个时间段定时饲喂，自动饮水，光照、温控、卫生等按常规饲养管理，每天观察记录肉鸽精神状态和采食情况。饲喂相同基础日粮与保健砂；基础日粮组成及营养水平见表6。
表6基础日粮与营养水平(wt.％；MJ/Kg)
原料 含量 营养水平 含量
玉米 35.0 代谢能 14.3
豌豆 20.0 粗蛋白质 14.6
高粱 6.5 粗纤维 4.9
小麦 7.5 钙 1.04
火麻仁 1.0 磷 0.60
肉鸽颗粒饲料 30.0
测试指标与方法
采用SPSS20.0统计软件进行方差分析，Duncan's法进行组间差异性比较，试验数据以(平均值±标准差)表示。
血清免疫指标的测定：试验期结束，翅下静脉采血，分离血清，-30℃保存备用。采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)的含量。测定结果见表7和图6。
表7不同组别处理对幼鸽血清免疫球蛋白的影响
Figure BDA0003075470940000141
由表7和图6可知，50日龄时，与微生物组合菌剂、对照组比较，本发明提供的制剂显著提高血清IgA、IgG的含量(P﹤0.05)。
免疫器官指数的测定：试验期结束，逐一屠宰，摘取脾脏、法氏囊、胸腺，称取重量，计算免疫器官指数。免疫器官指数(g/kg)＝免疫器官重量(g)/活重(kg)。测定结果见表8和图7。
表8不同组别处理对幼鸽免疫器官指数的影响
Figure BDA0003075470940000142
由表8和图7可知，50日龄时，与微生物组合菌剂、对照组比较，本发明提供的制剂显著提高幼鸽免疫器官脾脏指数、胸腺指数、法氏囊指数(P﹤0.05)。
应用例3
微生态制剂对念珠菌的体外竞争抑制试验
将白色念珠菌接种到沙氏葡萄糖琼脂培养基进行复苏培养，采用平板计数法计数，将菌液浓度调节至l×108CFU/mL备用。分为8组，即复配菌剂Ⅰ组(实施例1制备的制剂)、复配菌剂Ⅱ组(实施例2制备的制剂)、复配菌剂Ⅲ组(实施例3制备的制剂)、枯草芽孢杆菌组(对比例1制备的微生物菌剂)、罗伊氏乳杆菌组(对比例2制备的微生物菌剂)、嗜热链球菌组(对比例3制备的微生物菌剂)、溶纤维丁酸弧菌组(对比例4制备的微生物菌剂)、白色念珠菌对照组；每组盛装10mL RPMI-1640液体培养基的试管5支。每只试管接种白色念珠菌液100μL，37℃培养；除对照组外，于12h后，接入各组相应菌剂100μL，37℃继续培养24h。
微生态制剂对念珠菌的体内竞争抑制试验
选取银王鸽产鸽240对和同批孵化出雏的幼鸽960只，每对产鸽哺育4只幼鸽，乳鸽称量初始体重后随机分成8个试验组，每组30对产鸽和120只幼鸽；每组6个重复，每个重复5对产鸽和20只幼鸽；从幼鸽第2日龄开始试验。试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别为复配菌剂Ⅰ组(实施例1制备的制剂)、复配菌剂Ⅱ组(实施例2制备的制剂)、复配菌剂Ⅲ组(实施例3制备的制剂)，每只幼鸽分别口腔滴服实施例1～3制备的制剂0.1ml，每日1次，连续使用5日；试验Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组、Ⅶ组分别为枯草芽孢杆菌组(对比例1制备的微生物菌剂)、罗伊氏乳杆菌组(对比例2制备的微生物菌剂)、嗜热链球菌组(对比例3制备的微生物菌剂)和溶纤维丁酸弧菌组(对比例4制备的微生物菌剂)，每只幼鸽分别口腔滴服对比例1～4制备的微生物菌0.1ml，每日1次，连续使用5日；试验Ⅷ组为空白对照组，每只幼鸽口腔滴服生理盐水0.1ml，每日1次，连续使用5日；幼鸽第7日龄时，进行新城疫(ND)疫苗(Lasota)点眼免疫，每只1羽份。试验期至幼鸽20日龄。
饲养管理
试验在南宁市顶哈肉鸽养殖农民专业合作社进行，鸽舍为3层垂直式鸽笼，每笼饲养1对亲鸽和4只幼鸽，喂料方式为行走式自动饲喂机，分6:30～8:30、10:30～11:30、14:30～15:30和17:30～19:00四个时间段定时饲喂，自动饮水，光照、温控、卫生等按常规饲养管理，每天观察记录肉鸽精神状态和采食情况。饲喂相同基础日粮与保健砂；基础日粮组成及营养水平见表9。
表9基础日粮与营养水平(wt.％；MJ/Kg)
原料 含量 营养水平 含量
玉米 32.0 代谢能 13.1
豌豆 23.0 粗蛋白质 16.3
高粱 4.5 粗纤维 3.0
小麦 5.5 钙 1.02
肉鸽颗粒饲料 35.0 磷 0.65
测试指标与方法
采用SPSS20.0统计软件进行方差分析，Duncan's法进行组间差异性比较，试验数据以(平均值±标准差)表示。
体外竞争抑制试验念珠菌数量测定：各组在试验第12、24、36小时取样，进行梯度稀释涂板计数，每个梯度做2个平行，测定结果见表10。
表10体外竞争抑制试验白色念珠菌数量(单位CFU/mL)
12h 24h 36h
复配菌剂Ⅰ组 (4.21±0.26)×10<sup>9</sup> (2.65±0.13)×10<sup>5a</sup> (6.28±0.29)×10<sup>2a</sup>
复配菌剂Ⅱ组 (4.41±0.17)×10<sup>9</sup> (3.16±0.20)×10<sup>5a</sup> (5.69±0.31)×10<sup>2a</sup>
复配菌剂Ⅲ组 (4.36±0.29)×10<sup>9</sup> (2.94±0.19)×10<sup>5a</sup> (6.04±0.22)×10<sup>2a</sup>
枯草芽孢杆菌组 (4.31±0.21)×10<sup>9</sup> (1.86±0.08)×10<sup>7b</sup> (7.24±0.55)×10<sup>5b</sup>
罗伊氏乳杆菌组 (4.29±0.18)×10<sup>9</sup> (3.24±0.12)×10<sup>7b</sup> (8.31±0.61)×10<sup>5b</sup>
嗜热链球菌组 (4.38±0.25)×10<sup>9</sup> (3.96±0.17)×10<sup>7b</sup> (8.27±0.59)×10<sup>5b</sup>
溶纤维丁酸弧菌组 (4.26±0.24)×10<sup>9</sup> (3.37±0.21)×10<sup>7b</sup> (8.05±0.48)×10<sup>5b</sup>
念珠菌对照组 (4.33±0.20)×10<sup>9</sup> (8.78±0.39)×10<sup>9c</sup> (2.66±0.18)×10<sup>10c</sup>
由表10可知，3个复配菌剂组、4个单方菌剂组均对先接种定植的白色念珠菌表现出竞争性抑制作用，而且复配菌剂对白色念珠菌的竞争性抑制作用显著优于各单方菌剂(P﹤0.01)；24h时，复配菌剂组白色念珠菌含量比对照组下降4个数量级，比单方菌剂组下降2个数量级；36h时，复配菌剂组白色念珠菌含量比对照组下降8个数量级，比单方菌剂组下降3个数量级。
念珠菌载量测定：于第10日龄，以重复为单位，每个重复随机选取4只幼鸽，利用无菌棉拭子沾湿生理盐水后于口咽部进行标本采集；另外选取2只接近平均体重的幼鸽屠宰，剪开嗉囊，剥离食物，利用无菌棉拭子沾湿生理盐水后采集嗉囊标本。每份采集标本用生理盐水定量稀释，接种科玛嘉念珠菌显色培养基，置于30℃生化培养箱培养24～48h，进行念珠菌总数测定，测定结果见表11和图8。
消化道念珠菌病例检测：试验期间，对罹患鸽口疮、口腔溃疡、嗉囊酸臭肿胀等疑似念珠菌病的病例进行病理学解剖、采集病变部位进行念珠菌分离与鉴定，综合确诊消化道念珠菌病例，测定结果见表11和图9。
表11不同组别处理对幼鸽上消化道念珠菌载量和发病率的影响
Figure BDA0003075470940000171
由表11和图8可知，与枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、溶纤维丁酸弧菌单方制剂比较，本发明提供的复配菌剂显著减少幼鸽上消化道念珠菌载量(P﹤0.01)；与对照组比较，枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、溶纤维丁酸弧菌单方制剂显著减少幼鸽上消化道念珠菌分离载量(P﹤0.01)，但减少效果显著低于本发明提供的复配菌剂(P﹤0.01)。
由表11和图9可知，与枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、溶纤维丁酸弧菌单方制剂比较，本发明提供的复配菌剂显著降低幼鸽上消化道念珠菌病发病率(P﹤0.05)；与对照组比较，枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、溶纤维丁酸弧菌单方制剂显著降低幼鸽上消化道念珠菌病发病率(P﹤0.05)，但降低效果显著低于本发明提供的复配菌剂(P﹤0.05)。
综上所述，本发明提供的预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂或预防鸽形目念珠菌病的制剂不仅可以快速形成益生菌优势菌群，抑制念珠菌等内源性致病菌生长繁殖，调节、提高机体免疫力与抗病力，有效预防鸽形目念珠菌病，而且还可以减少乳鸽饲养期间抗生素的使用或滥用，提高乳鸽食品安全性与产品品质，提高肉鸽产业综合经济效益与社会效益。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂，其特征在于，包括以下重量份的组分：枯草芽孢杆菌35～50份、罗伊氏乳杆菌25～35份、嗜热链球菌10～18份和溶纤维丁酸弧菌10～18份；
所述枯草芽孢杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL，所述罗伊氏乳杆菌的有效活菌数≥5×109CFU/mL，所述嗜热链球菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL，所述溶纤维丁酸弧菌的有效活菌数≥1×108CFU/mL。
2.一种预防鸽形目念珠菌病的制剂，其特征在于，包括以下重量份的组分：权利要求1所述的微生物菌剂85～88份和免疫增强剂2～2.8份。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述免疫增强剂包括桃金娘脂多糖和/或野牡丹多糖。
4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，当所述免疫增强剂为桃金娘脂多糖和野牡丹多糖时，所述桃金娘脂多糖和野牡丹多糖的重量比为(1.6～2):(1～1.4)。
5.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述制剂的剂型包括口服液；当所述剂型为口服液时，所述制剂还包括稳定剂，所述稳定剂与微生物菌剂的重量比为(1.9～4):(85～88)；
所述稳定剂包括氯化钠、β-环糊精或泊洛沙姆中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，当所述稳定剂为氯化钠和泊洛沙姆时，所述氯化钠和泊洛沙姆的重量比为(1.5～3):(1～2.5)。
7.根据权利要求5或6所述的制剂，其特征在于，所述制剂的pH值为6.5～7。
8.权利要求5～7任一项所述预防动物念珠菌病的制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述微生物菌剂、免疫增强剂、稳定剂和水混合后，调节pH值为6.5～7，得到预防动物念珠菌病的制剂；所述稳定剂和水的重量比为(1.9～4)：(2.5～7.6)。
9.权利要求1所述预防鸽形目念珠菌病的微生物菌剂或权利要求2～7任一项所述预防鸽形目念珠菌病的制剂或利用权利要求8所述制备方法得到的预防鸽形目念珠菌病的制剂在制备防治鸽形目念珠菌病药物中的应用；其特征在于，所述鸽形目包括鸽属动物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述鸽属动物包括乳鸽。
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