CN107849564A

CN107849564A - 用于检测致病性钩端螺旋体菌株的测定

Info

Publication number: CN107849564A
Application number: CN201680032326.XA
Authority: CN
Inventors: E·P·约翰逊
Original assignee: Quest Diagnostics Investments LLC
Current assignee: Quest Diagnostics Investments LLC
Priority date: 2015-04-03
Filing date: 2016-04-04
Publication date: 2018-03-27
Also published as: US20210164022A1; EP3277847A2; US20190085376A1; US10907218B2; MX2017012741A; BR112017021135A2; WO2016161412A2; EP3277847A4; CA2981679A1; MX2021004701A; WO2016161412A3

Abstract

本发明提供了用于确定测试样品中致病性钩端螺旋体的存在和/或量的方法和组合物。特别地，描述了基本上纯化的寡核苷酸引物和探针，其可以通过扩增方法用于定性和定量检测测试样品中的病原性钩端螺旋体核酸。本发明还提供用于产生和检测对照核酸序列的引物和探针，其提供用于评估钩端螺旋体测定的内部质量控制的简便方法。

Description

用于检测致病性钩端螺旋体菌株的测定

发明领域

一般而言，本发明涉及用于检测测试样品中致病性钩端螺旋体的组合物和方法。

发明背景

提供发明背景的下述讨论仅为辅助读者理解本发明，而并非承认本发明描述或构成现有技术。

钩端螺旋体病是由钩端螺旋体属的水性螺旋体引起的。直到最近，通过血清学数据将钩端螺旋体种分为两种，问号钩端螺旋体(L.interrogans)和非致病性双曲钩端螺旋体(L.biflexa)，共包含230多种血清变型。更近期地，序列信息已经允许将钩端螺旋体分为16个基因种，包括问号钩端螺旋体、双曲钩端螺旋体、L.kirshneri和L.borgpetersenii。不幸的是，不能将这些种整齐分类为致病性和非致病性，因为两类血清变型都存在于任何给定的基因种中。尽管存在该复杂性，问号钩端螺旋体血清变型出血性黄疸型(L.interrogans serovars icterohaemorrhagiae)、copenhageni、lai、australis和autumnalis是人类中最常见的，其中黄疸出血型钩端螺旋体通常引起最严重的症状。

尽管不需要直接接触，钩端螺旋体感染的来源是通过暴露于受感染动物的尿液。感染经常在已经接触过受污染水体的患者中发现。钩端螺旋体经由切口和擦伤或与粘膜接触进入体内，温育持续2-20天。该细菌首先感染血液，然后感染CSF，通常在出现症状后第三周从两者中清除。钩端螺旋体可以在症状发作后一周内在尿液中发现，不治疗下可以继续存在数月或数年。

钩端螺旋体病的症状具有广泛的严重性。大多数感染个体无症状或有温和的症状，且不寻求医疗救助。然而有些人有能导致死亡的更严重的症状。症状可能突然发生，包括发烧、发冷、头痛、身体疼痛、腹痛、结膜充血，有时是皮肤疹。头痛和肌痛可能是严重的，且高达25％的患者患有无菌性脑膜炎。所有钩端螺旋体病患者中的5％至10％患有黄疸性钩端螺旋体病，有时称为外韦尔病(Weil’s disease)，这是更严重的情况，病例中5％至15％是致死的。症状包括先天性疾病中的那些，并且在许多病例中也可以包括黄疸、肝衰竭或急性肾功能衰竭。呼吸和心脏的牵涉也是常见的，并且可能导致呼吸窘迫综合征或心肌炎。

在临床环境中检测钩端螺旋体是麻烦的。血清学研究是耗时和复杂的，且培养可能需要6至26周。此外，该细菌在尿液中迅速丧失活力，原代样品类型和培养测试提供有限的效用。与此相反，实时PCR检测是快速、灵敏的，且不需要生物体的活力。样品可以冷冻或与防腐剂混合用于运输。虽然钩端螺旋体的分类学是复杂的，但16S序列数据表明致病性和非致病性亚种可以通过PCR区分。设计公开的方法和组合物以仅检测致病性的种。没有检测如双曲钩端螺旋体(L.biflexa)的非致病种。此外，利用基于PCR的方法将允许测试血液、CSF或尿液，以便在早期测试时给出感染阶段的指示。

一些报告公开了在核酸扩增步骤如PCR之后的患者样品的测定法(Brown等,Evaluation of the polymerase chain reaction for early diagnosis ofleptospirosis.J.Med.Microbiol.43:110-114,1995and Smythe等,A quantitative PCR(TaqMan)assay for pathogenic Leptospira spp.BMC Infectious Diseases.2(13),2002)，但这些参考文献没有教导仅检测致病性钩端螺旋体DNA的方法。其它相关的参考文献描述了目前对钩端螺旋体血清变型中基因型差异的理解(Levett,P.N.,Leptospirosis.Clinical Microbiology Reviews.14(2):296-36,2001；Brenner等,Further determination of DNA relatedness between serogroups and serovars inthe family Leptospira ceae with a proposal for Leptospira alexanderisp.nov.and four new Leptospira genomospecies.Int.J.Syst.Bacteriol.49:839-858,1999；Ramadass等,Genetic characterization of pathogenic Leptospira species byDNA hybridization.Int.J.Syst.Bacteriol.42:215-219,1992；Yasuda等,Deoxyribonucleic acid relatedness between serogroups and serovars in thefamily Leptospira ceae with proposals for seven new Leptospiraspecies.Int.J.Syst.Bacteriol.37:407-415,1987；World HealthOrganization.Leptospirosis worldwide,1999.Wkly.Epidemiol.Rec.WHO 75:217-223,1999；Edwards and Domm,Human leptospirosis.Medicine 39:117-156,1960；Kelly,Leptospirosis.p.1580-1587from:Gorbach,S.L.等,Infectious Diseases,2nd Edition,W.B.Saunders,Philadelphia PA,1998)。

然而，尽管有本领域的知识，目前还没有仅检测钩端螺旋体的致病性血清变型的方法或者也能够将致病性钩端螺旋体与其它螺旋体区分的测定。本文公开的组合物和方法旨在提供这种方法。

发明概述

本发明提供了用于确定测试样品中致病性钩端螺旋体核酸的存在和/或量的方法和组合物。特别地，本发明提供了基本上纯化的寡核苷酸，用于定性和定量检测测试样品中的钩端螺旋体核酸，并且本文描述了扩增方法。本发明可以提供一种特异性的、敏感的方法，其显示对致病性钩端螺旋体检测的广泛动态范围而不检测不相关的螺旋体或非致病性血清变型，且其可以有利地提供定量以及定性结果。本发明可以单独使用，或与临床症状或其它指标组合使用，用于将个体诊断为具有致病性钩端螺旋体。

因此，在一个方面，本公开提供在本文描述的方法中使用的寡核苷酸引物和探针以提供用于检测致病性钩端螺旋体的测定法。在某些实施方案中，本发明提供了基本上纯化的寡核苷酸，其具有选自下组的序列：

5’-AGTAACACGTGGGTAATCTTCCT-3’(SEQ ID NO:1)，

5’-TCTCTCGGGACCATCCAGTA-3’(SEQ ID NO:2)，和

5’-TGGGATAACTTTCCGAAAGGGAAG C-3’(SEQ ID NO:3)，

其中，所述寡核苷酸直接或间接地附接至可检测的标记物。

直接或间接附接可以意味着该标记物可以并入寡核苷酸，与寡核苷酸相连或缀合，或者附接可以包括多种长度的间隔臂。附接可以通过共价或非共价的方式，只要寡核苷酸可以通过本文公开的和本领域已知的方式检测。

可检测的标记物可以是荧光染料，或者可检测的标记物可以包含报告染料和淬灭剂。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸可以是5’[6～FAM]–TGGGATAACTTTCCGAAAGGGAAGC–[BHQ-1]3’。

在一些实施方案中，本发明提供基本上纯的包含SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2的寡核苷酸引物对。引物可以被可检测地标记，并且它们可以连同可检测标记的探针使用。引物对可适用于扩增致病性钩端螺旋体的16S基因或其片段或互补物，包括但不限于SEQ IDNO:4。许多致病性的钩端螺旋体血清变型的16S基因序列在该领域中是已知的，且在一些实施方案中，本发明提供了适用于扩增致病性钩端螺旋体血清变型的16S基因序列的引物对，但其不包含SEQ ID NO:1或2。

在一个方面，本发明提供了一种用于鉴定测试样品中致病性钩端螺旋体的存在或缺乏的检测方法，其包括检测16S靶核酸的存在或缺乏，该16S靶核酸包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13或其片段或互补物至少95％相同的至少15个连续的核苷酸，其中所述16S靶核酸的存在鉴定致病性钩端螺旋体的存在。

在一些实施方案中，该检测方法还包括：(a)提供适于扩增所述16S靶核酸或其片段的引物对，并提供适于与所述16S靶核酸或其片段杂交的可检测标记的探针，(b)当所述16S靶核酸存在于所述样品中时，在适于产生第一反应产物的条件下，进行包含步骤(a)的引物对的引物延伸反应，以及(c)通过检测所述探针可检测标记物的存在或缺乏来确定致病性钩端螺旋体的存在或缺乏。

在另一个方面，本发明提供在检测方法中使用的引物对中的至少一个成员包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。可替换地，引物对中的至少一个成员由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2组成。在另一个方面，可检测标记的探针可以包含SEQ ID NO:3或由5’[6～FAM]–TGGGATAACTTTCCGAAAGGGAAGC–[BHQ-1]3’组成。

在一个方面，本发明提供了一种用于检测测试样品中致病性钩端螺旋体核酸的存在或量的方法，包括：

(a)如果致病性钩端螺旋体核酸存在于所述样品中，使用具有SEQ IDNO：1和SEQID NO：2所示序列的寡核苷酸引物对扩增致病性钩端螺旋体核酸；

(b)在酶存在的情况下,将所述扩增的致病性钩端螺旋体核酸与具有SEQ ID NO：3所示序列的寡核苷酸探针杂交，当所述探针与所述致病性钩端螺旋体核酸杂交时，所述酶切割所述探针；以及

(c)检测来自所述探针的信号，其中所述信号指示所述测试样品中致病性钩端螺旋体核酸的存在或量。

在一些实施方案中，测试样品可以选自下组：血清、血液、血浆、脑脊髓液、滑液和尿液。在一些实施方案中，致病性钩端螺旋体核酸在扩增核酸之前从所述测试样品提取，而在其它实施方案中，测试样品可以直接使用。在一些实施方案中，所述探针可以包含报告染料和淬灭剂，并且在一些实施方案中，所述报告染料可以是6～FAM，所述淬灭剂可以是BHQ-1。

在一个方面，本发明提供一种诊断疑似具有致病性钩端螺旋体的个体的方法，包括：

(a)从所述疑似具有致病性钩端螺旋体的个体获得样品，

(b)从所述样品提取基本上纯的核酸，

(c)在包含SEQ ID NO:3的可检测标记的探针和包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对存在下进行扩增反应，其中，当来自所述样品的核酸通过所述引物对扩增时，在聚合酶存在下，可检测标记的探针与来自所述样品的核酸的相应序列的杂交会将从所述探针上切割所述可检测的标记物，

(d)检测来自所述探针的可检测标记物的信号，其中所述信号指示所述样品中的致病性钩端螺旋体核酸的存在或量，以及

(e)如果检测出所述信号，则确定所述疑似具有致病性钩端螺旋体的个体有致病性钩端螺旋体，如果没有检测出所述信号，则将所述个体诊断为没有致病性构端螺旋体。

在一些实施方案中，所述扩增反应可以包括实时PCR。在一些实施方案中，所述探针可以包含报告染料和淬灭剂，并且在一些实施方案中，所述报告染料可以是6～FAM，所述淬灭剂可以是BHQ-1。

在一个方面，本发明提供了一种包含引物对和探针的试剂盒，所述引物对与包含SEQ ID NO:4、其片段或互补物的靶核酸特异性杂交，所述探针与SEQ ID NO:4、其片段或互补物的靶核酸特异性杂交。

在所述试剂盒的一些实施方案中，所述引物对的至少一个成员包含SEQ ID NO:1或2，或其互补物的序列。在一些实施方案中，所述引物对由第一引物和第二引物组成，其中所述第一引物包含SEQ ID NO:1或其互补物，且所述第二引物包含SEQ ID NO:2或其互补物。在一些实施方案中，所述探针可以包含SEQ ID NO:3或其互补物。在一些实施方案中，在所述探针上的可检测标记物包含报告染料和淬灭剂，并且在一些实施方案中，所述报告染料可以是6～FAM，所述淬灭剂可以是BHQ-1。

在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含引物对和可检测标记的探针，所述引物对与包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、或其片段或互补物的靶核酸特异性杂交，所述可检测标记的探针与包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、或其片段或互补物的靶核酸特异性杂交。在一些实施方案中，所述可检测的探针包含报告染料和淬灭剂，并且在一些实施方案中，所述报告染料可以是6～FAM，所述淬灭剂可以是BHQ-1。

附图简述

图1显示来自所述公开的钩端螺旋体测定法的典型的扩增绘图。小图A显示在线性视图中的高阳性、低阳性、和阴性结果。小图B显示对数视图中的高阳性、低阳性、和阴性结果。

图2显示来自引物和探针组验证的结果。组1显示在小图A中，组2显示在小图B中，且组3显示在小图C中。

发明详述

本发明提供快速且灵敏地确定测试样品中致病性钩端螺旋体核酸的方法和组合物。特别地，描述了可用于定量或定性地检测样品中的致病性钩端螺旋体核酸的方法中的寡核苷酸探针和引物。本发明还提供了用于产生和检测对照核酸序列的引物和探针，其为评估所述公开的钩端螺旋体测定的内部质量控制(control)提供一种便利的方法。

除另有说明，如本文所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代。因此，例如提及“寡核苷酸”包括多个寡核苷酸分子，而提及“核酸”是指一个或多个核酸。

如本文所用的“约”意指加或减10％。

如本文所用的，提及寡核苷酸的术语“基本上纯的”不需要绝对纯度。相反，它表示该序列比在自然环境中相对更纯的表示。这样的寡核苷酸可以通过许多方法获得，包括，例如，实验室合成、限制酶消化、从样品提取或分离、或PCR。“基本上纯的”寡核苷酸优选地大于50％纯，更优选地至少75％纯，甚至更优选地至少95％纯，以及最优选地98％纯。

如本文所用的术语“寡核苷酸”意指由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任意组合组成的短的聚合物。这些寡核苷酸长度为至少5个核苷酸，优选地10到70个核苷酸长，其中15到16个核苷酸是最常见的。在一些实施方案中，所述寡核苷酸用可检测的标记物结合在一起或连接到可检测的标记物。

作为引物或探针用于特异性扩增(即扩增具体的靶核酸序列)或特异性检测(即检测具体靶核酸序列)靶核酸的寡核苷酸通常能够与该靶核酸特异性杂交。

当提及寡核苷酸引物或引物对时，如本文所用的术语“适于扩增”，意为与靶核酸特异性杂交的且能够为引物延伸反应(靶核酸的互补拷贝在其中合成)提供起始位点的引物。

如本文所用的术语“杂交”意指两个互补核酸链在适当严格的条件下彼此退火的过程。通常优选地用探针-长度核酸分子进行杂交，优选地长度为10-100个核苷酸。核酸杂交技术是本领域公知的。参见例如Sambrook等,1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Second Edition,Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY。本领域技术人员了解如何估计和调整杂交条件的严格性，使得具有至少合意的互补性水平的序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列则不会。关于杂交条件和参数的实例，参见例如Sambrook等,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring HarborPress,Plainview,NY；Ausubel,F.M.等.1994,Current Protocols in MolecularBiology.John Wiley&Sons,Secaucus,N.J。

如本文所使用的术语“严格的杂交条件”意指至少如以下杂交条件一样严格：在50％甲酰胺、5X SSC、50mM NaH₂PO4、pH 6.8、0.5％SDS、0.1mg/mL超声处理的鲑鱼精子DNA、和5X Denhart's溶液中42℃过夜杂交；用2X SSC，0.1％SDS在45℃洗涤；并用0.2X SSC，0.1％SDS在45℃洗涤。在另一个实施例中，严格的杂交条件不应允许伸展开超过20个连续核苷酸都不同的两个核酸有超过两个碱基的杂交。

如本文所用的术语“靶核酸”或“靶序列”意指包括要扩增和/或检测的目的核苷酸的区段的序列。将在扩增反应过程中产生的靶序列的拷贝称为扩增产物或扩增子。靶核酸可以由染色体区段、有或没有基因间序列的完整基因、有或没有基因间序列的基因的区段或部分、或针对其设计探针或引物的核酸序列组成。靶核酸可以包括野生型序列、突变、缺失或复制、串联重复区、感兴趣的基因、感兴趣的基因的区域或其任何上游或下游区域。靶核酸可以代表具体基因的可替换序列或等位基因。靶核酸可以来源于基因组DNA、cDNA、或RNA。本文所用的靶核酸可以是提取自细胞的DNA或RNA或从其拷贝或扩增的核酸，或可以包括进一步用亚硫酸氢盐反应(bisulfite reaction)转换的提取的核酸。

如本文所用的，术语“钩端螺旋体核酸”意指包含来自钩端螺旋体基因组的连续序列的DNA和/或RNA，或其互补序列。钩端螺旋体核酸可以是钩端螺旋体基因组DNA，钩端螺旋体信使RNA，或这些来源的互补物，其通过任何方法获得，包括从生物来源获得该核酸、在体外合成该核酸，或通过本领域已知的任何方法来扩增该核酸。

如本文所用的术语“扩增(amplification)”或“扩增(amplify)”包括复制靶核酸，从而增加所选核酸序列的拷贝数的方法。扩增可以是指数或线性的。靶核酸可以是DNA或RNA。以这种方式扩增的序列形成“扩增子”或“扩增产物”。虽然下文描述的示例性方法通常涉及使用聚合酶链式反应(PCR)的扩增，但是本领域已知用于核酸扩增的许多其它方法(例如等温法，滚环法等)。本领域技术人员会理解，这些其它方法可用于代替PCR方法或与PCR方法一起使用。参见例如Saiki,“Amplification of Genomic DNA”in PCR Protocols,Innis等编,Academic Press,San Diego,CA 1990,pp.13-20；Wharam等,Nucleic AcidsRes.,2011年7月1日；29(11):E54-E54；Hafner等,Biotechniques,2011年4月；30(4):852-56,858,860；Zhong等,Biotechniques,2011年4月；30(4):852-6,858,860,2001。

如本文使用提及多核苷酸(即核苷酸序列如寡核苷酸或靶核酸)的术语“互补”、“互补的”或“互补性”意指标准沃森/克里克(Watson/Crick)配对规则。核酸序列的互补是按照“反向平行结合”的，如一个序列的5’末端与另一序列的3’末端配对。例如，序列“5’-A-G-T-3’”与序列“3’-T-C-A-5’”是互补的。一些天然核酸中不常见的碱基可以包括在本文所述的核酸中；其包括，例如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)、锁核酸(LNA)、和肽核酸(PNA)。互补性不需要是完美的；稳定的双螺旋可以含有错配的碱基对、简并的(degenerative)或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员能按经验考虑一些变量来确定双螺旋稳定性，所述变量包括，例如寡核苷酸长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对发生率。互补序列还可以是与DNA序列或其互补序列互补的RNA序列，并且还可以是cDNA。本文所用的术语“基本互补”意指两个序列特异性地杂交(如上文所定义)。技术人员会理解，基本互补的序列不需要沿其全长杂交。

如本文所用的术语“样品”、“测试样品”或“生物样品”意指认为包含钩端螺旋体核酸的任何液体或固体材料。在优选的实施方案中，测试样品获取自生物来源，如培养中的细胞或来自动物(最优选人)的组织或液体样品。本发明的优选样品包括但不限于：血浆、血清、全血、血细胞、淋巴液、脑脊液、滑液、尿液、唾液和皮肤或其它器官(例如活检材料)。本文所用的术语“患者样品”也可以指获取自寻求诊断或治疗钩端螺旋体感染相关疾病的人的组织样品。这些术语中的每一个可以互换使用。

如本文所用的术语“可检测的标记物”意指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学或化学方法如荧光，化学荧光，或化学发光，或任何其它适当的方法检测的组合物或模块。优选的可检测的标记物是荧光染料分子，或荧光染料，如荧光素、藻红蛋白(phycocrytherin)、CY3、CY5，异藻蓝素(allophycocyanine)、德克萨斯红(Texas Red)、亚季宁素叶绿素(peridenin chlorophyll)、花青、FAM、6～FAM、JOE、TAMRA、串联偶联物如藻红蛋白-CY5(phycoerythrin-CY5)等。这些实施例并不意味着是限制性的。

本文所用的术语“荧光染料”意指在一个波长处吸收电磁辐射的量子(quantum)，并在不同的，通常较长的波长的发射一个或多个光子作为响应的分子。在优选的实施方案中，荧光染料可以是显示荧光能量转移的物理连接的荧光染料对的成员。在激发供体荧光染料的波长处，能量传递对可以被电磁辐射的量子激发；然而，在缺乏受体的情况下会期望来自供体荧光染料的荧光至少部分淬灭，并且观察到所述受体荧光染料的发射波长处的发射。

在具体优选的实施方案中，荧光染料是物理连接的“分子信标”对的一个成员。在这些实施例中，在激发该对的第一荧光染料成员的波长处，分子信标对可以被电磁辐射的量子激发；然而，在缺乏第二荧光染料的情况下会期望来自第一荧光染料的荧光至少部分淬灭。然而，不同于能量转移对，未观察到在所述受体荧光染料的发射波长处的发射。因此，这些标记物包含染料对，其中之一被称为“报告剂(reporter)”，其中第二个被称为“淬灭剂”。当两种染料保持紧密接近时，例如在核酸探针末端，所述淬灭剂模块阻止了来自所述报告剂模块的荧光信号的检测。然而，当两种染料分离时，来自所述报告剂模块的荧光信号变得可检测。

如本文所用的，“蝎形(Scorpion)引物”或“蝎形探针”意指具有带有5'延伸的探针尾的3'引物的寡核苷酸，该5'延伸的探针尾具有拥有荧光团/淬灭剂对的发夹结构。任选地，蝎形引物/探针还包含将探针模块从引物模块分离的扩增阻断剂(例如六甘醇(“HEG”))。

如本文所用的，术语“蝎形检测系统”意指用于实时PCR的方法。该方法利用双官能团的分子(本文称“蝎形”)，其包含通过聚合酶-阻断基团共价地连接至探针元件的PCR引物元件。另外，每个蝎形分子包含荧光团，该荧光图案与淬灭剂相互作用以减少背景荧光。

在检测来自可检测标记物的信号以指示所述样品中靶核酸存在的语境中，如本文所用的术语“检测”不需要该方法提供100％灵敏度和/或100％特异性。众所周知的是，“灵敏度”是假设人具有靶核酸序列时测试为阳性的概率，而“特异性”是假设人不具有靶核酸序列时测试为阴性的概率。至少50％的灵敏度是优选的，而至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％的灵敏度明显是更优选的。至少50％的特异性是优选的，而至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％的特异性明显是更优选的。检测还涵盖了具有假阳性和假阴性的测定。假阴性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。假阳性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。

如本文所用的“PCR检测”意指一种用于实时PCR的方法。在该方法中，与扩增的核酸区段杂交的探针包含于PCR反应混合液中。所述探针在探针的每一端各包含报告染料和淬灭剂荧光团，并且互相足够接近(in close enoughproximity)，从而所述报告剂的荧光由所述淬灭剂占据。然而，当该探针与扩增的区段杂交时，Taq聚合酶的5’-核酸外切酶活性切割探针，由此允许报告荧光团激发可检测的荧光。

基因片段语境中的“片段”意指核苷酸残基序列，其为至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、或至少约100个核苷酸。片段通常小于约400个核苷酸、小于约300个核苷酸、小于约250个核苷酸、小于约200个核苷酸、或小于150个核苷酸。在某些实施方案中，所述片段可用于多种杂交程序或微阵列程序中，以鉴定具体的病原体。

当指代核酸(例如寡核苷酸)时，“分离的”意指与其天然存在的基因组实质部分分开(apart from)的核酸。例如，已经合成地产生的任何核酸(例如通过系列碱基缩合)认为是分离的。同样，通过引物延伸反应(例如，PCR)产生的、重组表达的、或其他从基因组剪切的核酸也认为是分离的。

如本文所用的术语“接头”意指用于将一个模块与另一个连接的一个或多个化学键或化学基团，其作为二硫桥发挥作用，其中其提供两个其它化学模块间的基团。

钩端螺旋体测定：

本文公开的组合物和方法包含用于扩增和检测来自钩端螺旋体的靶DNA序列的引物和探针。所公开的DNA引物与钩端螺旋体的致病株如问号钩端螺旋体(L.interrogans)和kirchneri钩端螺旋体(L.kirchneri)的16S核糖体RNA基因中的侧翼靶区域杂交。该测定法中使用的DNA引物不与非致病株如双曲钩端螺旋体的16S基因或媒介物致病株像illini钩端螺旋体(L.illini)杂交。所公开的组合物和方法还将允许检测仅在世界的特定地区中常见的致病株，L.santarosai和L.weilii。

在一些实施方案中，所述方法包括从受试者中获得生物样品，从该样品中提取DNA，以及对该提取的DNA进行检测测定，其中DNA与针对钩端螺旋体致病性菌株的16S核糖体RNA基因特异性的可检测标记的探针和引物接触。

样品收集和制备：

样品可以包含血液、血浆、尿液、唾液、脑脊髓液(CSF)、组织样品、或其它常用类型的生物样品。

在一些实施方案中，可以将尿液收集在带有防漏盖的无菌、塑料容器中，然后在-20至-70℃冷冻。应避免重复冷冻和解冻。尿液样品可以被冷冻运输，或者，可替换地，立即转移到特定的尿液运输管中，例如尿液样本运输管。

在一些实施方案中，CSF可以收集在带有防漏盖的无菌、塑料容器中。可选地，可以将血液收集在无菌管中，优选地所述无菌管含有EDTA或另一种抗凝血剂。这些样品可以在2-8℃冷藏时储存和运输。

核酸分离或提取：

所述核酸(DNA或RNA)可以根据本领域技术人员熟知的任何方法从样品中分离。如果需要，可以通过离心等收集或浓缩所述样品。所述样品的细胞可以经过裂解，例如通过用酶、热、表面活性剂、超声破碎法或其组合进行。进行所述裂解处理是为了获得足够数量的源自该病原体的核酸(如果存在于该样品中)以使用聚合酶链反应进行检测。DNA提取方法可以包括但不限于乙醇沉淀、有机萃取如苯酚-氯仿提取、盐析或盐沉淀、氯化铯浓度梯度、阴离子交换法、基于二氧化硅的方法(包括市售的管柱试剂盒)、和自动化高通量纯化系统。

在一个实施方案中，DNA提取可以使用MagNA Pure LC自动化核酸提取系统或类似的自动化核酸提取系统进行。许多商业试剂盒还生产合适的DNA，包括但不限于：QIAamp^TM微型血液试剂盒、Agencourt Genfind^TM，RocheRoche MagNA或者用Eppendorf Phase Lock的苯酚-氯仿萃取。

钩端螺旋体特异性引物和探针：

在本发明的各种实施方案中，寡核苷酸引物和探针可用于本文描述的方法中以扩增和检测致病性钩端螺旋体的靶序列。在某些实施方案中，靶核酸可以包括钩端螺旋体致病株例如问号钩端螺旋体和kirchneri钩端螺旋体的16S核糖体RNA基因。此外，第二组引物也可用于扩增一个或多个对照核酸序列。本文所描述的靶核酸可以利用每个靶物的单个标记物单独地或以多重形式检测。

鉴于本公开，本领域技术人员能够设计和制备适于扩增靶序列的引物。用于本发明的扩增引物的长度取决于几个因素，包括核苷酸序列同一性以及在体外核酸扩增期间这些核酸杂交或使用的温度。确定具体序列同一性的扩增引物的优选的长度所必需的考虑是本领域普通技术人员所熟知的。

在一个优选的实施方案中，所述钩端螺旋体具体的引物为5’-AGTAACACGTGGGTAATCTTCCT-3’(SEQ ID NO:1)和5’-TCTCTCGGGACCATCCAGTA-3’(SEQ IDNO:2)，尽管本领域技术人员会理解可以使用其它探针。可替换的引物可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％的同一性。在其它的实施方案中，可以设计引物使得它们与钩端螺旋体16S基因的靶序列结合并适于使其扩增。例如，可设计引物以扩增SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13或其片段或互补物。

引物长度可以在10至30个核苷酸之间。例如，引物长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。本领域技术人员会理解引物的精确长度和组成取决于样品和测定条件。如本文所公开的，SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或其片段或互补物提供用于设计能够检测致病性钩端螺旋体的引物的适当靶序列。在一些实施方案中，包含SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或其片段或互补物的10-30个核苷酸的引物可以用于致病性钩端螺旋体的检测。在其它实施方案中，与包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或其片段或互补物的10-30个核苷酸的序列至少90％、至少95％或至少99％相同的引物可以用于检测致病性钩端螺旋体。表1显示SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13。

表1-16S序列

扩增靶核酸序列的额外的引物可以用，例如计算机程序，如OLIGO(MolecularBiology Insights,Inc.,Cascade,CO)设计。设计用作扩增引物的寡核苷酸时的重要特征包括但不限于：合适大小的扩增产物以促进检测(例如通过电泳或实时PCR)、引物对成员的相似熔解温度、以及每个引物的长度(即所述引物需要足够长以使序列特异性退火并引发合成，但是不要过长以至于寡核苷酸合成期间保真度降低)。通常，寡核苷酸引物长度为15至35个核苷酸。

在一些实施方案中，在一个或多个核苷酸位置可以提供具有简并性的引物混合物。简并引物在其中靶序列存在可变性的PCR中使用，即该序列信息是不明确的。通常，简并引物将在不超过约4、不超过约3、优选地不超过约2、最优选地不超过约1个核苷酸位置显示可变性。

设计用作杂交探针的寡核苷酸可以以与引物设计相似的方式进行。与寡核苷酸引物一样，寡核苷酸探针通常具有相似的融合温度，并且每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交，但是不要过长以至于合成期间保真度降低。寡核苷酸探针长度通常为15至60个核苷酸。

在一个优选的实施方案中，所述钩端螺旋体特异性探针为5’[6～FAM]–TGGGATAACTTTCCGAAAGGGAAGC-[BHQ1]3’(SEQ ID NO:3)，尽管本领域技术人员会理解可以使用其它探针。可替换的杂交探针可以与SEQ IDNO:3 70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％相同。在其它的实施方案中，可以设计探针使得它们与钩端螺旋体16S基因靶序列杂交并适合检测钩端螺旋体16S基因靶序列。例如，可以设计探针与SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或其片段或互补物杂交。

探针长度可以在10至30个核苷酸之间。例如，探针长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。本领域技术人员会理解探针的精确长度和组成取决于样品和测定条件。如本文所公开的，SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或其片段或互补物提供用于设计能够检测致病性钩端螺旋体的探针的适当靶序列。在一些实施方案中，包含SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13或其片段或互补物的10-30个核苷酸的探针可以用于检测致病性钩端螺旋体。在其它实施方案中，与包含SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或其片段或互补物的10-30个核苷酸的序列至少90％、至少95％或至少99％相同的探针可以用于致病性钩端螺旋体的检测。上面表1显示SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13。

可以检测靶核酸序列的额外的引物可以用，例如计算机程序，如OLIGO(MolecularBiology Insights,Inc.,Cascade,CO)设计。设计用作探针的寡核苷酸时的重要特征包括但不限于：合适大小的靶序列以促进检测(例如通过电泳或实时PCR)、与反应引物相比相似或更高的熔解温度(如果用在扩增反应中，像RT-PCR)、以及探针的长度(即探针需要足够长以使序列特异性退火，但是不要过长以至于保真度降低)。通常，寡核苷酸探针长度为5至40个核苷酸。

靶序列的扩增和检测：

核酸样品或分离的核酸可以通过本领域技术人员已知的多种方法扩增。优选地，PCR用于扩增感兴趣的核酸。简而言之，在PCR中，制备与靶序列的相反互补链上的区域互补的两个引物序列。将过量的脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)与DNA聚合酶例如Taq聚合酶一起添加到反应混合物中。

如果靶序列存在于样品中，则所述引物将结合至该序列，并且该聚合酶将通过添加核苷酸引起引物沿靶序列延伸。通过升高和降低所述反应混合物的温度，所述延长的引物将从标记物分离以形成反应产物，过量的引物将与所述标记物和反应产物结合并重复该过程，从而生成扩增产物。循环参数可以是变化的，这取决于待延伸的扩增产物的长度。利用寡核苷酸引物和/或探针，可以将内部阳性扩增对照(IPC)包括在样品中。所述IPC可用于监控转换过程和任何后续扩增。

在一些实施方案中，所述PCR反应可以包含35、40、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55或多至60个循环的热循环。变性温度可以在约95至105℃的范围内或约95℃，并且延长(elongation)温度可以在约50至75℃的范围内或约60℃。可以设置循环以使变性温度保持1秒到3分钟。可以设置循环使得延长温度保持1秒至3分钟。本领域技术人员会了解，除了其它方面这些参数可以取决于所使用的样品和引物等优化。

使用能够检测PCR扩增产物的积累的任何合适的仪器进行实时PCR。最常见地，该仪器能够检测来自一种或多种荧光标记物的荧光。例如，仪器上的实时检测(例如ABI实时PCR系统序列检测器)监测荧光并计算每个PCR循环期间报告信号的测量，或Rn值。阈值循环，或Ct值是在荧光与阈值相交处的循环。阈值可以由序列检测系统软件或手动确定。

可以通过本领域众所周知的许多方法中的任何一种检测核酸的扩增，例如凝胶电泳、柱层析、与探针的杂交、测序、熔解曲线分析或“实时”检测。对于实时检测，引物和/或探针可以被可检测地标记以允许例如在引物并入时或在探针杂交时的荧光发生差异，例如，在反应期间能够监测荧光变化的仪器中扩增。用于核酸扩增的实时检测方法是众所周知的并且包括例如系统、Scorpion^TM引物系统和双链核酸的嵌入染料的使用。

在一些实施方案中，通过与特异性探针杂交来检测扩增的核酸。探针寡核苷酸，其与所述扩增的靶序列的一部分互补，可以用于检测扩增的片段。杂交可以实时或非实时地检测。每个靶序列的扩增的核酸可以同时检测(即在相同的反应容器中)或单独检测(即在分开的反应容器中)。对于序列修饰的核酸，所述靶物可以独立地选自顶链或底链。因此，要检测的所有靶物可以包括顶链、底链、或顶链和底链靶物的组合。

在一些实施方案中，所述钩端螺旋体特异性引物可用于聚合酶链反应以扩增和检测致病性钩端螺旋体。所述PCR反应可以包含无菌无核酸酶的水、正向和反向引物、钩端螺旋体特异性探针、内部对照引物、以及包含DNA聚合酶、dNTP、盐、反应缓冲液和镁的“主混合液”(master mix)。正向和反向引物可以在从100nM至1.5μM，或更具体地250-950nM、350-850nM、450-750nM、550-650nM的反应浓度范围内使用。在一些实施方案中，正向和反向引物可以在450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840或850的反应浓度使用。钩端螺旋体特异性探针可以在从1-500nM、或更具体地，从25-400nM、50-300nM、或75-200nM的反应浓度范围内使用。在一些实施方案中，钩端螺旋体特异性探针可以在50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、或250nM的反应浓度使用。

在一些实施方案中，该PCR主混合液可以含有DNA聚合酶、盐、镁、dNTP，和反应缓冲液，以及其它必需和任选的组分。

探针(Heid等,Genome Res 6:986-994,1996)使用Taq聚合酶的荧光5'核酸外切酶活性测量测试样品中靶序列的量。探针是寡核苷酸，其含有通常在5'或靠近5'碱基附近的报告染料，以及典型地在3'或3'碱基附近的淬灭模块。该淬灭剂模块可以是染料，如TAMRA，黑洞淬灭剂(Black Hole Quencher)，或其可以是非荧光分子，如4-(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)。见Tyagi等,16Nature Biotechnology 49-53(1998)。当辐射时，受激的荧光报告剂通过FRET而非荧光将能量转移到附近的淬灭模块。因此，当所述探针是完整的，该报告剂和淬灭剂的紧密接近防止了供体荧光的发射。

探针被设计为与PCR产物的内部区域退火。当聚合酶复制其上结合有探针的模板时，其5'核酸外切酶活性切割该探针。这结束了淬灭剂(无FRET)的活性，并且报告荧光团开始发射荧光，该荧光在每个循环中与探针切割速率成比例地增加。PCR产物的积累通过监测报告染料的荧光增加来检测(注意引物可能不被标记)。如果淬灭剂是受体荧光团，则PCR产物的积累可以通过监测受体荧光团的荧光减少来检测。

所公开的组合物和方法的一些实施方案包含针对钩端螺旋体扩增子特异性的探针。用于检测钩端螺旋体扩增子的所述探针可以任选地用报告染料和淬灭剂如探针标记。例如，示例性探针可以包含在其5'末端的FAM报告染料和在其3'端的BHQ-1淬灭剂。本领域技术人员会理解，这仅是可用于这种测定法中的许多报告染料和淬灭剂组合的一个实例。有用的报告染料包括但不限于：BODIPY FL、FAM、6～FAM、VIC、4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸(isothiocyanatostilbene)-2,2'二磺酸、吖啶及其衍生物(吖啶,吖啶异硫氰酸盐)Alexa350、Alexa488、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647(分子探针)、5-(2'-氨乙基)萘胺-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯]萘亚胺-3,5二磺酸盐(撒旦黄VS(LuciferYellow VS))、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺(anthranilamid)、奥勒冈州绿488(Oregon Green 488)、罗丹明绿(Rhodamine green)、俄勒冈州绿514(OregonGreen 514)、TET,Cal金、BODIPY R6G、Yakima黄、JOE、HEX、Cal桔、BODIPY TMR-X、Quasar-570/Cy3、TAMRA、Rhodamine红-X、Rhodamine红、BODIPY 581/591、Cy3.5、ROX、Cal红、Texas红、BODIPY TR-X、BODIPY 630/665-X、Pulsar-650、Quasar-670/Cy5、和Cy5.5。

基于具体的荧光团的荧光光谱选择合适的淬灭剂。有用的淬灭剂包括例如黑洞^TM(Black Hole^TM)淬灭剂BHQ-1、BHQ 2和BHQ-3(生物搜索技术学公司(BiosearchTechnologies,Inc.))和ATTO系列淬灭剂(ATTO 540Q、ATTO 580Q和ATTO 612Q；Atto-TecGmbH)。其它有用的淬灭剂包括但不限于：苯甲酸、QSY 35、Eclipse、QSY 7、QSY 9、ElleQuencher、爱荷华黑(Iowa black)、QSY 21、Qx1淬灭剂、爱荷华黑FQ、爱荷华黑RQ、和IRDye QC-1。

本领域技术人员会了解报告染料和淬灭剂的某些配对是优选的。例如，在一个实施方案中，报告物/淬灭剂对是6～FAM/BHQ1。在另一个实施方案中，报告剂可以是Quasar-670、Cal Red、Quasar-570或TAMRA，且淬灭剂可以是BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。

当报告染料和淬灭剂非常接近时(即两者都存在于完整的寡核苷酸探针上)，该报告剂的荧光被抑制。然而，当寡核苷酸探针在所公开的测定中被延长时，该探针如果与正向和反向引物位点之间的所述靶序列特异性结合，DNA聚合酶的5'-3'核酸酶活性则将切割该探针。这释放了所述报告染料和淬灭剂，并且在激发时，由报告染料产生的荧光信号不再淬灭。这导致可检测的荧光的增加。

在所公开的组合物和方法的一些实施方案中，黑洞淬灭剂可以用来减少背景。在优选的实施方案中，钩端螺旋体特异性探针包含报告染料和淬灭剂以便其可在靶序列扩增时检测。

另外，可检测的标记物包括但不限于：放射性同位素(例如，³²P、³⁵S、³H、¹⁴C、¹²⁵I、¹³¹I)，电子致密试剂(例如金)，酶(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记物(例如胶体金)、磁性标记物(例如Dynabeads^TM)、生物素、地高辛，或半抗原以及蛋白质(针对其已有抗血清的或单克隆的抗体)。其它标记物包括能够分别与相应的受体或寡核苷酸互补物形成复合物的配体或寡核苷酸。

所述标记物可以直接并入待检测的核酸，或者其可以附接至与要检测的核酸杂交或结合的探针(例如寡核苷酸)或抗体上。标记物可以直接或间接地附接至探针或引物上，并且标记物可以通过共价或非共价的方法附接。标记物可以通过多种长度的间隔臂附接以减少潜在的空间位阻或对其它有用或期望的性能的影响。见，例如，Mansfield,9Mol.Cell.Probes 145-156(1995)。可检测的标记物可以通过共价或非共价的方法并入核酸，例如，通过转录，如通过使用Klenow聚合酶的随机引物标记，或切口平移(nicktranslation)，或扩增，或本领域已知的等同方法(equivalent)。例如，将核苷酸碱基与可检测的模块偶联，例如荧光染料，然后在核酸合成或扩增期间并入核酸。

可替换地，所述可检测的标记物可以是蝎形检测系统的一部分。用蝎形检测系统，使用单个分子实现序列特异性引导(priming)和PCR产物检测。蝎形探针在未杂交的状态下保持茎(stem)-环构型。尽管在合适的实施方案中，荧光团连接到5'末端并由偶联到3'端的模块淬灭，但该荧光团由偶联到5'末端的模块淬灭。该茎的3'部分还含有与所述引物的延伸产物互补的序列。该序列通过不可扩增的单体连接到蝎形探针的5'末端。延伸后，使用蝎形引物，所述特异性探针序列能够在延伸的扩增子内与其互补物结合，从而打开发夹环。这防止了荧光被淬灭并且可观察到信号。特异性靶物通过反向引物和该蝎形的引物部分扩增，产生延伸产物。荧光信号是由于该蝎形的探针元件与所述延伸产物的结合导致的荧光团与淬灭剂的分离而生成的。

内部对照：

为了确保样品中不存在非特异性PCR抑制剂，每个样本可以包括内部阳性扩增对照(IPC)。可以加入该阳性对照引物和探针以与靶物和样品引物产生多重反应。IPC扩增子可以用探针检测，该探针用附着于该探针5'末端的报告染料标记。如果内部阳性对照的分析表明DNA扩增已经在反应管中发生，但没有检测到钩端螺旋体特异性探针，则样品可以解释为阴性。

实施例

实施例1.样品制备和DNA提取

取出一个250μl的“钩端螺旋体阳性对照”的等分试样并在室温下解冻。200μl无菌水用于阴性对照。对每批提取物进行1个阳性和1个阴性对照。将200μl对照或样本移液到样品盒的给定的孔中。在装入所述样品盒之前，允许将与尿液运输介质混合的冷藏或冷冻的尿液样品加热至室温(18°至26℃)。

在提取之前将内部阳性对照DNA加入到裂解缓冲液中，并将200μl加入到每个含有样品的孔中。

实施例2.DNA扩增和检测

用ABI 7500Real-Time PCR系统进行DNA扩增。在扩增之前，样品与主混合液组合。

检验了所述对照的扩增绘图(plot)。该绘图显示不同指数生长期的S形曲线，随后是平台期。

也检验了样品扩增。由于在较低的荧光值的弱分辨率，阴性绘图只能作为该图底部附近的线条可见。

钩端螺旋体测定的典型曲线的实例示于图1A和1B中。左侧的曲线是典型的高阳性结果。右边的曲线是典型的低阳性结果。水平线是阈值。所有阳性结果都穿过这条线。给定绘图穿过阈值线的循环称为阈值循环(Ct)。阴性绘图不具有S形形状，和/或不穿越该阈值线。该数据可以以如图1A所示的线性形式，或如图1B所示的对数形式来查看。用于可视化扩增绘图的格式由技术人员慎重决定，但每种绘图都有优势。阳性结果可能用线性形式更直观明显，因为只有阳性绘图在这种形式的背景上是可区分的。然而，对数视图允许更好地分辨绘图线之间的小差异，尤其是在低荧光下。

如果所述对照的扩增绘图不显示曲线，则可能指示存在污染、主混合液或对照的不当制备、或所述荧光探针的降解。所述IPC必须放大，并且必须在IPC结果有效的指定Ct范围内。如果IPC结果超出了指定的Ct范围且未检测到靶物，则靶物结果可能无效。

在检验所述对照并显示具有正确的结果之后进行临床样品的检验。检验每个样品的扩增绘图。当扩增绘图显示指数增加时，扩增曲线被认为是有效的，阳性结果。

实施例3.用于区分致病性和非致病性钩端螺旋体的引物和探针的验证

钩端螺旋体weillii(ATCC#43285)是非问号(non-interrogans)病原体,其在钩端螺旋体测定中可能难以检测到。测试了多组引物以确定检测的有效性。

为了验证，将来自ATCC的解冻的细菌稀释10倍，并以250μl或1ml等分试样冷冻。解冻的样品用于DNA提取。样品粗略估计有10⁸个细胞/ml。来自连续稀释所述细菌的DNA用于确定各种引物对的检测极限。

将三组不同的引物对用于验证测试。组1由引物F76和R148组成，组2由F71和R148组成，组3由FSmythe和RSmythe组成。这些引物的序列可见表2。对于组1和2，使用探针P101来检测靶序列扩增，对于组3，使用PSmythe来检测靶序列扩增。

表2–引物和探针的序列

将100μM给定组中的每种引物和10μM相应的探针在包含主混合物、taq聚合酶、钩端螺旋体wellii DNA和水的反应混合液中组合。热循环使用ABI7500实时PCR系统进行。

扩增实时检测的结果见表3。

表1引物组的检测结果

循环输出数据可见图2，粗水平线表示阈值限制。

组1的PCR效率是97.8％。组2的PCR效率为99.0％。组3的PCR效率为91.3％。虽然所述引物组在Ct评分方面有所不同，但是组1和2具有显著高于组3的PCR效率。这个验证表明组1和组2更适合于可靠地检测致病性钩端螺旋体。另外，组1和组2具有优于组3的检测极限，这表明组3可能在检测某些种的钩端螺旋体方面有困难。

虽然已充分地详细描述和示例了本发明以使得本领域技术人员进行制造和使用，但在不脱离本发明的精神和范围的情况下，各种替代、修改和改进应当是显而易见的。

本领域技术人员能够理解，本发明良好地适用于实现发明目的并获得提及的及其中内含的结果和优点。本领域技术人员能够预料到对其的修改和其它用途。这些修改均包括在本发明的精神内并由权利要求的范围限定。

对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的本发明进行种种替换和修改。

在本说明书中提到的所有专利和出版物都表明本发明所属领域的普通技术人员的水平。如同每个单独的出版物被具体和单独通过引用并入的相同程度，所有专利和出版物通过引用并入本文。

本文说明性地描述的本发明可以在缺乏本文未具体公开的任何要素或要件，限制或局限的情况下实施。因此，例如在本文中，本文中的任何术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”可以用其它两个术语中的任一个代替。已使用的术语和表达用作描述性的术语而非限制性，并且不意味着这些术语和表达的使用排除了所示和描述的特征或其部分的任何等同物，但应该认识到，在所要求保护的本发明的范围内能够进行各种修改。因此，应当理解尽管通过优选实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采取本文公开的概念的修改和变化，且这些修改和变化视为包括在所附权利要求限定的本发明的范围内。

在所附权利要求中阐述了非限制性实施方案。

Claims

1.一种基本上纯化的寡核苷酸，其具有选自下组的序列：

5’-AGT AAC ACG TGG GTA ATC TTC CT-3’(SEQ ID NO:1)，

5’-TCTCTCGGGACCATCCAGTA-3’(SEQ ID NO:2)，和

5’-TGGGATAACTTTCCGAAAGGGAAG C-3’(SEQ ID NO:3)，

其中，所述寡核苷酸直接或间接地附接至可检测的标记物。

2.如权利要求1的寡核苷酸，其中所述可检测的标记物是荧光染料。

3.如权利要求1的寡核苷酸，其中所述可检测的标记物包含报告染料和淬灭剂。

4.如权利要求3的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是5’[6～FAM]–TGGGATAACTTTCCGAAAGGGAAGC–[BHQ-1]3’。

5.基本上纯的寡核苷酸引物对，其包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

6.一种用于鉴定样品中致病性钩端螺旋体的存在或缺乏的检测方法，其包括通过以下检测16S靶核酸的存在或缺乏：

(a)提供适于扩增所述16S靶核酸或其片段的引物对，并提供适于与所述16S靶核酸或其片段杂交的可检测标记的探针，其中所述引物对中的至少一个成员包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；

(b)当所述16S靶核酸存在于所述样品中时，在适于产生第一反应产物的条件下，进行包含步骤(a)的所述引物对的引物延伸反应；以及

(c)通过检测所述探针的可检测的标记物的存在或缺乏来确定致病性钩端螺旋体的存在或缺乏，

所述16S靶核酸包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13或其片段或互补物至少95％相同的至少15个连续的核苷酸，

其中所述16S靶核酸的存在鉴定致病性钩端螺旋体的存在。

7.如权利要求6的方法，其中所述引物对中的至少一个成员由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2组成。

8.如权利要求6的方法，其中所述可检测标记的探针包含SEQ ID NO:3。

9.如权利要求6的方法，其中所述可检测标记的探针由5’[6～FAM]-TGGGATAACTTTCCGAAAGGGAAGC-[BHQ-1]3’组成。

10.一种用于检测测试样品中致病性钩端螺旋体核酸的存在或量的方法，包括：

(a)如果致病性钩端螺旋体核酸存在于所述样品中，使用具有SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示序列的寡核苷酸引物对扩增致病性钩端螺旋体核酸；

(b在酶存在的情况下，将所述扩增的致病性钩端螺旋体核酸与具有SEQ ID NO：3所示序列的寡核苷酸探针杂交，当所述探针与所述致病性钩端螺旋体核酸杂交时，所述酶切割所述探针；以及

11.如权利要求10的方法，其中所述测试样品选自下组：血清、血液、血浆、脑脊髓液、滑液和尿液。

12.如权利要求10的方法，其中所述致病性钩端螺旋体核酸在所述扩增步骤(a)之前从所述样品提取。

13.如权利要求10的方法，其中所述探针包含报告染料和淬灭剂。

14.如权利要求13的方法，其中所述报告染料是6～FAM。

15.如权利要求13的方法，其中所述淬灭剂是BHQ-1。

16.一种诊断疑似具有致病性钩端螺旋体的个体的方法，包括：

(a)从所述疑似具有致病性钩端螺旋体的个体中获得样品，

(b)从所述样品中提取基本上纯的核酸，

(c)在包含SEQ ID NO:3的可检测标记的探针和包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对的存在下进行扩增反应，其中，当来自所述样品的核酸通过所述引物对扩增时，在聚合酶存在下，可检测标记的探针与来自所述样品的核酸的相应序列的杂交将从所述探针切割所述可检测的标记物，

(d)检测来自所述探针的信号，其中所述信号指示所述样品中的致病性钩端螺旋体核酸的存在或量，以及

(e)如果检测出所述信号，则确定所述疑似具有致病性钩端螺旋体的个体有致病性钩端螺旋体，或者如果没有检测出所述信号，则诊断所述个体为没有致病性构端螺旋体。

17.如权利要求16的方法，其中所述扩增反应包括实时PCR。

18.如权利要求16的方法，其中所述探针包含报告染料和淬灭剂。

19.如权利要求18的方法，其中所述报告染料是6～FAM。

20.如权利要求18的方法，其中所述淬灭剂是BHQ-1。

21.一种试剂盒，其包含：

与具有SEQ ID NO:4、其片段或互补物的靶16S序列的核酸特异性杂交的引物对，以及与具有SEQ ID NO:4、其片段或互补物的序列的核酸特异性杂交的可检测标记的探针，其中所述引物对的至少一个成员包含SEQ ID NO:1或2的序列，或其互补物。

22.如权利要求21的试剂盒，其中所述探针包含SEQ ID NO:3的所述序列，或其互补物。

23.如权利要求21的试剂盒，其中所述可检测的标记物包含报告染料和淬灭剂。

24.如权利要求23的试剂盒，其中所述报告染料是6～FAM。

25.如权利要求23的试剂盒，其中所述淬灭剂是BHQ-1。

26.一种试剂盒，其包含：

与包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或其片段或互补物的靶核酸特异性杂交的引物对，以及与包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13或其片段或互补物的靶核酸特异性杂交的可检测标记的探针。

27.如权利要求26的试剂盒，其中所述可检测的标记物包含报告染料和淬灭剂。