JP2004536557A - 哺乳動物の腸に対する共生ミクロフローラの効果を調べるための方法およびそれに基づく胃腸関連疾患の治療 - Google Patents
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Abstract
哺乳動物の腸内共生ミクロフローラのコロニー形成に起因する化学変化を調べる方法であって、ａ）共生細菌がコロニーを形成した腸内および無菌の腸内で少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を測定すること、およびｂ）共生細菌がコロニーを形成した腸と無菌の腸とで発現レベルが少なくとも２倍異なるａ）の遺伝子を同定することを含む方法。この方法により、さらに進んだ評価のための遺伝子が選択され、予防的治療の開発が進む。
Description
【０００１】
【技術分野】
本発明は、哺乳動物の腸内共生ミクロフローラのコロニー形成に起因する変化を調べるための方法、および得られた情報を消化管の改変および胃腸関連疾患の治療に有用な薬剤の製造および療法に使用することに関する。
【０００２】
【背景技術】
哺乳動物一般、特にヒトには、非常に複雑な多量の微生物集団が棲息している。このミクロフローラ構成成分との接触は、生まれた時に始まる。ヒトの腸には、他のどんな粘膜表面よりも微生物が密集している。したがって、この器官は、ミクロフローラが宿主の生理に顕著な影響を及ぼす可能性が高い部位である。
【０００３】
病原性または他の潜在的に有害な侵入微生物の効果は調べられているが（例えば、Ｌ．Ｅｃｋｍａｎｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００、２７５：１４０８４〜１４０９４、Ｄ．Ａ．Ｒｅｌｍａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年５月２１日：２８４（５４１８） １３０８〜１０、Ｄ．Ａ．Ｒｅｌｍａｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００年４月：１２（２）：２１５〜８を参照）、共生細菌が通常どのように発生し、どのような生理を示すかについては驚くほどわずかしか知られていない。これは、部分的には、非病原性の微生物が宿主の生態をどのように調節しているかを調査するための明確な実験的に扱い易いｉｎ ｖｉｖｏモデル系が不足しているためだけでなく、これら微生物が、消化プロセスなどに有意な影響を与えないという見解が一般的であるためでもある。
【０００４】
これまで、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎでコロニーを形成させた成体無菌動物を用いたモデルを使用して、この共生微生物が無菌マウスに導入された後に回腸上皮フコシル化グリカンの産生を制御することが示され、また、この微生物がそれ自身の栄養摂取のためにこれらグリカンの産生を制御する方法が詳細に叙述されてきた（Ｌ．Ｂｒｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、１３８０、１９９６；Ｌ．Ｖ．Ｈｏｏｐｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、９８３３（１９９９））。これ以外、常在菌が腸の遺伝子発現をどのように調節するのか、また、それが宿主の状態にどのように影響するかについては実質的に何もわかっていない。
【０００５】
本出願人らは、共生ミクロフローラが消化管の生理および成熟を規定するのに大いに寄与することを見出し、これを分子レベルで試験する手段を開発した。
【０００６】
【発明の概要】
本発明の第１の態様によれば、哺乳動物の腸内共生ミクロフローラのコロニー形成に起因する変化を調べるための方法であって、
ａ）共生細菌がコロニーを形成した腸内および無菌の腸内で少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を測定すること、および
ｂ）少なくとも１つの共生細菌がコロニーを形成した腸と無菌の腸とで発現レベルが少なくとも２倍異なるａ）の遺伝子を同定することを含む方法が提供される。
【０００７】
適切には、複数の遺伝子の発現は、後述のＤＮＡマイクロアレイ分析および／または定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定するが、他の従来法を使用することもできる。このような方法の例は、定量ノーザン・ブロット法ならびに２個の試料間で異なる遺伝子を検出するＰＣＲを基礎としたアッセイであるリプリゼンテイショナル・ディファレンス分析（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ分析）（ＲＤＡ）（例えば、Ｏｄｅｂｅｒｇ Ｊ 等、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１７、１〜９、２０００）である。特に、高密度オリゴヌクレオチド・アレイの使用が、ミクロフローラの構成成分によって形成される範囲の腸機能を包括的に分析するために好ましい。
【０００８】
マイクロアレイ分析は、腸で見られるような複数のタイプの細胞からなる複合組織内の宿主の応答を測定するために使用することができる。所与の微生物に対する宿主細胞の応答を詳細に示すｉｎ ｖｉｖｏモデルの価値は、細胞培養に基づくモデルとは異なり、その応答形成に対する系統因子および環境因子の寄与が維持され、無菌実験系で研究できることにある。
【０００９】
好ましい実施形態では、応答細胞集団はその発現されたｍＲＮＡ集団を撹乱することなく回収され、そのため微生物に対するその反応の特性を定量的に明らかにすることができる。これは、２つの技術、すなわちレーザ・マイクロダイセクション（ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）（ＬＣＭ）と、その後のレーザ捕捉試料の定量分析、例えば定量ＰＣＲおよび／またはマイクロアレイ分析とを、組み合わせることにより適切に実施される。
【００１０】
本発明の方法を用いると、ｉｎ ｖｉｖｏの宿主応答を複合組織中の特定の細胞集団に帰属させ、この細胞応答を定量的に記述することが実際に可能になる。腸の生態および宿主の生理の重要ではあるがこれまで価値を認められていなかったレギュレーターとして機能する宿主の遺伝子を同定することができる。原型の消化管内共生生物によるコロニー形成に対する応答に基づいて同定される遺伝子は、治療処置の全く新しい標的となる可能性がある。腸内微生物は、数百万年にわたる膨大な淘汰の外圧を受けて、微生物と宿主の両者がその相互関係から恩恵を得るようにその宿主を操作する微妙ではあるが有効な方法を見出してきた。微生物宿主の遺伝子標的に影響を及ぼす細菌遺伝子産物を同定し試験することにより、化学構造および作用機序がこれまで評価されなかった、または評価できなかった新しい薬剤を得ることができる。
【００１１】
本発明の方法に使用される無菌の腸および共生細菌がコロニーを形成する腸は、どんな動物モデルのものでもよいが、特に単純な腸−微生物相互作用マウス・モデルが使用される。
【００１２】
この方法によって、個々の共生細菌の、ならびに必要ならばこれらの組み合せの効果を調べることが可能になる。
【００１３】
本出願人らは、免疫−炎症プロセスに関与または関連する遺伝子が、本発明の方法を用いて同定されそうにないことを見出した。このことは、宿主が、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎなどの消化管内定住微生物をその寿命全体にわたって棲息させる必要があることと矛盾しない。しかし、本発明の方法を使用して、この知見を他の共生細菌で確認することができる。
【００１４】
次に、このようにして同定した遺伝子とその機能を、例えば消化プロセスに対するその効果を決定するためにさらに調べることができる。このさらに進んだ研究は、例えば任意の従来法を用いて実施することができる。
【００１５】
好ましい実施形態では、本方法は、（ｃ）ｂ）で同定された遺伝子の機能をさらに調べるステップをさらに含む。これを実施できる適切な方法には、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞培養アッセイにおける研究または下等真核生物モデルにおける研究ならびにトランスジェニック動物モデルなどの動物モデルにおける研究が含まれる。
【００１６】
遺伝子、その関連遺伝子および遺伝子産物が操作および分析に利用可能である限りは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイ法によって、動物個体よりも簡単な系での研究が可能になるはずである。
【００１７】
酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）などの下等真核生物モデルは、ゲノムおよび多くの場合細胞機能が極めて明確な真核生物である。哺乳動物において研究対象となっている基本的特徴的機能のいくつかは、より単純な真核生命体においても維持されており、そのためそれらが分子的事象の明確なモデルとして極めて魅力的なものになっている。これらの生物は哺乳動物よりも取り扱いが容易である。
【００１８】
これらの系においては、この機能は、
ｉ）トランスジェニック・ノックアウト、
ｉｉ）ドミナント・ネガティブ実験、
ｉｉｉ）導入遺伝子の過剰発現、
ｉｖ）抗体結合アッセイ、
ｖ）性質の明確な化学薬剤を用いた薬理学的介入（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）による、などの方法を用いて調べることができる。
【００１９】
トランスジェニック・ノックアウト法は、例えば、遺伝子産物が正常に機能しないように遺伝子を欠失または変異させる、または遺伝子を無効にするアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入する組換えＤＮＡ技術を用いて、生物内遺伝子を不活性化することに基づいている。後者の場合、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを生物内に導入する。遺伝子の転写の所産であるメッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）は一本鎖であり、それが二本鎖の場合はタンパク質配列に翻訳することができない。二本鎖ＲＮＡはこの相補的断片によって形成され、得られる二本鎖ＲＮＡ断片がさらにプロセシングされることはない。したがって、この遺伝子からはタンパク質は産生されない。これは通常、一過性の実験として実施される。すなわち、アンチセンス断片を細胞、モデル生物、または哺乳動物モデルに加えると、有効なアンチセンスがある限り遺伝子発現は起こらない。それが消費されると、正常な機能を取り戻し、正常／制御状態が回復されることになる。
【００２０】
古典的なトランスジェニック・ノックアウト法は、変異を受けた、したがって正常に機能しない遺伝子を胚性細胞株に導入することを基礎としている。次いで、この細胞株を、正常な胚盤胞中に導入し、それによって正常なバックグラウンド由来の、および胚性幹（ＥＳ）細胞株由来の生殖細胞からなるキメラ胎児が生成される。数回の交配を経ると、このＥＳ細胞由来の変異型対立遺伝子が、生殖細胞中に見られるようになり、したがって子孫に伝達可能になる。
【００２１】
今回、新しい技術によって、このような突然変異のサイレントで不活性型の遺伝が可能となり、その結果、発育が完了した時に、成体においてそれらを活性化させることが可能になる。このことは、そのような沈黙突然変異の成獣、特にマウスを、その変異遺伝子の発現を活性化する化学薬剤（ホルモン、抗生物質）に曝すことによって実施される。
【００２２】
遺伝子の機能を破壊する別の方法は、ドミナント・ネガティブ実験を実施することである。この場合、標的細胞系譜において極めて高度な発現を可能にするプロモーターの転写調節の下で、欠陥のある遺伝子をモデル生物のゲノム中に導入する。この遺伝子産物を産生し、細胞内の所期の作用部位に輸送すると、この遺伝子産物は正常な遺伝子産物とこれらの部位をめぐって競争することになる。この導入遺伝子はより多量にあり、所期の機能を果たすことができないので、最終的にこの機能が撹乱されることになる。
【００２３】
特定の系またはモデルにおける遺伝子の過剰発現の効果も調べることができる。この場合、複数の遺伝子コピーを試験生物に導入することも、遺伝子を高度に発現する特定のプロモーターを使用することもできる。
【００２４】
導入遺伝子の過剰発現が関与する古典的トランスジェニック実験には、そのモデルには通常は存在しない遺伝子（例えば、ヒト特異的遺伝子をマウスに）を導入して、細胞の機能および／または生理に対するこの遺伝子の効果を評価することが含まれる。必要に応じ、この導入遺伝子を、最適な細胞集団を対象として発現するように、組織特異的プロモーター配列の制御の下に置くことができる。プロモーターは、体全体の全身的発現用のものと、限定された器官部位にある特異的な少数の細胞集団の極めてわずかな分布用のものの両者が存在する。
【００２５】
遺伝子の効果を調べる他の手段は、遺伝子産物によるタンパク質レベルでの介入である。例えば、抗体結合アッセイを使用して、タンパク質が細胞、モデル生物、または哺乳動物内に存在するかどうかを決定し、かつ／または遺伝子産物に特異的に結合してその機能を抑制して、その所期分子パートナーとの相互作用能力を妨害することができる。
【００２６】
性質の明確な化学薬剤を用いた薬理学的介入は、遺伝子が、特定のクラスの分子、例えば、Ｇタンパク質共役受容体、プロテアーゼ、または核内受容体に属することが確認できれば、このタイプの分子の作用薬または拮抗薬として作用することが知られている薬品を用いてその機能を評価することができ、特に有用であろう。
【００２７】
本発明の方法にはどんな共生細菌でも使用することができる。特にその例としては、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、大腸菌、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、またはこれらの混合物、または従来法によって飼育された種から得られる完全な回腸および／または盲腸のミクロフローラがある。本方法での使用に特に適した細菌は、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎである。本出願人らは、共生フローラの様々なメンバーが異なる結果をもたらし、種間で高度な特異性を示すことを見出した。
【００２８】
本発明の方法は、この共生生物が消化管遺伝子の発現に対して予期せぬ範囲の影響を与えることをすでに示した。適切に特許請求された広範な遺伝子の発現は、本発明の方法のステップ（ａ）で測定される。このような遺伝子の例は、栄養素の摂取と代謝、ホルモン／成熟応答、粘膜防御機能、解毒／薬剤耐性、異物代謝、運動性、腸管神経系／筋層の発生または活動、血管形成、細胞骨格／細胞外マトリックスの機能または発生、シグナル伝達、および他の基本的な細胞機能に関連する遺伝子である。
【００２９】
研究対象とすることができる栄養摂取および代謝の遺伝子には、Ｎａ＋／グルコースコトランスポーター（ＳＧＬＴ１）やラクターゼ・フロリジン−ヒドロラーゼ遺伝子などの炭水化物の摂取と代謝に関連する遺伝子、すいリパーゼ関連タンパク質２（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、コリパーゼ、肝脂肪酸結合タンパク質、絶食誘導脂肪因子（ｆａｓｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｄｉｐｏｓｅ Ｆａｃｔｏｒ）（ＦＩＡＦ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、ホスホリパーゼＢ、ＣＹＰ２７遺伝子などの脂質の摂取と代謝に関連した遺伝子、高親和性銅トランスポーター、メタロチオネインＩ、メタロチオネインＩＩ、フェリチン重鎖遺伝子などの金属の摂取または隔離の遺伝子、またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ・サブユニット、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、リンゴ酸オキシドレダクターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子などの細胞エネルギー生成が含まれる。
【００３０】
ホルモン／成熟応答に関連する遺伝子の例は、アデノシン・デアミナーゼ、オミシン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ）・デカルボキシラーゼ抗酵素、１５−ヒドロキシプロスタグランジン・デヒドロゲナーゼ、ＧＡＲＧ−１６、ＦＫＢＰ５１、アンドロゲン制御輸精管タンパク質、短鎖デヒドロゲナーゼ、および耐熱性抗原遺伝子である。
【００３１】
粘膜防御機能に関連する遺伝子の例は、減衰促進因子（ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、重合体Ｉｇ受容体、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｍａｌｌ ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ）、血清アミロイド・タンパク質Ａ、ＣＲＰ−ダクチン（ｄｕｃｔｉｎ）α（ＭＵＣＬＩＮ）、ゼータ・プロテアソーム鎖（ｚｅｔａ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｃｈａｉｎ）、および抗ＤＮＡ ＩｇＧ Ｌ鎖遺伝子である。
【００３２】
解毒／薬剤耐性に関与する適切な遺伝子には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、Ｐ−糖タンパク質（ｍｄｒ１ａ）およびＣＹＰ２Ｄ２遺伝子が含まれる。 腸管神経系／筋層の発生または活動に関連する遺伝子の例は、Ｌ−グルタミン酸トランスポーター、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、小胞関連タンパク質−３３（ｖｅｓｉｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−３３）、システイン・リッチ・タンパク質２（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈタンパク質２）、平滑筋（腸）γアクチン、およびＳＭ−２０遺伝子である。
【００３３】
ＲＮアーゼ・スーパーファミリー・メンバーには、いくつかのアンギオゲニンが含まれる。これには、本出願人らがその配列を決定し、腸に特異的で上皮に存在しその発現が微生物叢の構成成分によって制御されているように見える点で特に興味深いことが判明したアンギオゲニン−４も含まれる。ネズミのアンギオゲニン−４の配列が、最近報告された（Ｄ．Ｅ．Ｈｏｌｌｏｗａｙ等、ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、（２００１）、２２：３０７）。
【００３４】
本出願人らは、驚くべきことに、このような一遺伝子、特にアンギオゲニン−４遺伝子が腸管上皮中で発現され、発現レベルが共生細菌の影響を特に受けることを見出した。
【００３５】
細胞骨格／細胞外マトリックスの機能に関連する遺伝子の例は、ゲルゾリン、デストリン、心筋αアクチン、エンドＢサイトケラチン、フィブロネクチン、プロテイナーゼ阻害剤６およびα１タイプ１コラーゲン遺伝子である。
【００３６】
シグナル伝達遺伝子には、Ｐｔｅｎ、ｇｐ１０６（ＴＢ２／ＤＰ１）、ｒａｃ２、Ｓｅｍｃａｐ２、血清およびグルココルチコイド制御キナーゼ、ＳＴＥ２０様タンパク質キナーゼ、およびＢ細胞ミエロイド・キナーゼ（ｍｙｅｌｏｉｄ ｋｉｎａｓｅ）が含まれる。（ｒａｃ２遺伝子が関連するシグナル経路は、粘膜防御機能に影響することが知られている。）
【００３７】
最後に、基本的な細胞機能に関連するその他の遺伝子の例は、グルタチオン・レダクターゼ、カルモジュリン、ｅｌＦ３サブユニット、ｈｓｃ７０、オリゴサッカリル・トランスフェラーゼ・サブユニット（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）、フィブリラリン、Ｈ＋−輸送ＡＴＰアーゼ、およびＭｓｅｃ２３遺伝子である。
【００３８】
本発明の方法では、適切には、少なくとも１０種類のこのような遺伝子がステップ（ａ）で測定される。上記列挙したすべての遺伝子の発現を測定することが好ましい。
【００３９】
本発明によれば、発現が少なくとも２倍の遺伝子が同定され、選択されてさらに調べられる。適切には、発現が少なくとも４倍、より適切には少なくとも５倍、さらに適切には７倍、好ましくは９倍の遺伝子がステップ（ｂ）で同定され、選択されてさらに調べられる。
【００４０】
Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニー形成後に本発明の方法を用いてすでに同定されているいくつかの特定の遺伝子は特に興味深い。この遺伝子には、コリパーゼ、減衰促進因子（ＤＡＦ）、重合体ＩｇＡ受容体、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（Ｓｐｒｒ２ａ）、｛アンギオゲニン−３｝Ｐｔｅｎ、ＣＹＰ２Ｄ２、Ｓｐｒｒ２ａ、ｒａｃ２、およびＭｄｒ−１が含まれる。この遺伝子には、アンギオゲニン−３に関係し、新たに発見されたタンパク質であるアンギオゲニン−４も含まれる。
【００４１】
これらの遺伝子は治療上有用な機能を有するかもしれず、したがって、これら１つまたは複数の遺伝子の発現を、研究中の特定の共生細菌がその発現に与える影響を検出するために、本発明の方法で測定することが好ましい。
【００４２】
具体的には、本発明の方法により、コリパーゼ、および配列番号１２および２５（アンギオゲニン−４）などのプライマー（下記表３参照）を用いてその遺伝子を増幅可能であるアンギオゲニンなどのアンギオゲニン類、ならびにＳｐｒｒ２ａおよびｒａｃ２の発現を、さらに研究すべきであることが判明した。
【００４３】
したがって、本発明は、配列番号１２および２５（アンギオゲニン−４）などのプライマー（下記表３参照）を用いてその遺伝子を増幅可能であるアンギオゲニンが腸内で関与する生化学的経路の評価をさらに含む。
【００４４】
別の実施形態では、本発明はコリパーゼが腸内で関与する生化学的経路の評価をさらに含む。
別の実施形態では、本発明はＳｐｒｒ２ａが腸内で関与する生化学的経路の評価をさらに含む。
別の実施形態では、本発明はｒａｃ２が腸内で関与する生化学的経路の評価をさらに含む。
評価は、上述の方法も含めてどんな適切な方法を用いても実施することができる。
【００４５】
本発明の方法を用いた遺伝子の同定、ならびにこれらに関連する生化学的経路のさらに進んだ研究は、胃腸管の疾患または障害の予防的なまたは治療的な処置をもたらし得るものである。具体的には、共生細菌の存在または非存在によりどの遺伝子が最も影響を受けるか、また、病状、疾患、または障害に関連する生化学的経路にどの遺伝子が関与しているかを明らかにすることで、この病状、疾患、または障害を治すために特定の遺伝子の発現を変化させることを目的とした治療法を開発することが可能になるはずである。あるいは、遺伝子産物によって維持される生化学的経路に薬理学的に介入することが可能になるはずである。
【００４６】
このことは、適切な共生細菌を投与することによって実施することができる。所望のミクロフローラの集団を増加させることは、例えば、錠剤、医薬品または栄養補給組成物、さらには生きているヨーグルト培養物などの食品の形で、この細菌を経口投与することによって実施することができる。
具体的には、本発明は、上皮で発現される血管形成因子を、それに変調をもたらす共生細菌のコロニー形成によって調節する方法を提供する。
【００４７】
このような方法の別の具体例は、代謝、特に食事性脂質の代謝を調節する方法であり、この方法は、この代謝に効果があることが上述の方法を用いて確認された共生細菌を使用するものである。
さらに別の具体例は、上述の方法を用いて確認された共生細菌を使用して上皮防御機能を調節する方法である。
【００４８】
別の例は、血管形成またはシグナル伝達を調節することが本発明の方法を用いて確認された、腸内に存在する共生細菌の集団を調節することによって、腸の腫瘍を予防または治療する方法である。
【００４９】
さらに別の態様では、本発明の方法は、消化管内の不適切なレベルの遺伝子発現によって引き起こされた疾患や病状の診断に有用となり得る。ある患者から採取された共生ミクロフローラの分析から、上述のミクロフローラの個体数の自然変動が大きいことがわかる。しかし、本発明の方法を用いて同定される共生ミクロフローラの量の著しい増加または減少を検出することによって、特定の遺伝子が異常な量で発現し、そのため疾病状態または病状を招いていることを示せるかもしれない。このような病状の治療は、適宜、上述したように共生細菌の量を変化させるか、細菌もしくはヒトの遺伝子産物もしくは誘導体を直接投与するか、この遺伝子産物の化学的もしくは生物学的阻害薬もしくは拮抗薬を用いるなど遺伝子産物をタンパク質レベルで阻止する手段のいずれかによって実施することができる。
【００５０】
本発明の方法を一般に使用して、ヒト、および微生物が多数存在するこの世界に棲息する他の無数の種に問われる問題に取り組むことができる。すなわち、細菌は、その宿主の生理と成熟にどのように寄与し、それをどのように調節しているのだろうか。ヒトの場合、我々の祖先とその微生物パートナーの共進化を含む長い淘汰のプロセスの間に発達した複雑な調節メカニズムの組み合せが、ミクロフローラの構築と維持に関与していることは間違いない。以下に示す結果は、重要な生理機能に関わる遺伝子の発現に対する常在菌種の影響を実証しており、我々の生態を我々の複雑な定住菌群の生態と関連させて考えることの重要性を強調している。
【００５１】
この結果は、明確なｉｎ ｖｉｖｏモデルを使用して、周囲の細胞および環境の影響を維持しながら、微生物に対する複合組織内の指定細胞集団の応答を推定することの実用性も実証している。
【００５２】
これらのモデルおよび手法は、ヒトの健康に対する微生物の広範な寄与を評価することを可能にし、治療上有用な微生物産物の同定を可能にする。さらに、これらのモデルおよび手法は、これら宿主−微生物の正常な関係が様々な疾患プロセスにどのように影響しているかを明らかにし、何が病原性関係を構成しているかについて新たな展望と定義を提供するはずである。
【００５３】
しかしまた、本方法は、多数の遺伝子または遺伝子産物が腸組織中で重要な効果を持ち、このような遺伝子または遺伝子産物を患者に有益な方法で標的とするような医薬品を開発できる可能性を高めているように見えることをすでに明らかにしている。このことは、遺伝子産物の活性を調節する化合物をスクリーニングすることによって実施することができる。
【００５４】
本発明の別の態様は、腸の生態のレギュレーターとして機能する遺伝子を同定するための方法を含み、この方法は、上述の方法を適用すること、およびこのような機能にこれまでは関連づけられていない発現遺伝子を検出することを含む。
【００５５】
したがって、本発明のさらに別の態様は、胃腸疾患の薬剤として応用できる化合物をスクリーニングする方法を含み、この方法は、上述の方法を用いて同定される遺伝子の産物の活性を調節する能力でこの化合物を評価することを含む。
【００５６】
本発明のさらに別の態様は、請求項１に記載の方法を用いて同定される遺伝子の産物の活性を調節する化合物の治療有効量を投与することを含む、胃腸疾患を治療または予防する方法である。
【００５７】
具体的には、以下に報告する結果に基づいて、本発明は、さらに、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｐｒｒ２ａ）またはｒａｃ２の活性または量を調節する能力によってその化合物を評価することを含む、腸の防御機能の欠陥を特徴とする病状の治療または予防に潜在的に有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
適切なスクリーニング法は、当業者には明らかなはずである。この化合物は、同定されると腸の防御機能を含む病状の治療または予防に有用である。
【００５８】
したがって、本発明のさらに別の態様は、腸の防御機能の欠陥を特徴とする病状の治療または予防用の薬物を調製する際に、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｐｒｒ２ａ）またはｒａｃ２の活性または量を調節できる化合物を使用することを含む。
適切には、この化合物は、医薬品組成物として処方される。このタイプの新規組成物およびその調製は本発明のさらに別の態様を形成する。
【００５９】
【発明の詳述】
共生細菌によって調整された腸内の変化を分子レベルで調べるために、正常なマウスおよびヒトの腸ミクロフローラの主要な構成成分であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎを含めた共生細菌を用いて、無菌マウスにコロニーを形成させた。
コロニー形成に対する腸の包括的な転写応答を高密度オリゴヌクレオチド・アレイを用いて詳細に記述し、特異的応答の細胞起源をレーザ・マイクロダイセクションおよびリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲで確立した。
【００６０】
以下に示す結果から、共生細菌が多数の遺伝子の発現を調節し、そのいくつかの発現は有意なレベルで調節されることがわかる。これに関係する遺伝子は、栄養素吸収、粘膜防御、および異物代謝を含めた消化管の多様な基本的生理機能に関与する。コロニー形成に関連した遺伝子発現のいくつかの変化が種によって異なることは、常在ミクロフローラ組成の変化によってヒトの生理がどのように影響されるかを強く示唆するものである。
【００６１】
また、いくつかの共生生物は生後の発育の移行に、ある役割を演じているように見える。哺乳−離乳の移行に付随する変化は、成体のマウスではＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎによって誘発されたことから、常在菌が生後の消化管の発育に指導的な役割を演じていることが示唆される。
【００６２】
明確なｉｎ ｖｉｖｏモデルをゲノムに基づく包括的分析と組み合わせると、このように、宿主の生態に対する定住微生物の重要な寄与を確認するための強力な手法となる。
【００６３】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、遺伝子操作可能な嫌気性菌であり、成体マウスとヒト双方の消化管ミクロフローラの主要なメンバーであるので、腸の生態に対する定住細菌の影響を明確にする初期研究用に選択された。また、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、通常、哺乳−離乳移行、すなわち消化管の機能が急速かつ顕著に成熟する時期に、小腸の末端（回腸）にコロニーを形成する（Ｗ．Ｅ．Ｃ．Ｍｏｏｒｅ、Ｌ．Ｖ．Ｈｏｌｄｅｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７、９６１（１９７４）、Ｔ．Ｕｓｈｉｊｉｍａ、Ｍ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｋ．Ｔａｔｅｗａｋｉ、Ｙ．Ｏｚａｋｉ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、９８５（１９８３））。
【００６４】
コロニー形成は、宿主の脂質吸収機構の４つの構成成分の発現亢進を含めた協奏的な応答を誘発した。すいリパーゼ関連タンパク質−２（ＰＬＲＰ−２）およびコリパーゼをコードするｍＲＮＡは、それぞれ平均４倍および９倍増加した（表１および２）。ＰＬＲＰ−２は、トリおよびジアシルグリセロール、リン脂質、およびガラクトリピドを加水分解する。コリパーゼは、ＰＬＲＰ−２活性を増大させる（Ｍ．Ｅ．Ｌｏｗｅ、Ｍ．Ｈ．Ｋａｐｌａｎ、Ｌ．Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｇｒｕｓｂｙ、Ｄ．Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ、Ｍ．Ｊ．Ｇｒｕｓｂｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、３１２１５（１９９８））。また、腸細胞内の脂肪酸輸送に関わる豊富なサイトゾル・タンパク質をコードするＬ−ＦＡＢＰ ｍＲＮＡが４〜６倍に増加し、腸細胞の基底外側表面から分泌されるトリグリセリド・リッチ・リポタンパク質（キロミクロン、ＶＬＤＬ）の主要な成分であるアポリポタンパク質ＡＩＶが誘導された（表１）。
【００６５】
コロニー形成は、腸のＮａ＋／グルコースコトランスポーター（ＳＧＬＴ−１）ｍＲＮＡ量を増加させた。すいリパーゼ関連タンパク質−２（ＰＬＲＰ−２）、コリパーゼ、肝脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）、およびアポリポタンパク質Ａ−ＩＶを含めて、宿主の脂質吸収／搬出機構のいくつかの構成成分の発現も協奏的に増加した（下記表１参照）。脂肪摂食によって抑圧されることが知られている新規なＰＰＡＲα標的（Ｓ．Ｋｅｒｓｔｅｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、２８４８８（２０００））である絶食誘導脂肪因子の発現が顕著に減少したことで、コロニー形成されたマウスの脂質摂取が増大したことのさらなる証拠が提供された。
【００６６】
特にこれら６種類の遺伝子の発現が変化したことは、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎが宿主の栄養素吸収／処理能力の増加を誘発することを示し、なぜ無菌のげっ歯動物がその体重を維持するために、通常のミクロフローラを有するげっ歯動物よりも高カロリーの摂取が必要であるかを部分的に説明していると考えられる（Ｂ．Ｓ．Ｗｏｓｔｍａｎｎ、Ｃ．Ｌａｒｋｉｎ、Ａ．Ｍｏｒｉａｒｔｙ、Ｅ．Ｂｒｕｃｋｎｅｒ Ｋａｒｄｏｓｓ、Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．３３、４６（１９８３））。
【００６７】
また、本出願人らは、コロニー形成が食事性金属（ｄｉｅｔａｒｙ ｍｅｔａｌ）の吸収に関与する４種類の遺伝子の発現に変化をもたらすことを見出した。上皮の高親和性銅トランスポーター（ＣＲＴ１）ｍＲＮＡが増加し、一方メタロチオネイン−Ｉ、メタロチオネイン−ＩＩ、フェリチンＨ鎖ｍＲＮＡが減少した（表１）。これらの変化は、コロニー形成が（例えば、ＣＲＴ１経由の）重金属吸収能の増加を引き起こし、同時に、重金属を細胞内に隔離する能力（ＭＴ−Ｉ／ＩＩ、フェリチン）の減少を引き起こすことを示唆している。このことは、宿主自身の代謝経路での利用の増加、または微生物との競合のいずれかのために、これらの化合物に対する宿主の要求が増大することを意味する。ＳＧＬＴ−１、コリパーゼ、Ｌ−ＦＡＢＰ、およびＭＴ１（と以下に考察する他の８種類のｍＲＮＡ）の変化は、ｑＲＴ−ＰＣＲで個別に確認された（Ｃ．Ａ．Ｈｅｉｄ、Ｊ．Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ、Ｐ．Ｍ．ＷＩＬＬＩＡＭＳ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６、９８６（１９９６）（下記表２参照））。
【００６８】
コリパーゼは、すい臓トリグリセリド・リパーゼおよびＰＬＲＰ−２の両者の活性を刺激することにより、食事性脂質の代謝に重要な役割を果たす。また、プロコリパーゼ（ｐｒｏｃｏｌｉｐａｓｅ）のタンパク質分解切断によって、脂肪摂取の満腹シグナルとして機能するペンタペプチド（エンテロスタチン）を生成する（Ｓ．Ｏｋａｄａ、Ｄ．Ａ．Ｙｏｒｋ、Ｇ．Ａ．Ｂｒａｙ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．４９、１１８５（１９９１））。以下に示すＢ．Ｔｈｅｔｏａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニー形成後に見られる発現が有意に増加することは、これまで価値を認められていない、腸管上皮が消化管内定住細菌と共に食事性脂質代謝に寄与する機序を暗示している。
【００６９】
無傷の粘膜防御は、腸の莫大な数の定住微生物を棲息させるために極めて重要である。その破壊は、宿主に、また管腔のミクロフローラの安定性に有害な免疫応答を起こすことがあり、炎症性腸疾患などの病的状態をもたらす（Ｐ．Ｇ．Ｆａｌｋ等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２、１１５７（１９９８））。
【００７０】
Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎによるコロニー形成は、組織検査から判断して検出可能な炎症反応を起こさないことが判明した（Ｌ．Ｂｒｙ、Ｐ．Ｇ．Ｆａｌｋ、Ｔ．Ｍｉｄｔｖｅｄｔ、Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、１３８０（１９９６））。また、応答に関与する多数の遺伝子の、マイクロアレイ上に表出する認識可能な誘発（または抑圧）もない。Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎを導入してから１０日後に、ＩｇＡを産生するＢ細胞の流入が回腸粘膜内で起こる。一方、共生生物によって誘導される同様のＩｇＡ応答は、Ｔ細胞には無関係であり、防御をより完全なものにすることがわかった（Ａ．Ｊ．Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８、２２２２（２０００））。
【００７１】
防御機能に関与する遺伝子は、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎコロニー形成で観察される遺伝子発現変化の１０％（７／７１）を占める。マイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲ分析から、ＩｇＡを産生するＢ細胞の流入は、上皮にわたってＩｇＡを輸送する重合体免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）の発現の増加を伴うことが明らかになった（表１、２）。上皮の上にある保護粘液層の１成分（ＭＵＣＬＩＮ；Ｒ．Ｃ．ＤｅＬｉｓｌｅ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５、Ｇ２１９（１９９８））と腸粘膜の防御／治癒に関与する三つ葉型ペプチドに対する想定上の受容体（Ｌ．Ｔｈｉｍ、Ｅ．Ｍｏｒｔｚ、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．９０、６１（２０００））の両者をコードするＣＲＰ−ダクチン遺伝子の発現も増大した。また、補体によって媒介される細胞崩壊を抑制する（Ｍ．Ｅ．Ｍｅｄｏｆ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５、８４８（１９８７））、上皮尖端の表面タンパク質である減衰促進因子（ＤＡＦ）の発現も増加する。ｐＩｇＲ、ＭＵＣＬＩＮ、およびＤＡＦの発現が同時に亢進されると、細菌の上皮防御膜の通過を妨げるのに役立つはずであり、さらに腸分泌液中に存在する補体成分の微生物による活性化に続いて起こる恐れがある粘膜損傷も防止するはずである。
【００７２】
Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎを用いたコロニー形成によって減衰促進因子（ＤＡＦ）の発現が５倍になることがわかった。ＤＡＦは、腸の上皮細胞の尖端表面上に存在し、補体によって媒介される細胞崩壊を抑制することが知られている（Ｍ．Ｅ．Ｍｅｄｏｆ、Ｅ．Ｉ．Ｗａｌｔｅｒ、Ｊ．Ｌ．Ｒｕｔｇｅｒｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｖ．Ｎｕｓｓｅｎｚｅｉｇ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５、８４８（１９８７））。ＤＡＦ、ｐＩｇＲ、ＭＵＣＬＩＮの発現が同時に亢進されると、細菌の上皮防御膜の通過を妨げるのに役立つはずであり、さらに腸分泌液中に存在する補体成分の微生物による活性化に続いて起こる恐れがある粘膜損傷を防止するはずである。
【００７３】
Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎに対する最も顕著な応答は、小型プロリン・リッチ・タンパク質２（ｓｐｒｒ２ａ）ｍＲＮＡの増加であった（表１）。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、コロニー形成によりこのｍＲＮＡが２０５±６４倍に増加することが確認された（表２）。Ｓｐｒｒ２ａは、扁平上皮細胞の最終分化に関連するタンパク質ファミリーの１メンバーである。Ｓｐｒｒ類は、角質細胞外被成分として、かつ主要なデスモソーム構成要素の１つであるデスモソームのデスモプラキンに結合する架橋タンパク質として、扁平上皮の防御機能に寄与する（Ｐ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｅｒｔ、Ｌ．Ｎ．Ｍａｒｅｋｏｖ、ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １０、４２４７（１９９９））。コロニー形成は、デスモソーム（デスモプラキン、プラコグロビン、プラコフィリン（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ）、プレクチン）またはタイト・ジャンクション（ＺＯ−１、オクルディン）に結合する他のタンパク質をコードする遺伝子の発現に顕著な変化（すなわち２倍以上）を生じなかった。
【００７４】
腸内でのＳｐｒｒ２ａの発現およびその微生物による制御は新規な知見である。扁平上皮防御へのｓｐｒｒ２ａの重要な寄与およびＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎに対するｓｐｒｒ２ａ発現の劇的な応答はともに、このタンパク質が腸の防御機能に重要な役割を演じていることを示唆している。したがって、これは、特にＳｐｒｒ２ａが腸内で関与する生化学経路を評価することによって、本発明によるさらに進んだ研究に特に適した標的となる。
【００７５】
離乳過渡期の顕著な指標は、主要な乳糖のラクトースを加水分解する腸細胞刷子縁酵素であるラクターゼ−フロリジン・ヒドロラーゼ（ＬＰＨ）の減少である。ＬＰＨ ｍＲＮＡ量は、従来法で飼育された動物の小腸全体で哺乳期間中に増加し、その後離乳中に回腸で減少する（Ｓ．Ｄ．Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７、Ｇ５８４（１９９４））。これら遺伝子の発現に対する共生細菌の効果は、この細菌が有意な影響を及ぼすかどうかを決定するうえで特に興味深い。
【００７６】
本発明の方法を用いると、コロニー形成が、血管形成活性が実証されている分泌タンパク質であるアンギオゲニン−３類似のアンギオゲニン−４の発現を亢進する結果となることが見出されている（Ｘ．Ｆｕ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７、１５０３（１９９７）、Ｘ．Ｆｕ等、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７、１２５（１９９９））。Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎがコロニーを形成すると、配列番号１２および配列番号２５（アンギオゲニン−４）のプライマー（表１、２）で増幅することによって認識可能な血管形成因子の発現が１１倍になることは、血管形成因子の新規な制御方式であることを意味し、したがって、本発明によるさらに進んだ研究の対象とすることができる。
【００７７】
下記のレーザ・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）実験は、この応答の細胞起源を詳細に叙述している。それによれば、細菌の存在が腸の血管新生に影響することが示唆される。
【００７８】
消化管は、摂取された多数の毒素および生体異物が最初に接する部位である。これらの化合物の解毒および代謝に対する管腔の細菌および上皮の相対的な寄与度を、従来法で飼育された動物で正確に叙述することは困難であった。無菌マウスにＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎでコロニーを形成させると、これらのプロセスに関与するいくつかの遺伝子の発現が減少することが見出された（下記表１）。多様な求電子物質を解毒するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡが減少し、それに応じてグルタチオンと抱合された化合物を上皮から搬出する多剤耐性タンパク質−１（Ｍｄｒ−１）が減少する（Ｒ．Ｗ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ、Ａ．Ａ．Ｒｕｅｆｌｉ、Ｍ．Ｊ．Ｓｍｙｔｈ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５、１（２０００））。ヒトの薬物酸化的代謝に関与するＣＹＰ２Ｄ２（デブリソキン・ヒドロキシラーゼ）（Ｍ．Ｉｎｇｅｌｍａｎ−Ｓｕｎｄｂｅｒｇ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０、３４２（１９９９））の発現も、コロニー形成により減少する。これらの遺伝子の発現が減少することは、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ自体が宿主に有害な化合物の解毒に寄与することを示唆している。
【００７９】
このチトクロムＰ−４５０を欠乏させる遺伝的多型はヒトでは一般的であり、薬物酸化的代謝の変化と関連している（Ｍ．Ｉｎｇｅｌｍａｎ−Ｓｕｎｄｂｅｒｇ、Ｍ．Ｏｓｃａｒｓｏｎ、Ｒ．Ａ．ＭｃＬｅｌｌａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０、３４２（１９９９））。これら３つの宿主遺伝子の発現が減少することは、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎなどの共生細菌が宿主に有害となり得る化合物の解毒に寄与していることを示唆している。このことは、正常なミクロフローラの構成成分が薬物代謝に関与する宿主遺伝子を調節でき、個体間のこのような代謝変動がどのようにしてこれら個体の消化管内定住フローラの差異から生じるかを明示できることを示している。したがって、これら遺伝子の発現に対する共生細菌の効果を本発明の方法を用いて評価することは有用と考えられる。
【００８０】
Ｐｔｅｎは、両特異性タンパク質ホスファターゼ・ファミリーの１メンバーである。ヒトのＰＴＥＮハプロ不全は、腫瘍形成に対する感受性の増加と関連している（Ｄ．Ｊ．Ｍａｒｓｈ等、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７、５０７（１９９８））。また、Ｐｔｅｎ＋／−＜−＞Ｐｔｅｎ＋／＋キメラ・マウスは、結腸のポリープおよび腺癌を発生する（Ａ．ＤｉＣｒｉｓｔｏｆａｎｏ、Ｂ．Ｐｅｓｃｅ、Ｃ．Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ、Ｐ．Ｐ．Ｐａｎｄｏｌｆｉ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９、３４８（１９９８））。Ｇｐ１０６のヒト相同体であるＴＢ２／ＤＰ１は、突然変異すると複数の腸腺腫を発生する遺伝子座の１構成部分である（Ｒ．Ｗ．Ｂｕｒｔ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４７０、９９（１９９９））。ミクロフローラの１成分が、配列番号１２および２５（アンギオゲニン−４）などのプライマー（下記表３参照）を用いてその遺伝子が増幅可能である血管形成因子、ＰｔｅｎおよびＧｐ１０６などの遺伝子の発現に影響するという発見は、腸細菌が、消化管の内部で、または外部でさえも腫瘍形成を開始または進行させる一因となりうる機序を考慮することの重要性を強調するものである。
【００８１】
腸の運動性は、その腸管神経系（ＥＮＳ）によって制御されている。運動活性の調節不全を伴う過敏性大腸症候群が主要な健康問題であるにもかかわらず、内因子および外因子のＥＮＳ活性に対する相対的寄与度は十分に理解されていない。Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎなど共生細菌の消化管生理への影響は、腸管神経系（ＥＮＳ）および筋層で発現される遺伝子に及ぶ。Ｌ−グルタミネートトランスポーターおよびグルタミン酸をＧＡＢＡに転化するＬ−グルタミネートデカルボキシラーゼをコードするｍＲＮＡがいずれも増加したことから、ＥＮＳのグルタミン酸作動性神経に対するコロニー形成に伴う効果が示唆される（Ｍ．Ｔ．Ｌｉｕ、Ｊ．Ｄ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｍ．Ｄ．Ｇｅｒｓｈｏｎ、Ａ．Ｌ．Ｋｉｒｃｈｇｅｓｓｎｅｒ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７、４７６４（１９９７））。神経伝達物質放出に関与するシナプトブレビン結合タンパク質である小胞関連タンパク質−３３（Ｐ．Ａ．Ｓｋｅｈｅｌ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７、１１０１（２０００））の発現の亢進も見られる。腸管γ−アクチンとシステイン・リッチ・タンパク質２の２種類の筋特異的ｍＲＮＡも同時に増加する。無菌動物および従来法で飼育された動物のこれまでの電気生理学的研究により、ミクロフローラが消化管の運動性にある役割を果たしていることが示唆された（Ｅ．Ｈｕｓｅｂｙｅ、Ｐ．Ｍ．Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ、Ｔ．Ｍｉｄｔｖｅｄｔ、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．３９、９４６（１９９４））。本発明の方法は、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎなどの消化管内定住微生物がどのように作用して運動性を調節しているかについて分子的詳細を提供することができる。
【００８２】
Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、通常、離乳中にマウスやヒトの腸にコロニーを形成する（Ｗ．Ｅ．Ｃ．Ｍｏｏｒｅ、Ｌ．Ｖ．Ｈｏｌｄｅｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７、９６１（１９７４）、Ｔ．Ｕｓｈｉｊｉｍａ、Ｍ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｋ．Ｔａｔｅｗａｋｉ、Ｙ．Ｏｚａｋｉ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、９８５（１９８３））。この時期は、ミクロフローラの組成の劇的な変化、および腸管上皮内の一連の重要な発育変化を特徴とする。これらの変化のうちいくつが腸細胞メカニズムによって制御されているか、また、いくつが間充織からまたは（食事性の、微生物の）管腔因子から発せられる外因性シグナルによって制御されているかは不明である。
【００８３】
発現を分析すると、驚くべきことに、成体無菌マウスのＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎによるコロニー形成が、従来法で飼育された動物の成熟した腸に通常発生する変化によく似た別の応答を誘発することが明らかとなった。主要な乳糖（ラクトース）を加水分解するラクターゼの発現は、通常離乳期中に減少する（Ｓ．Ｄ．Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７、Ｇ５８４（１９９４））。成体無菌マウスのＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎによるコロニー形成は、回腸のラクターゼｍＲＮＡの減少をもたらす（下記表１、２）。これらの知見は、生後に出現しつつある正常フローラのメンバーが腸の成熟にどのように寄与しうるかを示している。
【００８４】
アデノシン・デアミナーゼ（ＡＤＡ）およびポリアミン（スペルミン、スペルミジン）は、出生後の腸の成熟に重要な役割を果たす（Ｇ．Ｄ．Ｌｕｋ、Ｌ．Ｊ．Ｍａｒｔｏｎ、Ｓ．Ｂ．Ｂａｙｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１０、１９５（１９８０）、Ｊ．Ｍ．Ｃｈｉｎｓｋｙ等、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４２、１７２（１９９０））。Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニー形成は、ＡＤＡおよびオルニチン・デカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）抗酵素をコードするｍＲＮＡの５倍未満の増加をもたらすことが判明した。ポリアミン量によってその発現が影響される抗酵素は、ＯＤＣの代謝回転の重要なレギュレーターである（Ｊ．Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｓ．Ｋｏｓｋｉｎｉｅｍｉ、Ｋ．Ｐｅｒｓｓｏｎ、Ｂ．Ｇｒａｈｎ、Ｉ．Ｈｏｌｍ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０、２２３（１９９７））。したがって、抗酵素ｍＲＮＡ量の増加は、コロニー形成が回腸のポリアミン合成に影響することを示唆している。これらのデータは、消化管成熟の２クラスのレギュレーターであるアデノシンとポリアミンの合成を制御する遺伝子それ自体が、ミクロフローラのある成分によって調節されることを示しており、消化管の成熟に影響するカスケードの上流エフェクターとして細菌が働くというアイデアに通じるものである。その他下記コロニー形成実験は、他の消化管共生生物がこのような変化の操作能力を持つことを示している。
【００８５】
哺乳−離乳移行に付随する消化管成熟の変化は、グルココルチコイドの増加によっても制御されていると考えられている（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ、Ｌ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４）の中のＳ．Ｊ．Ｈｅｎｎｉｎｇ、Ｄ．Ｃ．Ｒｕｂｉｎ、Ｒ．Ｊ．Ｓｈｕｌｍａｎ、ｐｐ．５８４〜５８６）。以下に記述するＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニー形成は、グルココルチコイドによってその転写が抑制されることが知られている２つの遺伝子、すなわち１５−ヒドロキシプロスタグランジン・デヒドロゲナーゼ（Ｍ．Ｄ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｖ．Ｇｏｏｄｗｉｎ、Ｓ．Ｍｅｓｎａｇｅ、Ｊ．Ａ．Ｋｅｅｌａｎ、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ６２、１（２０００））とグルココルチコイド減弱応答遺伝子−１６（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅ−１６）（Ｊ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ、Ｈ．Ｒ．Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０、１６７５６（１９９５））の発現の減少を伴った。また、核内ホルモン受容体ファミリー・メンバーとその生成物が相互作用する別の遺伝子であるイムノフィリンＦＫＢＰ５１の発現も減少した（Ｓ．Ｃ．Ｎａｉｒ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７、５９４（１９９７））。しかし、個々のどの場合でも１／５未満には減少しなかった。したがって、本発明の方法を用いて他の共生細菌を調べて、それらがより重要な効果をもたらすかどうかを見ることができる。
【００８６】
上述のとおり、本発明者らは、その遺伝子が上記配列番号１２および２５のプライマーを用いて増幅可能でありマウスの腸で発現される、アンギオゲニン・ファミリーのある特定のメンバーが、新規であることを発見した。したがって、このタンパク質とそれをコードする遺伝子は、本発明の別の態様を形成する。
【００８７】
本発明のさらに別の態様は、以下の図４に示す配列番号２９のタンパク質、その対立遺伝子変異体、または配列番号２９と同一のアミノ酸配列を少なくとも８５％持つタンパク質を提供する。
具体的には、本発明は配列番号２９のタンパク質を提供する。
さらに別の態様では、本発明は上述のタンパク質をコードする核酸を提供する。
これらのタンパク質は、本発明のスクリーニング・プロセス用標的として有用である。
以下の実施例は本発明を例示するものである。
【００８８】
実施例１
７〜１５週齢無菌ＮＭＲＩ／ＫＩマウスの同年齢のグループを、プラスチック製ノトバイオート隔離装置に１２時間の照明サイクルで飼育し、加圧滅菌された固形飼料の食餌（Ｂ ＆ Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）を自由に採餌させた。オスに野生型Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ（ＶＰＩ−５４８２菌株）（Ｌ．Ｈｏｏｐｅｒ等（１９９９）、前掲）を接種した。マウスを１０日後、照明を点けて２時間後に屠殺した。末端の１ｃｍの小腸を使用して、押し出した管腔内容物のｍｌ当たりのコロニー形成単位数を規定した。
【００８９】
管腔内容物のＭＬ当たり１０７以上のコロニー形成単位（ＣＦＵ）のバクテリアを有するマウスから回腸ＲＮＡを単離した［以前の研究から、回腸の活発なコロニーを形成するには１０日で十分であり、回腸上皮中のフコシル化グリカンの産生を完全に誘発するには１０７ＣＦＵ／ｍＬが必要であることがわかっている（Ｌ Ｈｏｏｐｅｒ等（１９９９）、前掲。Ｌ．Ｂｒｙ、Ｐ．Ｇ．Ｆａｌｋ、Ｔ．Ｍｉｄｔｖｅｄｔ、Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、１３８０（１９９６））］。
【００９０】
３個の独立したコロニー形成集団（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｓ）由来の４匹のマウスの小腸末端１ｃｍに隣接する３ｃｍの小腸から、および同年齢同性無菌マウス（ｎ＝８）から、ＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ）を用いて調製した回腸ＲＮＡの全サンプルを、ビオチン化ｃＲＮＡ標的の生成用にそれぞれ等量プールした。Ｃ．Ｋ．Ｌｅｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５、１３９０（１９９９）に概説された方法を用いて、３０μｇの各細胞ＲＮＡプール全体から２つの標的を個別に調製した。
【００９１】
ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎベースのリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ研究（Ｎ．Ｓｔｅｕｅｒｗａｌｄ等、Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．５、１０３４（１９９９））を、下記表３に列記した遺伝子特異的プライマーおよびＤＮアーゼで処理したＲＮＡを用いて実施した。
【００９２】
各アンプリコン用シグナルは、プライマー・ダイマーやゲノムＤＮＡからではなくｃＤＮＡに由来することをコントロール実験により確認した。シグナルは、内部参照ｍＲＮＡ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）に対して規格化したものである。この規格化したデータを用いて、無菌およびコロニー形成した回腸中の所与のｍＲＮＡを定量した（ΔΔＣＴ分析；Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ＳＥＱＵＥＮＣＥ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）。
【００９３】
【表１】
【００９４】
各ｃＲＮＡを、Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｂｕｉｌｄ ４およびＴＩＧＲクラスター・データベースからの約２５，０００個のマウス・ユニーク遺伝子を有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｕ１１ＫおよびＭｕ１９Ｋチップ・セットと、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従い交雑させた。各チップから収集したデータを、各チップにわたる全体の蛍光強度が同等（目標強度＝１５０）になるようにスケーリングした。「無菌」と「コロニー形成」の発現レベルを対ごとに比較した。
【００９５】
３つの基準、すなわち、ＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウェアが「増加」または「減少」の差異のある判定を返した、無菌ｃＲＮＡまたはコロニー形成ｃＲＮＡのいずれでもｍＲＮＡがＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウェアにより「プレゼント（ｐｒｅｓｅｎｔ）」と呼ばれた、あるいは二重マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓ）で差異が観測された、を満たす場合に、２倍以上の差異が記録された。
【００９６】
１１８個のプローブ・セットで表されるｍＲＮＡが、コロニー形成により、二重マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションで規定して少なくとも２倍になった。
【００９７】
９５個のプローブ・セットで表される転写産物が増加し、一方、２３個のプローブ・セットで表される転写産物が減少したことが判明した。これらプローブ・セットの８４個で表される遺伝子（７１ユニーク遺伝子）を機能グループに割り当て、以下の表１に列記する。この表では、結果は、コロニー形成回腸と無菌回腸とのｍＲＮＡ量の倍数差として表され、二重マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションの平均値である。２個以上の別々のプローブ・セットで表される遺伝子の平均変化倍率を分けて列記する。
【００９８】
１これらのプローブ・セットは、ファミリー・メンバー同士を区別しない。
【００９９】
【表２】
【０１００】
【表３】
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
これらの基準を用いて同定された多数の遺伝子が、基本的な腸の機能の調節に関与していることは重要である。すなわち、７１種類の遺伝子のうち２０種類（２８％）は、栄養素の摂取と代謝に分類された。また、すいリパーゼ関連タンパク質２（ＰＬＲＰ−２）、コリパーゼ、肝脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）、およびアポリポタンパク質Ａ−ＩＶを含めて、宿主の脂質吸収／搬出機構のいくつかの構成成分の発現が協奏的に増加した（表１）。脂肪摂食によって抑圧されることが知られている（Ｓ．Ｋｅｒｓｔｅｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、２８４８８（２０００））新規なＰＰＡＲｇ標的である絶食誘導脂肪因子の発現が顕著に減少したことで、コロニー形成されたマウスの脂質摂取が増大したことのさらなる証拠が提供された。これら６種類の遺伝子の発現が変化したことは、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎが宿主の栄養素吸収／処理能力の増加を誘発することを示し、なぜ無菌のげっ歯動物がその体重を維持するために、ミクロフローラを有するげっ歯動物よりも高カロリー摂取が必要であるかを説明するのに役立つ。
【０１０４】
また、食事性金属の吸収に関与する４種類の遺伝子の発現が変化した。上皮の高親和性銅トランスポーター（ＣＲＴ１）のｍＲＮＡが増加し、一方、メタロチオネイン−Ｉ、メタロチオネイン−ＩＩ、およびフェリチンＨ鎖ｍＲＮＡが減少した（表１）。これらの変化は、コロニー形成が（例えば、ＣＲＴ１経由の）重金属吸収能の増加を引き起こし、同時に、重金属を細胞内に隔離する能力（ＭＴ−Ｉ／ＩＩ、フェリチン）の減少を引き起こすことを示唆している。このことは、宿主自身の代謝経路での利用が増加するので、あるいは微生物と競合するので、これらの化合物に対する宿主の要求が増大することを意味する。ＳＧＬＴ−１、コリパーゼ、Ｌ−ＦＡＢＰ、およびＭＴ１（と以下に考察する他の８種類のｍＲＮＡ）の変化は、ｑＲＴ−ＰＣＲで個別に確認された（Ｃ．Ａ．Ｈｅｉｄ、Ｊ．Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ、Ｐ．Ｍ．ＷＩＬＬＩＡＭＳ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６、９８６（１９９６））（表２）。
【０１０５】
これらのうち、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニー形成により発現が５倍以上異なることが判明した遺伝子は、コリパーゼ、肝脂肪酸結合タンパク質、絶食誘導脂肪因子、メタロチオネインＩおよびメタロチオネインＩＩ、リンゴ酸オキシドレダクターゼ、Ｓｐｒｒ２ａ、アンギオゲニン−３、アンギオゲニン関連タンパク質、アンギオゲニン・ファミリー、ゲルゾリン、ｇｐ１０６（ＴＢ２／ＤＰ１）、およびｒａｃ２であった。これらのうち、コリパーゼ、絶食誘導脂肪因子、アンギオゲニン３、およびＳｐｒｒ２ａ遺伝子は、９倍以上異なる発現レベルを示した。
【０１０６】
Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎに対する宿主応答の注目すべき特徴は、マイクロアレイ上に表出する、免疫−炎症プロセスに関与する多数の遺伝子の、検出可能なまたは変化した発現がないことであった。これには、侵入病原体に対する宿主応答の重要なレギュレーターであるＮＦ−ＫＢ制御プロセスに関与する遺伝子が含まれる（Ｄ．Ｅｌｅｗａｕｔ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３、１４５７（１９９９））。これらの応答がないことは、消化管の侵入病原体であるＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対するヒト腸上皮細胞系の応答に関する最近のｃＤＮＡマイクロアレイ分析で得られた結果と対照的である（Ｌ．Ｅｃｋｍａｎｎ、Ｊ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．Ｐ．Ｈｏｕｓｌｅｙ、Ｍ．Ｂ．Ｄｗｉｎｅｌｌ、Ｍ．Ｆ．Ｋａｇｎｏｆｆ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、１４０８４（２０００））。Ｉｎ ｖｉｖｏ免疫−炎症応答が誘発された形跡がないことは、宿主がＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎなどの消化管内定住微生物をその全寿命の間収容する必要があることと矛盾しない。
【０１０７】
コロニー形成は、消化管腫瘍症の発達に関係する２種類の遺伝子ＰｔｅｎとＧｐ１０６の発現を増加させる（表１）。
【０１０８】
実施例２
さらに進んだ分析では、２つの技術を組み合わせた。第１に、レーザ・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）を使用して、無菌マウスおよびコロニー形成マウスの屠殺直後に採取した回腸の凍結切片から３個の細胞集団を回収した。この３個の集団は、（ｉ）陰か内に存在する上皮（未分化細胞ならびにパネート細胞系譜の分化メンバーを含む腸の増殖区画）、（ｉｉ）上皮を覆うじゅう毛（有糸分裂後の腸の他の３つの系譜の分化メンバーを含む）、および（ｉｉｉ）間充織を覆う陰か−じゅう毛単位である（図１）。
【０１０９】
マイクロアレイ分析用ＲＮＡを生成するために使用されるマウス群とは別のマウス群についてＬＣＭを実施した。凍結回腸から７μｍ厚みの切片を切り出し、Ａｒｃｔｕｒｕｓ製ＰｉｘＣｅｌｌ ＩＩシステム（レーザ・スポット直径７．５μＭ）を用いてＬＣＭを実施した。ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ−Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）および標準の組織化学的プロトコルを用いて、解剖した細胞集団からＲＮＡを調製した。ＭＲ Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２７４、９９８〜１００１、１９９６およびＲ．Ｆ．Ｂｏｎｎｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１２０３〜４、１９９７に記載の従来法によりレーザ・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）を実施した。
結果を図１に示す。
【０１１０】
第２に、リアル・タイムＲＴ−ＰＣＲを使用してレーザ捕捉細胞集団中の特異的ＲＮＡを定量した。マイクロアレイ分析用に使用されるマウスとは別の３通りの実験の無菌マウスおよびコロニー形成マウスを用いて、ＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
各試料を４回の独立実験で３回繰り返して分析した。個々の測定の平均値±１Ｓ．Ｄ．を表２に示す。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
コリパーゼは、すい臓の外分泌（胞状）細胞によって産生される。腸内での発現は、これまで報告されていない。そこで、ＬＣＭおよびリアル・タイムＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎに対するその応答の細胞起源を詳細に叙述する。
【０１１３】
この結果から、ｓｐｒｒ２ａ ｍＲＮＡは上皮に限られ、そこではその濃度はじゅう毛上の方が陰かよりも７倍高いことがわかる（図１Ｂ）。Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、じゅう毛上皮内で２８０倍の増加を誘発する。この値は、回腸ＲＮＡ全体で記録された増加とよく一致する（表２）。ｓｐｒｒ２ａ応答の細胞起源は、それが細菌のコロニー形成に応答して腸上皮防御の強化に関与するという仮説を支持するものである。
【０１１４】
コリパーゼは、すい臓の外分泌胞状細胞によって産生される。ＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲから、コリパーゼｍＲＮＡも回腸陰か上皮に存在し、そこではＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニーが形成されるとコリパーゼが１０倍になることが明らかになった（図１Ｂ）。このことは、回腸ＲＮＡ全体のマイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって検出される増加を説明するものである（表１、２）。コリパーゼは、すい臓トリグリセリド・リパーゼおよびＰＬＲＰ−２の両者の活性を刺激して食事性脂質の代謝に重要な役割を演じている（Ｍ．Ｅ．Ｌｏｗｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、３１２１５（１９９８）。また、プロコリパーゼのタンパク質分解切断により、脂肪摂取の満腹シグナルとして機能するペンタペプチド（エンテロスタチン）が生成する（Ｓ．Ｏｋａｄａ等、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．４９、１１８５（１９９１））。コリパーゼ遺伝子制御の分析から、食事性脂質代謝に対する腸上皮（と消化管内定住共生生物）のこれまで価値が認められていなかった寄与が明らかになる。
【０１１５】
アンギオゲニン−３は、最初にＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞中で同定されたが（Ｘ．Ｆｕ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７、１５０３（１９９７））、その細胞起源または制御についてはほとんど知られていない。ＬＣＭおよびｑＲＴ−ＰＣＲから、陰か上皮は、アンギオゲニン−３ ｍＲＮＡだけでなく新しいタンパク質であるアンギオゲニン−４ｍＲＮＡにも特異的な配列番号１２および２５などのプライマー（上記表３参照）を用いて増幅可能である遺伝子が優勢な部位であり、また、コロニー形成によってこの区画内のその量が７倍に増加する結果となることが明らかになった。この増加は、回腸ＲＮＡ全体のマイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲ分析で明確になる発現変化を説明するものである（表１、２）。分泌／ＲＮアーゼ／血管形成因子の上皮部位は、微生物コロニー形成に対する多数の宿主応答のエフェクターとして機能する戦略的な部位になっている（例えば、栄養素の吸収／分布の促進／防御機能の増強。
【０１１６】
ｓｐｒｒ２ａ、コリパーゼ、およびアンギオゲニン−４のＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲ研究により、ｉｎ ｖｉｖｏ宿主応答を複合組織中の特定の細胞集合に帰属すること、および細胞応答を定量的に記述することの実現可能性が確立される。本出願人らの結果は、応答細胞集団を回収し微生物に対するその反応を定量的に表現するうえで、宿主細胞遺伝子発現に対する微生物の影響を調べるために、どのようにするとｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを越えてｉｎ ｖｉｖｏ系を使用できるかを示すものである。
【０１１７】
無菌マウスのＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎによるコロニー形成は、回腸のＬＰＨ ｍＲＮＡ量を（１／５以下にはならないが）減少させる（表１、２）。レーザ捕捉された上皮および間充織細胞集団から単離されたＲＮＡの分析から、コロニー形成によって誘発されるＬＰＨ ｍＲＮＡ量の減少が、じゅう毛上皮内で主に起こることを確認した（図２）。
無菌マウスとＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎを伴うマウスとの転写産物量の比較から、アンギオゲニン−４の発現がコロニー形成に伴って増加することが明らかとなった。
【０１１８】
実施例１で見られたそのｍＲＮＡが１１倍誘発されることは、回腸ＲＮＡ全体のリアル・タイムＲＴ−ＰＣＲによって別個に確認された（表２）。アンギオゲニン−３は、最初にＮＩＨ ３Ｔ３ 線維芽細胞中で同定された（Ｘ．Ｆｕ、Ｍ．Ｐ．Ｋａｍｐｓ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７、１５０３（１９９７））。しかし、ＬＣＭおよびリアル・タイムＲＴ−ＰＣＲ分析により、コロニー形成された回腸では、アンギオゲニン−３用に設計されたプライマーを用いて増幅可能であるｍＲＮＡの量が陰か上皮中で最大であることが明らかとなった（回腸じゅう毛および間充織内の値は、それぞれ１／１４および１／１５である。図２）。しかし、下記実施例４で概説するように、このｍＲＮＡは実際にはアンギオゲニン−４ｍＲＮＡである。
【０１１９】
コロニー形成後に陰か上皮で観測されるこれらアンギオゲニン−４ｍＲＮＡ量が７倍の増加になることで、回腸ＲＮＡ全体のマイクロアレイおよびリアル・タイムＲＴ−ＰＣＲ分析で明確になった変化が説明される。
上皮で発現されるアンギオゲニン−４の細菌による調節は、血管形成因子を制御するための新規な様式である。
【０１２０】
実施例３
コロニー形成によりじゅう毛上皮内のラクターゼｍＲＮＡ量が減少することをＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲで確認した（図１Ｂ）。発育にしたがって制御されるラクターゼなどの遺伝子の発現変化を規制するのに微生物が役立つかもしれないという考えは、ミクロフローラの数個または多数の構成成分がこれらの変化を誘発できるかどうかという問いを提起する。
【０１２１】
このことを検討するために、７〜１５週齢の無菌ＮＭＲＩ／ＫＩマウスの同年齢グループ（ｎ＝４〜８匹／グループ）をプラスチック製ノトバイオート隔離装置に１２時間の照明サイクルで飼育し、加圧滅菌した固形飼料の食餌（Ｂ ＆ Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）を自由に取れるようにした。オスに、以下の群、
（ｉ）無処置（無菌コントロール）、
（ｉｉ）Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ菌株ＶＰＩ−５４８２（Ｌ．Ｖ．Ｈｏｏｐｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６、９８３３（１９９９））、
（ｉｉｉ）正常なヒトの糞便フローラから元来採取されたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２、
（ｉｖ）離乳前のヒトおよびマウスの回腸フローラの主要成分であり通常用いられるプロバイオティックであるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ（ＡＴＣＣ １５６９７）、
（ｖ）従来法で飼育されたマウスから採取された「完全な」回腸／盲腸ミクロフローラ（Ｌ．Ｂｒｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、１３８０（１９９６））
のうちの１つを接種した。
別のコントロール・グループは、出生以降従来法で飼育されたマウスからなる。
【０１２２】
マウスを１０日後、照明を点けて２時間後に屠殺した。末端の１ｃｍの小腸を使用してＣＦＵ／ｍｌ回腸内容物を規定した。この区画に直近の３ｃｍの小腸を用いて、回腸ＲＮＡ全体を単離した（ＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ）。
【０１２３】
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して各グループの回腸ラクターゼｍＲＮＡ量を比較した（すべての動物が１０７ＣＦＵ／ｍｌ回腸内容物を有していた）。結果を図３に示す。
【０１２４】
３種類のグラム陰性嫌気性菌のいずれかによるコロニー形成は、無菌コントロールに対してラクターゼの発現を同じように減少させた（図３）。この減少は、完全な回腸／盲腸フローラの接種後にも観察された。同じＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲから、コリパーゼおよびアンギオゲニン−４の回腸での発現が、３種類すべての生物がコロニーを形成したのちに、回腸／盲腸フローラによって誘発されることが明らかになった（図３）。
【０１２５】
これら元無菌マウス（ｅｘ−ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ｍｉｃｅ）の回腸で得られるコリパーゼおよびアンギオゲニン−４のｍＲＮＡ量は、出生後従来法で飼育された同年齢マウスのそれと同等であった（図３）。
【０１２６】
これらの知見とは対照的に、コロニー形成に対するｓｐｒｒ２ａの応答は、コロニー形成種に依存した。Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、回腸／盲腸フローラによる１０日間のコロニー形成に対する応答を繰り返してｓｐｒｒ２ａ ｍＲＮＡの顕著な増加をもたらしたが、Ｂ．ＩｎｆａｎｔｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉによるコロニー形成は、ｍＲＮＡ量をほんの無視できるほどしか増加させなかった（図３）。
【０１２７】
生体異物および求電子物質の代謝に協調して作用するＭｄｒ１ａおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼも、種特異的（かつ協奏的）応答を示した。発現を抑制するＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎとは異なり、Ｅ．ＣｏｌｉおよびＢ．ｉｎｆａｎｔｓの両者はこれらｍＲＮＡの増加を誘発する。これに対し、多成分回腸／盲腸フローラは、無菌コントロールと比較して、いずれのｍＲＮＡ量にも有意な（すなわち２倍の）変化をもたらさなかった。
【０１２８】
Ｍｄｒ１ａ／ＧＳＴ応答は、正常なミクロフローラの構成成分が、薬物代謝に関与する宿主遺伝子を調節できることの直接の証拠を提供し、薬物代謝の個体間の相違が個体の消化管内定住フローラの違いから一部は生じることを示唆している。
【０１２９】
実施例４
１０日間のコロニー形成が、アンギオゲニン−３の公表された配列から設計されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製プローブ・セットで検出されるｍＲＮＡの回腸での１１倍の発現増加を伴うことを観測したあとで、本出願人らはマウス・アンギオゲニン−３の３′および５′末端に特異的なプライマーを設計した。
それらは、
ＯＲＦ［フォワード・プライマー：
５′−ＣＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＴ ＴＣＴＴＴＧ （配列番号２７）
これは５′末端にＢａｍＨＩ部位を組み込んである；
リバース・プライマー：
５′−ＣＣＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＧＧＡＣＴＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＴＣＡＴＣＧＡＡＧ （配列番号２８）
これは５′末端にＸｂａＩ部位を組み込んである。
【０１３０】
これらのプライマーを、ＲＴ−ＰＣＲと共に使用して、元無菌ＮＭＲＩマウスの回腸から調製したＲＮＡ由来の４３８ｂｐの配列を増幅させた。これらのマウスに、従来法で飼育された同じ近交系に属する動物から採取された完全回腸／盲腸フローラで１０日間コロニーを形成させた。本出願人らは、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＸｂａＩにより消化されたｐＧＥＸ−ＫＧにサブクローニングして、ベクター特異的プライマーを用いてその配列を決定した。
【０１３１】
驚くべきことに、そのＯＲＦのヌクレオチド配列は、マウス・アンギオゲニン−３のそれと９０％しか同一ではなかった。ＰＣＲ反応に用いた（アンギオゲニン−３に特異的な）プライマー配列をその産物に組み込んだので、本出願人らは、５′−および３′−ＲＡＣＥを用いて、（ａ）この新しいアンギオゲニンのＯＲＦの５′および３′末端の正確な配列を得、（ｂ）そのｍＲＮＡの５′および３′非翻訳領域を特定した。その結果、アンギオゲニン−３ ｍＲＮＡと同一であるヌクレオチド配列はわずか８８．３％であることが明らかになった。
【０１３２】
このアンギオゲニン−４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、アンギオゲニン−３配列と並べて、それぞれ配列番号２９および３０として以下の図４に示す。
【０１３３】
アンギオゲニン−４は、マウス・アンギオゲニン・ファミリーの他の３種類のメンバーと７４〜８１％のアミノ酸配列が同一である（図５）。アンギオゲニン−４の５′および３′非翻訳領域が、アンギオゲニン−３ ｍＲＮＡの対応する領域に密接に関係していることが見出された（図４）。
【０１３４】
続いて、様々なマウス・アンギオゲニンｍＲＮＡの組織分布の比較分析を実施した。従来法で飼育した成体（１２〜１４週齢）のオスおよびメスＮＭＲＩマウスから採取した組織（２５組織／マウス）から単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。各遺伝子発現の相対レベルを定量するために、本出願人らは、４種類のマウス・アンギオゲニン・ファミリー・メンバーのそれぞれに特異的なプライマー・セットを設計し（図６、表４）、それらをＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎベースのリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析に用いた。
【０１３５】
意外なことに、アンギオゲニン−４ｍＲＮＡは、それが十二指腸から直腸で発現される場合は小腸に制限されていた（図７）。これに対し、アンギオゲニン−１の発現は、肝臓、肺、およびすい臓で最大であり（図８）、一方、アンギオゲニン−３は主に肝臓、肺、すい臓、および前立腺で発現される（図９）。アンギオゲニン関連タンパク質ｍＲＮＡは、４０サイクルのＰＣＲ後でさえも調査した全組織で検出されなかった（図１０）。
【０１３６】
したがって、アンギオゲニン−４は、その極めて限定的で腸特異的な発現パターンのため、マウス・アンギオゲニン・ファミリー・メンバーのなかでユニークなものとなっている。
【０１３７】
これらの知見から、腸内ではアンギオゲニン−３よりもアンギオゲニン−４の発現が微生物によって制御されることが示唆された。この仮説を直接試験するため、アンギオゲニン−４に特異的なプライマーとｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、無菌ＮＭＲＩマウスおよび従来法で飼育されたＮＭＲＩ動物から採取された回腸／盲腸フローラで１０日間コロニー形成させた無菌マウスの小腸の長さ方向に沿ったアンギオゲニン−４ｍＲＮＡ量を比較した。対ごとの比較から、アンギオゲニン−４の発現がコロニー形成されたマウスの空腸で最大であり、従来法に従うとこの領域でのアンギオゲニン−４の発現が最大１７倍にまで誘発されることが明らかになった（図１１）。無菌ＮＭＲＩマウスをＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎだけと１０日間共生させると（Ｍｏｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、アンギオゲニン−４の発現が同程度に誘発された（データ示さず）。
【０１３８】
【表７】
【０１３９】
アンギオゲニン−４の生後発育中の発現制御は、その微生物による制御と一致する。
次いで、生後５日（Ｐ５）〜Ｐ３０の無菌および従来法で飼育されたＮＭＲＩマウス（ｎ＝３マウス／日／グループ）の発育に伴うアンギオゲニン−４の発現パターンを評価した（図９）。アンギオゲニン−４の転写産物相対量は、Ｐ２０までいずれのマウス・グループでも比較的低いままであった。この時点以降、無菌動物でわずかに（２〜３倍）発現が増加した。これに対し、従来法で飼育された動物では、Ｐ１５からＰ３０の間でアンギオゲニン−４の発現が２０倍以上になった。これらの結果から、哺乳／離乳移行中にアンギオゲニン−４が誘導されることが示唆され、これは消化管内微生物の主な変化と一致する。生後の無菌マウスでアンギオゲニン−４が誘導されないことも、微生物叢の構成成分がアンギオゲニン−４の発現の制御に重要な役割を演じているという結論と一貫している。
【０１４０】
アンギオゲニン−４の細胞局在化
これまでのアンギオゲニン・タンパク質発現の細胞起源のレーザ・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）／ｑＲＴ−ＰＣＲによる研究（実施例２）では、アンギオゲニン−３およびアンギオゲニン−４の両者を認識するプライマー、および捕捉された陰か上皮、じゅう毛上皮、またはじゅう毛核（ｖｉｌｌｕｓ ｃｏｒｅ）由来の間充織集団から単離したＲＮＡを使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析から、微生物制御された「アンギオゲニン」が、リーベルキューンかの底部に位置する上皮細胞で産生されることが示された（Ｈｏｏｐｅｒ等、２００１）。
【０１４１】
アンギオゲニン−４の発現がパネート細胞中で起こるという仮説を試験するために、本出願人らは、ＬＣＭを使用して、（ａ）弱毒ジフテリア毒素Ａフラグメント（ｔｏｘ１７６）によってパネート細胞系譜を切断した無菌成体（１２週齢）トランスジェニック・マウス（ＣＲ２−ｔｏｘ１７６マウス）（Ｇａｒａｂｅｄｉａｎ等、１９９７）、および（ｂ）それらの同年齢同性無菌正常同腹子から、空腸陰かの底部に位置する細胞を単離した。アンギオゲニン４特異的プライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲにより、正常マウスの陰か底部の上皮細胞から精製されたＲＮＡでアンギオゲニン−４ｍＲＮＡレベルがＣＲ２−ｔｏｘ１７６同腹子に比べて１０倍になることが明らかになった（図１０）。
【０１４２】
従来法で飼育されたＮＭＲＩマウスを用いて追跡調査を実施した。３個の細胞プールをＬＣＭで採取した。すなわち、パネート細胞単体、上部陰かおよびじゅう毛の上皮細胞（パネート細胞を除いた画分）、およびじゅう毛核および陰か周辺領域から回収した間充織である。アンギオゲニン−４ｍＲＮＡの分布は、Ｍｏｍ−１遺伝子座の産物であり周知のパネート細胞特異的遺伝子の産物であるホスホリパーゼＡ２の分布に極めて類似していた（データ示さず）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
レーザ捕捉顕微解剖された回腸細胞集団、コロニー形成されたマウス回腸のＬＣＭにおける遺伝子発現のコロニー形成に関連する変化のリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ研究の結果を示す図である。ヌクレア・ファースト・レッドで切片を染色した。棒目盛＝２５μｍ。
【図２】
レーザ捕捉された細胞集団から単離されたｍＲＮＡの量のリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示すグラフである。値は、下記ΔΔＣＴ分析を用いた無菌間充織内の量に対するものである。各試料の遺伝子産物を３〜４回の独立実験で各３回繰り返して分析した。無菌マウスとコロニー形成マウスのペアから得られた代表的な結果（平均値±１Ｓ．Ｄ．）をプロットしてある。
【図３】
ミクロフローラの様々なメンバーによるコロニー形成に対する宿主応答の特異性を示す実験結果を示すグラフである。示した菌のうちの１つを、または従来法で飼育されたマウス由来の完全な回腸／盲腸フローラ（従来法ミクロフローラ）を無菌マウスに接種した（４）。接種から１０日後に１０７ＣＦＵ／ｍｌ回腸量でコロニー形成させた動物から調製された回腸ＲＮＡをプールし、図示した各ｍＲＮＡ量をリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）で分析した。３回の測定の平均値（±１Ｓ．Ｄ．）をプロットしてある。
【図４】
マウスのアンギオゲニン−４およびアンギオゲニン−３のヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号２９および３０）を並べて示す図である。
【図５】
マウスのアンギオゲニン・ファミリー・メンバーのアミノ酸配列の配列アラインメント（配列番号３１〜３４）を示す図である。
【図６】
マウスのアンギオゲニン・ファミリー・メンバーに特異的なプライマーの位置を示す図である。
【図７】
アンギオゲニン−４ｍＲＮＡの組織分布を示すグラフと、アガロース・ゲル分析の結果を示す図である。
【図８】
アンギオゲニン−１ｍＲＮＡの組織分布を示すグラフである。
【図９】
定量リアル・タイムＲＴ−ＰＣＲ分析後のアンギオゲニン−３ｍＲＮＡの組織分布を示すグラフである。
【図１０】
アンギオゲニン関連タンパク質発現の欠如を示すＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図である。
【図１１】
小腸内のアンギオゲニン−４の発現の微生物による制御に関する実験結果を示すグラフである。
【図１２】
生後発育期間におけるアンギオゲニン−４の発現の制御を示すグラフである。
【図１３】
陰か底部（ｃｒｙｐｔ ｂａｓｅ）から単離した細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析による小腸内のアンギオゲニン−４発現の細胞局在化を示す棒グラフである。
【技術分野】
本発明は、哺乳動物の腸内共生ミクロフローラのコロニー形成に起因する変化を調べるための方法、および得られた情報を消化管の改変および胃腸関連疾患の治療に有用な薬剤の製造および療法に使用することに関する。
【０００２】
【背景技術】
哺乳動物一般、特にヒトには、非常に複雑な多量の微生物集団が棲息している。このミクロフローラ構成成分との接触は、生まれた時に始まる。ヒトの腸には、他のどんな粘膜表面よりも微生物が密集している。したがって、この器官は、ミクロフローラが宿主の生理に顕著な影響を及ぼす可能性が高い部位である。
【０００３】
病原性または他の潜在的に有害な侵入微生物の効果は調べられているが（例えば、Ｌ．Ｅｃｋｍａｎｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００、２７５：１４０８４〜１４０９４、Ｄ．Ａ．Ｒｅｌｍａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年５月２１日：２８４（５４１８） １３０８〜１０、Ｄ．Ａ．Ｒｅｌｍａｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００年４月：１２（２）：２１５〜８を参照）、共生細菌が通常どのように発生し、どのような生理を示すかについては驚くほどわずかしか知られていない。これは、部分的には、非病原性の微生物が宿主の生態をどのように調節しているかを調査するための明確な実験的に扱い易いｉｎ ｖｉｖｏモデル系が不足しているためだけでなく、これら微生物が、消化プロセスなどに有意な影響を与えないという見解が一般的であるためでもある。
【０００４】
これまで、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎでコロニーを形成させた成体無菌動物を用いたモデルを使用して、この共生微生物が無菌マウスに導入された後に回腸上皮フコシル化グリカンの産生を制御することが示され、また、この微生物がそれ自身の栄養摂取のためにこれらグリカンの産生を制御する方法が詳細に叙述されてきた（Ｌ．Ｂｒｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、１３８０、１９９６；Ｌ．Ｖ．Ｈｏｏｐｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、９８３３（１９９９））。これ以外、常在菌が腸の遺伝子発現をどのように調節するのか、また、それが宿主の状態にどのように影響するかについては実質的に何もわかっていない。
【０００５】
本出願人らは、共生ミクロフローラが消化管の生理および成熟を規定するのに大いに寄与することを見出し、これを分子レベルで試験する手段を開発した。
【０００６】
【発明の概要】
本発明の第１の態様によれば、哺乳動物の腸内共生ミクロフローラのコロニー形成に起因する変化を調べるための方法であって、
ａ）共生細菌がコロニーを形成した腸内および無菌の腸内で少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を測定すること、および
ｂ）少なくとも１つの共生細菌がコロニーを形成した腸と無菌の腸とで発現レベルが少なくとも２倍異なるａ）の遺伝子を同定することを含む方法が提供される。
【０００７】
適切には、複数の遺伝子の発現は、後述のＤＮＡマイクロアレイ分析および／または定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定するが、他の従来法を使用することもできる。このような方法の例は、定量ノーザン・ブロット法ならびに２個の試料間で異なる遺伝子を検出するＰＣＲを基礎としたアッセイであるリプリゼンテイショナル・ディファレンス分析（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ分析）（ＲＤＡ）（例えば、Ｏｄｅｂｅｒｇ Ｊ 等、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１７、１〜９、２０００）である。特に、高密度オリゴヌクレオチド・アレイの使用が、ミクロフローラの構成成分によって形成される範囲の腸機能を包括的に分析するために好ましい。
【０００８】
マイクロアレイ分析は、腸で見られるような複数のタイプの細胞からなる複合組織内の宿主の応答を測定するために使用することができる。所与の微生物に対する宿主細胞の応答を詳細に示すｉｎ ｖｉｖｏモデルの価値は、細胞培養に基づくモデルとは異なり、その応答形成に対する系統因子および環境因子の寄与が維持され、無菌実験系で研究できることにある。
【０００９】
好ましい実施形態では、応答細胞集団はその発現されたｍＲＮＡ集団を撹乱することなく回収され、そのため微生物に対するその反応の特性を定量的に明らかにすることができる。これは、２つの技術、すなわちレーザ・マイクロダイセクション（ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）（ＬＣＭ）と、その後のレーザ捕捉試料の定量分析、例えば定量ＰＣＲおよび／またはマイクロアレイ分析とを、組み合わせることにより適切に実施される。
【００１０】
本発明の方法を用いると、ｉｎ ｖｉｖｏの宿主応答を複合組織中の特定の細胞集団に帰属させ、この細胞応答を定量的に記述することが実際に可能になる。腸の生態および宿主の生理の重要ではあるがこれまで価値を認められていなかったレギュレーターとして機能する宿主の遺伝子を同定することができる。原型の消化管内共生生物によるコロニー形成に対する応答に基づいて同定される遺伝子は、治療処置の全く新しい標的となる可能性がある。腸内微生物は、数百万年にわたる膨大な淘汰の外圧を受けて、微生物と宿主の両者がその相互関係から恩恵を得るようにその宿主を操作する微妙ではあるが有効な方法を見出してきた。微生物宿主の遺伝子標的に影響を及ぼす細菌遺伝子産物を同定し試験することにより、化学構造および作用機序がこれまで評価されなかった、または評価できなかった新しい薬剤を得ることができる。
【００１１】
本発明の方法に使用される無菌の腸および共生細菌がコロニーを形成する腸は、どんな動物モデルのものでもよいが、特に単純な腸−微生物相互作用マウス・モデルが使用される。
【００１２】
この方法によって、個々の共生細菌の、ならびに必要ならばこれらの組み合せの効果を調べることが可能になる。
【００１３】
本出願人らは、免疫−炎症プロセスに関与または関連する遺伝子が、本発明の方法を用いて同定されそうにないことを見出した。このことは、宿主が、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎなどの消化管内定住微生物をその寿命全体にわたって棲息させる必要があることと矛盾しない。しかし、本発明の方法を使用して、この知見を他の共生細菌で確認することができる。
【００１４】
次に、このようにして同定した遺伝子とその機能を、例えば消化プロセスに対するその効果を決定するためにさらに調べることができる。このさらに進んだ研究は、例えば任意の従来法を用いて実施することができる。
【００１５】
好ましい実施形態では、本方法は、（ｃ）ｂ）で同定された遺伝子の機能をさらに調べるステップをさらに含む。これを実施できる適切な方法には、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞培養アッセイにおける研究または下等真核生物モデルにおける研究ならびにトランスジェニック動物モデルなどの動物モデルにおける研究が含まれる。
【００１６】
遺伝子、その関連遺伝子および遺伝子産物が操作および分析に利用可能である限りは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイ法によって、動物個体よりも簡単な系での研究が可能になるはずである。
【００１７】
酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）などの下等真核生物モデルは、ゲノムおよび多くの場合細胞機能が極めて明確な真核生物である。哺乳動物において研究対象となっている基本的特徴的機能のいくつかは、より単純な真核生命体においても維持されており、そのためそれらが分子的事象の明確なモデルとして極めて魅力的なものになっている。これらの生物は哺乳動物よりも取り扱いが容易である。
【００１８】
これらの系においては、この機能は、
ｉ）トランスジェニック・ノックアウト、
ｉｉ）ドミナント・ネガティブ実験、
ｉｉｉ）導入遺伝子の過剰発現、
ｉｖ）抗体結合アッセイ、
ｖ）性質の明確な化学薬剤を用いた薬理学的介入（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）による、などの方法を用いて調べることができる。
【００１９】
トランスジェニック・ノックアウト法は、例えば、遺伝子産物が正常に機能しないように遺伝子を欠失または変異させる、または遺伝子を無効にするアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入する組換えＤＮＡ技術を用いて、生物内遺伝子を不活性化することに基づいている。後者の場合、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを生物内に導入する。遺伝子の転写の所産であるメッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）は一本鎖であり、それが二本鎖の場合はタンパク質配列に翻訳することができない。二本鎖ＲＮＡはこの相補的断片によって形成され、得られる二本鎖ＲＮＡ断片がさらにプロセシングされることはない。したがって、この遺伝子からはタンパク質は産生されない。これは通常、一過性の実験として実施される。すなわち、アンチセンス断片を細胞、モデル生物、または哺乳動物モデルに加えると、有効なアンチセンスがある限り遺伝子発現は起こらない。それが消費されると、正常な機能を取り戻し、正常／制御状態が回復されることになる。
【００２０】
古典的なトランスジェニック・ノックアウト法は、変異を受けた、したがって正常に機能しない遺伝子を胚性細胞株に導入することを基礎としている。次いで、この細胞株を、正常な胚盤胞中に導入し、それによって正常なバックグラウンド由来の、および胚性幹（ＥＳ）細胞株由来の生殖細胞からなるキメラ胎児が生成される。数回の交配を経ると、このＥＳ細胞由来の変異型対立遺伝子が、生殖細胞中に見られるようになり、したがって子孫に伝達可能になる。
【００２１】
今回、新しい技術によって、このような突然変異のサイレントで不活性型の遺伝が可能となり、その結果、発育が完了した時に、成体においてそれらを活性化させることが可能になる。このことは、そのような沈黙突然変異の成獣、特にマウスを、その変異遺伝子の発現を活性化する化学薬剤（ホルモン、抗生物質）に曝すことによって実施される。
【００２２】
遺伝子の機能を破壊する別の方法は、ドミナント・ネガティブ実験を実施することである。この場合、標的細胞系譜において極めて高度な発現を可能にするプロモーターの転写調節の下で、欠陥のある遺伝子をモデル生物のゲノム中に導入する。この遺伝子産物を産生し、細胞内の所期の作用部位に輸送すると、この遺伝子産物は正常な遺伝子産物とこれらの部位をめぐって競争することになる。この導入遺伝子はより多量にあり、所期の機能を果たすことができないので、最終的にこの機能が撹乱されることになる。
【００２３】
特定の系またはモデルにおける遺伝子の過剰発現の効果も調べることができる。この場合、複数の遺伝子コピーを試験生物に導入することも、遺伝子を高度に発現する特定のプロモーターを使用することもできる。
【００２４】
導入遺伝子の過剰発現が関与する古典的トランスジェニック実験には、そのモデルには通常は存在しない遺伝子（例えば、ヒト特異的遺伝子をマウスに）を導入して、細胞の機能および／または生理に対するこの遺伝子の効果を評価することが含まれる。必要に応じ、この導入遺伝子を、最適な細胞集団を対象として発現するように、組織特異的プロモーター配列の制御の下に置くことができる。プロモーターは、体全体の全身的発現用のものと、限定された器官部位にある特異的な少数の細胞集団の極めてわずかな分布用のものの両者が存在する。
【００２５】
遺伝子の効果を調べる他の手段は、遺伝子産物によるタンパク質レベルでの介入である。例えば、抗体結合アッセイを使用して、タンパク質が細胞、モデル生物、または哺乳動物内に存在するかどうかを決定し、かつ／または遺伝子産物に特異的に結合してその機能を抑制して、その所期分子パートナーとの相互作用能力を妨害することができる。
【００２６】
性質の明確な化学薬剤を用いた薬理学的介入は、遺伝子が、特定のクラスの分子、例えば、Ｇタンパク質共役受容体、プロテアーゼ、または核内受容体に属することが確認できれば、このタイプの分子の作用薬または拮抗薬として作用することが知られている薬品を用いてその機能を評価することができ、特に有用であろう。
【００２７】
本発明の方法にはどんな共生細菌でも使用することができる。特にその例としては、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、大腸菌、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、またはこれらの混合物、または従来法によって飼育された種から得られる完全な回腸および／または盲腸のミクロフローラがある。本方法での使用に特に適した細菌は、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎである。本出願人らは、共生フローラの様々なメンバーが異なる結果をもたらし、種間で高度な特異性を示すことを見出した。
【００２８】
本発明の方法は、この共生生物が消化管遺伝子の発現に対して予期せぬ範囲の影響を与えることをすでに示した。適切に特許請求された広範な遺伝子の発現は、本発明の方法のステップ（ａ）で測定される。このような遺伝子の例は、栄養素の摂取と代謝、ホルモン／成熟応答、粘膜防御機能、解毒／薬剤耐性、異物代謝、運動性、腸管神経系／筋層の発生または活動、血管形成、細胞骨格／細胞外マトリックスの機能または発生、シグナル伝達、および他の基本的な細胞機能に関連する遺伝子である。
【００２９】
研究対象とすることができる栄養摂取および代謝の遺伝子には、Ｎａ＋／グルコースコトランスポーター（ＳＧＬＴ１）やラクターゼ・フロリジン−ヒドロラーゼ遺伝子などの炭水化物の摂取と代謝に関連する遺伝子、すいリパーゼ関連タンパク質２（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、コリパーゼ、肝脂肪酸結合タンパク質、絶食誘導脂肪因子（ｆａｓｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｄｉｐｏｓｅ Ｆａｃｔｏｒ）（ＦＩＡＦ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、ホスホリパーゼＢ、ＣＹＰ２７遺伝子などの脂質の摂取と代謝に関連した遺伝子、高親和性銅トランスポーター、メタロチオネインＩ、メタロチオネインＩＩ、フェリチン重鎖遺伝子などの金属の摂取または隔離の遺伝子、またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ・サブユニット、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、リンゴ酸オキシドレダクターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子などの細胞エネルギー生成が含まれる。
【００３０】
ホルモン／成熟応答に関連する遺伝子の例は、アデノシン・デアミナーゼ、オミシン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ）・デカルボキシラーゼ抗酵素、１５−ヒドロキシプロスタグランジン・デヒドロゲナーゼ、ＧＡＲＧ−１６、ＦＫＢＰ５１、アンドロゲン制御輸精管タンパク質、短鎖デヒドロゲナーゼ、および耐熱性抗原遺伝子である。
【００３１】
粘膜防御機能に関連する遺伝子の例は、減衰促進因子（ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、重合体Ｉｇ受容体、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｍａｌｌ ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ）、血清アミロイド・タンパク質Ａ、ＣＲＰ−ダクチン（ｄｕｃｔｉｎ）α（ＭＵＣＬＩＮ）、ゼータ・プロテアソーム鎖（ｚｅｔａ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｃｈａｉｎ）、および抗ＤＮＡ ＩｇＧ Ｌ鎖遺伝子である。
【００３２】
解毒／薬剤耐性に関与する適切な遺伝子には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、Ｐ−糖タンパク質（ｍｄｒ１ａ）およびＣＹＰ２Ｄ２遺伝子が含まれる。 腸管神経系／筋層の発生または活動に関連する遺伝子の例は、Ｌ−グルタミン酸トランスポーター、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、小胞関連タンパク質−３３（ｖｅｓｉｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−３３）、システイン・リッチ・タンパク質２（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈタンパク質２）、平滑筋（腸）γアクチン、およびＳＭ−２０遺伝子である。
【００３３】
ＲＮアーゼ・スーパーファミリー・メンバーには、いくつかのアンギオゲニンが含まれる。これには、本出願人らがその配列を決定し、腸に特異的で上皮に存在しその発現が微生物叢の構成成分によって制御されているように見える点で特に興味深いことが判明したアンギオゲニン−４も含まれる。ネズミのアンギオゲニン−４の配列が、最近報告された（Ｄ．Ｅ．Ｈｏｌｌｏｗａｙ等、ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、（２００１）、２２：３０７）。
【００３４】
本出願人らは、驚くべきことに、このような一遺伝子、特にアンギオゲニン−４遺伝子が腸管上皮中で発現され、発現レベルが共生細菌の影響を特に受けることを見出した。
【００３５】
細胞骨格／細胞外マトリックスの機能に関連する遺伝子の例は、ゲルゾリン、デストリン、心筋αアクチン、エンドＢサイトケラチン、フィブロネクチン、プロテイナーゼ阻害剤６およびα１タイプ１コラーゲン遺伝子である。
【００３６】
シグナル伝達遺伝子には、Ｐｔｅｎ、ｇｐ１０６（ＴＢ２／ＤＰ１）、ｒａｃ２、Ｓｅｍｃａｐ２、血清およびグルココルチコイド制御キナーゼ、ＳＴＥ２０様タンパク質キナーゼ、およびＢ細胞ミエロイド・キナーゼ（ｍｙｅｌｏｉｄ ｋｉｎａｓｅ）が含まれる。（ｒａｃ２遺伝子が関連するシグナル経路は、粘膜防御機能に影響することが知られている。）
【００３７】
最後に、基本的な細胞機能に関連するその他の遺伝子の例は、グルタチオン・レダクターゼ、カルモジュリン、ｅｌＦ３サブユニット、ｈｓｃ７０、オリゴサッカリル・トランスフェラーゼ・サブユニット（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）、フィブリラリン、Ｈ＋−輸送ＡＴＰアーゼ、およびＭｓｅｃ２３遺伝子である。
【００３８】
本発明の方法では、適切には、少なくとも１０種類のこのような遺伝子がステップ（ａ）で測定される。上記列挙したすべての遺伝子の発現を測定することが好ましい。
【００３９】
本発明によれば、発現が少なくとも２倍の遺伝子が同定され、選択されてさらに調べられる。適切には、発現が少なくとも４倍、より適切には少なくとも５倍、さらに適切には７倍、好ましくは９倍の遺伝子がステップ（ｂ）で同定され、選択されてさらに調べられる。
【００４０】
Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニー形成後に本発明の方法を用いてすでに同定されているいくつかの特定の遺伝子は特に興味深い。この遺伝子には、コリパーゼ、減衰促進因子（ＤＡＦ）、重合体ＩｇＡ受容体、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（Ｓｐｒｒ２ａ）、｛アンギオゲニン−３｝Ｐｔｅｎ、ＣＹＰ２Ｄ２、Ｓｐｒｒ２ａ、ｒａｃ２、およびＭｄｒ−１が含まれる。この遺伝子には、アンギオゲニン−３に関係し、新たに発見されたタンパク質であるアンギオゲニン−４も含まれる。
【００４１】
これらの遺伝子は治療上有用な機能を有するかもしれず、したがって、これら１つまたは複数の遺伝子の発現を、研究中の特定の共生細菌がその発現に与える影響を検出するために、本発明の方法で測定することが好ましい。
【００４２】
具体的には、本発明の方法により、コリパーゼ、および配列番号１２および２５（アンギオゲニン−４）などのプライマー（下記表３参照）を用いてその遺伝子を増幅可能であるアンギオゲニンなどのアンギオゲニン類、ならびにＳｐｒｒ２ａおよびｒａｃ２の発現を、さらに研究すべきであることが判明した。
【００４３】
したがって、本発明は、配列番号１２および２５（アンギオゲニン−４）などのプライマー（下記表３参照）を用いてその遺伝子を増幅可能であるアンギオゲニンが腸内で関与する生化学的経路の評価をさらに含む。
【００４４】
別の実施形態では、本発明はコリパーゼが腸内で関与する生化学的経路の評価をさらに含む。
別の実施形態では、本発明はＳｐｒｒ２ａが腸内で関与する生化学的経路の評価をさらに含む。
別の実施形態では、本発明はｒａｃ２が腸内で関与する生化学的経路の評価をさらに含む。
評価は、上述の方法も含めてどんな適切な方法を用いても実施することができる。
【００４５】
本発明の方法を用いた遺伝子の同定、ならびにこれらに関連する生化学的経路のさらに進んだ研究は、胃腸管の疾患または障害の予防的なまたは治療的な処置をもたらし得るものである。具体的には、共生細菌の存在または非存在によりどの遺伝子が最も影響を受けるか、また、病状、疾患、または障害に関連する生化学的経路にどの遺伝子が関与しているかを明らかにすることで、この病状、疾患、または障害を治すために特定の遺伝子の発現を変化させることを目的とした治療法を開発することが可能になるはずである。あるいは、遺伝子産物によって維持される生化学的経路に薬理学的に介入することが可能になるはずである。
【００４６】
このことは、適切な共生細菌を投与することによって実施することができる。所望のミクロフローラの集団を増加させることは、例えば、錠剤、医薬品または栄養補給組成物、さらには生きているヨーグルト培養物などの食品の形で、この細菌を経口投与することによって実施することができる。
具体的には、本発明は、上皮で発現される血管形成因子を、それに変調をもたらす共生細菌のコロニー形成によって調節する方法を提供する。
【００４７】
このような方法の別の具体例は、代謝、特に食事性脂質の代謝を調節する方法であり、この方法は、この代謝に効果があることが上述の方法を用いて確認された共生細菌を使用するものである。
さらに別の具体例は、上述の方法を用いて確認された共生細菌を使用して上皮防御機能を調節する方法である。
【００４８】
別の例は、血管形成またはシグナル伝達を調節することが本発明の方法を用いて確認された、腸内に存在する共生細菌の集団を調節することによって、腸の腫瘍を予防または治療する方法である。
【００４９】
さらに別の態様では、本発明の方法は、消化管内の不適切なレベルの遺伝子発現によって引き起こされた疾患や病状の診断に有用となり得る。ある患者から採取された共生ミクロフローラの分析から、上述のミクロフローラの個体数の自然変動が大きいことがわかる。しかし、本発明の方法を用いて同定される共生ミクロフローラの量の著しい増加または減少を検出することによって、特定の遺伝子が異常な量で発現し、そのため疾病状態または病状を招いていることを示せるかもしれない。このような病状の治療は、適宜、上述したように共生細菌の量を変化させるか、細菌もしくはヒトの遺伝子産物もしくは誘導体を直接投与するか、この遺伝子産物の化学的もしくは生物学的阻害薬もしくは拮抗薬を用いるなど遺伝子産物をタンパク質レベルで阻止する手段のいずれかによって実施することができる。
【００５０】
本発明の方法を一般に使用して、ヒト、および微生物が多数存在するこの世界に棲息する他の無数の種に問われる問題に取り組むことができる。すなわち、細菌は、その宿主の生理と成熟にどのように寄与し、それをどのように調節しているのだろうか。ヒトの場合、我々の祖先とその微生物パートナーの共進化を含む長い淘汰のプロセスの間に発達した複雑な調節メカニズムの組み合せが、ミクロフローラの構築と維持に関与していることは間違いない。以下に示す結果は、重要な生理機能に関わる遺伝子の発現に対する常在菌種の影響を実証しており、我々の生態を我々の複雑な定住菌群の生態と関連させて考えることの重要性を強調している。
【００５１】
この結果は、明確なｉｎ ｖｉｖｏモデルを使用して、周囲の細胞および環境の影響を維持しながら、微生物に対する複合組織内の指定細胞集団の応答を推定することの実用性も実証している。
【００５２】
これらのモデルおよび手法は、ヒトの健康に対する微生物の広範な寄与を評価することを可能にし、治療上有用な微生物産物の同定を可能にする。さらに、これらのモデルおよび手法は、これら宿主−微生物の正常な関係が様々な疾患プロセスにどのように影響しているかを明らかにし、何が病原性関係を構成しているかについて新たな展望と定義を提供するはずである。
【００５３】
しかしまた、本方法は、多数の遺伝子または遺伝子産物が腸組織中で重要な効果を持ち、このような遺伝子または遺伝子産物を患者に有益な方法で標的とするような医薬品を開発できる可能性を高めているように見えることをすでに明らかにしている。このことは、遺伝子産物の活性を調節する化合物をスクリーニングすることによって実施することができる。
【００５４】
本発明の別の態様は、腸の生態のレギュレーターとして機能する遺伝子を同定するための方法を含み、この方法は、上述の方法を適用すること、およびこのような機能にこれまでは関連づけられていない発現遺伝子を検出することを含む。
【００５５】
したがって、本発明のさらに別の態様は、胃腸疾患の薬剤として応用できる化合物をスクリーニングする方法を含み、この方法は、上述の方法を用いて同定される遺伝子の産物の活性を調節する能力でこの化合物を評価することを含む。
【００５６】
本発明のさらに別の態様は、請求項１に記載の方法を用いて同定される遺伝子の産物の活性を調節する化合物の治療有効量を投与することを含む、胃腸疾患を治療または予防する方法である。
【００５７】
具体的には、以下に報告する結果に基づいて、本発明は、さらに、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｐｒｒ２ａ）またはｒａｃ２の活性または量を調節する能力によってその化合物を評価することを含む、腸の防御機能の欠陥を特徴とする病状の治療または予防に潜在的に有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
適切なスクリーニング法は、当業者には明らかなはずである。この化合物は、同定されると腸の防御機能を含む病状の治療または予防に有用である。
【００５８】
したがって、本発明のさらに別の態様は、腸の防御機能の欠陥を特徴とする病状の治療または予防用の薬物を調製する際に、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｐｒｒ２ａ）またはｒａｃ２の活性または量を調節できる化合物を使用することを含む。
適切には、この化合物は、医薬品組成物として処方される。このタイプの新規組成物およびその調製は本発明のさらに別の態様を形成する。
【００５９】
【発明の詳述】
共生細菌によって調整された腸内の変化を分子レベルで調べるために、正常なマウスおよびヒトの腸ミクロフローラの主要な構成成分であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎを含めた共生細菌を用いて、無菌マウスにコロニーを形成させた。
コロニー形成に対する腸の包括的な転写応答を高密度オリゴヌクレオチド・アレイを用いて詳細に記述し、特異的応答の細胞起源をレーザ・マイクロダイセクションおよびリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲで確立した。
【００６０】
以下に示す結果から、共生細菌が多数の遺伝子の発現を調節し、そのいくつかの発現は有意なレベルで調節されることがわかる。これに関係する遺伝子は、栄養素吸収、粘膜防御、および異物代謝を含めた消化管の多様な基本的生理機能に関与する。コロニー形成に関連した遺伝子発現のいくつかの変化が種によって異なることは、常在ミクロフローラ組成の変化によってヒトの生理がどのように影響されるかを強く示唆するものである。
【００６１】
また、いくつかの共生生物は生後の発育の移行に、ある役割を演じているように見える。哺乳−離乳の移行に付随する変化は、成体のマウスではＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎによって誘発されたことから、常在菌が生後の消化管の発育に指導的な役割を演じていることが示唆される。
【００６２】
明確なｉｎ ｖｉｖｏモデルをゲノムに基づく包括的分析と組み合わせると、このように、宿主の生態に対する定住微生物の重要な寄与を確認するための強力な手法となる。
【００６３】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、遺伝子操作可能な嫌気性菌であり、成体マウスとヒト双方の消化管ミクロフローラの主要なメンバーであるので、腸の生態に対する定住細菌の影響を明確にする初期研究用に選択された。また、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、通常、哺乳−離乳移行、すなわち消化管の機能が急速かつ顕著に成熟する時期に、小腸の末端（回腸）にコロニーを形成する（Ｗ．Ｅ．Ｃ．Ｍｏｏｒｅ、Ｌ．Ｖ．Ｈｏｌｄｅｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７、９６１（１９７４）、Ｔ．Ｕｓｈｉｊｉｍａ、Ｍ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｋ．Ｔａｔｅｗａｋｉ、Ｙ．Ｏｚａｋｉ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、９８５（１９８３））。
【００６４】
コロニー形成は、宿主の脂質吸収機構の４つの構成成分の発現亢進を含めた協奏的な応答を誘発した。すいリパーゼ関連タンパク質−２（ＰＬＲＰ−２）およびコリパーゼをコードするｍＲＮＡは、それぞれ平均４倍および９倍増加した（表１および２）。ＰＬＲＰ−２は、トリおよびジアシルグリセロール、リン脂質、およびガラクトリピドを加水分解する。コリパーゼは、ＰＬＲＰ−２活性を増大させる（Ｍ．Ｅ．Ｌｏｗｅ、Ｍ．Ｈ．Ｋａｐｌａｎ、Ｌ．Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｇｒｕｓｂｙ、Ｄ．Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ、Ｍ．Ｊ．Ｇｒｕｓｂｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、３１２１５（１９９８））。また、腸細胞内の脂肪酸輸送に関わる豊富なサイトゾル・タンパク質をコードするＬ−ＦＡＢＰ ｍＲＮＡが４〜６倍に増加し、腸細胞の基底外側表面から分泌されるトリグリセリド・リッチ・リポタンパク質（キロミクロン、ＶＬＤＬ）の主要な成分であるアポリポタンパク質ＡＩＶが誘導された（表１）。
【００６５】
コロニー形成は、腸のＮａ＋／グルコースコトランスポーター（ＳＧＬＴ−１）ｍＲＮＡ量を増加させた。すいリパーゼ関連タンパク質−２（ＰＬＲＰ−２）、コリパーゼ、肝脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）、およびアポリポタンパク質Ａ−ＩＶを含めて、宿主の脂質吸収／搬出機構のいくつかの構成成分の発現も協奏的に増加した（下記表１参照）。脂肪摂食によって抑圧されることが知られている新規なＰＰＡＲα標的（Ｓ．Ｋｅｒｓｔｅｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、２８４８８（２０００））である絶食誘導脂肪因子の発現が顕著に減少したことで、コロニー形成されたマウスの脂質摂取が増大したことのさらなる証拠が提供された。
【００６６】
特にこれら６種類の遺伝子の発現が変化したことは、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎが宿主の栄養素吸収／処理能力の増加を誘発することを示し、なぜ無菌のげっ歯動物がその体重を維持するために、通常のミクロフローラを有するげっ歯動物よりも高カロリーの摂取が必要であるかを部分的に説明していると考えられる（Ｂ．Ｓ．Ｗｏｓｔｍａｎｎ、Ｃ．Ｌａｒｋｉｎ、Ａ．Ｍｏｒｉａｒｔｙ、Ｅ．Ｂｒｕｃｋｎｅｒ Ｋａｒｄｏｓｓ、Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．３３、４６（１９８３））。
【００６７】
また、本出願人らは、コロニー形成が食事性金属（ｄｉｅｔａｒｙ ｍｅｔａｌ）の吸収に関与する４種類の遺伝子の発現に変化をもたらすことを見出した。上皮の高親和性銅トランスポーター（ＣＲＴ１）ｍＲＮＡが増加し、一方メタロチオネイン−Ｉ、メタロチオネイン−ＩＩ、フェリチンＨ鎖ｍＲＮＡが減少した（表１）。これらの変化は、コロニー形成が（例えば、ＣＲＴ１経由の）重金属吸収能の増加を引き起こし、同時に、重金属を細胞内に隔離する能力（ＭＴ−Ｉ／ＩＩ、フェリチン）の減少を引き起こすことを示唆している。このことは、宿主自身の代謝経路での利用の増加、または微生物との競合のいずれかのために、これらの化合物に対する宿主の要求が増大することを意味する。ＳＧＬＴ−１、コリパーゼ、Ｌ−ＦＡＢＰ、およびＭＴ１（と以下に考察する他の８種類のｍＲＮＡ）の変化は、ｑＲＴ−ＰＣＲで個別に確認された（Ｃ．Ａ．Ｈｅｉｄ、Ｊ．Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ、Ｐ．Ｍ．ＷＩＬＬＩＡＭＳ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６、９８６（１９９６）（下記表２参照））。
【００６８】
コリパーゼは、すい臓トリグリセリド・リパーゼおよびＰＬＲＰ−２の両者の活性を刺激することにより、食事性脂質の代謝に重要な役割を果たす。また、プロコリパーゼ（ｐｒｏｃｏｌｉｐａｓｅ）のタンパク質分解切断によって、脂肪摂取の満腹シグナルとして機能するペンタペプチド（エンテロスタチン）を生成する（Ｓ．Ｏｋａｄａ、Ｄ．Ａ．Ｙｏｒｋ、Ｇ．Ａ．Ｂｒａｙ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．４９、１１８５（１９９１））。以下に示すＢ．Ｔｈｅｔｏａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニー形成後に見られる発現が有意に増加することは、これまで価値を認められていない、腸管上皮が消化管内定住細菌と共に食事性脂質代謝に寄与する機序を暗示している。
【００６９】
無傷の粘膜防御は、腸の莫大な数の定住微生物を棲息させるために極めて重要である。その破壊は、宿主に、また管腔のミクロフローラの安定性に有害な免疫応答を起こすことがあり、炎症性腸疾患などの病的状態をもたらす（Ｐ．Ｇ．Ｆａｌｋ等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２、１１５７（１９９８））。
【００７０】
Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎによるコロニー形成は、組織検査から判断して検出可能な炎症反応を起こさないことが判明した（Ｌ．Ｂｒｙ、Ｐ．Ｇ．Ｆａｌｋ、Ｔ．Ｍｉｄｔｖｅｄｔ、Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、１３８０（１９９６））。また、応答に関与する多数の遺伝子の、マイクロアレイ上に表出する認識可能な誘発（または抑圧）もない。Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎを導入してから１０日後に、ＩｇＡを産生するＢ細胞の流入が回腸粘膜内で起こる。一方、共生生物によって誘導される同様のＩｇＡ応答は、Ｔ細胞には無関係であり、防御をより完全なものにすることがわかった（Ａ．Ｊ．Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８、２２２２（２０００））。
【００７１】
防御機能に関与する遺伝子は、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎコロニー形成で観察される遺伝子発現変化の１０％（７／７１）を占める。マイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲ分析から、ＩｇＡを産生するＢ細胞の流入は、上皮にわたってＩｇＡを輸送する重合体免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）の発現の増加を伴うことが明らかになった（表１、２）。上皮の上にある保護粘液層の１成分（ＭＵＣＬＩＮ；Ｒ．Ｃ．ＤｅＬｉｓｌｅ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５、Ｇ２１９（１９９８））と腸粘膜の防御／治癒に関与する三つ葉型ペプチドに対する想定上の受容体（Ｌ．Ｔｈｉｍ、Ｅ．Ｍｏｒｔｚ、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．９０、６１（２０００））の両者をコードするＣＲＰ−ダクチン遺伝子の発現も増大した。また、補体によって媒介される細胞崩壊を抑制する（Ｍ．Ｅ．Ｍｅｄｏｆ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５、８４８（１９８７））、上皮尖端の表面タンパク質である減衰促進因子（ＤＡＦ）の発現も増加する。ｐＩｇＲ、ＭＵＣＬＩＮ、およびＤＡＦの発現が同時に亢進されると、細菌の上皮防御膜の通過を妨げるのに役立つはずであり、さらに腸分泌液中に存在する補体成分の微生物による活性化に続いて起こる恐れがある粘膜損傷も防止するはずである。
【００７２】
Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎを用いたコロニー形成によって減衰促進因子（ＤＡＦ）の発現が５倍になることがわかった。ＤＡＦは、腸の上皮細胞の尖端表面上に存在し、補体によって媒介される細胞崩壊を抑制することが知られている（Ｍ．Ｅ．Ｍｅｄｏｆ、Ｅ．Ｉ．Ｗａｌｔｅｒ、Ｊ．Ｌ．Ｒｕｔｇｅｒｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｖ．Ｎｕｓｓｅｎｚｅｉｇ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５、８４８（１９８７））。ＤＡＦ、ｐＩｇＲ、ＭＵＣＬＩＮの発現が同時に亢進されると、細菌の上皮防御膜の通過を妨げるのに役立つはずであり、さらに腸分泌液中に存在する補体成分の微生物による活性化に続いて起こる恐れがある粘膜損傷を防止するはずである。
【００７３】
Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎに対する最も顕著な応答は、小型プロリン・リッチ・タンパク質２（ｓｐｒｒ２ａ）ｍＲＮＡの増加であった（表１）。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、コロニー形成によりこのｍＲＮＡが２０５±６４倍に増加することが確認された（表２）。Ｓｐｒｒ２ａは、扁平上皮細胞の最終分化に関連するタンパク質ファミリーの１メンバーである。Ｓｐｒｒ類は、角質細胞外被成分として、かつ主要なデスモソーム構成要素の１つであるデスモソームのデスモプラキンに結合する架橋タンパク質として、扁平上皮の防御機能に寄与する（Ｐ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｅｒｔ、Ｌ．Ｎ．Ｍａｒｅｋｏｖ、ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １０、４２４７（１９９９））。コロニー形成は、デスモソーム（デスモプラキン、プラコグロビン、プラコフィリン（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ）、プレクチン）またはタイト・ジャンクション（ＺＯ−１、オクルディン）に結合する他のタンパク質をコードする遺伝子の発現に顕著な変化（すなわち２倍以上）を生じなかった。
【００７４】
腸内でのＳｐｒｒ２ａの発現およびその微生物による制御は新規な知見である。扁平上皮防御へのｓｐｒｒ２ａの重要な寄与およびＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎに対するｓｐｒｒ２ａ発現の劇的な応答はともに、このタンパク質が腸の防御機能に重要な役割を演じていることを示唆している。したがって、これは、特にＳｐｒｒ２ａが腸内で関与する生化学経路を評価することによって、本発明によるさらに進んだ研究に特に適した標的となる。
【００７５】
離乳過渡期の顕著な指標は、主要な乳糖のラクトースを加水分解する腸細胞刷子縁酵素であるラクターゼ−フロリジン・ヒドロラーゼ（ＬＰＨ）の減少である。ＬＰＨ ｍＲＮＡ量は、従来法で飼育された動物の小腸全体で哺乳期間中に増加し、その後離乳中に回腸で減少する（Ｓ．Ｄ．Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７、Ｇ５８４（１９９４））。これら遺伝子の発現に対する共生細菌の効果は、この細菌が有意な影響を及ぼすかどうかを決定するうえで特に興味深い。
【００７６】
本発明の方法を用いると、コロニー形成が、血管形成活性が実証されている分泌タンパク質であるアンギオゲニン−３類似のアンギオゲニン−４の発現を亢進する結果となることが見出されている（Ｘ．Ｆｕ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７、１５０３（１９９７）、Ｘ．Ｆｕ等、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７、１２５（１９９９））。Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎがコロニーを形成すると、配列番号１２および配列番号２５（アンギオゲニン−４）のプライマー（表１、２）で増幅することによって認識可能な血管形成因子の発現が１１倍になることは、血管形成因子の新規な制御方式であることを意味し、したがって、本発明によるさらに進んだ研究の対象とすることができる。
【００７７】
下記のレーザ・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）実験は、この応答の細胞起源を詳細に叙述している。それによれば、細菌の存在が腸の血管新生に影響することが示唆される。
【００７８】
消化管は、摂取された多数の毒素および生体異物が最初に接する部位である。これらの化合物の解毒および代謝に対する管腔の細菌および上皮の相対的な寄与度を、従来法で飼育された動物で正確に叙述することは困難であった。無菌マウスにＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎでコロニーを形成させると、これらのプロセスに関与するいくつかの遺伝子の発現が減少することが見出された（下記表１）。多様な求電子物質を解毒するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡが減少し、それに応じてグルタチオンと抱合された化合物を上皮から搬出する多剤耐性タンパク質−１（Ｍｄｒ−１）が減少する（Ｒ．Ｗ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ、Ａ．Ａ．Ｒｕｅｆｌｉ、Ｍ．Ｊ．Ｓｍｙｔｈ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５、１（２０００））。ヒトの薬物酸化的代謝に関与するＣＹＰ２Ｄ２（デブリソキン・ヒドロキシラーゼ）（Ｍ．Ｉｎｇｅｌｍａｎ−Ｓｕｎｄｂｅｒｇ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０、３４２（１９９９））の発現も、コロニー形成により減少する。これらの遺伝子の発現が減少することは、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ自体が宿主に有害な化合物の解毒に寄与することを示唆している。
【００７９】
このチトクロムＰ−４５０を欠乏させる遺伝的多型はヒトでは一般的であり、薬物酸化的代謝の変化と関連している（Ｍ．Ｉｎｇｅｌｍａｎ−Ｓｕｎｄｂｅｒｇ、Ｍ．Ｏｓｃａｒｓｏｎ、Ｒ．Ａ．ＭｃＬｅｌｌａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０、３４２（１９９９））。これら３つの宿主遺伝子の発現が減少することは、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎなどの共生細菌が宿主に有害となり得る化合物の解毒に寄与していることを示唆している。このことは、正常なミクロフローラの構成成分が薬物代謝に関与する宿主遺伝子を調節でき、個体間のこのような代謝変動がどのようにしてこれら個体の消化管内定住フローラの差異から生じるかを明示できることを示している。したがって、これら遺伝子の発現に対する共生細菌の効果を本発明の方法を用いて評価することは有用と考えられる。
【００８０】
Ｐｔｅｎは、両特異性タンパク質ホスファターゼ・ファミリーの１メンバーである。ヒトのＰＴＥＮハプロ不全は、腫瘍形成に対する感受性の増加と関連している（Ｄ．Ｊ．Ｍａｒｓｈ等、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７、５０７（１９９８））。また、Ｐｔｅｎ＋／−＜−＞Ｐｔｅｎ＋／＋キメラ・マウスは、結腸のポリープおよび腺癌を発生する（Ａ．ＤｉＣｒｉｓｔｏｆａｎｏ、Ｂ．Ｐｅｓｃｅ、Ｃ．Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ、Ｐ．Ｐ．Ｐａｎｄｏｌｆｉ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９、３４８（１９９８））。Ｇｐ１０６のヒト相同体であるＴＢ２／ＤＰ１は、突然変異すると複数の腸腺腫を発生する遺伝子座の１構成部分である（Ｒ．Ｗ．Ｂｕｒｔ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４７０、９９（１９９９））。ミクロフローラの１成分が、配列番号１２および２５（アンギオゲニン−４）などのプライマー（下記表３参照）を用いてその遺伝子が増幅可能である血管形成因子、ＰｔｅｎおよびＧｐ１０６などの遺伝子の発現に影響するという発見は、腸細菌が、消化管の内部で、または外部でさえも腫瘍形成を開始または進行させる一因となりうる機序を考慮することの重要性を強調するものである。
【００８１】
腸の運動性は、その腸管神経系（ＥＮＳ）によって制御されている。運動活性の調節不全を伴う過敏性大腸症候群が主要な健康問題であるにもかかわらず、内因子および外因子のＥＮＳ活性に対する相対的寄与度は十分に理解されていない。Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎなど共生細菌の消化管生理への影響は、腸管神経系（ＥＮＳ）および筋層で発現される遺伝子に及ぶ。Ｌ−グルタミネートトランスポーターおよびグルタミン酸をＧＡＢＡに転化するＬ−グルタミネートデカルボキシラーゼをコードするｍＲＮＡがいずれも増加したことから、ＥＮＳのグルタミン酸作動性神経に対するコロニー形成に伴う効果が示唆される（Ｍ．Ｔ．Ｌｉｕ、Ｊ．Ｄ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｍ．Ｄ．Ｇｅｒｓｈｏｎ、Ａ．Ｌ．Ｋｉｒｃｈｇｅｓｓｎｅｒ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７、４７６４（１９９７））。神経伝達物質放出に関与するシナプトブレビン結合タンパク質である小胞関連タンパク質−３３（Ｐ．Ａ．Ｓｋｅｈｅｌ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７、１１０１（２０００））の発現の亢進も見られる。腸管γ−アクチンとシステイン・リッチ・タンパク質２の２種類の筋特異的ｍＲＮＡも同時に増加する。無菌動物および従来法で飼育された動物のこれまでの電気生理学的研究により、ミクロフローラが消化管の運動性にある役割を果たしていることが示唆された（Ｅ．Ｈｕｓｅｂｙｅ、Ｐ．Ｍ．Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ、Ｔ．Ｍｉｄｔｖｅｄｔ、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．３９、９４６（１９９４））。本発明の方法は、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎなどの消化管内定住微生物がどのように作用して運動性を調節しているかについて分子的詳細を提供することができる。
【００８２】
Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、通常、離乳中にマウスやヒトの腸にコロニーを形成する（Ｗ．Ｅ．Ｃ．Ｍｏｏｒｅ、Ｌ．Ｖ．Ｈｏｌｄｅｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７、９６１（１９７４）、Ｔ．Ｕｓｈｉｊｉｍａ、Ｍ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｋ．Ｔａｔｅｗａｋｉ、Ｙ．Ｏｚａｋｉ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、９８５（１９８３））。この時期は、ミクロフローラの組成の劇的な変化、および腸管上皮内の一連の重要な発育変化を特徴とする。これらの変化のうちいくつが腸細胞メカニズムによって制御されているか、また、いくつが間充織からまたは（食事性の、微生物の）管腔因子から発せられる外因性シグナルによって制御されているかは不明である。
【００８３】
発現を分析すると、驚くべきことに、成体無菌マウスのＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎによるコロニー形成が、従来法で飼育された動物の成熟した腸に通常発生する変化によく似た別の応答を誘発することが明らかとなった。主要な乳糖（ラクトース）を加水分解するラクターゼの発現は、通常離乳期中に減少する（Ｓ．Ｄ．Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７、Ｇ５８４（１９９４））。成体無菌マウスのＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎによるコロニー形成は、回腸のラクターゼｍＲＮＡの減少をもたらす（下記表１、２）。これらの知見は、生後に出現しつつある正常フローラのメンバーが腸の成熟にどのように寄与しうるかを示している。
【００８４】
アデノシン・デアミナーゼ（ＡＤＡ）およびポリアミン（スペルミン、スペルミジン）は、出生後の腸の成熟に重要な役割を果たす（Ｇ．Ｄ．Ｌｕｋ、Ｌ．Ｊ．Ｍａｒｔｏｎ、Ｓ．Ｂ．Ｂａｙｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１０、１９５（１９８０）、Ｊ．Ｍ．Ｃｈｉｎｓｋｙ等、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４２、１７２（１９９０））。Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニー形成は、ＡＤＡおよびオルニチン・デカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）抗酵素をコードするｍＲＮＡの５倍未満の増加をもたらすことが判明した。ポリアミン量によってその発現が影響される抗酵素は、ＯＤＣの代謝回転の重要なレギュレーターである（Ｊ．Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｓ．Ｋｏｓｋｉｎｉｅｍｉ、Ｋ．Ｐｅｒｓｓｏｎ、Ｂ．Ｇｒａｈｎ、Ｉ．Ｈｏｌｍ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０、２２３（１９９７））。したがって、抗酵素ｍＲＮＡ量の増加は、コロニー形成が回腸のポリアミン合成に影響することを示唆している。これらのデータは、消化管成熟の２クラスのレギュレーターであるアデノシンとポリアミンの合成を制御する遺伝子それ自体が、ミクロフローラのある成分によって調節されることを示しており、消化管の成熟に影響するカスケードの上流エフェクターとして細菌が働くというアイデアに通じるものである。その他下記コロニー形成実験は、他の消化管共生生物がこのような変化の操作能力を持つことを示している。
【００８５】
哺乳−離乳移行に付随する消化管成熟の変化は、グルココルチコイドの増加によっても制御されていると考えられている（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ、Ｌ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４）の中のＳ．Ｊ．Ｈｅｎｎｉｎｇ、Ｄ．Ｃ．Ｒｕｂｉｎ、Ｒ．Ｊ．Ｓｈｕｌｍａｎ、ｐｐ．５８４〜５８６）。以下に記述するＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニー形成は、グルココルチコイドによってその転写が抑制されることが知られている２つの遺伝子、すなわち１５−ヒドロキシプロスタグランジン・デヒドロゲナーゼ（Ｍ．Ｄ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｖ．Ｇｏｏｄｗｉｎ、Ｓ．Ｍｅｓｎａｇｅ、Ｊ．Ａ．Ｋｅｅｌａｎ、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ６２、１（２０００））とグルココルチコイド減弱応答遺伝子−１６（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅ−１６）（Ｊ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ、Ｈ．Ｒ．Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０、１６７５６（１９９５））の発現の減少を伴った。また、核内ホルモン受容体ファミリー・メンバーとその生成物が相互作用する別の遺伝子であるイムノフィリンＦＫＢＰ５１の発現も減少した（Ｓ．Ｃ．Ｎａｉｒ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７、５９４（１９９７））。しかし、個々のどの場合でも１／５未満には減少しなかった。したがって、本発明の方法を用いて他の共生細菌を調べて、それらがより重要な効果をもたらすかどうかを見ることができる。
【００８６】
上述のとおり、本発明者らは、その遺伝子が上記配列番号１２および２５のプライマーを用いて増幅可能でありマウスの腸で発現される、アンギオゲニン・ファミリーのある特定のメンバーが、新規であることを発見した。したがって、このタンパク質とそれをコードする遺伝子は、本発明の別の態様を形成する。
【００８７】
本発明のさらに別の態様は、以下の図４に示す配列番号２９のタンパク質、その対立遺伝子変異体、または配列番号２９と同一のアミノ酸配列を少なくとも８５％持つタンパク質を提供する。
具体的には、本発明は配列番号２９のタンパク質を提供する。
さらに別の態様では、本発明は上述のタンパク質をコードする核酸を提供する。
これらのタンパク質は、本発明のスクリーニング・プロセス用標的として有用である。
以下の実施例は本発明を例示するものである。
【００８８】
実施例１
７〜１５週齢無菌ＮＭＲＩ／ＫＩマウスの同年齢のグループを、プラスチック製ノトバイオート隔離装置に１２時間の照明サイクルで飼育し、加圧滅菌された固形飼料の食餌（Ｂ ＆ Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）を自由に採餌させた。オスに野生型Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ（ＶＰＩ−５４８２菌株）（Ｌ．Ｈｏｏｐｅｒ等（１９９９）、前掲）を接種した。マウスを１０日後、照明を点けて２時間後に屠殺した。末端の１ｃｍの小腸を使用して、押し出した管腔内容物のｍｌ当たりのコロニー形成単位数を規定した。
【００８９】
管腔内容物のＭＬ当たり１０７以上のコロニー形成単位（ＣＦＵ）のバクテリアを有するマウスから回腸ＲＮＡを単離した［以前の研究から、回腸の活発なコロニーを形成するには１０日で十分であり、回腸上皮中のフコシル化グリカンの産生を完全に誘発するには１０７ＣＦＵ／ｍＬが必要であることがわかっている（Ｌ Ｈｏｏｐｅｒ等（１９９９）、前掲。Ｌ．Ｂｒｙ、Ｐ．Ｇ．Ｆａｌｋ、Ｔ．Ｍｉｄｔｖｅｄｔ、Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、１３８０（１９９６））］。
【００９０】
３個の独立したコロニー形成集団（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｓ）由来の４匹のマウスの小腸末端１ｃｍに隣接する３ｃｍの小腸から、および同年齢同性無菌マウス（ｎ＝８）から、ＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ）を用いて調製した回腸ＲＮＡの全サンプルを、ビオチン化ｃＲＮＡ標的の生成用にそれぞれ等量プールした。Ｃ．Ｋ．Ｌｅｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５、１３９０（１９９９）に概説された方法を用いて、３０μｇの各細胞ＲＮＡプール全体から２つの標的を個別に調製した。
【００９１】
ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎベースのリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ研究（Ｎ．Ｓｔｅｕｅｒｗａｌｄ等、Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．５、１０３４（１９９９））を、下記表３に列記した遺伝子特異的プライマーおよびＤＮアーゼで処理したＲＮＡを用いて実施した。
【００９２】
各アンプリコン用シグナルは、プライマー・ダイマーやゲノムＤＮＡからではなくｃＤＮＡに由来することをコントロール実験により確認した。シグナルは、内部参照ｍＲＮＡ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）に対して規格化したものである。この規格化したデータを用いて、無菌およびコロニー形成した回腸中の所与のｍＲＮＡを定量した（ΔΔＣＴ分析；Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ＳＥＱＵＥＮＣＥ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）。
【００９３】
【表１】
各ｃＲＮＡを、Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｂｕｉｌｄ ４およびＴＩＧＲクラスター・データベースからの約２５，０００個のマウス・ユニーク遺伝子を有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｕ１１ＫおよびＭｕ１９Ｋチップ・セットと、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従い交雑させた。各チップから収集したデータを、各チップにわたる全体の蛍光強度が同等（目標強度＝１５０）になるようにスケーリングした。「無菌」と「コロニー形成」の発現レベルを対ごとに比較した。
【００９５】
３つの基準、すなわち、ＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウェアが「増加」または「減少」の差異のある判定を返した、無菌ｃＲＮＡまたはコロニー形成ｃＲＮＡのいずれでもｍＲＮＡがＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウェアにより「プレゼント（ｐｒｅｓｅｎｔ）」と呼ばれた、あるいは二重マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓ）で差異が観測された、を満たす場合に、２倍以上の差異が記録された。
【００９６】
１１８個のプローブ・セットで表されるｍＲＮＡが、コロニー形成により、二重マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションで規定して少なくとも２倍になった。
【００９７】
９５個のプローブ・セットで表される転写産物が増加し、一方、２３個のプローブ・セットで表される転写産物が減少したことが判明した。これらプローブ・セットの８４個で表される遺伝子（７１ユニーク遺伝子）を機能グループに割り当て、以下の表１に列記する。この表では、結果は、コロニー形成回腸と無菌回腸とのｍＲＮＡ量の倍数差として表され、二重マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションの平均値である。２個以上の別々のプローブ・セットで表される遺伝子の平均変化倍率を分けて列記する。
【００９８】
１これらのプローブ・セットは、ファミリー・メンバー同士を区別しない。
【００９９】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
これらの基準を用いて同定された多数の遺伝子が、基本的な腸の機能の調節に関与していることは重要である。すなわち、７１種類の遺伝子のうち２０種類（２８％）は、栄養素の摂取と代謝に分類された。また、すいリパーゼ関連タンパク質２（ＰＬＲＰ−２）、コリパーゼ、肝脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）、およびアポリポタンパク質Ａ−ＩＶを含めて、宿主の脂質吸収／搬出機構のいくつかの構成成分の発現が協奏的に増加した（表１）。脂肪摂食によって抑圧されることが知られている（Ｓ．Ｋｅｒｓｔｅｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、２８４８８（２０００））新規なＰＰＡＲｇ標的である絶食誘導脂肪因子の発現が顕著に減少したことで、コロニー形成されたマウスの脂質摂取が増大したことのさらなる証拠が提供された。これら６種類の遺伝子の発現が変化したことは、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎが宿主の栄養素吸収／処理能力の増加を誘発することを示し、なぜ無菌のげっ歯動物がその体重を維持するために、ミクロフローラを有するげっ歯動物よりも高カロリー摂取が必要であるかを説明するのに役立つ。
【０１０４】
また、食事性金属の吸収に関与する４種類の遺伝子の発現が変化した。上皮の高親和性銅トランスポーター（ＣＲＴ１）のｍＲＮＡが増加し、一方、メタロチオネイン−Ｉ、メタロチオネイン−ＩＩ、およびフェリチンＨ鎖ｍＲＮＡが減少した（表１）。これらの変化は、コロニー形成が（例えば、ＣＲＴ１経由の）重金属吸収能の増加を引き起こし、同時に、重金属を細胞内に隔離する能力（ＭＴ−Ｉ／ＩＩ、フェリチン）の減少を引き起こすことを示唆している。このことは、宿主自身の代謝経路での利用が増加するので、あるいは微生物と競合するので、これらの化合物に対する宿主の要求が増大することを意味する。ＳＧＬＴ−１、コリパーゼ、Ｌ−ＦＡＢＰ、およびＭＴ１（と以下に考察する他の８種類のｍＲＮＡ）の変化は、ｑＲＴ−ＰＣＲで個別に確認された（Ｃ．Ａ．Ｈｅｉｄ、Ｊ．Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ、Ｐ．Ｍ．ＷＩＬＬＩＡＭＳ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６、９８６（１９９６））（表２）。
【０１０５】
これらのうち、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニー形成により発現が５倍以上異なることが判明した遺伝子は、コリパーゼ、肝脂肪酸結合タンパク質、絶食誘導脂肪因子、メタロチオネインＩおよびメタロチオネインＩＩ、リンゴ酸オキシドレダクターゼ、Ｓｐｒｒ２ａ、アンギオゲニン−３、アンギオゲニン関連タンパク質、アンギオゲニン・ファミリー、ゲルゾリン、ｇｐ１０６（ＴＢ２／ＤＰ１）、およびｒａｃ２であった。これらのうち、コリパーゼ、絶食誘導脂肪因子、アンギオゲニン３、およびＳｐｒｒ２ａ遺伝子は、９倍以上異なる発現レベルを示した。
【０１０６】
Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎに対する宿主応答の注目すべき特徴は、マイクロアレイ上に表出する、免疫−炎症プロセスに関与する多数の遺伝子の、検出可能なまたは変化した発現がないことであった。これには、侵入病原体に対する宿主応答の重要なレギュレーターであるＮＦ−ＫＢ制御プロセスに関与する遺伝子が含まれる（Ｄ．Ｅｌｅｗａｕｔ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３、１４５７（１９９９））。これらの応答がないことは、消化管の侵入病原体であるＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対するヒト腸上皮細胞系の応答に関する最近のｃＤＮＡマイクロアレイ分析で得られた結果と対照的である（Ｌ．Ｅｃｋｍａｎｎ、Ｊ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．Ｐ．Ｈｏｕｓｌｅｙ、Ｍ．Ｂ．Ｄｗｉｎｅｌｌ、Ｍ．Ｆ．Ｋａｇｎｏｆｆ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、１４０８４（２０００））。Ｉｎ ｖｉｖｏ免疫−炎症応答が誘発された形跡がないことは、宿主がＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎなどの消化管内定住微生物をその全寿命の間収容する必要があることと矛盾しない。
【０１０７】
コロニー形成は、消化管腫瘍症の発達に関係する２種類の遺伝子ＰｔｅｎとＧｐ１０６の発現を増加させる（表１）。
【０１０８】
実施例２
さらに進んだ分析では、２つの技術を組み合わせた。第１に、レーザ・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）を使用して、無菌マウスおよびコロニー形成マウスの屠殺直後に採取した回腸の凍結切片から３個の細胞集団を回収した。この３個の集団は、（ｉ）陰か内に存在する上皮（未分化細胞ならびにパネート細胞系譜の分化メンバーを含む腸の増殖区画）、（ｉｉ）上皮を覆うじゅう毛（有糸分裂後の腸の他の３つの系譜の分化メンバーを含む）、および（ｉｉｉ）間充織を覆う陰か−じゅう毛単位である（図１）。
【０１０９】
マイクロアレイ分析用ＲＮＡを生成するために使用されるマウス群とは別のマウス群についてＬＣＭを実施した。凍結回腸から７μｍ厚みの切片を切り出し、Ａｒｃｔｕｒｕｓ製ＰｉｘＣｅｌｌ ＩＩシステム（レーザ・スポット直径７．５μＭ）を用いてＬＣＭを実施した。ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ−Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）および標準の組織化学的プロトコルを用いて、解剖した細胞集団からＲＮＡを調製した。ＭＲ Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２７４、９９８〜１００１、１９９６およびＲ．Ｆ．Ｂｏｎｎｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１２０３〜４、１９９７に記載の従来法によりレーザ・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）を実施した。
結果を図１に示す。
【０１１０】
第２に、リアル・タイムＲＴ−ＰＣＲを使用してレーザ捕捉細胞集団中の特異的ＲＮＡを定量した。マイクロアレイ分析用に使用されるマウスとは別の３通りの実験の無菌マウスおよびコロニー形成マウスを用いて、ＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
各試料を４回の独立実験で３回繰り返して分析した。個々の測定の平均値±１Ｓ．Ｄ．を表２に示す。
【０１１１】
【表６】
コリパーゼは、すい臓の外分泌（胞状）細胞によって産生される。腸内での発現は、これまで報告されていない。そこで、ＬＣＭおよびリアル・タイムＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎに対するその応答の細胞起源を詳細に叙述する。
【０１１３】
この結果から、ｓｐｒｒ２ａ ｍＲＮＡは上皮に限られ、そこではその濃度はじゅう毛上の方が陰かよりも７倍高いことがわかる（図１Ｂ）。Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、じゅう毛上皮内で２８０倍の増加を誘発する。この値は、回腸ＲＮＡ全体で記録された増加とよく一致する（表２）。ｓｐｒｒ２ａ応答の細胞起源は、それが細菌のコロニー形成に応答して腸上皮防御の強化に関与するという仮説を支持するものである。
【０１１４】
コリパーゼは、すい臓の外分泌胞状細胞によって産生される。ＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲから、コリパーゼｍＲＮＡも回腸陰か上皮に存在し、そこではＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのコロニーが形成されるとコリパーゼが１０倍になることが明らかになった（図１Ｂ）。このことは、回腸ＲＮＡ全体のマイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって検出される増加を説明するものである（表１、２）。コリパーゼは、すい臓トリグリセリド・リパーゼおよびＰＬＲＰ−２の両者の活性を刺激して食事性脂質の代謝に重要な役割を演じている（Ｍ．Ｅ．Ｌｏｗｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、３１２１５（１９９８）。また、プロコリパーゼのタンパク質分解切断により、脂肪摂取の満腹シグナルとして機能するペンタペプチド（エンテロスタチン）が生成する（Ｓ．Ｏｋａｄａ等、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．４９、１１８５（１９９１））。コリパーゼ遺伝子制御の分析から、食事性脂質代謝に対する腸上皮（と消化管内定住共生生物）のこれまで価値が認められていなかった寄与が明らかになる。
【０１１５】
アンギオゲニン−３は、最初にＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞中で同定されたが（Ｘ．Ｆｕ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７、１５０３（１９９７））、その細胞起源または制御についてはほとんど知られていない。ＬＣＭおよびｑＲＴ−ＰＣＲから、陰か上皮は、アンギオゲニン−３ ｍＲＮＡだけでなく新しいタンパク質であるアンギオゲニン−４ｍＲＮＡにも特異的な配列番号１２および２５などのプライマー（上記表３参照）を用いて増幅可能である遺伝子が優勢な部位であり、また、コロニー形成によってこの区画内のその量が７倍に増加する結果となることが明らかになった。この増加は、回腸ＲＮＡ全体のマイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲ分析で明確になる発現変化を説明するものである（表１、２）。分泌／ＲＮアーゼ／血管形成因子の上皮部位は、微生物コロニー形成に対する多数の宿主応答のエフェクターとして機能する戦略的な部位になっている（例えば、栄養素の吸収／分布の促進／防御機能の増強。
【０１１６】
ｓｐｒｒ２ａ、コリパーゼ、およびアンギオゲニン−４のＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲ研究により、ｉｎ ｖｉｖｏ宿主応答を複合組織中の特定の細胞集合に帰属すること、および細胞応答を定量的に記述することの実現可能性が確立される。本出願人らの結果は、応答細胞集団を回収し微生物に対するその反応を定量的に表現するうえで、宿主細胞遺伝子発現に対する微生物の影響を調べるために、どのようにするとｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを越えてｉｎ ｖｉｖｏ系を使用できるかを示すものである。
【０１１７】
無菌マウスのＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎによるコロニー形成は、回腸のＬＰＨ ｍＲＮＡ量を（１／５以下にはならないが）減少させる（表１、２）。レーザ捕捉された上皮および間充織細胞集団から単離されたＲＮＡの分析から、コロニー形成によって誘発されるＬＰＨ ｍＲＮＡ量の減少が、じゅう毛上皮内で主に起こることを確認した（図２）。
無菌マウスとＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎを伴うマウスとの転写産物量の比較から、アンギオゲニン−４の発現がコロニー形成に伴って増加することが明らかとなった。
【０１１８】
実施例１で見られたそのｍＲＮＡが１１倍誘発されることは、回腸ＲＮＡ全体のリアル・タイムＲＴ−ＰＣＲによって別個に確認された（表２）。アンギオゲニン−３は、最初にＮＩＨ ３Ｔ３ 線維芽細胞中で同定された（Ｘ．Ｆｕ、Ｍ．Ｐ．Ｋａｍｐｓ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７、１５０３（１９９７））。しかし、ＬＣＭおよびリアル・タイムＲＴ−ＰＣＲ分析により、コロニー形成された回腸では、アンギオゲニン−３用に設計されたプライマーを用いて増幅可能であるｍＲＮＡの量が陰か上皮中で最大であることが明らかとなった（回腸じゅう毛および間充織内の値は、それぞれ１／１４および１／１５である。図２）。しかし、下記実施例４で概説するように、このｍＲＮＡは実際にはアンギオゲニン−４ｍＲＮＡである。
【０１１９】
コロニー形成後に陰か上皮で観測されるこれらアンギオゲニン−４ｍＲＮＡ量が７倍の増加になることで、回腸ＲＮＡ全体のマイクロアレイおよびリアル・タイムＲＴ−ＰＣＲ分析で明確になった変化が説明される。
上皮で発現されるアンギオゲニン−４の細菌による調節は、血管形成因子を制御するための新規な様式である。
【０１２０】
実施例３
コロニー形成によりじゅう毛上皮内のラクターゼｍＲＮＡ量が減少することをＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲで確認した（図１Ｂ）。発育にしたがって制御されるラクターゼなどの遺伝子の発現変化を規制するのに微生物が役立つかもしれないという考えは、ミクロフローラの数個または多数の構成成分がこれらの変化を誘発できるかどうかという問いを提起する。
【０１２１】
このことを検討するために、７〜１５週齢の無菌ＮＭＲＩ／ＫＩマウスの同年齢グループ（ｎ＝４〜８匹／グループ）をプラスチック製ノトバイオート隔離装置に１２時間の照明サイクルで飼育し、加圧滅菌した固形飼料の食餌（Ｂ ＆ Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）を自由に取れるようにした。オスに、以下の群、
（ｉ）無処置（無菌コントロール）、
（ｉｉ）Ｂ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ菌株ＶＰＩ−５４８２（Ｌ．Ｖ．Ｈｏｏｐｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６、９８３３（１９９９））、
（ｉｉｉ）正常なヒトの糞便フローラから元来採取されたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２、
（ｉｖ）離乳前のヒトおよびマウスの回腸フローラの主要成分であり通常用いられるプロバイオティックであるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ（ＡＴＣＣ １５６９７）、
（ｖ）従来法で飼育されたマウスから採取された「完全な」回腸／盲腸ミクロフローラ（Ｌ．Ｂｒｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、１３８０（１９９６））
のうちの１つを接種した。
別のコントロール・グループは、出生以降従来法で飼育されたマウスからなる。
【０１２２】
マウスを１０日後、照明を点けて２時間後に屠殺した。末端の１ｃｍの小腸を使用してＣＦＵ／ｍｌ回腸内容物を規定した。この区画に直近の３ｃｍの小腸を用いて、回腸ＲＮＡ全体を単離した（ＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ）。
【０１２３】
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して各グループの回腸ラクターゼｍＲＮＡ量を比較した（すべての動物が１０７ＣＦＵ／ｍｌ回腸内容物を有していた）。結果を図３に示す。
【０１２４】
３種類のグラム陰性嫌気性菌のいずれかによるコロニー形成は、無菌コントロールに対してラクターゼの発現を同じように減少させた（図３）。この減少は、完全な回腸／盲腸フローラの接種後にも観察された。同じＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲから、コリパーゼおよびアンギオゲニン−４の回腸での発現が、３種類すべての生物がコロニーを形成したのちに、回腸／盲腸フローラによって誘発されることが明らかになった（図３）。
【０１２５】
これら元無菌マウス（ｅｘ−ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ ｍｉｃｅ）の回腸で得られるコリパーゼおよびアンギオゲニン−４のｍＲＮＡ量は、出生後従来法で飼育された同年齢マウスのそれと同等であった（図３）。
【０１２６】
これらの知見とは対照的に、コロニー形成に対するｓｐｒｒ２ａの応答は、コロニー形成種に依存した。Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、回腸／盲腸フローラによる１０日間のコロニー形成に対する応答を繰り返してｓｐｒｒ２ａ ｍＲＮＡの顕著な増加をもたらしたが、Ｂ．ＩｎｆａｎｔｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉによるコロニー形成は、ｍＲＮＡ量をほんの無視できるほどしか増加させなかった（図３）。
【０１２７】
生体異物および求電子物質の代謝に協調して作用するＭｄｒ１ａおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼも、種特異的（かつ協奏的）応答を示した。発現を抑制するＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎとは異なり、Ｅ．ＣｏｌｉおよびＢ．ｉｎｆａｎｔｓの両者はこれらｍＲＮＡの増加を誘発する。これに対し、多成分回腸／盲腸フローラは、無菌コントロールと比較して、いずれのｍＲＮＡ量にも有意な（すなわち２倍の）変化をもたらさなかった。
【０１２８】
Ｍｄｒ１ａ／ＧＳＴ応答は、正常なミクロフローラの構成成分が、薬物代謝に関与する宿主遺伝子を調節できることの直接の証拠を提供し、薬物代謝の個体間の相違が個体の消化管内定住フローラの違いから一部は生じることを示唆している。
【０１２９】
実施例４
１０日間のコロニー形成が、アンギオゲニン−３の公表された配列から設計されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製プローブ・セットで検出されるｍＲＮＡの回腸での１１倍の発現増加を伴うことを観測したあとで、本出願人らはマウス・アンギオゲニン−３の３′および５′末端に特異的なプライマーを設計した。
それらは、
ＯＲＦ［フォワード・プライマー：
５′−ＣＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＴ ＴＣＴＴＴＧ （配列番号２７）
これは５′末端にＢａｍＨＩ部位を組み込んである；
リバース・プライマー：
５′−ＣＣＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＧＧＡＣＴＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＴＣＡＴＣＧＡＡＧ （配列番号２８）
これは５′末端にＸｂａＩ部位を組み込んである。
【０１３０】
これらのプライマーを、ＲＴ−ＰＣＲと共に使用して、元無菌ＮＭＲＩマウスの回腸から調製したＲＮＡ由来の４３８ｂｐの配列を増幅させた。これらのマウスに、従来法で飼育された同じ近交系に属する動物から採取された完全回腸／盲腸フローラで１０日間コロニーを形成させた。本出願人らは、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＸｂａＩにより消化されたｐＧＥＸ−ＫＧにサブクローニングして、ベクター特異的プライマーを用いてその配列を決定した。
【０１３１】
驚くべきことに、そのＯＲＦのヌクレオチド配列は、マウス・アンギオゲニン−３のそれと９０％しか同一ではなかった。ＰＣＲ反応に用いた（アンギオゲニン−３に特異的な）プライマー配列をその産物に組み込んだので、本出願人らは、５′−および３′−ＲＡＣＥを用いて、（ａ）この新しいアンギオゲニンのＯＲＦの５′および３′末端の正確な配列を得、（ｂ）そのｍＲＮＡの５′および３′非翻訳領域を特定した。その結果、アンギオゲニン−３ ｍＲＮＡと同一であるヌクレオチド配列はわずか８８．３％であることが明らかになった。
【０１３２】
このアンギオゲニン−４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、アンギオゲニン−３配列と並べて、それぞれ配列番号２９および３０として以下の図４に示す。
【０１３３】
アンギオゲニン−４は、マウス・アンギオゲニン・ファミリーの他の３種類のメンバーと７４〜８１％のアミノ酸配列が同一である（図５）。アンギオゲニン−４の５′および３′非翻訳領域が、アンギオゲニン−３ ｍＲＮＡの対応する領域に密接に関係していることが見出された（図４）。
【０１３４】
続いて、様々なマウス・アンギオゲニンｍＲＮＡの組織分布の比較分析を実施した。従来法で飼育した成体（１２〜１４週齢）のオスおよびメスＮＭＲＩマウスから採取した組織（２５組織／マウス）から単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。各遺伝子発現の相対レベルを定量するために、本出願人らは、４種類のマウス・アンギオゲニン・ファミリー・メンバーのそれぞれに特異的なプライマー・セットを設計し（図６、表４）、それらをＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎベースのリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析に用いた。
【０１３５】
意外なことに、アンギオゲニン−４ｍＲＮＡは、それが十二指腸から直腸で発現される場合は小腸に制限されていた（図７）。これに対し、アンギオゲニン−１の発現は、肝臓、肺、およびすい臓で最大であり（図８）、一方、アンギオゲニン−３は主に肝臓、肺、すい臓、および前立腺で発現される（図９）。アンギオゲニン関連タンパク質ｍＲＮＡは、４０サイクルのＰＣＲ後でさえも調査した全組織で検出されなかった（図１０）。
【０１３６】
したがって、アンギオゲニン−４は、その極めて限定的で腸特異的な発現パターンのため、マウス・アンギオゲニン・ファミリー・メンバーのなかでユニークなものとなっている。
【０１３７】
これらの知見から、腸内ではアンギオゲニン−３よりもアンギオゲニン−４の発現が微生物によって制御されることが示唆された。この仮説を直接試験するため、アンギオゲニン−４に特異的なプライマーとｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、無菌ＮＭＲＩマウスおよび従来法で飼育されたＮＭＲＩ動物から採取された回腸／盲腸フローラで１０日間コロニー形成させた無菌マウスの小腸の長さ方向に沿ったアンギオゲニン−４ｍＲＮＡ量を比較した。対ごとの比較から、アンギオゲニン−４の発現がコロニー形成されたマウスの空腸で最大であり、従来法に従うとこの領域でのアンギオゲニン−４の発現が最大１７倍にまで誘発されることが明らかになった（図１１）。無菌ＮＭＲＩマウスをＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎだけと１０日間共生させると（Ｍｏｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、アンギオゲニン−４の発現が同程度に誘発された（データ示さず）。
【０１３８】
【表７】
アンギオゲニン−４の生後発育中の発現制御は、その微生物による制御と一致する。
次いで、生後５日（Ｐ５）〜Ｐ３０の無菌および従来法で飼育されたＮＭＲＩマウス（ｎ＝３マウス／日／グループ）の発育に伴うアンギオゲニン−４の発現パターンを評価した（図９）。アンギオゲニン−４の転写産物相対量は、Ｐ２０までいずれのマウス・グループでも比較的低いままであった。この時点以降、無菌動物でわずかに（２〜３倍）発現が増加した。これに対し、従来法で飼育された動物では、Ｐ１５からＰ３０の間でアンギオゲニン−４の発現が２０倍以上になった。これらの結果から、哺乳／離乳移行中にアンギオゲニン−４が誘導されることが示唆され、これは消化管内微生物の主な変化と一致する。生後の無菌マウスでアンギオゲニン−４が誘導されないことも、微生物叢の構成成分がアンギオゲニン−４の発現の制御に重要な役割を演じているという結論と一貫している。
【０１４０】
アンギオゲニン−４の細胞局在化
これまでのアンギオゲニン・タンパク質発現の細胞起源のレーザ・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）／ｑＲＴ−ＰＣＲによる研究（実施例２）では、アンギオゲニン−３およびアンギオゲニン−４の両者を認識するプライマー、および捕捉された陰か上皮、じゅう毛上皮、またはじゅう毛核（ｖｉｌｌｕｓ ｃｏｒｅ）由来の間充織集団から単離したＲＮＡを使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析から、微生物制御された「アンギオゲニン」が、リーベルキューンかの底部に位置する上皮細胞で産生されることが示された（Ｈｏｏｐｅｒ等、２００１）。
【０１４１】
アンギオゲニン−４の発現がパネート細胞中で起こるという仮説を試験するために、本出願人らは、ＬＣＭを使用して、（ａ）弱毒ジフテリア毒素Ａフラグメント（ｔｏｘ１７６）によってパネート細胞系譜を切断した無菌成体（１２週齢）トランスジェニック・マウス（ＣＲ２−ｔｏｘ１７６マウス）（Ｇａｒａｂｅｄｉａｎ等、１９９７）、および（ｂ）それらの同年齢同性無菌正常同腹子から、空腸陰かの底部に位置する細胞を単離した。アンギオゲニン４特異的プライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲにより、正常マウスの陰か底部の上皮細胞から精製されたＲＮＡでアンギオゲニン−４ｍＲＮＡレベルがＣＲ２−ｔｏｘ１７６同腹子に比べて１０倍になることが明らかになった（図１０）。
【０１４２】
従来法で飼育されたＮＭＲＩマウスを用いて追跡調査を実施した。３個の細胞プールをＬＣＭで採取した。すなわち、パネート細胞単体、上部陰かおよびじゅう毛の上皮細胞（パネート細胞を除いた画分）、およびじゅう毛核および陰か周辺領域から回収した間充織である。アンギオゲニン−４ｍＲＮＡの分布は、Ｍｏｍ−１遺伝子座の産物であり周知のパネート細胞特異的遺伝子の産物であるホスホリパーゼＡ２の分布に極めて類似していた（データ示さず）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
レーザ捕捉顕微解剖された回腸細胞集団、コロニー形成されたマウス回腸のＬＣＭにおける遺伝子発現のコロニー形成に関連する変化のリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ研究の結果を示す図である。ヌクレア・ファースト・レッドで切片を染色した。棒目盛＝２５μｍ。
【図２】
レーザ捕捉された細胞集団から単離されたｍＲＮＡの量のリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示すグラフである。値は、下記ΔΔＣＴ分析を用いた無菌間充織内の量に対するものである。各試料の遺伝子産物を３〜４回の独立実験で各３回繰り返して分析した。無菌マウスとコロニー形成マウスのペアから得られた代表的な結果（平均値±１Ｓ．Ｄ．）をプロットしてある。
【図３】
ミクロフローラの様々なメンバーによるコロニー形成に対する宿主応答の特異性を示す実験結果を示すグラフである。示した菌のうちの１つを、または従来法で飼育されたマウス由来の完全な回腸／盲腸フローラ（従来法ミクロフローラ）を無菌マウスに接種した（４）。接種から１０日後に１０７ＣＦＵ／ｍｌ回腸量でコロニー形成させた動物から調製された回腸ＲＮＡをプールし、図示した各ｍＲＮＡ量をリアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）で分析した。３回の測定の平均値（±１Ｓ．Ｄ．）をプロットしてある。
【図４】
マウスのアンギオゲニン−４およびアンギオゲニン−３のヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号２９および３０）を並べて示す図である。
【図５】
マウスのアンギオゲニン・ファミリー・メンバーのアミノ酸配列の配列アラインメント（配列番号３１〜３４）を示す図である。
【図６】
マウスのアンギオゲニン・ファミリー・メンバーに特異的なプライマーの位置を示す図である。
【図７】
アンギオゲニン−４ｍＲＮＡの組織分布を示すグラフと、アガロース・ゲル分析の結果を示す図である。
【図８】
アンギオゲニン−１ｍＲＮＡの組織分布を示すグラフである。
【図９】
定量リアル・タイムＲＴ−ＰＣＲ分析後のアンギオゲニン−３ｍＲＮＡの組織分布を示すグラフである。
【図１０】
アンギオゲニン関連タンパク質発現の欠如を示すＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図である。
【図１１】
小腸内のアンギオゲニン−４の発現の微生物による制御に関する実験結果を示すグラフである。
【図１２】
生後発育期間におけるアンギオゲニン−４の発現の制御を示すグラフである。
【図１３】
陰か底部（ｃｒｙｐｔ ｂａｓｅ）から単離した細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析による小腸内のアンギオゲニン−４発現の細胞局在化を示す棒グラフである。
Claims (25)
- ａ）共生細菌がコロニーを形成した腸内および無菌の腸内で少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を測定すること、および
ｂ）共生細菌がコロニーを形成した腸と無菌の腸とで発現レベルが少なくとも２倍異なるａ）の遺伝子を同定すること
を含む哺乳動物の腸内共生ミクロフローラのコロニー形成に起因する化学変化を調べる方法。 - ステップａ）の複数の遺伝子発現をＤＮＡマイクロアレイ分析および／または定量ＲＴＰＣＲで測定する、請求項１に記載の方法。
- ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物、下等真核生物モデル、または動物モデルからなる群から選択される系内で、ｂ）で同定された遺伝子の機能を調べるステップｃ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- ｉ）トランスジェニック・ノックアウト、
ｉｉ）ドミナント・ネガティブ実験、
ｉｉｉ）導入遺伝子の過剰発現、
ｉｖ）抗体結合アッセイ、
ｖ）性質の明確な化学薬剤を用いた薬理学的介入による、
からなる群から選択される方法を用いて機能を調べる、請求項３に記載の方法。 - 共生細菌がＢ．Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎである、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１０種類の遺伝子の発現を測定し、栄養素の摂取と代謝、ホルモン／成熟応答、粘膜防御機能、解毒／薬剤耐性、腸管神経系／筋層の発生または活動、血管形成、細胞骨格／細胞外マトリックスの機能または発生、シグナル伝達、または他の細胞機能に関連する遺伝子から選択される前記遺伝子をステップ（ａ）で測定する、請求項１に記載の方法。
- Ｎａ＋／グルコースコトランスポーター（ＳＧＬＴ１）、ラクターゼ・フロリジン−ヒドロラーゼ、膵リパーゼ関連タンパク質２、コリパーゼ、肝脂肪酸結合タンパク質、絶食誘導脂肪因子（ＦＩＡＦ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、ホスホリパーゼＢ、ＣＹＰ２７高親和性銅トランスポーター、メタロチオネインＩ、メタロチオネインＩＩ、フェリチン重鎖、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ・サブユニット、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、リンゴ酸オキシドレダクターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、オミシン・デカルボキシラーゼ抗酵素、１５−ヒドロキシプロスタグランジン・デヒドロゲナーゼ、ＧＡＲＧ−１６、ＦＫＢＰ５１、アンドロゲン制御輸精管タンパク質、短鎖デヒドロゲナーゼ、耐熱性抗原、減衰促進因子、重合Ｉｇ受容体、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ、血清アミロイド・タンパク質Ａ、ＣＲＰ−ダクチンα（ＭＵＣＬＩＮ）、ゼータ・プロテアソーム鎖、抗ＤＮＡ ＩｇＧ Ｌ鎖、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、Ｐ−糖タンパク質（ｍｄｒ１ａ）、ＣＹＰ２Ｄ２、Ｌ−グルタミン酸トランスポーター、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、小胞関連タンパク質−３３、システイン・リッチ・タンパク質２、平滑筋（腸）γアクチン、ＳＭ−２０、アンギオゲニン−４、ゲルゾリン、デストリン、心筋αアクチン、エンドＢサイトケラチン、フィブロネクチン、プロテイナーゼ阻害剤６、α１タイプ１コラーゲン、Ｐｔｅｎ、ｇｐ１０６（ＴＢ２／ＤＰ１）、ｒａｃ２、Ｓｅｍｃａｐ２、血清およびグルココルチコイド制御キナーゼ、ＳＴＥ２０様タンパク質キナーゼおよびＢ細胞ミエロイド・キナーゼ、グルタチオン・レダクターゼ、カルモジュリン、ｅｌＦ３サブユニット、ｈｓｃ７０、オリゴサッカリル・トランスフェラーゼ・サブユニット、フィブリラリン、Ｈ＋−輸送ＡＴＰアーゼ、およびＭｓｅｃ２３をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１０種類の遺伝子の発現である、請求項６に記載の方法。
- １０種類の遺伝子が、コリパーゼ、減衰促進因子（ＤＡＦ）、重合ＩｇＡ受容体、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（Ｓｐｒｒ２ａ）、アンギオゲニン−３、アンギオゲニン−４、Ｐｔｅｎ、ＣＹＰ２Ｄ２、Ｓｐｒｒ２ａ、ｒａｃ２、およびＭｄｒ−１をコードする遺伝子を含む、請求項６に記載の方法。
- 実質上すべての前記遺伝子の発現を測定する、請求項７に記載の方法。
- 発現が少なくとも７倍異なる遺伝子をステップ（ｂ）で同定する、請求項１に記載の方法。
- 腸内でアンギオゲニン−４またはコリパーゼが関与する生物化学的経路を評価することを含む、請求項３に記載の方法。
- 哺乳動物の消化管内で特定の遺伝子の発現レベルを、治療または予防の目的で変化させる方法であって、請求項１に記載の方法を用いて同定される共生細菌の胃腸管内密度を、前記発現レベルの所望の変化をもたらすように変更することを含む方法。
- 請求項１の方法を用いて同定される有効な共生細菌を用いて、上皮で発現される血管形成因子を調節することを含む、請求項１２に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法を用いて同定される有効な共生細菌を用いて、代謝を調節することを含む、請求項１２に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法を用いて同定される有効な共生細菌を用いて、上皮の防御機能を調節することを含む、請求項１２に記載の方法。
- 胃腸疾患に薬剤として応用される化合物のスクリーニング方法であって、請求項１に記載の方法を用いて同定される遺伝子産物の活性を調節する能力について前記化合物を評価することを含む方法。
- 請求項１に記載の方法を用いて同定される遺伝子産物の活性を調節する化合物の治療有効量を投与することを含む、胃腸疾患を治療しまたは予防する方法。
- 小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｐｒｒ２ａ）またはｒａｃ２の活性または量を調節する能力について化合物をアッセイすることを含む、腸の防御機能の欠陥を特徴とする病状の治療または予防に潜在的に有用な化合物をスクリーニングする方法。
- 腸の防御機能の欠陥を特徴とする病状の治療または予防用薬物の調製における、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｐｒｒ２ａ）またはｒａｃ２の活性または量を調節できる化合物の使用。
- 小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｐｒｒ２ａ）またはｒａｃ２の活性または量を調節できる化合物の治療有効量を投与することを含む、腸の防御機能の欠陥を特徴とする病状を治療または予防する方法。
- 腸の生態のレギュレーターとして機能する遺伝子を同定するための方法であって、請求項１に記載の方法を応用すること、およびこのような機能にこれまで関連づけられていない発現遺伝子を検出することを含む方法。
- マウスの腸で発現され、配列番号１２および２５のプライマーを用いて少なくとも部分的に増幅可能である遺伝子によってコードされるアンギオゲニン・タンパク質。
- タンパク質が、図４に示す配列番号２９のタンパク質、その対立遺伝子変異体、または配列番号２９と同一のアミノ酸配列を少なくとも８５％有するタンパク質である、請求項２２に記載のタンパク質。
- 配列番号２９のタンパク質である請求項２３に記載のタンパク質。
- 請求項２２に記載のタンパク質をコードする核酸。
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