ES2910946T3

ES2910946T3 - Composiciones que comprenden cepas bacterianas

Info

Publication number: ES2910946T3
Application number: ES19196804T
Authority: ES
Inventors: George Grant; Angela Margaret Patterson; Imke Mulder; Seanin Mccluskey; Emma Raftis
Original assignee: 4D Pharma Research Ltd
Current assignee: 4D Pharma Research Ltd
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2016-06-15
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2036-06-15
Also published as: IL294213B2; SG10201912319SA; CN108271353B; EP3650033A1; BR112017026564B1; SI3360559T1; JP6439037B2; EA201890051A1; US10736926B2; EP3360559A1; IL255662B; LT3360559T; CN114028431A; EP3360559B1; TWI797058B; RS63089B1; AU2020244599B2; HRP20191344T1; US20210145900A1; SA517390513B1

Abstract

Una composición que comprende una cepa bacteriana que tiene un genoma con por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2, para su uso en un método para tratar o prevenir el asma alérgica, el asma eosinofílica o la hipersensibilidad asociada con el asma.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden cepas bacterianas

CAMPO TÉCNICO

Esta invención está en el campo de las composiciones que comprenden cepas bacterianas aisladas del tracto digestivo de los mamíferos y el uso de tales composiciones en el tratamiento de la enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El intestino humano se cree que es estéril en el útero, pero está expuesto a una gran variedad de maternos y microbios ambientales inmediatamente después del nacimiento. A partir de entonces, se produce un período dinámico de colonización y sucesión microbiana, que está influenciado por factores como el modo de entrega, el medio ambiente, la dieta y el genotipo del huésped, todos los cuales impactan en la composición de la microbiota intestinal, particularmente durante los primeros años de vida. Posteriormente, la microbiota se estabiliza y se convierte en un adulto [1]. La microbiota intestinal humana contiene más de 500-1000 filotipos diferentes que pertenecen esencialmente a dos divisiones bacterianas principales, los Bacteroidetes y los Firmicutes [2]. Las exitosas relaciones simbióticas que surgen de la colonización bacteriana del intestino humano han producido una amplia variedad de funciones metabólicas, estructurales, protectoras y otras beneficiosas. Las actividades metabólicas mejoradas del intestino colonizado aseguran que los componentes dietéticos que de otro modo no serían digeribles se degradan con la liberación de subproductos que proporcionan una importante fuente de nutrientes para el huésped. Del mismo modo, la importancia inmunológica de la microbiota intestinal es bien reconocida y se ejemplifica en animales libres de gérmenes que tienen un sistema inmunitario deteriorado que se reconstituye funcionalmente después de la introducción de bacterias comensales [3-5].

Los cambios dramáticos en la composición de la microbiota se han documentado en los trastornos gastrointestinales tales como enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). Por ejemplo, los niveles de la bacteria de cluster XIVa Clostridium se reducen en pacientes con EII mientras que el número de E. coli aumenta, lo que sugiere un cambio en el equilibrio de simbiontes y patobiontes dentro del intestino [6-9]. Curiosamente, esta disbiosis microbiana también se asocia con desequilibrios en las poblaciones de células efectoras T.

En reconocimiento del efecto positivo potencial que ciertas cepas bacterianas pueden tener en el intestino animal, varias cepas se han propuesto para uso en el tratamiento de diversas enfermedades (véase, p. ej., [10-13]). Además, ciertas cepas, incluidas principalmente cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium, se han propuesto para su uso en el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunes que no están directamente relacionadas con los intestinos (ver [14] y [15] para revisiones). Sin embargo, la relación entre diferentes enfermedades y diferentes cepas bacterianas, y los efectos precisos de cepas bacterianas particulares en el intestino y a nivel sistémico y en cualquier tipo particular de enfermedades, están pobremente caracterizados.

Los documentos WO2011/110918 y WO2011/149335 describen estudios clínicos que usan probióticos en el tratamiento de dermatitis atópica y alergias. El documento WO2009/072889 describe estudios clínicos que usan probióticos en el tratamiento del asma alérgica.

Existe un requisito en la técnica para nuevos métodos de tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes. También hay un requisito para que los efectos potenciales de las bacterias intestinales se caractericen para que se puedan desarrollar nuevas terapias que usen bacterias intestinales.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana con por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 de PCT/GB2016/051776, para su uso en un método de tratamiento o prevención del asma alérgica, asma eosinofílica o hipersensibilidad de las vías respiratorias asociada al asma.

Los inventores han desarrollado nuevas terapias para tratar y prevenir enfermedades inflamatorias y autoinmunes. En particular, los inventores han desarrollado nuevas terapias para tratar y prevenir enfermedades y afecciones mediadas por IL-17 o la vía Th17. En particular, los inventores han identificado una nueva cepa bacteriana que es efectiva para reducir la respuesta inflamatoria Th17. Como se describe en los ejemplos, la administración oral de composiciones que comprenden la bacteria depositada con el número de acceso Nc iMb 42380 puede reducir la gravedad de la respuesta inflamatoria, incluida la respuesta inflamatoria Th17, en modelos de ratón de asma, artritis reumatoide y esclerosis múltiple. Como también se describe en los ejemplos, la administración oral de composiciones que comprenden la bacteria depositada con el número de acceso NCIMb 42380 puede reducir el tamaño del tumor en modelos de cáncer de ratón que pueden estar asociados con la respuesta inflamatoria Th17.

Los inventores han identificado que el tratamiento con tales cepas bacterianas puede reducir los niveles de citocinas que son parte de la vía Th 17, incluyendo IL-17, puede aliviar la respuesta inflamatoria Th17 y puede proporcionar beneficios clínicos en modelos de ratón de enfermedades inflamatorias y autoinmunes mediadas por IL-17 y la vía Th17.

En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380, para su uso en un método de tratamiento o prevención de asma alérgica. Los inventores han identificado que el tratamiento con la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 puede reducir el reclutamiento de neutrófilos y eosinófilos en los pulmones, lo que puede ayudar a tratar o prevenir el plasma. Además, los inventores han probado y demostrado la eficacia de la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 en modelos de ratón de asma. El efecto mostrado por las composiciones de la invención sobre los eosinófilos significa que puede ser particularmente eficaz para tratar o prevenir el asma eosinofílica. De hecho, en ciertas realizaciones, la composición es para su uso en un método para reducir una respuesta inflamatoria eosinofílica en el tratamiento o prevención del asma eosinofílica. La bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 muestra tener un efecto particularmente pronunciado sobre los neutrófilos en modelos de asma y el tratamiento con esta bacteria puede ser particularmente eficaz para tratar el asma neutrofílica.

En particular, las composiciones de la invención pueden usarse para reducir la producción de IL-17 o reducir la diferenciación de células Th17 en el tratamiento o prevención del asma alérgica o eosinofílica.

En ciertas realizaciones, la composición es para uso en un paciente con niveles de IL-17 elevados o células Th17. El efecto sobre la respuesta inflamatoria Th17 que se muestra para la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 puede ser particularmente beneficioso para tales pacientes.

En formas de realización preferidas de la invención, la cepa bacteriana en la composición es la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42380. Las cepas bacterianas pueden tener una secuencia de ARNr 16S que es al menos 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a s Eq

ID NO: 1. Preferiblemente, la cepa bacteriana para usar en la invención tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO:1.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención es para administración oral. Además, la administración oral es conveniente para pacientes y profesionales y permite la entrega y/o colonización parcial o total del intestino.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención comprende uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención comprende una cepa bacteriana que ha sido liofilizada. La liofilización es una técnica efectiva y conveniente para preparar composiciones estables que permiten el suministro de bacterias.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un producto alimenticio que comprende la composición como se describe anteriormente.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición de vacuna que comprende la composición como se ha descrito anteriormente.

En el desarrollo de la invención anterior, los inventores han identificado y caracterizado una cepa bacteriana que es particularmente útil para la terapia. La bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 se muestra eficaz para tratar las enfermedades descritas en este documento, tales como artritis, asma y esclerosis múltiple. La bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 también se muestra efectiva para tratar el cáncer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Recuentos de células de fluido BAL totales.

Figura 2: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Recuento total de eosinófilos en BALF.

Figura 3: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Proporción de eosinófilos en BALF.

Figura 4: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Recuento total de macrófagos en BALF.

Figura 5: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Proporción de macrófagos en BALF.

Figura 6: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico: Recuento total de neutrófilos en BALF.

Figura 7: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Proporción de neutrófilos en BALF.

Figura 8: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico: recuento total de linfocitos en BALF.

Figura 9: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Proporción de linfocitos en BALF.

Figura 10: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Recuento total de células de líquido BAL.

Figura 11: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Recuento total de eosinófilos en BALF.

Figura 12: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Proporción de eosinófilos en BALF.

Figura 13: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Recuento total de macrófagos en BALF.

Figura 14: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Proporción de macrófagos en BALF.

Figura 15: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Recuento total de neutrófilos en BALF.

Figura 16: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Proporción de neutrófilos en BALF.

Figura 17: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Recuento total de linfocitos en BALF.

Figura 18: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Proporción de linfocitos en BALF.

Figura 19: Modelo de ratón de artritis reumatoide: Pesos corporales, días -14 a 0. Los datos se presentan como porcentajes promedio de SEM de los pesos corporales iniciales (día -14). Significación estadística: ▲ p <0,05 y ▲▲▲▲ p <0,0001 cuando se compara con el grupo tratado con vehículo.

Figura 20: Modelo de ratón de artritis reumatoide: Pesos corporales, días 0 a 42. Los datos se presentan como porcentajes promedio de SEM de los pesos corporales iniciales (día 0). ▲ p <0,05, ♦ p <0,05, ▲▲▲ p <0,001, •••• p <0,0001 en comparación con el grupo tratado con vehículo.

Figura 21: Modelo de ratón de artritis reumatoide - Puntajes clínicos. Los datos se presentan como SEM media. **** p < 0,0001 en comparación con el día 21 en el grupo tratado con vehículo. ♦, O p <0,05 en comparación con el grupo tratado con vehículo en un día determinado.

Figura 22: Modelo de ratón de artritis reumatoide: Respuesta proliferativa de esplenocitos al colágeno II. Los medios de fondo restados [estimulados por CII - medios de fondo] cuentan por minuto en función de la incorporación de 3H-TdR. Todos los datos se presentan como SEM media. ** p <0,01 en comparación con el grupo de vehículos.

Figura 23: Modelo de ratón de artritis reumatoide: Niveles de IFNy en sobrenadantes de cultivo de tejidos. Las líneas representan los valores medios del grupo.

Figura 24: Modelo de ratón de artritis reumatoide: Niveles de IL-17A en sobrenadantes de cultivo de tejidos. Las líneas representan los valores medios del grupo.

Figura 25: Modelo de ratón de artritis reumatoide: Niveles de IL-10 en sobrenadantes de cultivo de tejidos. Las líneas representan los valores medios del grupo.

Figura 26: Modelo de ratón de artritis reumatoide: Niveles de IL-6 en sobrenadantes de cultivo de tejidos. Las líneas representan los valores medios del grupo.

Figura 27: Sistema de puntuación de histopatología.

Figura 28: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - IgE total en suero Figura 29: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros de polvo doméstico - IgG1 específica de HDM en suero

Figura 30: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros de polvo doméstico - IgE total en BALF Figura 31: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - IgG1 específica de HDM en BALF

Figura 32: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros de polvo doméstico - Análisis histológico -Puntuación media de infiltración peribronquiolar

Figura 33: Modelo de ratón de ácaros del polvo doméstico- asma inducida - Análisis histológico - Puntuación media de infiltración perivascular

Figura 34: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Análisis histológico -Puntuación inflamatoria media (Promedio de puntuación de infiltración peribronquiolar y perivascular) Figura 35: Modelo de ratón de ácaros inducidos por ácaros del polvo doméstico asma - Análisis histológico - Puntuación de moco

Figura 36: Modelo de ratón del asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Nivel de IL-9 en tejido pulmonar

Figura 37: Modelo de ratón del asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Nivel de IL-1 a en tejido pulmonar

Figura 38: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Nivel de IFNg en tejido pulmonar

Figura 39: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros de polvo doméstico - Nivel de IL-17A en tejido pulmonar

Figura 40: Modelo de ratón de ácaros del polvo doméstico asma inducida - Nivel de IL-4 en tejido pulmonar Figura 41: Modelo de ratón del asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Nivel de IL-5 en tejido pulmonar

Figura 42: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Nivel de IL-1 b en tejido pulmonar

Figura 43: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Nivel de RANTES en tejido pulmonar

Figura 44: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - MIP-1a nivel en tejido pulmonar

Figura 45: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico - Nivel de KC en tejido pulmonar Figura 46: Modelo de ratón de asma inducida por ácaros de polvo doméstico - Nivel de MIP-2 en tejido pulmonar

Figura 47: Modelo de ratón de graves asma neutrofílica - IgG1 específica de HDM en suero

Figura 48: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - IgG2a específica de HDM en suero

Figura 49: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - IgG1 específica de HDM en BALF

Figura 50: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - IgG2a específica de HDM en BALF

Figura 51: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Análisis histológico - Puntuación media de infiltración peribronquiolar

Figura 52: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Análisis histológico - Puntuación media de infiltración perivascular

Figura 53: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Análisis histológico - Puntuación inflamatoria media (Promedio de puntuación de infiltración peribronquiolar y perivascular)

Figura 54: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Nivel de TNFa en tejido pulmonar

Figura 55: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Nivel de IL-1 a en tejido pulmonar

Figura 56: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Nivel de IFNg en tejido pulmonar

Figura 57: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Nivel de IL-17F en tejido pulmonar

Figura 58: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Nivel de IL-1 b en tejido pulmonar

Figura 59: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Nivel RANTES en tejido pulmonar

Figura 60: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Nivel de MIP-2 en tejido pulmonar

Figura 61: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa - Nivel de KC en tejido pulmonar

Figura 62: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa: Nivel de IL-17A en tejido pulmonar Figura 63: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa: Nivel de MIP-1a en tejido pulmonar Figura 64: Modelo de ratón de asma neutrofílica severa: Nivel de IL-33 en tejido pulmonar Figura 65: Modelo de ratón de artritis reumatoide: Plantilla visual para la puntuación de histopatología. Imágenes representativas que muestran puntajes compuestos de las articulaciones tarsales del ratón en un estudio de artritis inducida por colágeno.

Figura 66: Modelo de ratón de artritis reumatoide - Histopatología: Puntajes de inflamación. Los datos se presentan como SEM media. ** p <0,01 en comparación con el grupo tratado con vehículo.

Figura 67: Modelo de ratón de artritis reumatoide - Histopatología: Puntajes de cartílago. Los datos se presentan como SEM media. *** p <0,001 en comparación con el grupo tratado con vehículo.

Figura 68: Modelo de ratón de artritis reumatoide - Histopatología: Puntajes óseos. Los datos se presentan como SEM media. *** p <0,001 en comparación con el grupo tratado con vehículo.

Figura 69: Modelo de ratón de artritis reumatoide - Histopatología: Puntajes totales. Los datos se presentan como SEM media. * p <0,05, *** p <0,001 en comparación con el grupo tratado con vehículo.

Figura 70: Modelo de ratón de artritis reumatoide - Histopatología: Imágenes representativas. La identificación del animal (#n.n) y la extremidad (R para la derecha, L para la izquierda) se indican entre paréntesis. Imagen superior izquierda (vehículo): destrucción extensa de articulaciones y huesos con inflamación y fibrosis que se extienden a los tejidos blandos periarticulares.

Figura 71: Modelo de ratón de esclerosis múltiple: Puntuación clínica.

Figura 72: Modelo de ratón de esclerosis múltiple - Incidencia de enfermedad.

Figura 73: Modelo de ratón de cáncer de mama - Volumen tumoral.

Figura 74: Modelo de ratón de cáncer de pulmón - Volumen tumoral.

Figura 75: Modelo de ratón de cáncer de hígado - Peso del hígado.

Figura 76: Fijación de cepas de tipo MRX004 y B. breve a células humanas.

Figura 77: Ensayo de producción de exopolisacárido.

Figura 78: Producción de exopolisacáridos unidos y liberados por MRX004.

Figura 79: Fijación de MRX004 a las células Caco-2.

Figura 80: Perfil de ID rápida 32 A de MRX004 solo (A) y en comparación con cepas de tipo B. breve (B). Blanco = reacción negativa (sin cambio de color), sombreado hacia abajo = reacción positiva intermedia (cambio de color débil) y negro = reacción positiva (fuerte cambio de color apropiado).

Figura 81: Análisis API® 50 CH de MRX004. Sombreado cruzado hacia arriba = reacción negativa (sin cambio de color), sombreado cruzado hacia abajo = reacción positiva intermedia (cambio de color débil), negro = reacción positiva (cambio de color apropiado fuerte) y blanco = reacción dudosa (cambio de color inesperado).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Cepas bacterianas

Las composiciones de la invención comprenden la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380. Los ejemplos demuestran que tales bacterias son útiles para tratar o prevenir enfermedades y afecciones mediadas por IL-17 o la vía Th17. Los ejemplos también demuestran que tales bacterias son útiles para tratar o prevenir el cáncer. La cepa bacteriana preferida es la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42380.

La bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42380 se probó en los ejemplos y también se denomina en este documento como la cepa 751 o MRX004. En la SEQ ID NO:1 se proporciona una secuencia parcial de ARNr 16S para la cepa 751 que se probó. La cepa 751 fue depositada ante la autoridad depositaria internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) por GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Escocia) el 12 de marzo de 2015 y se le asignó la adhesión número NCIMB 42380. GT Biologics Ltd. posteriormente cambió su nombre a 4D Pharma Research Limited.

Una secuencia del genoma de la cepa 751 se proporciona en la SEQ ID NO:2 en el listado de secuencias publicado con el documento PCT/GB2016/051776. Las referencias a la SEQ ID NO:2 en la presente, incluyendo en la descripción y las reivindicaciones, se refieren a la SEQ ID NO:2 del PCT/GB2016/051776.

También se espera que cepas bacterianas que son biotipos de la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42380 sean eficaces para tratar o prevenir enfermedades y afecciones mediadas por IL-17 o la vía Th17. También se espera que las cepas bacterianas que son biotipos de la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 sean efectivas para tratar o prevenir el cáncer. Un biotipo es una cepa estrechamente relacionada que tiene las mismas características fisiológicas y bioquímicas o unas muy similares.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO:1. Preferiblemente, la cepa bacteriana para usar en la invención tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO:1.

Alternativamente, las cepas que son biotipos de la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 y que son adecuadas para su uso en la invención pueden identificarse secuenciando otras secuencias de nucleótidos para la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380. Por ejemplo, puede secuenciarse sustancialmente todo el genoma y una cepa de biotipo puede tener por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia en por lo menos un 80% de su genoma completo (p. ej., en por lo menos un 85%, 90%, 95% o 99%, o en su genoma completo).

La cepa bacteriana para su uso en la invención tiene un genoma con un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 del documento PCT/GB2016/051776. En casos preferidos, la cepa bacteriana para usar en la invención tiene un genoma con una identidad de secuencia de al menos 90% (p. ej., al menos 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de secuencia identidad) a SEQ ID NO:2 del documento PCT/GB2016/051776 en al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % o 100%) de SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776. Por ejemplo, la cepa bacteriana para usar en la invención puede tener un genoma con al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 del documento PCT/GB2016/051776 en el 70% de la SEQ ID NO:2 del documento PCT/GB2016/051776, o en al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 del documento PCT/GB2016/051776 a través del 80% de la SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776, o al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 del PCT/GB2016/05177690% de SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776, o al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776 en 100% de SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776, o al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776 en el 70% de la SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776, o al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 del PCT/GB2016/051776 en 80 % de SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776, o al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776 en 90% de SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776, o al menos 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776 en el 100% de SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776, o al menos 98% de secuencia e identidad con la SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776 en el 70% de la SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776, o al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776 en el 80% de SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776, o al menos 98% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776 en 90% de SEQ ID NO:2 de PCT/GB2016/051776, o al menos 98% de secuencia identidad con la SEQ ID NO:2 del PCT/GB2016/051776 en el 100% de la SEQ ID NO:2 del PCT/GB2016/051776.

Alternativamente, las cepas que son biotipos de la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 y que son adecuadas para su uso en la invención pueden identificarse usando el análisis de fragmentos de restricción y depósito del número de acceso NCIMB 42380 y/o análisis de PCR, por ejemplo mediante el uso de un polimorfismo fluorescente amplificado de longitud de fragmento (FAFLP) y el elemento repetitivo de ADN (rep)-huellas dactilares de PCR, o perfil de proteínas, o secuenciación parcial de ADNr 16S o 23s. En realizaciones preferidas, tales técnicas se pueden utilizar para identificar las cepas de la misma especie como la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42380.

En ciertas realizaciones, las cepas que son biotipos de la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42380 y que son adecuadas para usar en la invención son cepas que proporcionan el mismo patrón que la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 cuando se analizan mediante análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA), por ejemplo, cuando se usa la enzima de restricción Sau3AI (para ejemplos de métodos y orientación, ver, por ejemplo, [17]). Alternativamente, las cepas de biotipo se identifican como cepas que tienen los mismos patrones de fermentación de carbohidratos como la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42380.

Las cepas bacterianas que son biotipos de la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42380 y que son útiles en las composiciones y los métodos de la invención pueden identificarse utilizando cualquier método o estrategia apropiados, incluidos los ensayos descritos en los ejemplos. Por ejemplo, los biotipos para usar en la invención pueden identificarse cultivando en YCFA anaeróbico y/o administrando las bacterias al modelo de ratón de artritis inducida por colágeno tipo II y luego evaluando los niveles de citoquinas. En particular, las cepas bacterianas que tienen patrones de crecimiento, tipo metabólico y/o antígenos de superficie similares a la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 pueden ser útiles en la invención. Una cepa de biotipo tendrá una actividad inmunomoduladora comparable a la cepa NCIMB 42380. En particular, una cepa de biotipo provocará efectos comparables en los modelos de asma, artritis, esclerosis múltiple y enfermedad por cáncer y efectos comparables en los niveles de citocinas a los efectos mostrados en los Ejemplos, que pueden identificarse utilizando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos.

Una cepa particularmente preferida de la invención es la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42380. Esta es la cepa ejemplar 751 ensayada en los ejemplos y se muestra para ser eficaz para tratar la enfermedad.

Un derivado de la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42380 puede ser una cepa hija (progenie) o una cepa cultivada (subclonaron) de la original. Una cepa derivada tendrá una actividad inmunomoduladora comparable a la cepa NCIMB 42380. En particular, una cepa derivada provocará efectos comparables en los modelos de asma, artritis, esclerosis múltiple y enfermedad por cáncer y los mismos efectos comparables en los niveles de citoquinas a los efectos mostrados en los Ejemplos, que pueden identificarse utilizando los protocolos de cultivo y administración descritos en los ejemplos. Un derivado de la cepa NCIMB 42380 generalmente será un biotipo de la cepa NCIMB 42380.

Las referencias a las células de la bacteria depositadas con el número de acceso NCIMB 42380 abarcan cualquier célula que tenga las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que la cepa depositada con el número de acceso NCIMB 42380, y dichas células están abarcadas por la invención.

En realizaciones preferidas, las cepas bacterianas en las composiciones de la invención son viables y capaces de colonizar parcial o totalmente el intestino.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene una baja adherencia a las células epiteliales intestinales humanas, en particular las células Caco-2. En una realización preferida, la cepa bacteriana para usar en la invención tiene baja adherencia a las células epiteliales intestinales humanas, en particular a las células Caco-2, en YCFA en comparación con las Bifidobacterias, en particular B. breve. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención exhibe adherencia de menos de 1 % del total de cultivo, tales como preferiblemente menos de 0,5% o menos de 0,3%, cuando se prueba en las condiciones descritas en el Ejemplo 12.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención produce exopolisacáridos, p. ej., en donde los exopolisacáridos están unidos a la superficie extracelular de la cepa bacteriana. En ciertas realizaciones, la producción de los exopolisacáridos unidos aumenta la adhesión de la cepa bacteriana para usar en la invención al moco o a la superficie de las células epiteliales, por ejemplo, las células epiteliales intestinales humanas. En una realización preferida, la cepa bacteriana para uso en la invención produce más exopolisacáridos de superficie unida en comparación con Bifidobacterias, en particular B. breve.

En una realización preferida, la cepa bacteriana para uso en la invención tanto tiene una baja adherencia a células epiteliales intestinales humanas, en particular las células Caco-2, en YCFA en comparación con Bifidobacteria, en particular B. breve (tales como adherencia de menos de 1% del cultivo total, tal como preferiblemente menos del 0,5% o menos del 0,3%, cuando se prueba en las condiciones descritas en el Ejemplo 12), y produce más exopolisacáridos de superficie unida en comparación con las Bifidobacterias, en particular B. breve.

En ciertas realizaciones preferidas, la cepa bacteriana para uso en la invención es capaz de fermentar el polisacárido rafinosa, por ejemplo, cuando se cultivan en un medio de suspensión apropiado (tal como medio de suspensión API) a 37°C durante 4 h.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención ha reducido la capacidad de fermentar a-glucosidasa y/o p-glucosidasa en comparación con Bifidobacteria, en particular B. breve, por ejemplo, cuando se cultivan en un apropiado medio de suspensión (tal como medio de suspensión API) a 37°C durante 4 h.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención comprende uno o más de los genes enumerados en la Tabla 1, tales como 5, 10, 20, 50 o todos los genes en la Tabla 1. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención comprende uno o más de los genes enumerados en la Tabla 1 que están resaltados con un subrayado único, como el componente transmembrana BL0694 del módulo de activación del transportador de ECF predicho y/o el componente ATPasa duplicado BL0693 del módulo de activación del transportador de ECF predicho. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención comprende uno o más de los genes enumerados en la Tabla 1 que están resaltados con doble subrayado y en negrita, tales como 1,2,3, 4 o 5 genes seleccionados de: maltodextrina glucosidasa (EC 3,2,1,20), galactosidasa putativa, celulosa sintasa (formadora de UDP) (EC 2,4,1,12), quitinasa (EC 3,2,1,14) y caja sensorial/proteína de la familia GGDEF. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para usar en la invención comprende uno o más de los genes enumerados en la Tabla 1 que están resaltados en cursiva, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 genes seleccionados de: subunidad de ácido graso poliinsaturado sintasa omega-3 PfaA, poliquétido sintasa tipo I, glucosilo hidrolasa putativa de función desconocida (DUF1680), componente ATPasa BioM del módulo energizante del transportador ECF de biotina, familia de ATPasa E1-E2 transportadora de cationes, proteína de permeasa del sistema de transporte Ribosa RbsC (TC 3.A,1,2,1), proteína de unión al ATP del sistema de transporte Ribosa ABC RbsA (TC 3.A,1,2,1), oligoribonucleasa 3'-a-5' (orn), relacionada con la proteína de membrana a la proteína Actinobacillus (1944168).

En realizaciones preferidas, la cepa bacteriana para uso en la invención comprende uno o más (p. ej., 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50 o todos) genes seleccionados de: 2-succinilo 5-enolpiruvilo-6-hidroxi-3-ciclohexeno-1-ácido carboxílico sintasa (EC 2,2,1,9); oligoribonucleasa 3' a 5' (orn); Alfa-galactosidasa (EC 3,2,1,22); Componente ATPasa del módulo de energización general de transportadores ECF; componente ATPasa STY3233 del módulo de activación del transportador ECF regulado por queuosina; ADN helicasa dependiente de ATP recG (EC 3,6,1.-); Beta-glucosidasa (EC 3,2,1,21); Celulosa sintasa (formadora de UDP) (EC 2,4,1,12); Quitinasa (EC 3,2,1,14); COG1309: regulador transcripcional; D-alanilo-D-alanina carboxipeptidasa (EC 3,4,16,4); Componente ATPasa duplicado BL0693 del módulo de activación del transportador de ECF predicho; Fructoquinasa (EC 2,7,1,4); Glucosa/manosa: Symporter H+ GlcP; Glicosiltransferasa (EC 2,4,1.-); GMP sintasa [glutamina-hidrolizante] (EC 6,3,5,2); quinasa de azúcar hipotética en clúster con indigoidina sintasa indA, familia de quinasas PfkB; Inosina-uridina que prefiere la hidrolasa de nucleósido (EC 3,2,2,1); Proteína ribosómica L31p @ LSU proteína ribosómica LSU L31p, independiente del zinc; Proteína ribosómica L33p @ LSU proteína ribosómica LSU L33p, independiente del zinc; maltodextrina glucosidasa (EC 3,2,1,20); Proteína de membrana, relacionada con la proteína Actinobacillus (1944168); Precursor de transglucosilasa D de mureína lítica unida a membrana (EC 3,2,1.-); Metiltransferasa (EC 2,1,1.-); Butanol deshidrogenasa A dependiente de NADH (EC 1,1,1.-); Fosfoglicolato fosfatasa (EC 3,1,3,18); Fosforibosilantranilato isomerasa (EC 5,3,1,24); Glucosilo hidrolasa putativa de función desconocida (DUF1680); Permeasa de translocación de polisacárido que contiene ramnosa; Riboquinasa (EC 2,7,1,15); Sistema de transporte Ribosa ABC, proteína de unión a ATP RbsA (TC 3.A,1,2,1); Sistema de transporte Ribosa ABC, proteína de unión a ATP RbsA (TC 3.A,1,2,1); Sistema de transporte Ribosa ABC, RbsD de permeasa de alta afinidad (TC 3.A,1,2,1); Sistema de transporte de ribosa ABC, proteína de unión a ribosa periplásmica RbsB (TC 3.A,1,2,1); Sistema de transporte Ribosa ABC, proteína permease RbsC (TC 3.A,1,2,1); Sistema de transporte Ribosa ABC, proteína permeasa RbsC (TC 3.A,1,2,1); Sorbitol deshidrogenasa (EC 1,1,1,14); SSU proteína ribosomal S14p (S29e) @ SSU proteína ribosomal S14p (S29e), independiente del zinc; componente STY3230 específico del sustrato del transportador ECF regulado por queuosina; Sacarosa-6-fosfato hidrolasa (EC 3,2,1.B3); Proteína de unión a ATP de exportación de ácido teicoico TagH (EC 3,6,3,40); Componente transmembrana BL0694 del módulo energizante del transportador ECF predicho; Componente transmembrana STY3231 del módulo energizante del transportador ECF regulado por queuosina; Regulador de respuesta de dos componentes colocalizado con transportador HrtAB; Sistema de restricción-modificación de tipo I, subunidad de ADN-metiltransferasa M (EC 2,1,1,72); Sistema de restricción-modificación de tipo I, subunidad de restricción R(EC 3,1,21,3); Sistema de restricción-modificación tipo I, subunidad de especificidad S (EC 3,1,21,3); Sistema de restricción-modificación tipo I, subunidad de especificidad S (EC 3,1,21,3); Sistema de modificación de la restricción de tipo I, subunidad de especificidad S(EC 3,1,21,3); Xilitol deshidrogenasa (EC 1,1,1,9); y transportador Xilosa ABC, proteína de unión a xilosa periplásmica XylF. En realizaciones preferidas, la cepa bacteriana para usar en la invención comprende uno o más genes (como 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o todos) que se enumeran en la oración anterior y que no se destacan en la Tabla 1.

Usos terapéuticos

Como se demuestra en los ejemplos, las composiciones bacterianas de la invención son eficaces para la reducción de la respuesta inflamatoria Th 17. En particular, el tratamiento con composiciones de la invención logra una reducción en los niveles de IL-17A y otras citocinas de la ruta Th17, y mejoras clínicas en modelos animales de afecciones mediadas por IL-17 y la ruta Th17. Por lo tanto, las composiciones descritas en el presente documento pueden ser útiles para tratar o prevenir enfermedades inflamatorias y autoinmunes, y en particular enfermedades o afecciones mediadas por IL-17. En particular, las composiciones descritas en el presente documento pueden ser útiles para reducir o prevenir la elevación de la respuesta inflamatoria de IL-17.

Las células Th17 son un subconjunto de células T auxiliares que producen, p. ej., IL-17A, IL17-F, IL-21 e IL-22. La diferenciación de células Th17 y la expresión de IL-17 pueden ser conducidas por IL-23. Estas citocinas y otras forman partes importantes de la vía Th17, que es una vía de señalización inflamatoria bien establecida que contribuye y subyace a una serie de enfermedades inflamatorias y autoinmunes (como se describe, p. ej., [18-23]). Las enfermedades en las que se activa la ruta Th17 son enfermedades mediadas por la ruta Th17. Las enfermedades mediadas por la vía Th17 pueden mejorarse o aliviarse reprimiendo la vía Th17, que puede ser a través de una reducción en la diferenciación de las células Th17 o una reducción en su actividad o una reducción en el nivel de las citocinas de la vía Th17. Las enfermedades mediadas por la vía Th17 pueden caracterizarse por el aumento de los niveles de citocinas producidas por las células Th17, como IL-17A, IL-17f , IL-21, IL-22, IL-26, IL-9 (revisado en [24]). Las enfermedades mediadas por la vía Th17 pueden caracterizarse por una mayor expresión de genes relacionados con Th-17, como Stat3 o IL-23R. Las enfermedades mediadas por la vía Th17 pueden estar asociadas con mayores niveles de células Th17.

La IL-17 es una citocina proinflamatoria que contribuye a la patogénesis de varias enfermedades y afecciones inflamatorias y autoinmunes. IL-17 como se usa en el presente documento puede referirse a cualquier miembro de la familia IL-17, incluidos IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E e IL-17F. Las enfermedades y afecciones mediadas por IL-17 se caracterizan por una alta expresión de IL-17 y/o la acumulación o presencia de células positivas para IL-17 en un tejido afectado por la enfermedad o afección. De manera similar, las enfermedades y afecciones mediadas por IL-17 son enfermedades y afecciones que se ven exacerbadas por los altos niveles de IL-17 o un aumento en los niveles de IL-17, y que se alivian con bajos niveles de IL-17 o una reducción en los niveles de IL-17. La respuesta inflamatoria de IL-17 puede ser local o sistémica.

Los ejemplos de enfermedades y afecciones que pueden estar mediadas por IL-17 o la ruta Th17 incluyen esclerosis múltiple; artritis, tal como artritis reumatoide, osteoartritis, artritis psoriásica o artritis idiopática juvenil; neuromielitis óptica (enfermedad de Devic); espondilitis anquilosante; espondiloartritis; psoriasis; lupus eritematoso sistémico; enfermedad inflamatoria intestinal, como enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa; enfermedad celíaca; asma, tal como asma alérgica o asma neutrofílica; Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC); cáncer, como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón o cáncer de ovario; uveítis; escleritis; vasculitis; Enfermedad de Behcet; aterosclerosis; dermatitis atópica; enfisema; periodontitis rinitis alérgica; y rechazo de aloinjerto.

La vía de IL-17 y Th17 se asocian a menudo con enfermedades inflamatorias y autoinmunes crónicas, por lo que las composiciones descritas en el presente documento pueden ser particularmente útiles para tratar o prevenir enfermedades o afecciones crónicas como se enumeran anteriormente. En ciertas realizaciones, las composiciones son para uso en pacientes con enfermedad crónica. En ciertas realizaciones, las composiciones son para uso en la prevención del desarrollo de enfermedades crónicas.

En ciertas realizaciones, el tratamiento con composiciones de la invención proporciona una reducción o previene una elevación en los niveles de IL-17, en particular, los niveles de IL-17A. En ciertas realizaciones, el tratamiento con composiciones de la invención proporciona una reducción o evita una elevación en los niveles de IFN-y, IL-1 p, RANTES, MIP-1a, IL-8 o IL-6. Dicha reducción o prevención de niveles elevados de estas citocinas puede ser útil para tratar o prevenir enfermedades y afecciones inflamatorias y autoinmunes, en particular las mediadas por IL-17 o la vía Th17.

En ciertas realizaciones, el tratamiento con las composiciones de la invención proporciona un bloque de la unión a o la invasión de células humanas, por ejemplo, células epiteliales humanas por células patógenas, p. ej., E. coli y/o S. enteritidis.

En ciertas realizaciones, el tratamiento con las composiciones de la invención reduce o impide la unión de células patógenas, por ejemplo E. coli y/o S. enteritidis, a las células epiteliales humanas, por ejemplo, células epiteliales intestinales humanas.

En ciertas realizaciones, la producción y liberación de exopolisacáridos por las cepas bacterianas de las composiciones de la invención pueden tener efectos protectores contra especies patógenas, por ejemplo E. coli y/o S. enteritidis. En ciertas realizaciones, la producción y liberación de exopolisacáridos por las cepas bacterianas de las composiciones de la invención puede mediar el efecto de las bacterias en la vía iL-17 o Th17 y puede influir en la respuesta inmune del huésped. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para uso en la producción de exopolisacáridos en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes, y en particular enfermedades o afecciones mediadas por IL-17.

En ciertas realizaciones, la baja adherencia a las células epiteliales intestinales humanas, en particular las células Caco-2, de las cepas bacterianas de las composiciones de la invención pueden aumentar el efecto beneficioso de las composiciones de la invención en la IL-17 o la vía Th17 y en enfermedades mediadas por IL-17 o la vía Th17.

En ciertas realizaciones, el tratamiento con composiciones de la invención proporciona una mayor fermentación de rafinosa en el intestino. Los ejemplos demuestran que las cepas bacterianas de las composiciones de la invención fermentan el polisacárido rafinosa, y la fermentación de la rafinosa puede conferir efectos sobre el huésped tales como un aumento de butirato cecal y una mayor proliferación gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para aumentar la fermentación de rafinosa en el intestino en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes, y en particular enfermedades o afecciones mediadas por IL-17.

Asma

En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para uso en el tratamiento o la prevención del asma neutrofílica. Los ejemplos demuestran que las composiciones de la invención logran una reducción en el reclutamiento de neutrófilos y/o eosinófilos en las vías respiratorias después de la sensibilización y el desafío con el extracto de ácaros del polvo doméstico, por lo que pueden ser útiles en el tratamiento o prevención del asma. El asma es una enfermedad crónica caracterizada por inflamación y restricción de las vías respiratorias. La inflamación en el asma puede estar mediada por células IL-17 y/o Th17, por lo que las composiciones descritas en el presente documento pueden ser particularmente eficaces para prevenir o tratar el asma. La inflamación en el asma puede estar mediada por eosinófilos y/o neutrófilos.

En ciertas realizaciones, el asma es eosinofílica o asma alérgica. El asma eosinofílica y alérgica se caracteriza por un mayor número de eosinófilos en la sangre periférica y en las secreciones de las vías respiratorias y se asocia patológicamente con el engrosamiento de la zona de la membrana basal y farmacológicamente por la capacidad de respuesta a los corticosteroides [25]. Las composiciones que reducen o inhiben el reclutamiento o activación de eosinófilos pueden ser útiles para tratar o prevenir el asma eosinófilo y alérgico.

[0062] El asma eosinofílica y neutrofílica no son condiciones y tratamientos mutuamente excluyentes que ayudan a abordar las respuestas de eosinófilos y neutrófilos pueden ser útiles para tratar el asma en general.

[0064] En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento son para uso en los métodos de reducción de una eosinofílica respuesta inflamatoria en el tratamiento o prevención de asma eosinofílico. Como se señaló anteriormente, los altos niveles de eosinófilos en el asma se asocian patológicamente con el engrosamiento de la zona de la membrana basal, por lo que la reducción de la respuesta inflamatoria eosinofílica en el tratamiento o la prevención del asma puede abordar específicamente esta característica de la enfermedad. Además, los neutrófilos elevados, ya sea en combinación con eosinófilos elevados o en su ausencia, se asocia con asma grave y estrechamiento crónico de las vías respiratorias. Por lo tanto, reducir la respuesta inflamatoria neutrofílica puede ser particularmente útil para tratar el asma grave.

En ciertas realizaciones, las composiciones reducen la infiltración peribronquial en el asma alérgica, o son para uso en la reducción de la infiltración peribronquial en el tratamiento de asma alérgica.

En ciertas realizaciones, el tratamiento con composiciones de la invención proporciona una reducción o previene una elevación en niveles de IL-1p, IFNy, RANTES, MIP-1a o IL-8.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en un método para tratar el asma neutrofílica que resulta en una reducción de la respuesta inflamatoria eosinoílica y/o neutrofílica. En ciertas realizaciones, el paciente a tratar tiene, o se ha identificado previamente que tiene, niveles elevados de neutrófilos o eosinófilos, p. ej., según se identifica mediante muestreo de sangre o análisis de esputo.

Las composiciones de la invención pueden ser útiles para prevenir el desarrollo de asma alérgico o eosinofílico en un recién nacido cuando se administra a un recién nacido o a una mujer embarazada. Las composiciones pueden ser útiles para prevenir el desarrollo de asma en niños. Las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir el asma neutrofílica de inicio en adultos. Las composiciones de la invención pueden ser útiles para controlar o aliviar el asma neutrofílica. Las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para reducir los síntomas asociados con el asma que se agrava por los alérgenos, tales como los ácaros del polvo doméstico.

El tratamiento o la prevención del asma pueden referirse, p. ej., a un alivio de la gravedad de los síntomas o una reducción en la frecuencia de exacerbaciones o el rango de desencadenantes que son un problema para el paciente.

En ciertas realizaciones, el tratamiento con composiciones de la invención proporciona una reducción de las concentraciones de fenilalanina y/o histidina, p. ej., en los intestinos o en el plasma. Los ejemplos demuestran que las cepas bacterianas de las composiciones de la invención dieron positivo para la fermentación de aminoácidos, que incluyen fenilalanina e histidina, y se ha informado que el aumento de las concentraciones plasmáticas de fenilalanina e histidina se asocia con efectos adversos en el asma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para reducir la hiperreactividad de las vías respiratorias asociadas con el asma.

En ciertas realizaciones, el tratamiento con composiciones de la invención proporciona una reducción en las concentraciones de galactosa y/o fructosa, por ejemplo en los intestinos. Los ejemplos demuestran que las cepas bacterianas de las composiciones de la invención fermentan sustratos de carbohidratos que incluyen galactosa y fructosa, y la galactosa a-1,3-galactosa derivada de fuentes de carne es un alérgeno conocido y agente causante de anafilaxia, y niveles de ingesta de fructosa en la dieta están correlacionados con una mayor gravedad del asma.

Modos de administración

Preferiblemente, las composiciones de la invención son para ser administradas al tracto gastrointestinal con el fin de permitir la entrega y colonización/o parcial o total del intestino con la cepa bacteriana de la invención. Generalmente, las composiciones de la invención se administran por vía oral, pero pueden administrarse por vía rectal, intranasal o por vía bucal o sublingual.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se pueden administrar en forma de espuma, como una pulverización o un gel.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden administrarse como un supositorio, tal como un supositorio rectal, por ejemplo, en forma de un aceite de teobroma (manteca de cacao), grasa dura sintética (por ejemplo, Suppocire, Witepsol), glicero-gelatina, polietilenglicol o composición de glicerina de jabón.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención se administra en el tracto gastrointestinal a través de un tubo, tal como un tubo nasogástrico, sonda orogástrica, tubo gástrico, tubo de yeyunostomía (tubo J), gastrostomía endoscópica percutánea (PEG), o un puerto, como un puerto de pared torácica que proporciona acceso al estómago, el yeyuno y otros puertos de acceso adecuados.

Las composiciones de la invención pueden administrarse una vez, o se pueden administrar de forma secuencial como parte de un régimen de tratamiento. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención deben administrarse diariamente.

En ciertas realizaciones de la invención, el tratamiento según la invención está acompañada por la evaluación de la microbiota intestinal del paciente. El tratamiento puede repetirse si no se logra el suministro y/o la colonización parcial o total con la cepa de la invención de manera que no se observe la eficacia, o el tratamiento puede cesar si el suministro y/o la colonización parcial o total es exitosa y se observa la eficacia.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención puede administrarse a un animal preñado, p. ej., un mamífero tal como un ser humano para evitar que se desarrolle una enfermedad inflamatoria o autoinmune en su hijo en el útero y/o después de que nazca.

Las composiciones de la invención pueden administrarse a un paciente que ha sido diagnosticado con una enfermedad o afección mediada por IL-17 o la vía Th17, o que se ha identificado como en riesgo de una enfermedad o afección mediada por IL-17 o la vía Th17. Las composiciones también pueden administrarse como una medida profiláctica para prevenir el desarrollo de enfermedades o afecciones mediadas por IL-17 o la vía Th17 en un paciente sano.

Las composiciones de la invención se pueden administrar a un paciente que ha sido identificado por tener una microbiota intestinal anormal. Por ejemplo, el paciente puede haber reducido o ausentado colonización por la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42380.

Las composiciones de la invención se pueden administrar como un producto alimenticio, como un suplemento nutricional.

En general, las composiciones de la invención son para el tratamiento de humanos, aunque pueden usarse para tratar animales que incluyen mamíferos monogástricos tales como aves de corral, cerdos, gatos, perros, caballos o conejos. Las composiciones de la invención pueden ser útiles para mejorar el crecimiento y el rendimiento de los animales. Si se administran a animales, se puede usar sonda oral.

Composiciones

Generalmente, la composición de la invención comprende bacterias. En realizaciones preferidas de la invención, la composición se formula en forma liofilizada. Por ejemplo, la composición de la invención puede comprender gránulos o cápsulas de gelatina, por ejemplo, cápsulas de gelatina dura, que comprenden una cepa bacteriana de la invención.

Preferiblemente, la composición de la invención comprende bacterias liofilizadas. La liofilización de bacterias es un procedimiento bien establecido y se dispone de orientación relevante en, p. ej., referencias [51-53].

Alternativamente, la composición de la invención puede comprender un cultivo bacteriano vivo y activo.

En realizaciones preferidas, la composición de la invención se encapsula para permitir el suministro de la cepa bacteriana al intestino. La encapsulación protege la composición de la degradación hasta la entrega en la ubicación diana a través, p. ej., de la ruptura con estímulos químicos o físicos como la presión, la actividad enzimática o la desintegración física, que pueden desencadenarse por cambios en el pH. Se puede usar cualquier método de encapsulación apropiado. Las técnicas de encapsulación ejemplares incluyen atrapamiento dentro de una matriz porosa, unión o adsorción en superficies de soporte sólidas, autoagregación por floculación o con agentes de reticulación y contención mecánica detrás de una membrana microporosa o una microcápsula. La orientación sobre la encapsulación que puede ser útil para preparar composiciones de la invención está disponible, p. ej., en las referencias [54] y [55].

La composición se puede administrar por vía oral y puede estar en la forma de un comprimido, cápsula o polvo. Se prefieren los productos encapsulados porque la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 puede ser un anaerobio. Se pueden incluir otros ingredientes (como la vitamina C, por ejemplo), como captadores de oxígeno y sustratos prebióticos para mejorar el suministro y/o la colonización parcial o total y la supervivencia in vivo. Alternativamente, la composición probiótica de la invención puede administrarse por vía oral como un alimento o producto nutricional, tal como leche o lácteos fermentados a base de suero producto, o como producto farmacéutico.

La composición puede formularse como un probiótico.

Una composición de la invención incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de una cepa bacteriana de la invención. Una cantidad terapéuticamente efectiva de una cepa bacteriana es suficiente para ejercer un efecto beneficioso sobre un paciente. Una cantidad terapéuticamente efectiva de una cepa bacteriana puede ser suficiente para dar lugar a la administración y/o colonización parcial o total del intestino del paciente.

Una dosis diaria adecuada de la bacteria, por ejemplo, para un humano adulto, puede ser de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias (CFU); p. ej., de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1010 CFU; en otro ejemplo de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1010 CFU.

En ciertas realizaciones, la composición contiene la cepa bacteriana en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1011 CFU/g, con respecto al peso de la composición; p. ej., de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1010 CFU/g. La dosis puede ser, p. ej., 1 g, 3 g, 5 g y 10 g.

Típicamente, un probiótico, tal como la composición de la invención, se combina opcionalmente con al menos un compuesto prebiótico. Un compuesto prebiótico suele ser un carbohidrato no digerible, como un oligo o polisacárido, o un alcohol de azúcar, que no se degrada ni se absorbe en el tracto digestivo superior. Los prebióticos conocidos incluyen productos comerciales tales como inulina y transgalacto-oligosacáridos.

En ciertas realizaciones, la composición probiótica de la presente invención incluye un compuesto prebiótico en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 30% en peso, con respecto a la composición de peso total (p. ej., de 5 a 20% en peso). Los carbohidratos se pueden seleccionar del grupo que consiste en: fructooligosacáridos (o FOS), fructo-oligosacáridos de cadena corta, inulina, isomalt-oligosacáridos, pectinas, xilooligosacáridos (o XOS), quitosano-oligosacáridos (o COS), beta-glucanos, goma de almendra modificada y almidones resistentes, polidextrosa, D-tagatosa, fibras de acacia, algarroba, avena y fibras cítricas. En un aspecto, los prebióticos son los fructo-oligosacáridos de cadena corta (por simplicidad mostrada a continuación como FOSs-c.c); dichos FOSsc.c no son carbohidratos digeribles, generalmente obtenidos por la conversión del azúcar de remolacha e incluyen una molécula de sacarosa a la que se unen tres moléculas de glucosa.

Las composiciones de la invención pueden comprender excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de tales excipientes adecuados se pueden encontrar en la referencia [56]. Los vehículos o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, p. ej., en la referencia [57]. Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua. La elección del vehículo farmacéutico, excipiente o diluyente se puede seleccionar con respecto a la ruta de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además del vehículo, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante(s) adecuado, lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento, agente(s) solubilizante(s). Los ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. Se pueden proporcionar conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes aromatizantes en la composición farmacéutica. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.

Las composiciones de la invención pueden formularse como un producto alimenticio. Por ejemplo, un producto alimenticio puede proporcionar un beneficio nutricional además del efecto terapéutico de la invención, como en un suplemento nutricional. De manera similar, un producto alimenticio puede formularse para mejorar el sabor de la composición de la invención o para hacer que la composición sea más atractiva para el consumo al ser más similar a un producto alimenticio común, que a una composición farmacéutica. En ciertas realizaciones, la composición de la invención se formula como un producto a base de leche. El término "producto a base de leche" significa cualquier producto a base de leche o suero líquido o semisólido que tiene un contenido variable de grasa. El producto a base de leche puede ser, p. ej., leche de vaca, leche de cabra, leche de oveja, leche desnatada, leche entera, leche recombinada a partir de leche en polvo y suero sin ningún procesamiento, o un producto procesado, como yogur, leche cuajada, cuajada, leche agria, leche entera agria, leche de mantequilla y otros productos de leche agria. Otro grupo importante incluye las bebidas lácteas, como las bebidas de suero, las leches fermentadas, las leches condensadas, las leches infantiles o para bebés; leches aromatizadas, helados; alimentos que contienen leche, como dulces.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención contienen una sola cepa o especie bacteriana y no contienen ninguna otra cepa o especie bacteriana. Dichas composiciones pueden comprender solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de otras cepas o especies bacterianas. Dichas composiciones pueden ser un cultivo que esté sustancialmente libre de otras especies de organismos.

Las composiciones para uso de acuerdo con la invención pueden o pueden no requerir la aprobación de comercialización.

En algunos casos, la cepa bacteriana liofilizada se reconstituye antes de la administración. En algunos casos, la reconstitución es mediante el uso de un diluyente descrito aquí.

Las composiciones de la invención pueden comprender excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cantidad de la cepa bacteriana es de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias por gramo con respecto al peso de la composición.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la composición se administra a una dosis de 1 g, 3 g, 5 g o 10 g.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la composición se administra mediante un método seleccionado del grupo que consiste en oral, rectal, subcutáneo, nasal, bucal y sublingual.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un vehículo seleccionado del grupo que consiste en lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol y sorbitol.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un diluyente seleccionado del grupo que consiste en etanol, glicerol y agua.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste en almidón, gelatina, glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorante de maíz, acacia, tragacanto, sodio alginato, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio y cloruro de sodio.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende además al menos uno de un conservante, un antioxidante y un estabilizador.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un conservante seleccionado del grupo que consiste en benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde dicha cepa bacteriana se liofiliza.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde cuando la composición se almacena en un recipiente sellado a aproximadamente 4°C o aproximadamente 25°C y el recipiente se coloca en una atmósfera que tiene una humedad relativa del 50%, a al menos el 80% de la cepa bacteriana, medida en unidades formadoras de colonias, permanece después de un período de al menos aproximadamente: 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año, 1,5 años, 2 años, 2,5 años o 3 años.

Métodos de cultivo

Las cepas bacterianas para uso en la presente invención pueden cultivarse usando técnicas de microbiología estándar como se detalla, p. ej., en las referencias [58-60].

[0135] El medio sólido o líquido utilizado para el cultivo puede ser agar YCFA o medio YCFA. El medio YCFA puede incluir (por 100 ml, valores aproximados): casitona (1,0 g), extracto de levadura (0,25 g), NaHCO3 (0,4 g), cisteína (0,1 g), K2HPO4 (0,045 g), KH2PO4 (0,045 g), NaCl (0,09 g), (NH4)2SO4 (0,09 g), MgSO4-7H2O (0,009 g), CaCl2 (0,009 g), resazurina (0,1 mg), hemina (1 mg), biotina (1 pg), cobalamina (1 pg), ácido p-aminobenzoico (3 pg), ácido fólico (5 pg) y piridoxamina (15 pg).

General

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véanse, p. ej., las referencias [61] y [62-68], etc.

El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo. una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, p. ej., X Y.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, p. ej., x + 10%.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos significa que, cuando están alineadas, ese porcentaje de nucleótidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se pueden determinar utilizando programas de software conocidos en la técnica, p. ej., los descritos en la sección 7,7,18 de la ref. [69] El algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman determina una alineación preferida usando una búsqueda de espacio afín con una penalización de espacio abierto de 12 y una penalización de extensión de espacio de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología SmithWaterman se describe en la ref. [70]

A menos que se indique específicamente, un proceso o método que comprende numerosos pasos puede comprender pasos adicionales al principio o al final del método, o puede comprender pasos de intervención adicionales. Además, los pasos se pueden combinar, omitir o realizar en un orden alternativo, si corresponde.

En este documento se describen diversas realizaciones de la invención. Se apreciará que las características especificadas en cada realización pueden combinarse con otras características especificadas, para proporcionar realizaciones adicionales. En particular, las realizaciones resaltadas aquí como adecuadas, típicas o preferidas pueden combinarse entre sí (excepto cuando son mutuamente excluyentes).

Ejemplo 1 - Eficacia de los inóculos de bacterias en un modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico

Resumen

Los ratones fueron administrados con composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención y fueron posteriormente desafiados con extracto de ácaros del polvo doméstico (HDM) para producir una respuesta inflamatoria alérgica. La respuesta inflamatoria a HDM incluye componentes eosinofílicos y neutrofílicos, está mediada por IL-17 y la vía Th17, y es un modelo para el asma. La magnitud y las características de la respuesta inflamatoria exhibida por los ratones tratados con las composiciones de la invención se compararon con los grupos de control. Se encontró que las composiciones de la invención alivian la respuesta inflamatoria y reducen el reclutamiento de eosinófilos y neutrófilos, lo que indica que pueden ser útiles para tratar afecciones mediadas por IL-17 tales como eosinofilia, neutrofilia y asma.

Cepa

751: bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380.

Diseño del estudio:

Grupos:

1. Grupo de control negativo. Tratamiento con control del vehículo (por vía oral).

4. Tratamiento con cepa 751 de inóculo bacteriano terapéutico (por vía oral).

7. Grupo de control positivo. Tratamiento con dexametasona (i.p.).

8. Grupo de control no tratado.

Número de ratones por grupo = 5.

Día -14 a día 13: Administración diaria de control del vehículo por vía oral (Grupo 1).

Día -14 a día 13: Administración diaria de inóculo terapéutico de bacterias por vía oral (Grupo 2-6).

Día 0, 2, 4, 7, 9, 11 Administración de 15ug HDM (extracto de ácaros del polvo doméstico - Número de catálogo: XPB70D3A25, Número de lote: 231897, Greer Laboratories, Lenoir, NC, e E.UU.) En un volumen de 30ul PBS por nasal (Grupo 1-8).

Día 0, 2, 4, 7, 9, 11 Administración de dexametasona (ip, 3 mg/kg, Sigma-Aldrich, número de catálogo D1159) (Grupo 7).

Día 14 Sacrificio de todos los animales para análisis.

Número total de ratones = 40.

Criterios de valoración y análisis

El día 14 se sacrificaron los animales mediante inyección intraperitoneal letal con pentabarbitol (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) inmediatamente seguido de un lavado broncoalveolar (BAL).

Las células fueron aisladas de los recuentos de células de fluido y diferenciales BAL (lavado broncoalveolar) realizados (200 células cuentas/muestras).

Material y Métodos

Ratones. Se compraron ratones BALB/c hembra de 7 semanas de edad de Charles River Laboratories y se asignaron aleatoriamente a jaulas con un total de 5 ratones por jaula (jaulas ventiladas obtenidas de Indulab AG, Gams, Suiza Tipo de jaula: "The SealsafeTM - IVC cage. Número de producto 1248L). Las jaulas se etiquetaron con el número de estudio, el número de grupo y la fecha de inicio experimental. Los ratones se monitorearon semanalmente y se aclimataron a la instalación durante 7 días antes del inicio del estudio (Día de estudio -14). Los animales tenían 8 semanas de edad el día de estudio -14. Agua potable y alimentos disponibles a voluntad. Enriquecimiento de la jaula. El cuidado diario de los animales se realizó según el número de licencia de autorización local 2283,1 (emitido y aprobado por: Servicio de Consumo y Asuntos Veterinarios del Cantón de Vaud). Agua potable y alimentos estaban disponibles ad libitum y se actualizaban una vez al día. El enriquecimiento de la jaula estaba presente. Las regulaciones de bienestar animal fueron observadas según lo dispuesto por las autoridades oficiales de Suiza bajo la ordenanza 455,163 de la FVO (Oficina Veterinaria Federal) sobre cría de animales de laboratorio, producción de animales genéticamente modificados y métodos de experimentación animal.

Cultivo de inóculo bacteriano. Dentro de una estación de trabajo estéril, se descongeló un criovial de bacterias calentándolo con una mano enguantada y se inyectaron ~ 0,7 ml de contenido en un tubo Hungate (Número de Cat., 1020471, Glasgeratebau Ochs, Bovenden-Lenglern, Alemania), que contenía 8 ml de anaeróbico YCFA Por lo general, se prepararon dos tubos por cepa. Los tubos de Hungate se incubaron luego (estática) a 37°C durante 16 H(cepa 751).

Cultivo del control del vehículo. Se incubó un tubo Hungate que contenía 8 ml de YCFA anaeróbico (estático) a 37°C durante 16 h.

Administración de inoculo bacteriano o control de vehículo. Se administraron 400 ul de inóculo de bacterias cultivadas o control de vehículo por día por sonda oral.

Sensibilización intranasal. Los ratones se anestesiaron mediante inyección i.p. con 9,75 mg de xilasol y 48,75 mg de ketasol por kg (Dr. E. Graeub AG, Berna, Suiza) y se administraron con 15 ug de HDM (número de catálogo: XPB70D3A25, número de lote: 231897, Greer Laboratories, Lenoir, NC, EE.UU.) En un volumen de 30ul PBS por nasal.

Preparación y administración del compuesto de control positivo Dexametasona. La dexametasona 21-fosfato sal de disodio (Sigma-Aldrich, número de catálogo D1159, Lote N° SLBD,1030V) se resolvió en H2O y se administra a los animales en una dosis de 3 mg/kg en un volumen de 200 ul por oral en días indicado en el protocolo de estudio anterior.

Procedimiento terminal. El día 14 se sacrificaron los animales mediante inyección i.p. letal con pentabarbitol (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A), seguido inmediatamente por lavado broncoalveolar (BAL) en 500 ul de solución salina.

Medición de infiltrados celulares en BAL. Las células se aislaron del fluido BAL y se realizaron recuentos diferenciales de células en base a criterios morfológicos y citoquímicos estándar.

Gráficos y análisis estadístico. Todos los gráficos se generaron con Graphpad Prism Versión 6 y se aplicó un ANOVA unidireccional. Los resultados del análisis estadístico se proporcionaron con las tablas de datos individuales. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM).

Resultados y análisis

Los resultados de los experimentos se muestran en las Figuras 1-9.

No se observó morbilidad ni mortalidad en los ratones tratados con la bacteria o el vehículo. Los dos controles, el tratamiento del vehículo (control negativo) y el tratamiento con dexametasona (control positivo) se comportaron como se esperaba, con eosinofilia y neutrofilia alteradas observadas después del tratamiento con dexametasona.

Los resultados más importantes de este experimento se muestran en las Figuras 6 y 7, que informan sobre el número total y el porcentaje de neutrófilos detectados en el lavado bronquiolar después del desafío con HDM. La cepa 751 redujo los neutrófilos totales y la proporción de neutrófilos en BAL en relación con el control de solo vehículo.

Ejemplo 2 - Eficacia de los inóculos de bacterias en un modelo de ratón de asma grave neutrofílica Resumen

Los ratones se administraron con composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención y posteriormente se sensibilizaron con las administraciones subcutáneas de extracto de ácaros del polvo doméstico (HDM) y se desafiaron con una administración intranasal de HDM para modelar la respuesta inflamatoria del asma neutrofílica severa. La magnitud y las características de la respuesta inflamatoria exhibida por los ratones tratados con las composiciones de la invención se compararon con los grupos de control. Se encontró que las composiciones de la invención para aliviar la respuesta inflamatoria, y en particular para reducir el reclutamiento de neutrófilos, de una manera comparable con el control positivo que comprende administraciones de anticuerpos anti-IL-17. Por lo tanto, los datos indican que las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar afecciones mediadas por IL-17 y Th17 tales como neutrofilia y asma.

Cepa

751: bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380

Diseño del estudio

Grupos:

4. Tratamiento con inóculo bacteriano terapéutico cepa 751 (por vía oral).

7. Grupo de control positivo. Tratamiento anti-IL-17 (i.p.).

8. Grupo de control no tratado.

9: Ratones sanos (línea de base).

Número de ratones por grupo (Grupo 1-8) = 5

Día -14 al día 17: Administración diaria de control del vehículo por vía oral (Grupo 1).

Día -14 a día 17: Administración diaria de inóculo terapéutico de bacterias por vía oral (Grupo 2-6).

Día 0: Sensibilización con HDM en CFA (s.c.) (Grupo 1-8).

Día 7: Sensibilización con HDM en CFA (s.c.) (Grupo 1-8).

Día 13, 15, 17: Administración de anticuerpo neutralizante anti-IL-17 por i.p. (Grupo 7).

Día 14, 15, 16, 17: Desafío con HDM en 30ul PBS por nasal (Grupo 1-8).

Día 18: Sacrificio de todos los animales para análisis.

Criterios de valoración y análisis:

En el día 14 los animales fueron sacrificados mediante inyección intraperitoneal letal con pentabarbitol (Streuli PharmaAG, Uznach, Cat: 1170139A) seguido inmediatamente por un lavado broncoalveolar (BAL). Las células se aislaron del fluido BAL y se realizaron recuentos de células diferenciales (200 recuentos de células/muestras).

Material y métodos.

Ratones. Se compraron ratones C57BL/6 hembra de 7 semanas de edad de Charles River Laboratories y se asignaron aleatoriamente a jaulas con un total de 5 ratones por jaula (jaulas ventiladas de Indulab AG, Gams, Suiza Tipo de jaula: "The SealsafeTM - IVC cage. Número de producto 1248L). Las jaulas se etiquetaron con el número de estudio, el número de grupo y la fecha de inicio experimental. Los ratones se monitorearon semanalmente y se aclimataron a la instalación durante 7 días antes del inicio del estudio (Día de estudio -14). Los animales tenían 8 semanas de edad el Día de estudio -14. Agua potable y alimentos disponibles a voluntad. Enriquecimiento de la jaula. El cuidado diario de los animales se realizó según el número de licencia de autorización local 2283,1 (emitido y aprobado por: Servicio de Consumo y Asuntos Veterinarios del Cantón de Vaud). Agua potable y alimentos estaban disponibles ad libitum y se actualizaban una vez al día. El enriquecimiento de la jaula estaba presente. Las regulaciones de bienestar animal se observaron según lo dispuesto por las autoridades oficiales de Suiza en virtud de la ordenanza 455,163 del FVO (Oficina Veterinaria Federal) sobre cría de animales de laboratorio, producción de animales genéticamente modificados y métodos de experimentación animal.

Cultivo de inóculo bacteriano. Dentro de una estación de trabajo estéril, se descongeló un criovial de bacterias calentándolo con una mano enguantada y se inyectaron ~ 0,7 ml de contenido en un tubo Hungate (Número de Cat., 1020471, Glasgeratebau Ochs, Bovenden-Lenglern, Alemania), que contenía 8 ml de YCFA anaeróbico. Por lo general, se prepararon dos tubos por cepa. Los tubos de Hungate se incubaron luego (estáticos) a 37°C durante 16 H (cepa 751).

Cultivo de control de vehículos. Se incubó un tubo Hungate que contenía 8 ml de YCFA anaeróbico (estático) a 37°C durante 16 h.

Administración de inóculo bacteriano o control de vehículo. Se administraron 400 ul de inóculo de bacterias cultivadas o control de vehículo por día por sonda oral.

Sensibilización HDM. 50 pg de HDM (Número de catálogo: XPB70D3A25, Número de lote: 231897, Greer Laboratories, Lenoir, NC, EE.UU.) En PBS se emulsionó en un volumen igual de adyuvante completo de Freund (CFA Chondrex Inc. Washington, EE.UU.) y se administró por vía subcutánea en un volumen de 200 pl, dos veces durante dos semanas en flancos opuestos. Una semana después de la segunda inmunización, los ratones se anestesiaron mediante inyección i.p. con 9,75 mg de xilasol y 48,75 mg de ketasol por kg (Dr. E. Graeub AG, Berna, Suiza) y luego recibieron desafíos intranasales de 15 pg de HDM en un volumen de 30ul PBS en 4 días consecutivos. El análisis se realizó un día después del desafío final.

Preparación y administración del compuesto de control positivo anti-anticuerpo IL-17 de ratón. El anticuerpo neutralizante anti-IL-17 se obtuvo de Bio X Cell y se almacenó a 4°C (Clon 17F3, Cat. Número BE0173, Bio X Cell) y se administró por i.p. a una dosis de 12,5 mg/kg en los días indicados en el protocolo de estudio anterior.

Procedimiento terminal. El día 18 se sacrificaron los animales mediante inyección i.p. letal con pentabarbitol (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) inmediatamente seguido de lavado broncoalveolar (BAL) en 500 ul de solución salina.

Gráficos y análisis estadístico. Todos los gráficos se generaron con Graphpad Prism Versión 6 y se aplicó un ANOVA unidireccional. Los resultados del análisis estadístico se proporcionan con las tablas de datos individuales. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM).

Resultados y análisis

Los resultados del experimento se muestran en las Figuras 10-18.

No se observó morbilidad ni mortalidad en los ratones tratados con la bacteria o el vehículo. Como se muestra en las Figuras 15 y 16, la cepa 751 fue altamente eficaz para aliviar la magnitud de la respuesta inflamatoria neutrofílica. De hecho, el tratamiento con la cepa 751 mostró resultados comparables al tratamiento con anticuerpos anti-IL-17. Además, la cepa 751 redujo el número de eosinófilos en relación con los controles, como se muestra en las Figuras 11 y 12.

Ejemplo 3 - Eficacia de los inóculos bacterianos para tratar la artritis en un modelo de ratón con artritis inducida por colágeno tipo II

Materiales y métodos

Cepas

751: bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380

Cultivos bacterianos

Se cultivaron cultivos bacterianos para administración en una estación de trabajo anaeróbica (Don Whitley Scientific).

La cepa bacteriana #751 fue cultivada utilizando reservas de glicerol. Las reservas de glicerol se almacenaron a -80°C. Tres veces por semana, las reservas de glicerol se descongelaron a temperatura ambiente y se tiñeron en placas YCFA. Se usó una nueva alícuota de glicerol en cada ocasión. Se permitió que las bacterias crecieran en una placa dada durante hasta 72 horas.

Las soluciones a administrar a los animales se prepararon dos veces al día con un intervalo de ocho horas para tratamientos de mañana (AM) y tarde (PM). Se recogió una colonia bacteriana de la placa rayada y se transfirió a un tubo que contenía medio YCFA. La cepa bacteriana #751 se dejó crecer durante 16 horas antes de las administraciones de AM. Las bacterias se subcultivaron al 1% en medios YCFA para administraciones de PM. Los valores de OD se registraron para cada cepa después de las preparaciones de tratamiento de mañana y tarde.

Modelo de ratón de artritis inducida por colágeno tipo II

Se asignaron aleatoriamente ratones machos adultos DBA/1 a grupos experimentales y se les permitió aclimatarse durante dos semanas. El día 0, los animales se administraron mediante inyección subcutánea con 100 microlitros de una emulsión que contenía 100 microgramos de colágeno tipo II (CII) en adyuvante incompleto de Freund suplementado con 4 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis H37Ra. El día 21, los animales se administraron mediante inyección subcutánea con una emulsión de refuerzo que contenía 100 pg de colágeno tipo II en adyuvante de Freund incompleto.

Los tratamientos se administraron de acuerdo con el programa de administración a continuación. Desde el día 14 hasta el final del experimento en el día 45, los animales se pesaron tres veces por semana. Desde el día 21 hasta el final del experimento, se calificó a los animales tres veces por semana para que los signos clínicos de artritis incluyeran hinchazón de las patas traseras y delanteras, las articulaciones radiocarpianas (muñeca) y las articulaciones tibio-tarsales (tobillo).

El día 45 se sacrificaron ratones y se tomaron muestras de sangre terminal para análisis de citocinas.

En el día -14, día 0 y día 45, se recogieron muestras fecales para análisis microbiológico, se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -80°C.

El modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (CIA) es un modelo de ratón bien establecido para la artritis reumatoide [71]. La inmunización con CII causa una patogénesis que incluye varias características patológicas importantes de la artritis reumatoide, incluida la hiperplasia sinovial, la infiltración de células mononucleares y la degradación del cartílago. Significativamente, el desarrollo de CIA está mediado por células Th17 a través de la secreción de IL-17A [72]. La respuesta inmune subyacente en el modelo de artritis se ve reforzada por el uso del adyuvante de Freund complementado con Mycobacterium tuberculosis.

En el día 21, se recogieron bazos de tres animales satélites en cada grupo. Las células se cultivaron durante 72 horas en presencia o ausencia de colágeno tipo II. Las citocinas, que incluyen TNF-a, IL-6, IFN-y, IL-4, IL-10 e IL-17, se cuantificaron en los sobrenadantes de cultivo y en suero terminal por Luminex. La proliferación celular se cuantificó usando un método de incorporación de timidina tritiada.

Grupos de tratamiento y dosis

Todos los grupos fueron n = 15 (n= 12 para el grupo principal de estudio y n = 3 para grupos satélite). El vehículo utilizado para la bioterapéutica fue medio de extracto de levadura-ácidos grasos de casitona (YCFA).

Pesos corporales

Desde el día 14 hasta el final del experimento, los animales se pesaron tres veces por semana. Los datos fueron graficados (+ SEM media).

Observaciones clínicas no específicas

Desde el día 14 hasta el final del experimento, los animales se verificaron diariamente para detectar signos clínicos no específicos que incluyan una postura anormal (encorvada), una condición anormal del pelaje (piloerección) y niveles anormales de actividad (reducida o aumento de la actividad).

Observaciones clínicas

Desde el día 21 hasta el final del experimento en el día 45, los animales se puntuaron tres veces por semana para detectar signos clínicos de artritis que incluyan hinchazón de las patas traseras y frontales, las articulaciones radiocarpianas (muñeca) y articulaciones tibio-tarsales (tobillo). Cada miembro se puntuó utilizando la siguiente escala: (0) normal, (1) hinchazón leve, (2) hinchazón suave, (3) hinchazón moderada y (4) hinchazón severa. Se calculó una puntuación clínica sumando cada puntuación de extremidad. La puntuación clínica máxima posible para un animal fue (16). Los animales con un puntaje igual a (12) en dos ocasiones consecutivas y los animales con un puntaje mayor a (12) en cualquier ocasión fueron sacrificados. Los datos fueron graficados (media SEM).

Análisis de proliferación celular

En el día 21, se sacrificaron tres animales satélite por grupo y se diseccionaron los bazos. Las células de bazo se cultivaron durante 72 horas en presencia o ausencia de colágeno tipo II. Después de 72 horas, las células se pulsaron durante la noche en presencia de timidina tritiada. La proliferación celular se cuantificó midiendo la incorporación de timidina. Los datos fueron graficados (media SEM). Se tomaron los sobrenadantes y se evaluó la presencia de citocinas clave.

Análisis de citoquinas

Sobrenadantes terminales de los cultivos de células de bazo se pusieron a prueba con el fin de cuantificar el TNF-a, IL-6, IFN-y, IL- 4, IL-10 e IL-17 por Luminex. Los datos fueron graficados (media SEM).

Análisis microbiológico

En el día 14, día 0 y día 45, se recogieron muestras fecales de cada animal, se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -80°C. Caeca (incluido el contenido) se congeló inmediatamente y se almacenó a -80°C. Una prueba de identificación bacteriana se realizó diariamente mediante el recubrimiento de la bacteria.

Histopatología

Al final del experimento, las patas traseras se almacenaron en fijador de tejido. Las muestras se transfirieron a una solución de descalcificación. Las muestras de tejido se procesaron, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones fueron calificadas por un histopatólogo calificado, ciego al diseño experimental, para que los signos de artritis incluyan inflamación, daño del cartílago articular y daño al hueso metafisario subyacente. Se utilizó un sistema de puntuación detallado (ver más abajo). Los datos fueron graficados (media SEM). Se proporcionaron datos brutos y analizados, así como imágenes representativas.

Tabla 1: Sistema de puntuación de histopatología *123

Grado Descripción

Inflamación

0 Articulación normal

1 Hiperplasia sinovial leve con inflamación dominada por neutrófilos. Bajos números de neutrófilos y macrófagos en el espacio articular.

2 Hiperplasia sinovial con inflamación moderada a marcada que involucra neutrófilos y macrófagos. Neutrófilos y macrófagos en el espacio articular; pueden ser algunos restos de tejido necrótico.

3 Hiperplasia sinovial con marcada inflamación que involucra neutrófilos y macrófagos.

Pérdida de revestimiento de sinoviocitos. La inflamación puede extenderse desde la sinovial al tejido circundante, incluido el músculo. Numerosos neutrófilos y macrófagos en el espacio articular, junto con importantes restos de tejido necrótico._____________ Daño del cartílago articular

0 Articulación normal

1 El cartílago articular muestra solo un cambio degenerativo leve. La formación temprana de pannus puede estar presente periféricamente.

2 El cartílago articular muestra un cambio degenerativo moderado y pérdida focal. La formación de Pannus está presente focalmente.

3 Interrupción significativa y pérdida de cartílago articular con formación extensa de pannus.

Daño al hueso metafisario subyacente

0 Articulación normal

1 Sin cambios en el hueso metafisario subyacente.

2 Puede ser necrosis focal o fibrosis del hueso metafisario.

3 Interrupción o colapso del hueso metafisario. Inflamación extensiva, necrosis o fibrosis _____________ que se extiende al espacio medular de la metafisis______________________________

Resultados y análisis

Supervivencia y observaciones clínicas no específicas

Algunos animales fueron sacrificados antes del final programado del estudio debido a la gravedad de los signos clínicos de artritis o debido a la gravedad de las observaciones clínicas no específicas.

Tres animales fueron sacrificados o encontrados muertos o sacrificados durante el período de pretratamiento (Día -14 al Día 0): un animal en el Grupo 1 (tratado con vehículo, el animal llegó del proveedor con una pierna rota y fue sacrificado) y dos animales en el Grupo 2 (tratamiento Bioterapéutico #751, posible dosificación pulmonar en el primer día de pretratamiento y signos clínicos posteriores a la dosis en el segundo día de pretratamiento).

Ocho animales fueron sacrificados debido a la gravedad de los signos clínicos de artritis: cinco animales en el Grupo 1 (tratados con vehículo) y tres animales en el Grupo 2 (tratados con Bioterapéutico #751).

Cuatro animales fueron sacrificados debido a la severidad de los signos clínicos no específicos, incluyendo postura anormal (encorvada), condición anormal del pelaje (piloerección), niveles anormales de actividad (actividad reducida): tres animales en el Grupo 1 (tratados con vehículo) y un animal en el Grupo 2 (Bioterapéutico #751 tratado).

Pesos corporales

Datos del peso corporal registrados desde el día -14 hasta el día 0 y expresados como un porcentaje de los pesos corporales iniciales (día -14) se analizaron mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba posterior de Dunnett para comparaciones múltiples con el Día -14 y luego para la comparación múltiple con el grupo tratado con vehículo. Los datos se presentan en la Figura 19. Los datos de animales sacrificados antes del final programado del experimento se excluyeron de los análisis.

En comparación con el día 14, las administraciones dos veces al día por sonda oral indujeron una pérdida de peso corporal significativa en el grupo tratado con vehículo el día 9 y el día 7.

Los pesos corporales medidos entre el día 14 y el día -1 en los grupos tratados con bioterapia no diferían de los pesos corporales medidos en el grupo tratado con vehículo en un día determinado.

Los datos de peso corporal registrados desde el día 0 hasta el día 28 y expresados como un porcentaje de los pesos corporales iniciales (día 0) se analizaron mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba posterior de Dunnett para comparaciones múltiples con el día 0 en el grupo de vehículos y luego para comparación múltiple con el grupo tratado con vehículo. Los datos se presentan en la Figura 20. Los datos de animales sacrificados antes del final programado del experimento y de los animales satélite se excluyeron de los análisis. Los datos del día 28, día 35 y día 42 se analizaron adicionalmente mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba posterior de Dunnett para realizar comparaciones múltiples con el grupo tratado con vehículo.

La aparición de signos clínicos de artritis se asoció con una pérdida de peso corporal significativa el día 26 y el día 28 (p <0,0001) en comparación con el día 0 en el grupo tratado con vehículo.

No hubo diferencias significativas entre los grupos experimentales en el día 35 o el día 42.

Observaciones clínicas

Los datos de la puntuación clínica se analizaron mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba posterior de Dunnett para comparaciones múltiples entre días en el grupo tratado con vehículo que para comparaciones múltiples entre grupos experimentales y el grupo tratado con vehículo cada día. Los datos se presentan en la Figura 21. Los datos registrados de animales sacrificados antes del final del experimento se excluyeron del análisis. Cuando los animales fueron sacrificados debido a la gravedad de los signos clínicos de artritis, se informó la última puntuación registrada para los días siguientes y se utilizó en los análisis estadísticos.

Se observó un aumento significativo de las puntuaciones clínicas en el grupo tratado con vehículo desde el día 28 hasta el día 45 (p <0,0001) en comparación con el día 21.

Bioterapéutico #751 indujo una reducción de las puntuaciones clínicas en comparación al grupo tratado con vehículo desde el día 31 hasta el día 45, aunque la diferencia no fue significativa.

Análisis de proliferación celular

Para validar el ensayo, se cultivaron esplenocitos en presencia de anti-CD3 y anti-CD28 solubles (antiCD3/CD28) como estímulos de control positivo para confirmar el potencial proliferativo de las células.

Se observaron fuertes respuestas proliferativas a anti-CD3/CD28 en todos los grupos experimentales, mostrando que las células eran sanas, viables y capaces de responder a las señales de activación.

Para probar la respuesta proliferativa en presencia de colágeno II (CII), se cultivaron esplenocitos en presencia de CII a 50 pg/ml. La respuesta proliferativa de esplenocitos a CII se analizó mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba posterior de Sydak para comparaciones múltiples entre esplenocitos no estimulados y estimulados por CII y ANOVA de una vía seguido de la prueba posterior de Dunnett para comparar la respuesta estimulada por CII en diferentes grupos experimentales con grupo tratado con vehículo. Los datos se presentan en la Figura 22.

CII induce un aumento muy significativo de 3H-timidina (cpm) en comparación con los esplenocitos no estimulados en el grupo tratado con vehículo (p <0,0001).

Los grupos tratados con bioterapéutico #751 demostraron niveles significativamente más bajos de proliferación de esplenocitos inducida por CII que el grupo tratado con vehículo.

Niveles de citocinas en sobrenadantes de cultivo de tejidos

Los niveles de cada citocina se midieron en sobrenadantes de cultivo de tejidos derivados de cultivos estimulados con anti-CD3/CD28 mediante análisis luminex. Estos mostraron respuestas robustas para todas las citocinas medidas (los niveles medios en el grupo de vehículos fueron los siguientes: IL-4 = 6406 pg/ml; IL-6 = 306 pg/ml; IL-10 = 10.987 pg/ml; IL-17A = 11.447 pg/ml; IFN-y = 15.581 pg/ml; TNF-a = 76 pg/ml).

Las siguientes secciones resumen los datos obtenidos de los cultivos estimulados con Colágeno II. En su caso, los análisis estadísticos de las diferencias entre los niveles de citoquinas en los sobrenadantes de esplenocitos no estimulados y estimulados por CII se realizaron utilizando ANOVA de dos vías seguido de la prueba posterior de Sidak para comparaciones múltiples, mientras que se utilizó ANOVA de una vía seguido de la prueba posterior de Dunnett. para la comparación de la respuesta estimulada por CII en grupos tratados con bioterapia con el grupo tratado con vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de citoquinas entre los grupos en ambos casos. Esto probablemente se deba al pequeño tamaño de muestra utilizado (n= 3).

Con el fin de presentar con mayor precisión la distribución de los datos para las citocinas con una distribución sustancial de los datos del documento, estos se presentan como gráficos de dispersión.

Las medias grupales de IL-4 en los sobrenadantes de cultivo de tejidos después de la estimulación con CII fueron <5pg/ml. Estos no se consideran biológicamente significativos y no se incluyen aquí. Las medias grupales de TNF-a en los sobrenadantes de cultivo de tejidos después de la estimulación con colágeno estaban por debajo del límite de cuantificación.

Niveles de sobrenadante de IFN-y (FIG. 23)

Junto con IL-17, IFN-y es la principal enfermedad que conduce a las citocinas en el modelo de la CIA. El diagrama de dispersión en la Figura 23 demuestra los niveles de IFN-y después de la estimulación con CII, siendo la mediana del grupo más alta para el grupo tratado con vehículo en comparación con el bioterapéutico. El resultado atípico del mismo sujeto del grupo 2 es responsable de la mediana más alta en este grupo para IFN-y e IL-10.

Niveles de sobrenadante de IL-17A (FIG. 24)

Los niveles de IL-17A fueron 50 pg/ml en cultivos estimulados con CII para el grupo tratado con vehículo. Los niveles de esta citocina parecían ser más bajos en el grupo bioterapéutico en comparación con el tratado con el vehículo.

Niveles de sobrenadante de IL-10 (FIG. 25)

Los niveles de IL-10 en el grupo tratado con vehículo fueron 13 pg/ml y 2,1 pg/ml para cultivos estimulados con CII y de control de medios, respectivamente. Pueden esperarse niveles más altos de IL-10 (que es una citocina antiinflamatoria) para el grupo tratado con vehículo porque la inflamación y la inducción de citocinas proinflamatorias podrían estar acompañadas por un mecanismo de retroalimentación antiinflamatoria.

Niveles de sobrenadante de IL-6 (FIG. 26)

Las citocinas inflamatorias tales como IL-6 y TNF-a no se producen típicamente a niveles altos en cultivos anti-CII. Sin embargo, sus niveles pueden verse alterados como resultado de la modulación inmune. Los niveles de IL-6 en cultivos estimulados con CII fueron modestos, alcanzando 10pg/ml. Aunque mayor que en los cultivos de control de medios, estas diferencias fueron demasiado pequeñas para proporcionar una justificación para realizar análisis estadísticos.

Análisis microbiológico

El crecimiento bacteriano se confirmó midiendo la densidad óptica a 600 nm usando un espectrofotómetro. La identidad bacteriana se confirmó comparando imágenes de placas rayadas con imágenes de referencia.

Siguiendo el método mejorado de preparación bacteriana, se administraron consistentemente altas dosis de cepa bacteriana desde el día -2 y el día -3 como se indica por los altos valores de OD medidos.

Se recogieron muestras fecales y se congelaron instantáneamente el Día -14, Día 0 y al finalizar.

Histopatología

Los resultados de histopatología se muestran en las Figuras 66-70. Como se esperaba para este modelo, se observó variabilidad intraindividual e interindividual en términos de la presencia/ausencia de artritis o la gravedad del cambio presente.

La naturaleza de la patología fue como se esperaba para este modelo, con una extensa inflamación crónica activa mixta de la sinovial y la bolsa que se extiende para involucrar los tejidos blandos periarticulares (músculo, tejido adiposo, colágeno dérmico). En las articulaciones más severamente afectadas, hubo degeneración y pérdida de cartílago articular con restos intraarticulares e inflamación, y alteración de la estructura articular y ósea por fibrosis e inflamación.

La incidencia de cambios histopatológicos fue: vehículo - 80% (16/20); Bioterapéutico #751 - 45% (9/20). El tratamiento con Bioterapéutico #751 redujo la incidencia de puntajes histopatológicos en las extremidades posteriores del ratón en comparación con el grupo tratado con vehículo (ver Figuras 66-69). Los puntajes de histopatología se analizaron mediante ANOVA unidireccional para datos no paramétricos (prueba de Kruskal-Wallis) seguido de la prueba posterior de Dunn para comparaciones múltiples con el grupo tratado con vehículo. Bioterapéutico #751 indujo una reducción significativa de los puntajes de inflamación articular observados en histopatología en comparación con el grupo tratado con vehículo (p <0,01). Bioterapéutico #751 indujo una reducción significativa de los puntajes de daño de cartílago observados en histopatología en comparación con el grupo tratado con vehículo (p <0,001). Bioterapéutico #751 indujo una reducción significativa de los puntajes de daño óseo observados en histopatología en comparación con el grupo tratado con vehículo (p <0,001). Bioterapéutico #751 indujo una reducción significativa de los puntajes de histopatología total en comparación con el grupo tratado con vehículo (p <0,01).

Resumen

Se observaron puntuaciones clínicas aumentadas desde el día 28 después de la primera administración de colágeno tipo II, como se esperaba en este modelo de artritis en ratones DBA/1. El Bioterapéutico #751 demostró ser efectivo en el tratamiento de la artritis en este modelo y el Bioterapéutico #751 fue efectivo para reducir la severidad de los puntajes clínicos. Bioterapéutico #751 también fue eficaz para reducir la enfermedad patológica en las articulaciones, como se demostró en el análisis histopatológico.

Se observaron respuestas de recuerdo proliferativo al Colágeno II en cultivos de esplenocitos de todos los grupos experimentales. La respuesta específica de colágeno se redujo significativamente después del tratamiento con Bioterapéutico #751 (Grupo 2).

La mayoría de las citocinas de células T probadas mostraron aumentos detectables entre los controles estimulados con Colágeno II y los medios en el grupo tratado con Vehículo. Estos aumentos no fueron tan obvios en el grupo tratado con bioterapia. Esto apoya ampliamente las respuestas de recuerdo proliferativo al Colágeno II descritas anteriormente.

Hubo evidencia de supresión del eje Th1/Th17, que es la respuesta patogénica en este modelo y en la RA humana. La correlación de niveles reducidos de citocinas con proliferación reducida sugiere una modulación inmune. No hubo evidencia de que esta modulación fuera resultado de niveles mejorados de IL-4 asociada a TH2 o con aumentos en la citocina inmunomoduladora, IL-10.

Ejemplo 4 - Análisis adicional del efecto de los inóculos bacterianos en el modelo de ratón de asma inducida por ácaros del polvo doméstico

Los ratones probados en el Ejemplo 1 se sometieron a análisis adicionales para caracterizar aún más el efecto de las composiciones de la invención sobre la respuesta inflamatoria alérgica al asma.

Materiales y métodos

Extracción de sangre y preparación de suero en el día 14. Se recogieron muestras de sangre de animales mediante punción cardíaca. El suero se aisló de la muestra de sangre mediante centrifugación durante 5 minutos a 14000 g y se almacenó a -20°C.

Extracción de órganos el día 14. Recolección del lóbulo izquierdo del pulmón en formalina para el análisis histológico de seguimiento. Recolección de los lóbulos pulmonares derechos (todos los lóbulos restantes) y extracción del suero para congelación rápida y análisis de seguimiento. El fluido BAL restante se congeló rápidamente para el análisis de seguimiento.

Medición de los niveles de anticuerpos en suero y fluido BAL

La producción total de anticuerpos IgG1 específicos para IgE y ácaros del polvo doméstico (HDM) se midió en BAL y suero mediante ensayo ELISA.

Aislamiento del pulmón y análisis histológico

Los lóbulos del pulmón izquierdo se fijaron en formalina seguido de incrustación en parafina, seccionamiento y tinción con hematoxilina y eosina y PAS. La puntuación histológica posterior se realizó cegada de la siguiente manera: se puntuaron cinco campos de visión aleatorios por muestra para inflamación (infiltración peribronquial e infiltración perivascular) y producción de moco. La infiltración inflamatoria se calificó con el siguiente sistema de clasificación:

0 - normal

1 - infiltrados inflamatorios leves

2 - infiltrados inflamatorios moderados

3 - infiltrados inflamatorios marcados

4 - infiltrados inflamatorios severos

5- infiltrados inflamatorios muy severos

En cada campo de visión, las vías aéreas fueron medidas en tamaño y se cuantificaron los números de células mucosas/um.

Medición de mediadores inflamatorios en tejido pulmonar

Los lóbulos pulmonares derechos (todos los lóbulos restantes) aislados para la cuantificación de mediadores inflamatorios se congelaron instantáneamente para la medición posterior de CCL11, IFN-gamma, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-4, IL-5, IL-9, IL-17A, CXCL1, CCL3, CXCL2 y CCL5 por ensayo multiplex disponible comercialmente (Merck-Millipore). El análisis se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados y análisis

Los resultados de los experimentos se muestran en las Figuras 28-46.

En apoyo de los hallazgos descritos en El Ejemplo 1, el análisis de los infiltrados celulares en el tejido pulmonar de ratones tratados con la cepa 751 mostró una reducción notable y estadísticamente significativa en la puntuación media de inflamación (ver Figuras 32 y 34).

Se analizaron los niveles de anticuerpos en el fluido BAL y suero (véanse las Figuras 28-31). No se observó un efecto claro del tratamiento bacteriano sobre los niveles de anticuerpos en suero. Esto puede reflejar una falla en el experimento, porque la difusión de datos y las barras de error para cada tratamiento son grandes, y los controles positivos y negativos no parecen haberse comportado como se esperaría. Además, los niveles basales de anticuerpos en suero podrían haber enmascarado cualquier cambio.

De manera similar, no se observó ningún efecto claro del tratamiento bacteriano sobre los niveles de citocinas en el tejido pulmonar (véanse las Figuras 36-46). Nuevamente, esto puede reflejar una falla en el experimento, porque la difusión de datos y las barras de error para cada tratamiento son grandes, y los controles positivos y negativos no parecen haberse comportado como se esperaría. También es posible que el mecanismo de acción involucrado influya en las respuestas de citoquinas anteriores que ya no eran detectables en el día 4 después del desafío final de la vía aérea HDM. Se debe tener cuidado al interpretar los datos de citoquinas en el estudio actual, debido a la variabilidad en los niveles detectados. Esta variabilidad podría explicarse en parte por el hecho de que el tejido pulmonar se separó para los diferentes análisis y, por lo tanto, un lóbulo pulmonar podría no haber sido totalmente representativo o comparable al mismo lóbulo en otros ratones debido a la distribución irregular de la inflamación.

Ejemplo 5 - Análisis adicional del efecto de los inóculos bacterianos en el modelo de ratón de asma neutrofílica severa

Los ratones probados en el Ejemplo 2 se sometieron a análisis adicionales para caracterizar aún más el efecto de las composiciones de la invención sobre la respuesta neutrofílica asociada con asma severa.

Materiales y métodos

Extracción de órganos el día 18. Recolección del lóbulo pulmonar izquierdo en formalina para el análisis histológico de seguimiento. Recolección de los lóbulos pulmonares derechos (todos los lóbulos restantes) y extracción del suero para congelación rápida y análisis de seguimiento. El fluido BAL restante se congeló rápidamente para el análisis de seguimiento.

Medición de mediadores inflamatorios en tejido pulmonar (análisis de seguimiento). Los lóbulos pulmonares derechos (todos los lóbulos restantes) aislados para la cuantificación de mediadores inflamatorios se congelaron rápidamente para la medición posterior de IFN-gamma, IL-1 alfa, IL-1 beta, CXCL1, CCL3, CXCL2, CCL5, IL-17A, TNF-alfa, IL-17F, IL-23 e IL-33 por ensayo multiplex disponible comercialmente (Merck-Millipore). El análisis se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Medición de los niveles de anticuerpos en suero y fluido BAL (análisis de seguimiento). La producción de anticuerpos IgG1 e IgG2a específicos para ácaros del polvo doméstico (HDM) se midió en el BAL y el suero mediante ensayo ELISA.

Aislamiento de pulmón y análisis histológico (análisis de seguimiento). Los lóbulos pulmonares izquierdos se fijaron en formalina seguido de incrustación en parafina, seccionamiento y tinción con hematoxilina y eosina y PAS. La puntuación histológica posterior se realizó cegado de la siguiente manera: se puntuaron cinco campos de visión aleatorios por muestra para inflamación (infiltración peribronquial e infiltración perivascular) y producción de moco. La infiltración inflamatoria se calificó con el siguiente sistema de clasificación:

0 - normal

1 - infiltrados inflamatorios leves

2 - infiltrados inflamatorios moderados

3 - infiltrados inflamatorios marcados

4 - infiltrados inflamatorios severos

5- infiltrados inflamatorios muy graves

Resultados y análisis

Los resultados de los experimentos se muestran en las Figuras 47-64.

Un análisis adicional de los niveles de anticuerpos reveló que la eficacia de la cepa bacteriana 751 también se reflejó en niveles reducidos de IgG1 específica de h Dm en el fluido y suero BAL (véanse las Figuras 47 y 49). No se pueden extraer conclusiones firmes con respecto a un efecto sobre los niveles de IgG2a. En general, los datos del análisis de anticuerpos sugieren una reducción relacionada con una respuesta inflamatoria global reducida, en oposición a un efecto selectivo sobre el cambio de isotipo de anticuerpo.

El análisis histológico apoyó los recuentos diferenciales de células del fluido BAL, mostrando un infiltrado celular reducido en ratones tratados con Cepa 751 (ver Figuras 51-53).

En relación con los niveles de citoquinas, como para el Ejemplo 4, la propagación de datos y las barras de error para cada tratamiento son grandes, y los controles positivos y negativos no parecen haberse comportado como se esperaría necesariamente. También es posible que el mecanismo de acción implique influir en las respuestas de citocinas anteriores que ya no eran detectables en el día 4 después del desafío final de la vía aérea HDM. Se debe tener cuidado al interpretar los datos de citoquinas en el estudio actual, debido a la variabilidad en los niveles detectados. Esta variabilidad podría explicarse en parte por el hecho de que el tejido pulmonar se separó para los diferentes análisis y, por lo tanto, un lóbulo pulmonar podría no haber sido totalmente representativo o comparable al mismo lóbulo en otros ratones debido a la distribución irregular de la inflamación. A pesar de esta variabilidad, se demostró un claro efecto antiinflamatorio sobre los niveles de citocinas para la cepa 751, y el control positivo anti-IL-17 Ab se comportó generalmente como se esperaba.

Con las advertencias anteriores, los datos en las Figuras 56, 58, 59, 61 y 63 sugieren que el tratamiento con las cepas bacterianas de la invención, y en particular la cepa 751 puede lograr una reducción en los niveles de IL-1 b, IFNg, RANTES, MIP-1a y KC (el ortólogo de ratón de la IL-8 humana), que pueden ser indicativos de un mecanismo de acción relacionado con las influencias en la liberación de quimiocinas (y, por lo tanto, el reclutamiento de células) por las células inmunes estromales o innatas. Estas citocinas son parte de la vía Th17. Tomando este conjunto de datos juntos, se puede llegar a una conclusión clara de que Cepa 751 fue altamente eficaz para proteger a los ratones contra la inflamación en este modelo de asma neutrofílica severa.

Ejemplo 6 - Eficacia de la inoculación bacteriana en un modelo de ratón de esclerosis múltiple Resumen

Los ratones se administraron con composiciones que comprenden cepas bacterianas según la invención y los ratones se inmunizaron posteriormente con glucoproteína de oligodendrocitos de mielina para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). EAE es el modelo experimental más utilizado para la esclerosis múltiple humana. Se encontró que las composiciones de la invención tienen un efecto sorprendente sobre la incidencia y la gravedad de la enfermedad.

Cepa

751: bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380

Diseño del estudio

Grupos:

4. Tratamiento con inóculo bacteriano terapéutico cepa 751 (por vía oral).

9. Grupo de control positivo. Tratamiento con dexametasona (i.p.).

10. Grupo de control no tratado.

Número de ratones por grupo = 10

Días -14 a día 27: Administración diaria de control del vehículo por vía oral (Grupo 1).

Días -14 a día 27: administración diaria de inóculo terapéutico de bacterias por vía oral (Grupo 4).

Días 0-28: administración de dexametasona (i.p.) tres veces a la semana (Grupo 9)

Día 0: MOG35-55 (mielina de oligodendrocitos glicoproteína - 2 mg/ml) y CFA (2 mg/ml de MTB) se mezclaron 1:1 dando como resultado soluciones de 1 mg/ml. Se inyectaron 100 pl de la mezcla péptido-CFA por vía subcutánea en cada pata trasera. Administración de toxina pertussis por vía intraperitoneal (300 ng).

Día 1: La administración de toxina pertussis por vía intraperitoneal (300 ng).

Días 7 en adelante: Medición de la incidencia y el peso de la enfermedad tres veces por semana.

Criterios de valoración y análisis

Los ratones se analizaron para determinar la incidencia y la gravedad de la enfermedad tres veces por semana. La puntuación se realizó a ciegas. La gravedad de la enfermedad se evaluó utilizando una puntuación clínica que oscila entre 0 y 5, donde 5 indica un ratón muerto (ver el sistema de puntuación clínica a continuación).

Monitorización

En los días indicados, se pesaron los ratones y se observó su puntuación de actividad de la enfermedad y la incidencia de la enfermedad.

Observaciones de puntuación de actividad de la enfermedad:

0 - No hay cambios obvios en la función motora en comparación con los ratones no inmunizados.

0,5 - La punta de la cola está floja.

1.0 - Cola floja.

1.5 - Inhibición de la cola y la pata trasera.

2.0 - La cola floja y la debilidad de las patas traseras.

O - Hay signos obvios de inclinación de la cabeza cuando se observa la caminata. El equilibrio es pobre. 2.5 - La cola floja y arrastre de las patas traseras.

- O - Hay una fuerte inclinación de la cabeza que ocasiona que el ratón se caiga ocasionalmente.

3.0 - La cola floja y total parálisis de las patas traseras.

3.5 - La cola floja y total parálisis de las patas traseras.

Además de: el ratón se mueve alrededor de la jaula, pero cuando se coloca de lado, no puede enderezarse. Las patas traseras están juntas en un lado del cuerpo.

4.0 - La cola floja, pata trasera completa y parálisis parcial de la pata delantera.

- El ratón se mueve mínimamente alrededor de la jaula, pero parece alerto y se alimenta

4.5 - Parálisis completa de la pata delantera y parcial, sin movimiento alrededor de la jaula.

El ratón se sacrifica inmediatamente y se retira de la jaula.

5.0 El ratón se sacrifica debido a una parálisis severa.

Cuando un animal tiene una puntuación de actividad de la enfermedad igual o mayor de 1, se considera que tiene una puntuación de incidencia de enfermedad positiva.

Resultados

Los resultados del estudio se muestran en las Figuras 71 y 72.

La inducción de la enfermedad en los grupos de control negativo fue exitosa con puntuaciones altas mostradas por el control del vehículo y el control no tratado. El efecto del tratamiento con la cepa 751 fue sorprendente y los ratones tratados con la cepa 751 exhibieron una incidencia y gravedad de la enfermedad notablemente reducidas. De hecho, la reducción en la incidencia y la gravedad de la enfermedad fue comparable al grupo de control positivo. Estos datos indican que la cepa 751 puede ser útil para tratar o prevenir la esclerosis múltiple.

Ejemplo 7 - Eficacia de inóculos bacterianos en modelos de cáncer en ratones

Resumen

Este estudio probó la eficacia de composiciones que comprenden cepas bacterianas según la invención en cuatro tumores modelos.

Materiales

Sustancia de prueba - Cepa bacteriana #MRX004 (cepa 751).

Sustancia de referencia - Anticuerpo anti-CTLA-4 (clon: 9H10, catálogo: BE0131, isotipo: hámster sirio IgG1, Bioxcell).

Vehículos de sustancias de prueba y referencia: Medio de cultivo bacteriano (extracto de levadura, casitona, medio de ácido graso (YCFA)). Cada día de inyección a ratones, el anticuerpo se diluyó con PBS (ref: BE14-516F, Lonza, Francia).

Dosis de tratamiento - Bacterias: 2x108 en 200 pL. El a-CTLA-4 se inyectó a 10 mg/kg/inj. Anti-CTLA-4 se administró a un volumen de dosis de 10 ml/kg/adm (es decir, para un ratón que pesa 20 g, se administrarán 200 pL de sustancia de prueba) de acuerdo con el peso corporal más reciente de los ratones.

Vías de administración: El inóculo bacteriano se administró por sonda oral (per os, PO) a través de una cánula. Las cánulas se descontaminaron todos los días. Se inyectó anti-CTLA-4 en la cavidad peritoneal de ratones (intraperitonealmente, IP).

Las condiciones de cultivo de la cepa bacteriana - Las condiciones de cultivo para la cepa bacteriana fueron las siguientes:

• Pipeta de 10 ml de YCFA (de la prepararon 10 ml de botellas de laboratorio E&O) en tubos Hungate

• Sellar los tubos y al ras con CO2 utilizando una entrada de jeringa y sistema de escape

• Autoclave los tubos Hungate

• Cuando se enfríe, inocular los tubos Hungate con 1 ml de las reservas de glicerol

• Colocar los tubos en una incubadora estática a 37°C durante aproximadamente 16 horas

• El día siguiente, tomar 1 ml de este subcultivo e inocular 10 ml de YCFA (tubos de Hungate enrojecidos pre calentados de nuevo, todo por duplicado)

• Colocarlos en una incubadora estática 37° durante 5 a 6h

Línea celular de cáncer y condiciones de cultivo -Las líneas celulares que se usaron se detallan en la tabla a continuación:

La línea celular EMT-6 se estableció a partir de un carcinoma mamario murino trasplantable que surgió en un ratón BALB/cCRGL después de la implantación de un nódulo alveolar mamario hiperplásico [73].

La línea celular LL/2 (LLC1) se estableció a partir del pulmón de un ratón c57BL con un tumor resultante de una implantación de carcinoma primario de pulmón de Lewis [74].

La línea celular Hepa 1-6 es un derivado del hepatoma de ratón BW7756 que surgió en un ratón c57/L [75].

Condiciones de cultivo celular - Todas las líneas celulares se cultivaron como monocapa a 37°C en una atmósfera humidificada (5% de CO2 , 95% de aire). El medio de cultivo y el suplemento se indican en la tabla a continuación:

Para uso experimental, las células tumorales adherentes se separaron del matraz de cultivo mediante un tratamiento de 5 minutos con tripsina-verseno (ref: BE17-161E, Lonza), en medio de Hanks sin calcio ni magnesio (ref: BE10-543F, Lonza) y neutralizado mediante la adición de medio de cultivo completo. Las células se contaron en un hemocitómetro y su viabilidad se evaluará mediante un ensayo de exclusión de azul de tripano al 0,25%.

Uso de animales -Se obtuvieron ratones Balb/C (BALB/cByJ) hembras sanos, de peso y edad similares, de CHARLES RIVER (L'Arbresles) para los experimentos con el modelo EMT6.

Se obtuvieron ratones hembra sanosc57BL/6 (C57BL16J), de peso y edad similares, de CHARLES RIVER (L'Arbresles) para los experimentos modelo LL/2 (LLC1) y Hepa1-6.

Los animales se mantuvieron en estado de salud SPF de acuerdo con las pautas de FELASA, y se siguieron los procedimientos experimentales y de alojamiento de animales de acuerdo con las regulaciones francesas y europeas y la Guía NRC para el cuidado y uso de animales de laboratorio [76,77]. Los animales se mantuvieron en habitaciones de alojamiento en condiciones ambientales controladas: temperatura: 22 2°C, humedad 55 10%, fotoperíodo (12 h de luz/12 h de oscuridad), aire filtrado HEPA, 15 intercambios de aire por hora sin recirculación. Los recintos de animales se proporcionaron con un espacio estéril y adecuado con material de cama, alimentos y agua, enriquecimiento ambiental y social (alojamiento grupal) como se describe: jaulas de 900 cm2 (ref: verde, Tecniplast) en bastidores ventilados, ropa de cama Epicea (SAFE), 10 Dieta irradiada kGy (A04-10, SAFE), alimento completo para roedores inmunocompetentes - Extruido R/MH, agua de botellas de agua.

Diseño experimental y tratamientos

Actividad antitumoral, modelo EMT6

Programa de tratamiento - El inicio de la primera dosis se consideró como D0. En D0, los ratones no injertados se aleatorizaron según su peso corporal individual en grupos de 9/8 utilizando el software Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, Francia). En D0, los ratones recibieron vehículo (medio de cultivo) o cepa bacteriana. En D14, todos los ratones fueron injertados con células tumorales EMT-6 como se describe a continuación. En D24, los ratones del grupo de control positivo recibieron tratamientos con anticuerpos anti-CTLA-4.

El programa de tratamiento se resume en la tabla a continuación:

El seguimiento de los animales se realizó como se describe a continuación.

La inducción de tumores EMT6 en animales - En D14, los tumores fueron inducidos por inyección subcutánea de 1x106 EMT- 6 células en 200 pL RPMI 1640 en el flanco derecho de los ratones.

Eutanasia: Cada ratón se sacrificó cuando alcanzó un punto final humano como se describe a continuación, o después de un máximo de 6 semanas después del inicio de la dosificación.

Actividad antitumoral, modelo LL/2 (LLC1)

Programa de tratamiento - El inicio de la primera dosis se consideró como D0. En D0, los ratones no injertados se aleatorizaron de acuerdo con su peso corporal individual en 7 grupos de 9/8 utilizando el software Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, Francia). En D0, los ratones recibirán vehículo (medio de cultivo) o cepa bacteriana. En D14, todos los ratones fueron injertados con células tumorales LL/2 como se describe a continuación. En D27, los ratones del grupo de control positivo recibieron tratamientos con anticuerpos anti-CTLA-4.

El programa de tratamiento se resume en la siguiente tabla:

El seguimiento de los animales se realizó como se describe a continuación.

La inducción de tumores LL/2 (LLC1) en animales - En D14, los tumores fueron inducidos por inyección subcutánea de 1x106 células LL/2 (LLC1) en 200 pL RPMI 1640 en el flanco derecho de los ratones.

Actividad antitumoral, modelo Hepa1-6

Programa de tratamiento - El inicio de la primera dosis se consideró como D0. En D0, los ratones no injertados se aleatorizaron de acuerdo con su peso corporal individual en 7 grupos de 9 utilizando el software Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, Francia). En D0, los ratones recibieron vehículo (medio de cultivo) o cepa bacteriana. En D14, todos los ratones fueron injertados con células tumorales Hepa 1-6 como se describe a continuación. En D16, los ratones del grupo de control positivo recibieron tratamientos con anticuerpos anti-CTLA-4.

El programa de tratamiento se resume en la siguiente tabla:

El seguimiento de los animales se realizó como se describe a continuación.

La inducción ortotópica de las células tumorales Hepa 1-6 en animales mediante la inyección intraesplénica - En D14, un millón (1x106) células Hepa 1-6 tumorales en 50 pL RPMI 1640 se trasplantaron a través de inyección intraesplénica en los ratones. Brevemente, se realizó una pequeña incisión en el costado subcostal izquierdo y se exteriorizó el bazo. El bazo se expuso en una gasa estéril, y se inyectó bajo control visual con la suspensión celular con una aguja de calibre 27. Después de la inoculación celular, se extirpó el bazo.

Eutanasia: cada ratón se sacrificó cuando alcanzó un punto final humano como se describe en la sección a continuación, o después de un máximo de 6 semanas después del inicio de la dosificación.

Evaluación de la carga tumoral en la eutanasia: en el momento de la terminación, se recolectaron y pesaron los hígados.

Monitoreo en animales

Monitoreo clínico: la longitud y el ancho del tumor se midieron dos veces por semana con calibradores y el volumen del tumor se estimó mediante esta fórmula [78]:

ancho2 x longitud

Volumen de tumor = -------------------------

2

Puntos finales humanos [79]: Signos de dolor, sufrimiento o angustia: postura de dolor, mascarilla para el dolor, comportamiento; tumor superior al 10% del peso corporal normal, pero no superior a 2000 mm3; tumores que interfieren con la deambulación o la nutrición; tumor ulcerado o erosión tisular; 20% de pérdida de peso corporal restante durante 3 días consecutivos; malcondición corporal, emaciación, caquexia, deshidratación; ausencia prolongada de respuestas voluntarias a estímulos externos; respiración trabajosa rápida, anemia, sangrado significativo; signos neurológicos: círculos, convulsiones, parálisis; disminución sostenida de la temperatura corporal; distensión abdominal.

Anestesia: se usó anestesia con gas isoflurano para todos los procedimientos: cirugía o inoculación de tumores, inyecciones intravenosas, extracción de sangre. La anestesia con ketamina y xilazina se utilizaron para el procedimiento quirúrgico de estereotaxia.

Analgesia: el protocolo de analgesia carprofeno o carprofeno/buprenorfina multimodal se adaptó a la gravedad del procedimiento quirúrgico. Se brindó atención no farmacológica para todos los procedimientos dolorosos. Además, se prestó atención farmacológica que no interfiere con los estudios (tratamiento temático) por recomendación del veterinario a cargo.

Eutanasia: la eutanasia de animales se realizó mediante sobredosis de gas anestésico (isoflurano) seguido de luxación o desangrado cervical.

Resultados

Actividad antitumoral, modelo EMT6

Los resultados se muestran en la Figura 73. El tratamiento con la cepa bacteriana de la invención condujo a una clara reducción en el volumen del tumor con respecto a ambos controles negativos. El control positivo también condujo a una reducción en el volumen del tumor, como era de esperar.

Actividad antitumoral, modelo LL/2 (LLC1)

Los resultados se muestran en la Figura 74. Los controles negativos y positivos no aparecen como se esperaría, porque el volumen del tumor fue mayor en los ratones tratados con el control positivo que en el grupo de control negativo. Sin embargo, el volumen tumoral en los ratones tratados con la cepa bacteriana de la invención fue comparable al grupo de control positivo, lo que es consistente con un efecto terapéutico útil.

Actividad antitumoral, modelo Hepa1-6

Los resultados se muestran en la Figura 75. El control negativo no tratado no aparece como se esperaría, porque el peso del hígado fue menor en este grupo que en los otros grupos. Sin embargo, el control negativo del vehículo y los grupos de control positivo aparecen como era de esperar, porque los ratones tratados con vehículo solo tenían hígados más grandes que los ratones tratados con anticuerpos anti-CTLA4, lo que refleja una mayor carga tumoral en el grupo de control negativo del vehículo. El tratamiento con la cepa bacteriana de la invención condujo a una clara reducción en el peso del hígado (y, por lo tanto, la carga tumoral) en relación con los ratones en el grupo de control negativo del vehículo.

Estos datos indican que la cepa 751/MRX004 puede ser útil para tratar o prevenir el cáncer, y en particular para reducir el volumen tumoral en los cánceres de mama, pulmón e hígado.

Ejemplo 8 - Unión a células humanas en medio YCFA

Resumen

El nivel de unión de la cepa 751 y varias cepas breves de Bifidobacterium a células humanas se determinó en 3 puntos de tiempo distintos en medio YCFA. Las bacterias unidas a las células humanas se resuspendieron en medio y luego se analizó la densidad óptica del medio: cuanto mayor es la densidad óptica, mayor es el número de células bacterianas y, por lo tanto, mayor es el nivel de unión de las células bacterianas a células humanas. Se descubrió que la cepa 751 mostraba una unión reducida a las células humanas en comparación con las cepas de referencia de Bifidobacterium breve.

Resultados y análisis

Los resultados del experimento se muestran en la Figura 76.

Como se muestra en la Figura 76, las cepas de Bifidobacterium breve muestran un alto nivel de unión a las células humanas en todos los puntos de tiempo. Por otro lado, la cepa 751 tiene un nivel de unión drásticamente reducido a las células humanas. Por lo tanto, la baja adherencia a las células humanas de la cepa 751 puede aumentar el efecto beneficioso de las composiciones de la invención en la ruta IL-17 o Th17 y en enfermedades mediadas por la ruta IL-17 o Th17.

Ejemplo 9 - Ensayo que detecta la producción de exopolisacáridos

Resumen

El nivel de producción de exopolisacárido (EPS) por la cepa bacteriana de la invención (751) y varias cepas de Bifidobacterium breve se analizaron a 37°C durante 48 horas y a 30°C durante 72 horas. Los EPS son polisacáridos producidos por ciertas bacterias que se unen a la superficie exterior de la célula bacteriana. El nivel de EPS en la superficie de las bacterias se puede determinar usando un ensayo de Congo Red que se une a los polisacáridos. Una mayor intensidad de la absorbancia del Congo Red indica una mayor concentración de EPS en la superficie de la bacteria. Se descubrió que la cepa bacteriana de la invención produce y se une a más EPS que las cepas breves de Bifidobacterium.

Resultados y análisis

Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 77.

Como se muestra en la Figura 77, la cepa bacteriana de la invención mostró una mayor absorbancia del Congo Red que las cepas de Bifidobacterium breve a temperaturas y puntos temporales. Por lo tanto, la tensión de la invención muestra una mayor producción de EPS y un mayor nivel de EPS extracelulares unidos. Como los EPS permiten que las bacterias se unan al moco y las células epiteliales, la cepa bacteriana de la invención puede ser útil para competir con las células patógenas por los sitios de unión en las células epiteliales y dentro de las membranas mucosas. Por lo tanto, la cepa bacteriana de la invención puede ser útil para modular el microbioma y tratar una serie de enfermedades asociadas con el microbioma.

Ejemplo 10 - Prueba de estabilidad

Una composición descrita en este documento que contiene al menos una cepa bacteriana descrita en este documento se almacena en un recipiente sellado a 25°C o 4°C y el recipiente se coloca en una atmósfera que tiene 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% o 95% de humedad relativa. Después de 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año, 1,5 años, 2 años, 2,5 años o 3 años, al menos 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la cepa bacteriana permanecerá medido en unidades formadoras de colonias determinadas por protocolos estándar.

Ejemplo 11 - Ensayo de producción de exopolisacárido unido y liberado de MRX004

Para la extracción con EPS, MRX004 se cultivó en 10 ml de YCFA hasta que alcanzó la fase exponencial tardía, cuando las células bacterianas y los sobrenadantes se separaron por centrifugación. Las células se lavaron una vez con PBS para eliminar cualquier medio de cultivo restante. El EPS secretado o liberado (EPS-R) se precipitó de los sobrenadantes del cultivo mediante tratamiento con hielo helado al 100% de etanol (durante la noche a 4°C con agitación suave). Para extraer EPS capsular o unido (EPS-B), las células se incubaron con EDTA 0,05 M (durante la noche a 4°C con agitación suave), y los sobrenadantes de este tratamiento se recogieron y posteriormente se trataron con etanol 100% helado (durante la noche a 4°C con agitación suave) para precipitar EPS-B. Los precipitados EPS-B y EPS-R se sedimentaron por centrifugación y se dejaron secar brevemente en una campana laminar antes de resuspenderlos en suficiente agua ultrapura estéril para lograr una solución uniforme. Para purificar aún más las muestras, se dializaron contra agua ultrapura estéril en una proporción de 1:100 durante 48 horas con 3 cambios de tampón. EPS-B y EPS-R se cuantificaron usando el método del ácido fenol-sulfúrico usando glucosa como estándar. Usando este ensayo, se encontró que MRX004 produce una mayor cantidad de EPS-R (115 pg) que EPS-B (17 pg) (FIG. 78).

Ejemplo 12 - Ensayo de unión de MRX004 a células Caco-2

Se analizó la unión de MRX004 a células huésped usando un ensayo de cocultivo in vitro con células epiteliales intestinales Caco-2. Se sembraron células Caco-2 a una densidad de 1 x 10. Se cultivaron bacterias en 10 ml de YCFA hasta que alcanzaron una fase exponencial tardía, cuando se granularon, se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en medio de cultivo celular libre de antibióticos. La densidad bacteriana se ajustó para obtener una multiplicidad de infección (MOI) aproximada de 10:1 (que se confirmó mediante un recubrimiento en agar YCFA usando el protocolo estándar WASP), y MRX004 se incubó conjuntamente con células Caco-2 en condiciones anaeróbicas a 37°C durante 2 h. Posteriormente se eliminó el medio y se eliminaron las bacterias no unidas lavando las células Caco-2 tres veces con PBS. Las células Caco-2 unidas a las bacterias se lisaron y se retiraron del recipiente usando tratamiento con Triton X-100 al 0,1%, y se sembraron en placas de 50 pl de lisado diluido en agar YCFA usando el WASP. La unión se calculó contando el número de bacterias recuperadas del lisado y expresándolo como un porcentaje del total de bacterias. Se encontró que MRX004 mostraba una adherencia de bajo nivel (0,3% del cultivo total) a las células Caco-2 (FIG. 79).

Ejemplo 13 - Caracterización de la actividad enzimática

El sistema de prueba del Índice de Perfil Analítico (API®) consiste en tiras que contienen pruebas bioquímicas miniaturizadas que analizan la actividad enzimática en especies bacterianas. MRX004 (cepa 751, la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380) se caracterizó mediante dos sistemas de prueba API: ID rápida 32A: este sistema está diseñado específicamente para especies anaeróbicas y abarca pruebas de metabolismo de carbohidratos, aminoácidos y nitratos, así como actividad de fosfatasa alcalina; y API® 50 CH: este sistema prueba la fermentación de 49 fuentes de carbohidratos y se puede utilizar junto con el medio API® CHL para el análisis de especies anaeróbicas.

La prueba rápida ID 32A se llevó a cabo en colonias bacterianas según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las bacterias se cultivaron en agar YCFA durante 24 horas a 37°C en una estación de trabajo anaeróbica. Las colonias se retiraron de las placas usando un asa de inoculación estéril de 5 pl y se resuspendieron en una ampolla de 2 ml de medio de suspensión API® hasta que se logró una densidad aproximadamente equivalente a la del estándar McFarland N° 4. Se añadieron cincuenta y cinco microlitros de suspensión bacteriana a cada cápsula en una tira Rapid ID 32A, y la prueba de ureasa se superpuso con dos gotas de aceite mineral. Las tiras se cubrieron con una tapa de plástico y se incubaron aeróbicamente a 37°C durante 4 h, después de lo cual se desarrolló la fila inferior de cúpulas utilizando los siguientes reactivos: NIT: 1 gota de NIT1 y NIT2; IND: 1 gota de reactivo James; todas las cápsulas restantes: 1 gota de reactivo FastBlue. Las tiras se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos, después de lo cual se registró el color de cada cápsula y se le asignó un valor negativo, positivo intermedio o positivo.

Los resultados del análisis Rapid ID 32A se muestran en la Figura 80. MRX004 dio positivo para la fermentación de varias fuentes de carbohidratos, a saber, a-galactosidasa y p-galactosidasa, a-glucosidasa y pglucosidasa, a-arabinosa, manosa y rafinosa, así como los aminoácidos arginina, prolina, fenilalanina, leucina, tirosina, glicina e histidina. Curiosamente, se han reportado roles para algunos de estos aminoácidos en el asma. Por ejemplo, se ha informado que el aumento de las concentraciones plasmáticas de fenilalanina e histidina se asocia con efectos adversos en el asma, incluido un aumento de la inflamación, la producción de histamina y la hiperreactividad de las vías respiratorias. Además, el metabolismo de la arginina está implicado en la patogénesis del asma, ya que se han reportado niveles aumentados del metabolito de arginina L-ornitina en pacientes pediátricos, y la administración de arginina atenúa la inflamación en un modelo de asma in vivo. Según estos informes, es posible que el metabolismo de los aminoácidos por MRX004 esté involucrado en los efectos antiasmáticos de esta cepa.

Análisis comparativo Rapid ID 32A se llevó a cabo entre MRX004 y cuatro cepas de tipo B. breve, que están anotadas en la Figura 80B como Bif Ref 1 (DSM 20091), Bif Ref 2 (DSM 20213), Bif Ref 6 (JCM 7017) y Bif Ref 7 (UCC2003). Este análisis demostró que MRX004 fue la única cepa probada para fermentar el polisacárido rafinosa, lo que puede ser significativo, porque la rafinosa está involucrada en la producción de componentes bacterianos como los exopolisacáridos, y la fermentación de la rafinosa también puede conferir efectos en el huésped, como el aumento de ciego butirato, aumento de la proliferación gastrointestinal y pérdida de peso.

La prueba API® 50 CH se llevó a cabo para examinar más a fondo el metabolismo de carbohidratos en MRX004. Según las instrucciones del fabricante, las bacterias se cultivaron en 10 ml de caldo YCFA durante 16-18 horas a 37°C en una estación de trabajo anaeróbica. Este cultivo se diluyó en 10 ml de medio API® CHL para lograr una densidad aproximadamente equivalente al estándar McFarland N° 2, y se usaron 110 pl de esta mezcla para inocular cada cápsula en un conjunto de tiras reactivas API® 50 CH. Las tiras reactivas se incubaron en una caja de incubación humidificada a 37°C en una estación de trabajo anaeróbica durante 48 horas, después de lo cual se registró el color de cada cápsula y se le asignó un valor negativo, intermedio positivo, positivo o dudoso.

Utilizando API® 50, MRX004 dio positivo por la utilización de las siguientes fuentes de carbohidratos: amidón (almidón), amigdalina, arbutina, celobiosa, esculina, galactosa, gentiobiosa, glucosa, glucógeno, fructosa, fucosa, lactosa, maltosa, manosa, manitol, melibiosa, melezitosa, metilo a-D-glucopiranósido, N-acetilglucosamina, ribosa, sacarosa, salicina, sorbitol, trehalosa, turanosa y xilitol. Estos resultados se correlacionaron con los obtenidos para la prueba Rapid ID 32A en que MRX004 demostró la fermentación de galactosa, glucosa, manosa y rafinosa en ambos sistemas de prueba. Curiosamente, algunos sustratos de carbohidratos MRX004, a saber, galactosa y fructosa, pueden estar implicados en el mecanismo de acción de esta cepa, en función de sus efectos reportados en la literatura. La galactosa a-1,3-galactosa se deriva de fuentes de carne es un alergeno conocido y un agente causante de la anafilaxia, y los niveles de ingesta de fructosa en la dieta están correlacionados con una mayor gravedad del asma. En conjunto, ambos conjuntos de datos API® para MRX004 sugieren que el metabolismo de esta cepa puede desempeñar un papel en sus efectos antiasmáticos.

Ejemplo 14 - Análisis del genoma

Se realizó una comparación del contenido del genoma de la cepa MRX004 y las cepas de referencia de B. breve, 1, 2, 6 y 7 usando blastn como parte del conjunto de programas BLAST 2,3,0. Se empleó una puntuación máxima de corte del valor E de 10E-5 durante todo el análisis.

Se identificaron 333 genes (Tabla 1) que están presentes en el genoma de la cepa MRX004, pero están ausentes de las cepas de referencia 1 de B. breve (Ds M 20091), 2 (DSM 20213), 6 (Jc M 7017) y 7 (UCC2003). Muchos de los genes enumerados en la Tabla 1 se observan con frecuencia como hipervariables entre las cepas de B. breve [80]. Como era de esperar, las regiones de variabilidad incluyen genes que codifican proteínas involucradas en el metabolismo y transporte de carbohidratos, genes asociados a fagos, elementos móviles, así como 173 genes predichos para codificar proteínas o genes de función desconocida.

Los genes que están presentes en MRX004, pero ausentes de cepas B. breves de referencia 1,2, 6 y 7 se enumeran en la Tabla 1. Los genes que no están resaltados están ausentes en más de una de las cuatro cepas de referencia. El gran número de genes que están presentes en MRX004 pero que no están presentes en numerosas cepas de referencia de B. breve sugiere que MRX004 es distinto y/o distinguible de estas cepas de B. breve conocidas. Los genes resaltados con subrayado simple están presentes en MRX004, pero ausentes en cepa B. breve de referencia 1. Los genes resaltados con doble subrayado y en negrita están presentes en MRX004, pero ausentes en cepa B. breve de referencia 2. Los genes resaltados con cursiva están presentes en MRX004, pero ausente en B. breve cepa de referencia 6. Se empleó una puntuación de corte de valor E máximo de 10E-5 para el análisis de la explosión.

Tabla 1

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(Continuación)

Secuencias

SEQ ID NO:1 (secuencia consenso 16S ARNr para la cepa 751)

GGGACAGGCTCAGGATGAACGCCGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCATCGGGCTTTGCCT GGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATGCACCGGAATAGCTCCTGGAAACG GGTGGTAATGCCGGATGCTCCATCACACCGCATGGTGTGTTGGGAAAGCCTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCG TCCTATCAGCTTGATGGCGGGGTAACGGCCCACCATGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCC ACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCC TGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTGTTAGGGAGCAAGGCACTTT GTGTTGAGTGTACCTTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGC GTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAAC GGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAAT GTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCG TGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCC ACGGGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGA AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCT TGACATGTTCCCGACGATCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTC AGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCGGATTGTG CCGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTA CGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACAGCGCGAGCTGGAGCGGATCCCTGA AAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAG CAACGTCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAA GCCGGTGGCCTAACCCCTGCGGGAGGGAGCCKC

SEQ ID NO:2 (secuencia del genoma de la cepa 751)-ver la lista electrónica de secuencias del documento WO 2016/203223.

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[77] Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: 8a Edición. The National Academies Press; 2011 [78] Simpson-Herren and Lloyd (1970) Cancer Chemother Rep. 54:143-74.

[79] Workman et al. (2010) Br. J. Cancer. 102:1555-77.

[80] Bottacini et al (2014) BMC Genomics. 15:170, DOI: 10.1186/1471-2164-15-170, PMID: 24581150

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una cepa bacteriana que tiene un genoma con por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2, para su uso en un método para tratar o prevenir el asma alérgica, el asma eosinofílica o la hipersensibilidad asociada con el asma.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cepa bacteriana tiene un genoma con por lo menos un 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia en el 100% de dicha SEQ ID NO:2.

3. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cepa bacteriana utiliza las siguientes fuentes de carbohidratos: amidón, amigdalina, arbutina, celobiosa, esculina, galactosa, gentiobiosa, glucosa, glucógeno, fructosa, fucosa, lactosa, maltosa, manosa, manitol, melibiosa, melecitosa, metil a-D-glucopiranósido, N-acetilglucosamina, ribosa, sacarosa, salicina, sorbitol, trehalosa, turanosa y xilitol.

4. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cepa bacteriana proporciona el mismo patrón que la bacteria depositada con el número de acceso NCIMB 42380 cuando se analiza mediante análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado cuando se usa una enzima de restricción Sau3AI.

5. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cepa bacteriana tiene baja adherencia a las células Caco-2 en YCFA en comparación con Bifidobacterium breve.

6. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cepa bacteriana produce más exopolisacáridos de superficie unidos en comparación con Bifidobacterium breve.

7. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16s que es por lo menos un 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO:1, o en donde la cepa bacteriana tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO:1.

8. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cepa bacteriana comprende por lo menos 5, 10, 20, 50 o todos los genes de la Tabla 1.

9. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cepa bacteriana está depositada con el número de acceso NCIMB 42380.

10. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en un método para reducir una respuesta inflamatoria eosinofílica en el tratamiento o prevención del asma.

11. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en la reducción de la infiltración peribronquiolar en el tratamiento del asma alérgica.

12. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en un paciente con niveles elevados de eosinófilos, identificados a través de muestras de sangre o análisis de esputo.

13. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en un método para reducir la producción de IL-17 o reducir la diferenciación de células Th17 en el tratamiento o prevención del asma; y/o en donde la composición es para su uso en un paciente con niveles elevados de IL-17 o células Th17.

14. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición se formula como un probiótico y no se combina con un compuesto prebiótico.

15. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición es para administración oral, y/o en donde la composición comprende uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables, y/o en donde la bacteria está liofilizada.