KR102197145B1 - 기탁번호 kctc13836bp 또는 kctc13837bp로 기탁된 혼합균주 및 해조류를 이용한 장서식 유익미생물 증식 및 유해미생물 억제 신바이오틱스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기탁번호 KCTC13836BP 또는 KCTC13837BP로 기탁된 혼합균주 및 해조류를 이용한 장서식 유익미생물 증식 및 유해미생물 억제 신바이오틱스에 관한 것으로, 해조류를 포함한 기능성 천연물질을 미생물로 발효하여 병원성 및 유해 미생물을 억제하고 유익미생물의 성장과 면역을 촉진할 수 있는 신바이오틱스에 관한 것이다.
본 발명은 기탁번호 KCTC13836BP로 기탁되어 정장작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혼합균주 및 기탁번호 KCTC13837BP로 기탁되어 정장작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혼합균주이다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC13836BP의 혼합균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물 및 상기 기탁번호 KCTC13837BP의 혼합균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물이다.
또한, 기탁번호 KCTC13836BP의 혼합균주 또는 이의 배양물이 유효성분인 프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물 및 기탁번호 KCTC13837BP의 혼합균주 또는 이의 배양물이 유효성분인 프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물이다.
본 발명은 기탁번호 KCTC13836BP로 기탁되어 정장작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혼합균주 및 기탁번호 KCTC13837BP로 기탁되어 정장작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혼합균주이다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC13836BP의 혼합균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물 및 상기 기탁번호 KCTC13837BP의 혼합균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물이다.
또한, 기탁번호 KCTC13836BP의 혼합균주 또는 이의 배양물이 유효성분인 프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물 및 기탁번호 KCTC13837BP의 혼합균주 또는 이의 배양물이 유효성분인 프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물이다.
Description
본 발명은 기탁번호 KCTC13836BP 또는 KCTC13837BP로 기탁된 혼합균주 및 해조류를 이용한 장서식 유익미생물 증식 및 유해미생물 억제 신바이오틱스에 관한 것으로, 해조류를 포함한 기능성 천연물질들을 미생물로 발효하여 병원성 및 유해 미생물을 억제하고 유익미생물의 성장과 면역을 촉진할 수 있는 신바이오틱스에 관한 것이다.
인간은 미생물과 계속적인 접촉을 하며 살아가고 있는데, 수많은 미생물이 인체의 안팎에 존재하며 사람의 건강에 유익한 작용을 하거나, 때로는 질병의 원인이 되기도 한다. 이러한 미생물을 상재균이라 합니다. 인체의 상재균 중 대부분은 위장관 내에 존재한다. 인간과 공생하는 미생물의 질량은 총 1㎏이 넘으며, 수적으로는 대략100조 개 이상이다. 이와 같은 미생물 집단을 장내세균총이라 하고 이들은 장관 내부에서 하나의 생태계를 이루고 있다. 현재까지 밝혀진 장내세균총의 역할로는 체내의 대사, 영양, 에너지 이용과 관련된 역할, 선천 면역과 적응 면역의 조절, 장관 내 점막 상피의 발달과 생성, 병원체의 침입방지 등이 알려져 있다. 장내세균총은 개개인에 따라 미생물 종(species)과 균주(strain)에 상당한 차이가 있다. 어릴 때 접촉한 환경과 모체에서 기원한미생물, 숙주의 유전자형에 따라 개인의 고유한 장내세균총의 구성을 보이게 된다. 그 외에도 장내세균총은 식습관, 나이, 약물, 수술, 방사선 치료, 스트레스, 숙주가 가지고 있는 질병에 의해 영향을 받는다. 장내세균총에 대해 영향을 미치는 인자가 다양하기 때문에 질병과의 관계를 규명하는 것이 쉽지 않으나 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 비만, 변비, 지방간, 신생아 괴사성 장염, 알레르기 질환 등이 장내세균총과 관계가 있다고 알려져 있다.
프로바이오틱스란 ‘충분한 양을 투여할 때 숙주의 건강에 유익한, 살아있는 미생물’을 말한다. 지금까지 알려져 있는 대부분의 프로바이오틱스는 우리가 흔히 유산균이라고 알고 있는 종류가 거의 대부분이다. 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산, 담즙산에서 죽지 않고 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하여야 하며 장관 내에서 유익한 효과를 나타내어야 하고 독성이 없으며 병원성이 없어야 한다. 최근 과민성 대장 증후군이나 항생제 연관 설사, 염증성 장질환, 변비 등과 같은 대장 질환의 영역에서 최근 점차 프로바이오틱스의 사용을 시도해보는 추세이다. 과민성 대장 증후군이나 항생제 연관 설사에서는 일부에서 장내세균총의 조성에 변화를 일으키는 항생제 사용이나 감염성 장염을 앓은 과거력이 관련되어 있다. 따라서 이러한 경우에 프로바이오틱스를 이용하여 장내세균총을 정상적으로 회복시키고자 하는 시도를 하고 있다. 대표적인 프로바이오틱스로서 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유산균이 있다. 락토바실러스 속 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 젖산 간균으로서 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있다. 락토바실러스 속 미생물은 장내 pH를 산성으로 유지시켜 대장균(E. coli)이나 클로스트리디움(Clostridium)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라 비타민 합성, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다[Michael and Philippe, Probiotics and prebiotics: Effects on diarrhea, The journal of nutrition, Volume 137, March 2007, pages 803S-811S; Roberfroid, Prebiotics and probiotics: Are they functional foods?, American journal of clinical nutrition, Volume 71, June 2000, pages 1682S-1687S].
최근 소득수준이 높아짐에 따라 식생활 문화에 있어서 고칼로리 식품의 섭취가 늘어 비만 및 각종 성인질환 발병율이 높아지고 있다. 성인성 질환을 유발시키는 요인 중에서도 가장 주된 요인은 동물성 지방의 과다한 섭취로 인한 혈중 고콜레스테롤로서 고지혈증, 동맥경화증, 지질 관련 대사증후군과 같은 질환의 위험 지표가 된다.
콜레스테롤을 저하시키는 유산균의 선발에 대한 많은 연구를 토대로, 유산균에 의한 콜레스테롤 흡수의 저하 기작을 보통 세 가지로 설명할 수 있다(대한민국 등록특허 제10-0930251호 참조). 첫번째는 유산균이 장내에 정착증식하면서 콜레스테롤을 흡착하여 배설시키는 것이고 두번째는 유산균이 담즙산을 흡착하여 배설시키는 것이다. 이런 경우 콜레스테롤은 담즙산의 전구체이므로 부족한 담즙산을 보충하기 위해 콜레스테롤을 이용하게 되어 결과적으로 장내 콜레스테롤 농도를 감소시킬 수 있다. 그리고 세번째 기작은 유산균이 포합담즙산(conjugated bile acid)을 탈포합시키는 작용이다. 간에서 생성된 프리 담즙산(free bile acid)은 소장에서 타우린 또는 글라이신과 결합하여 포합담즙산(conjugated bile acid)이 된다. 포합담즙산은 지질 용해도가 높아 소장에서 콜레스테롤 등의 지질 흡수를 용이하게 한다. 그러므로, 포합담즙산이 많은 경우 혈중으로 흡수되는 콜레스테롤양이 많아져 혈중 콜레스테롤 농도가 높아진다. 그러나, 탈포합된 담즙산(deconjugated bile acid)은 지질용해도가 낮아 콜레스테롤 등 지질의 혈중 이행을 저하시키는 작용을 한다. 따라서, 포합담즙산을 탈포합시키는 담즙산 분해효소(bile salt hydrolase)를 갖는 균주는 지질 용해도를 낮추어 소장에서 콜레스테롤의 흡수를 저하시킬 수 있다. 따라서, 인체에 안전하면서도 콜레스테롤 저하 기능이 우수한 균주를 개발하고 이를 의약품 또는 기능성 식품으로 적용하는 것이 필요하다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0774969호에는 장관에서 콜레스테롤 흡수를 억제하고 혈중 HDL 지단백을 높이고 LDL 지단백을 낮춰 혈중 지질 개선을 통하여 동맥경화를 예방할 수 있는 락토바실러스 플란타럼이 개시되어 있다. 또한, 미국 공개특허 제20110117629호에는 위장관에 부착하고 콜레스테롤을 제거할 수 있는 락토바실러스 플란타룸 BB9가 개시되어 있다. 그러나 대부분의 락토바실러스 속 유산균은 내산성 또는 내담즙성이 부족하여 인체에 경구투여시 소수만이 장에 도달하여 콜레스테롤 저하 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0435168호에는 서열 1로 표현되는 내산성의 유산균 돌연변이 균주인 Lactobacillus fermentum JS 균주(기탁번호 : KCCM 10499) 및 이를 함유하는 혈당강하용, 항산화용, 과산화지질 생성 억제용 및 콜레스테롤 저하용 유산균 조성물이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2003-0064030호에는 위액 및 담즙산에 대한 내성이 우수하며, β-갈락토시다제를 생산하고, 리스테리아균 및 대장균에 대하여 항균활성을 가지는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) HY701 균주(기탁번호 KCCM 10351)이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2007-0121185호에는 위액과 담즙액에 안정하고, 우수한 유당분해효소 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ET 균주(KCTC 10955BP)가 개시되어 있다.
프로바이오틱 유산균은 위장관 내성에 기초하여 선별하는 것이 중요하다. 프로바이오틱 세균이 효과를 발휘하기 위해서는 장내 환경에서 생존할 수 있어야 하고, 장내 상피세포에 부착하여 장내에서 대량으로 서식하여야 한다[Salminen, S. et al., (1996) Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeuwenhoek 70:347-358; Conway, P. (1996) Selection criteria for probiotic microorganisms. Asia Pacific J Clin Nutr 5:10-14]. 또한, 새로운 원천으로부터 선별된 유산균이 프로바이오틱스 용도로 사용되기 위해서는 안전성 시험 및 병원성 시험이 요구된다[Holzapfel and Schillinger 2002; Ji et al. 2013]. 구체적으로 인간이나 가축에 투여되는 미생물은 생체아민(biogenic amine)을 생성하지 않아야 한다. 생체아민(biogenic amine)은 열처리에 의해서도 실활되지 않는 것으로 알려져 있다. 또한, 프로바이오틱스 용도로 사용되기 위해서 유산균은 점막방벽(mucosal barrier)을 파괴하지 않아야 하고 뮤신(mucin)을 분해하지 않아야 한다. 점막방벽(mucosal barrier)의 파괴 및 장내 뮤신의 분해에 의해 내부 기관의 전위가 일어나면 균혈증을 야기할 수 있다(Zhou et al. 2001). 또한, 프로바이오틱스 용도로 사용되기 위해서 유산균은 유전되는 약물 내성 유전자를 소유하지 않아야 한다. 유전되는 약물 내성 유전자를 소유한 유산균을 투여하는 경우 약물 내성을 가진 장내 미생물의 발달을 야기할 수 있다(Sharma et al. 2014). 그러나, 대부분의 유산균은 다양한 항생제에 대해 고유한 내성을 보유하고 있는 것으로 알려져 있다[Saarela et al. 2000; Argyri et al. 2013].
감태(Ecklonia cava Kjelman)에서 추출된 항염증 및 항알러지 물질 중 phlorofucofuroeckol A and triphlorethol-A가 가장 높은 DPPH radical 소거능을 보였고 phlorofucofuroeckol A는 가장 높은 항염증력을 보인다(Le 외, 2018). Phlorotanin이 풍부한 감태는 gamma-secretase 및 alpha-secretase의 작용을 상승시켜 Beta-amyloid의 합성을 감소 감소시키는 효과가 있으므로 알쯔하이머병을 관리하는 건강기능식품으로 개발할 수 있다(Kang 외, 2013).
최근의 연구에 의하면 감태는 생균제의 성장을 증가시켜 병원균에 감염된 물고기의 타고난 면역반응을 향상시키므로 prebiotics로 작용할 수 있다(Lee 외, 2016). 또한 감태는 잠재적으로 prebiotic으로 작용하여 병원균(E. tarda)으로 감염된 zebrafish을 보호하는 역할을 할 수 있다(Lee 외, 2016). 감태와 probiotics는 이유식을 하는 돼지에 유익하다(Choi 외, 2016). 버섯자실체는 다량의 다당류, 즉 lentinan, β-1,3 글루칸, β-1,6 글루칸 및 그리포란을 함유하여 여러 건강상의 이점 즉 면역억제, 항암, 항당뇨 등의 효과를 가지고 있으며 probiotics의 증식을 촉진한다(Bhakta, 외, 2013). 그리고 연근은 유산균에 대한 Prebiotics로서 역할을 할 수 있다(서다솜, 2017). 울금 추출물은 prebiotics로 작용하여 Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) 및 Bifidobacterium animalis BB12에 분해되어 이들의 성장을 촉진할 수 있다(Yazdi 외, 2019). 당귀는 항산화, collagenase 저해에 의한 주름개선, 조직 재생, 미백 작용 및 항암작용 등의 효과를 가지고 있는 것으로 알려지며(Park SK 외, 2009), 특히 참당귀 내 다량 함유되어있는 decursin 및 decursinol angelate는 항균, 혈관형성억제, 항암 등의 약리적인 효과가 보고되고 있다(Park MJ 외, 2009). 인삼다당류는 Lactobacillus plantarum C88의 성장을 촉진하므로 (He 외, 2015) 이 균주의 prebiotic 역할을 한다고 볼 수 있다.
현재 해조류(감태), 귀리, 누에, 표고버섯, 울금, 연근 및 인삼 등을 prebiotics의 역할을 할 수 있는 복합기질로 이용하고 유산균, Bacillus sp. 및 방선균 등 복합균에 의한 발효를 통한 정장작용, 면역개선 및 항노화 등에 유효한 제품에 대한 기술개발은 전무하다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 해조류 및 기타 유용한 기능성 천연물질을 이용하여 장서식 유익미생물 증식 및 장서식 유해 미생물 억제 프로바이오틱스 및 이를 이용한 신바이오틱스 기반 기능성 식품을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 해조류 및 기타 유용 기능성 천연물질로부터 기능성물질 추출을 위한 전처리 공정을 확립하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 프로바이오틱스 및 기능성 식품에 적절한 우수한 생물전환 미생물을 선발하고 선발된 미생물을 이용한 장서식 유익미생물 증식 및 장서식 유해 미생물 억제 프로바이오틱스 및 프리바이오틱스의 역할을 할 수 있는 복합기질을 이용한 기능성 식품을 제공하는 것이다.
발명이 해결하고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 기탁번호 KCTC13836BP로 기탁되어 정장작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혼합균주 및 기탁번호 KCTC13837BP로 기탁되어 정장작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혼합균주이다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC13836BP의 혼합균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물 및 상기 기탁번호 KCTC13837BP의 혼합균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물이다.
또한, 기탁번호 KCTC13836BP의 혼합균주 또는 이의 배양물이 유효성분인 프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물 및 기탁번호 KCTC13837BP의 혼합균주 또는 이의 배양물이 유효성분인 프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물이다.
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명은 해조류 및 기타 유용한 기능성 천연물질을 이용하여 장서식 유익미생물 증식 및 장서식 유해 미생물 억제 프로바이오틱스 및 이를 이용한 기능성 식품을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 해조류 및 기타 유용 기능성 천연물질로부터 기능성물질 추출을 위한 전처리 공정을 확립할 수 있다.
또한, 본 발명은 프로바이오틱스 및 기능성 식품에 적절한 우수한 생물전환 미생물을 선발하고 선발된 미생물을 이용한 장서식 유익미생물 증식 및 장서식 유해 미생물 억제 프로바이오틱스 및 이를 이용한 기능성 식품을 제공할 수 있다.
도 1은 대조군(C1, C2, C3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 NO 생성도로 측정된 항염증 결과 그래프이다.
도 2는 J1 처리군(J1-1, J1-2, J1-3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 NO 생성도로 측정된 항염증 결과 그래프이다.
도 3은 순수균의 혼합균(P) 처리군(P1, P2, P3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 NO 생성도로 측정된 항염증 결과 그래프이다.
도 4는 대조군(C1, C2, C3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과 그래프이다.
도 5는 J1 처리군(J1-1, J1-2, J1-3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과 그래프이다.
도 6은 순수균의 혼합균(P) 처리군(P1, P2, P3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과 그래프이다.
도 7은 현장 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 NO 생성도로 측정된 항염증 결과 그래프이다.
도 8은 현장 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과 그래프이다.
도 9는 KG-41(70대 대상자)의 장내세균총(gut microbiome)의 다양성지수, 균형지수, 장유형, 발생가능 장질병유형, 위험균 및 유익균의 분포변화를 나타낸 분석표이다.
도 10은 SH-55(60대 대상자)의 장내세균총(gut microbiome)의 다양성지수, 균형지수, 장유형, 발생가능 장질병유형, 위험균 및 유익균의 분포변화를 나타낸 분석표이다.
도 11은 LH-62(50대 후반 대상자)의 장내세균총(gut microbiome)의 다양성지수, 균형지수, 장유형, 발생가능 장질병유형, 위험균 및 유익균의 분포변화를 나타낸 분석표이다.
도 12는 KS-67(50대 초반 대상자)의 장내세균총(gut microbiome)의 다양성지수, 균형지수, 장유형, 발생가능 장질병유형, 위험균 및 유익균의 분포변화를 나타낸 분석표이다.
도 13은 PA-71(40대 대상자)의 장내세균총(gut microbiome)의 다양성지수, 균형지수, 장유형, 발생가능 장질병유형, 위험균 및 유익균의 분포변화를 나타낸 분석표이다.
도 14는 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 염기서열 결정 유전자수에 따른 Chao1 의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15는 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 염기서열 결정 유전자수에 따른 OTUs 의 변화 그래프이다.
도 16은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 염기서열 결정 유전자수에 따른 PD whole tree 의 변화 그래프이다.
도 17은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 OTUs 및 Chao1 의 변화 비교 그래프이다.
도 18은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 Shannon 및 Inverse Simpson 지수의 변화 비교 그래프이다.
도 19는 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 장내미생물군집 OTUs, Chao1, Shannon 및 Inverse Simpson 지수의 변화율 비교 그래프이다.
도 20은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 Unweighted pair group method (UPGMA)의 변화 비교
도 21은 J1 종균 발효식 섭취 전의 시료의 장내미생물군집의 문(phylum)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 22는 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 장내미생물군집의 문(phylum)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 23은 J1 종균 발효식 섭취 전의 시료의 장내미생물군집의 속(genus)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 24는 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 장내미생물군집의 속(genus)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 25는 J1 종균 발효식 섭취 전의 시료의 장내미생물군집의 종(species)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 26은 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 장내미생물군집의 종(species)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 27은 상기 KCTC13836BP 및 KCTC13837BP의 혼합균주를 각각 1000배 희석한 후 TSA에 접종 후 배양모습을 나타낸 사진이다.
도 28은 본 발명에서 진행된 모든 실험 과정을 나타낸 순서도이다.
도 2는 J1 처리군(J1-1, J1-2, J1-3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 NO 생성도로 측정된 항염증 결과 그래프이다.
도 3은 순수균의 혼합균(P) 처리군(P1, P2, P3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 NO 생성도로 측정된 항염증 결과 그래프이다.
도 4는 대조군(C1, C2, C3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과 그래프이다.
도 5는 J1 처리군(J1-1, J1-2, J1-3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과 그래프이다.
도 6은 순수균의 혼합균(P) 처리군(P1, P2, P3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과 그래프이다.
도 7은 현장 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 NO 생성도로 측정된 항염증 결과 그래프이다.
도 8은 현장 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과 그래프이다.
도 9는 KG-41(70대 대상자)의 장내세균총(gut microbiome)의 다양성지수, 균형지수, 장유형, 발생가능 장질병유형, 위험균 및 유익균의 분포변화를 나타낸 분석표이다.
도 10은 SH-55(60대 대상자)의 장내세균총(gut microbiome)의 다양성지수, 균형지수, 장유형, 발생가능 장질병유형, 위험균 및 유익균의 분포변화를 나타낸 분석표이다.
도 11은 LH-62(50대 후반 대상자)의 장내세균총(gut microbiome)의 다양성지수, 균형지수, 장유형, 발생가능 장질병유형, 위험균 및 유익균의 분포변화를 나타낸 분석표이다.
도 12는 KS-67(50대 초반 대상자)의 장내세균총(gut microbiome)의 다양성지수, 균형지수, 장유형, 발생가능 장질병유형, 위험균 및 유익균의 분포변화를 나타낸 분석표이다.
도 13은 PA-71(40대 대상자)의 장내세균총(gut microbiome)의 다양성지수, 균형지수, 장유형, 발생가능 장질병유형, 위험균 및 유익균의 분포변화를 나타낸 분석표이다.
도 14는 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 염기서열 결정 유전자수에 따른 Chao1 의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15는 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 염기서열 결정 유전자수에 따른 OTUs 의 변화 그래프이다.
도 16은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 염기서열 결정 유전자수에 따른 PD whole tree 의 변화 그래프이다.
도 17은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 OTUs 및 Chao1 의 변화 비교 그래프이다.
도 18은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 Shannon 및 Inverse Simpson 지수의 변화 비교 그래프이다.
도 19는 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 장내미생물군집 OTUs, Chao1, Shannon 및 Inverse Simpson 지수의 변화율 비교 그래프이다.
도 20은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 장내미생물군집 Unweighted pair group method (UPGMA)의 변화 비교
도 21은 J1 종균 발효식 섭취 전의 시료의 장내미생물군집의 문(phylum)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 22는 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 장내미생물군집의 문(phylum)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 23은 J1 종균 발효식 섭취 전의 시료의 장내미생물군집의 속(genus)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 24는 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 장내미생물군집의 속(genus)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 25는 J1 종균 발효식 섭취 전의 시료의 장내미생물군집의 종(species)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 26은 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 장내미생물군집의 종(species)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 27은 상기 KCTC13836BP 및 KCTC13837BP의 혼합균주를 각각 1000배 희석한 후 TSA에 접종 후 배양모습을 나타낸 사진이다.
도 28은 본 발명에서 진행된 모든 실험 과정을 나타낸 순서도이다.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대해 간략히 설명하고, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
명세서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
아래에서는 첨부한 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명에 대한 해결하고자 하는 과제, 과제의 해결 수단, 발명의 효과를 포함한 구체적인 사항들은 다음에 기재할 실시 예 및 도면들에 포함되어 있다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명인 기탁번호 KCTC13836BP 및 기탁번호 KCTC13837BP의 혼합균주는 2019년 04월 17일 생물자원센터(KCTC)에 의해 기탁되었다.
상기 KCTC13836BP 및 KCTC13837BP 혼합균주는 혼합미생물로 25~30℃ 온도에서 Trypticase soy agar 배지에서 배양되었다. 상기 KCTC13836BP 및 KCTC13837BP 혼합균주는 Trypticase soy broth (15% glycerol)의 보존용액에서 -80℃ 온도에서 보존되는 것이 바람직하다.
상기 KCTC13836BP의 혼합균주는 혼합원균주 2g을 phosphate-buffer saline 용액(40ml)에 잘 현탁한 다음 실온에서 30분간 진탕한 후 상등액을 10배씩 연속 희석한 후 Trypticase soy agar 배지에 접종하여 25~30℃에서 5-7일간 배양 후 생존성 확인하였다. 상기 KCTC13836BP 및 KCTC13837BP의 혼합균주를 1000배 희석한 후 TSA에 접종후 배양모습을 [도 27(A)] 및 [도 27(B)]에 각각 나타내었다.
상기 KCTC13836BP 및 상기 KCTC13837BP의 혼합균주의 혼합미생물 조성은 미강 외 수종의 곡물 야채 발효물질이 부형제로 함유되며 원종균은 분말상태이다.
상기 KCTC13836BP(이하 J1 복합균)은 pyrosequecning 분석결과Streptomyces scabiei group외 325종이며, 상기 KCTC13837BP(이하 J2 복합균)은 pyrosequecning 분석결과 Lactobacillus acidipiscis 포함 356종이다.
아래는 생물전환물질의 기능성 분석 방법을 나타내고자 한다.
1. 항산화 효능 평가(DPPH ASSAY)
항산화 효과의 측정은 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl(DPPH)을 사용한 방법으로 시료의 자유 라디칼 소거활성을 측정한다. 즉, 에탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH용액 950 mL에 시료를 DMSO에 녹여 농도(0, 2, 10, 40 80, 120 μg/mL)별로 희석한 시료 50 μL를 가한 후 실온에서 30 분간 incubation 후 517 nm에서 흡광도를 측정한다. 항산화 활성은 아래와 같이 계산한다.
항산화활성(%)=1-(시료 첨가군의 흡광도/시료 무첨가군의 흡광도)x100
2. 총 페놀 함량
Folin과 Ciocalteu를 사용하여 추출물을 측정 Singleton 및 Rossi(1965)에 의해 기술된 방법을 약간 수정하여 실시한다. 분광광도계를 사용하여 샘플 및 표준시험 샘플을 765nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료(0.2 mL)는 0.6 mL의 물과 Folin-Ciocalteu페놀시약(1 : 1) 0.2mL 혼합한다. 5 분후 1 mL의 포화탄산나트륨용액 (8% w/v 수용액)을 혼합물에 첨가하고 증류수로 최대 3mL 부피로 채운다. 이후 30 분간 암상태에서 반응을 수행하고 원심 분리한 후 청색상등액을 765 nm에서 측정한다.
페놀함량은 표준곡선을 기준으로 한 갈산당량(GAE/g)으로 계산된다. (5 - 500 mg / L, Y = 0.0027x-0.0055, R2 = 0.9999). 모든 시험은 3 회 수행된다.
3. 항염 효능평가 (LPS로 자극한 RAW cell에서 NO 생성의 억제효능)
RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5x105cells/mL로 조절한 후 24well plate에 접종하고 시험물질과 LPS 1μg/mL을 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양해준다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정한다. 세포 배양 상등액 100μL와 Griess시약 [1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid]100μL을 혼합하여 96well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정해준다. 표준농도곡선은 sodium nitrite(NaNO2)를 serial dilution하여 얻는다(1-100μM).
4. 면역력 증강 효능평가 (LPS로 자극한 RAW cell에서 TNF-α, IL-6 생성의 억제효능)
RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1x106 cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 5% CO2 항온기에서 18시간 전 배양해준다. 이 후 배지를 제거하고 10배 농도(1mg/mL로 조제된 시험물질) 50μL와 450μL의 LPS 최종농도 (1μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전배양과 동일조건에서 배양한다. 6시간 후 배양배지를 원심분리(12,000rpm, 3min)하여 얻어진 상층액의 TNF-α 및 IL-6 함량을 측정해준다.
5. 세포독성평가 (MTT assay)
배양된 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 각각 1×104cells/well로 분주하고 24시간 배양한다. 배양 후, 10% 희석한 시료를 농도별로 배지에 희석하여 처리 한 후 12시간 동안 CO2 incubator에서 배양한다. EZ-Cytox를 각 well에 20 μL씩 넣어 37℃, 5% CO2 incubator에서 2시간 반응시킨다. ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한다.
아래는 본 발명의 생물전환 조건에 대해 설명하고자 한다. 실험실 조건에서의 기질의 생물전환조건 생물전환은 기본적으로 아래의 시험 계획에 의거해서 실시하며 항산화능 및 항염증의 분석을 실시하였다.
1. 생물전환 조건 분석
[표 1]은 실험실 조건에서 생물전환 조건을 나타내었다.
| 기호 | 처리구1 | 주기질(g)2 | 미강(g) | 접종원(ml) |
| 1 | Control(C) | 250 | 250 | 50* |
| 2 | P | 250 | 250 | 50** |
| 3 | J1 | 250 | 250 | 50*** |
13반복; 2혼합기질; *살균증류수; **우점혼합균; Virgibacillus halotolerans, Bacillus pumilus, Bacillus tequilensis 및 Pediococcus acidilactici; (TSB culture); ***J1 복합균
[표 2]는 현장 pilot 조건에서 생물전환 조건을 나타내었다. 생물전환은 기본적으로 아래의 시험계획에 의거해서 실시하며 항산화능 및 항염증의 분석을 실시하였다.
| 기호 | 처리구1 | 주기질(kg)2 | 접종원 |
| 1 | J1 | 5 | 50g* |
| 2 | J2 | 5 | 50g** |
| 3 | J3(Control) | 5 | 50mL*** |
13반복; 2혼합기질; *J1 복합균; **J2 복합균; ***살균증류수
2. 항산화 효능 평가 결과(실험실 조건, 7일 발효, 생물전환 조건)
아래는 7일 동안 발효하여 실험실 조건에서 생물전환 조건의 실험결과를 나타내었다.
1) 항산화물질 생성도(DPPH 라디칼소거능; DPPH)
[표 3]은 실험실 조건의 생물전환 조건에서 항산화물질 생성도(DPPH)의 결과를 나타내었다.
| Blank | 0.881(흡광도) | |||
| Control 1 | 반복1 | 반복2 | 평균 | % SCV |
| 1 | 0.213 | 0.215 | 0.214 | 75.71 |
| 2 | 0.224 | 0.226 | 0.225 | 74.46 |
| 3 | 0.185 | 0.189 | 0.187 | 78.77 |
| 76.31 | ||||
| P 2 | 반복1 | 반복2 | 평균 | % SCV |
| 1 | 0.165 | 0.166 | 0.1655 | 81.21 |
| 2 | 0.186 | 0.18 | 0.183 | 79.23 |
| 3 | 0.202 | 0.207 | 0.2045 | 76.79 |
| 79.08 | ||||
| J1 3 | 반복1 | 반복2 | 평균 | % SCV |
| 1 | 0.248 | 0.248 | 0.248 | 71.85 |
| 2 | 0.229 | 0.229 | 0.229 | 74.01 |
| 3 | 0.242 | 0.24 | 0.241 | 72.64 |
| 72.83 | ||||
1 살균증류수반복; 2순수혼합균; *J1 복합균
[표 3]의 결과를 보면 대조군(C)일 때 생물전환이 76.31%이고, J1 복합균일 때 72.83%로 가장 낮음을 확인할 수 있다. 또한, 순수균의 혼합균(P; Virgibacillus halotolerans, Bacillus pumilus, Bacillus tequilensis 및 Pediococcus acidilactici)의 전환은 79.08%로 가장 높음을 알 수 있다.
[표 3]에서 Blank의 평균 흡광도는 0.881로 시료대신에 증류수를 넣고 측정한 흡광도로, 소거능계산에 활용된다.
2) 항산화물질 생성도 (Trolox 등가 항산화 제 용량 분석; Trolox equivalent antioxidant capacity; TEAC)
[표 4]는 실험실 조건의 생물전환 조건에서 항산화물질 생성도 (TEAC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 반복1 | 반복2 | 평균 | TEAC (mM/0.1g) | Dlution (10X) | TEAC (mM/g) | 평균 |
| C-1 | 0.574 | 0.574 | 0.574 | 2.69 | 26.9 | 26.9 | |
| C-2 | 0.563 | 0.562 | 0.563 | 2.64 | 26.4 | 26.4 | |
| C-3 | 0.565 | 0.565 | 0.565 | 2.65 | 26.5 | 26.5 | 26.6 |
| P-1 | 0.509 | 0.506 | 0.508 | 2.38 | 23.8 | 23.8 | |
| P-2 | 0.507 | 0.505 | 0.506 | 2.37 | 23.7 | 23.7 | |
| P-3 | 0.482 | 0.482 | 0.482 | 2.26 | 22.6 | 22.6 | 23.4 |
| J1-1 | 0.426 | 0.43 | 0.428 | 2.01 | 20.1 | 20.1 | |
| J1-2 | 0.413 | 0.426 | 0.420 | 1.97 | 19.7 | 19.7 | |
| J1-3 | 0.417 | 0.416 | 0.417 | 1.95 | 19.5 | 19.5 | 19.7 |
[표 4]의 결과를 보면 대조군(C)일 때 평균값이 26.6이고, 순수균의 혼합균(P)일 때 23.4이며, J1 복합균일 때 19.7로 모든 균주 처리군이 대조군(C)에 비해 낮음을 확인할 수 있다.
3) 항산화물질 생성도 (총플라보노이드 함량; TFC)
[표 5]는 실험실 조건에서 생물 전환 된 시료의 항산화물질 생성도 (TFC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 반복1 | 반복2 | 평균 | QE μg/0.1g | QE mg/0.1g | QE mg/g | |
| C-1 | 0.317 | 0.317 | 0.32 | 206 | 0.206 | 2.1 | |
| C-2 | 0.321 | 0.321 | 0.32 | 209 | 0.209 | 2.1 | |
| C-3 | 0.317 | 0.317 | 0.32 | 206 | 0.206 | 2.1 | 2.074 |
| P-1 | 0.432 | 0.437 | 0.43 | 285 | 0.285 | 2.8 | |
| P-2 | 0.417 | 0.414 | 0.42 | 272 | 0.272 | 2.7 | |
| P-3 | 0.447 | 0.44 | 0.44 | 291 | 0.291 | 2.9 | 2.826 |
| J1-1 | 0.398 | 0.396 | 0.40 | 260 | 0.260 | 2.6 | |
| J1-2 | 0.387 | 0.387 | 0.39 | 253 | 0.253 | 2.5 | |
| J1-3 | 0.407 | 0.411 | 0.41 | 268 | 0.268 | 2.7 | 2.602 |
[표 5]의 결과를 보면 대조군(C)일 때 평균값이 2.074이고, J1 복합균일 때 2.602 및 순수균의 혼합균(P)일 때 2.826로 모든 균주 처리군이 대조군(C)에 비해 높음을 확인할 수 있다.
4) 항산화물질 생성도 (총페놀함량; TPC)
[표 6]은 실험실 조건에서 생물 전환 된 시료의 항산화물질 생성도 (TPC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 반복1 | 반복2 | 평균 | GAE μg/0.2g | GAE mg/mL | Dilution (100X) | GAE mg/g | |
| C-1 | 0.233 | 0.234 | 0.23 | 50 | 0.05 | 5.0 | 5.0 | |
| C-2 | 0.239 | 0.239 | 0.24 | 59 | 0.06 | 5.9 | 5.9 | |
| C-3 | 0.241 | 0.241 | 0.24 | 62 | 0.06 | 6.2 | 6.2 | 5.7 |
| P-1 | 0.256 | 0.251 | 0.25 | 83 | 0.08 | 8.3 | 8.3 | |
| P-2 | 0.242 | 0.241 | 0.24 | 63 | 0.06 | 6.3 | 6.3 | |
| P-3 | 0.268 | 0.269 | 0.27 | 108 | 0.11 | 10.8 | 10.8 | 8.5 |
| J1-1 | 0.265 | 0.263 | 0.26 | 101 | 0.10 | 10.1 | 10.1 | |
| J1-2 | 0.279 | 0.275 | 0.28 | 122 | 0.12 | 12.2 | 12.2 | |
| J1-3 | 0.271 | 0.275 | 0.27 | 116 | 0.12 | 11.6 | 11.6 | 11.3 |
[표 6]을 보면 순수균의 혼합균(P) 전환 결과인 8.5과 혼합균(J1) 전환 결과인 11.3이 대조군(C) 전환 결과 5.7에 비해 높음을 확인할 수 있다.
3. 항산화 효능 평가 결과(실험실 조건, 14일 발효, 생물전환 조건)
아래는 14일 동안 발효하여 실험실 조건에서 생물전환 조건의 실험결과를 나타내었다.
1) 항산화물질 생성도(DPPH)
[표 7]은 실험실 조건의 생물전환 조건에서 항산화물질 생성도(DPPH)의 결과를 나타내었다.
| DPPH | Blank | 0.638(흡광도) | |||
| Control | 반복1 | 반복2 | 평균 | % SCV | |
| 1 | 0.178 | 0.172 | 0.175 | 72.57 | |
| 2 | 0.498 | 0.49 | 0.494 | 22.57 | |
| 3 | 0.801 | 0.81 | 0.8055 | -26.25 | |
| P | 반복1 | 반복2 | 평균 | % SCV | |
| 1 | 0.869 | 0.869 | 0.869 | -36.21 | |
| 2 | 0.811 | 0.812 | 0.8115 | -27.19 | |
| 3 | 0.817 | 0.819 | 0.818 | -28.21 | |
| J-1 | 반복1 | 반복2 | 평균 | % SCV | |
| 1 | 0.756 | 0.761 | 0.7585 | -18.89 | |
| 2 | 0.675 | 0.675 | 0.675 | -5.80 | |
| 3 | 0.822 | 0.821 | 0.8215 | -28.76 |
[표 7]의 결과를 보면 순수균(P)은 -28.21이고 J1 처리군은 -28.76이며 대조군(C)은 -26.25로, 순수균(P)과 J1 처리군이 대조군(C)에 비해 낮게 나타남을 확인할 수 있다.
2) 항산화물질 생성도 (Trolox 등가 항산화 제 용량 분석; Trolox equivalent antioxidant capacity; TEAC)
[표 8]은 실험실 조건의 생물전환 조건에서 항산화물질 생성도 (TEAC)의 결과를 나타내었다.
|
Sample value =
Blank - Absorance |
Blank |
0.724
(흡광도) |
|||||
| 반복1 | 반복2 | 평균 | TEAC mM/0.1g | Dlution (10X) | TEAC (mM/g) | ||
| C-1 | 0.694 | 0.685 | 0.690 | 3.23 | 32.3 | 26.9 | |
| C-2 | 0.627 | 0.648 | 0.638 | 2.99 | 29.9 | 26.4 | |
| C-3 | 0.668 | 0.669 | 0.669 | 3.13 | 31.3 | 26.5 | 26.6 |
| P-1 | 0.756 | 0.744 | 0.750 | 3.52 | 35.2 | 23.8 | |
| P-2 | 0.788 | 0.796 | 0.792 | 3.71 | 37.1 | 23.7 | |
| P-3 | 0.768 | 0.76 | 0.764 | 3.58 | 35.8 | 22.6 | 23.4 |
| J1-1 | 0.73 | 0.712 | 0.721 | 3.38 | 33.8 | 20.1 | |
| J1-2 | 0.795 | 0.796 | 0.796 | 3.73 | 37.3 | 19.7 | |
| J1-3 | 0.745 | 0.749 | 0.747 | 3.50 | 35.0 | 19.5 | 19.7 |
[표 8]의 결과를 보면 대조군(C)일 때 평균값이 26.6이고, 순수균의 혼합균(P)일 때 23.4이며, J1 복합균일 때 19.7로 모든 균주 처리군이 대조군(C)에 비해 낮음을 확인할 수 있다.
3) 항산화물질 생성도 (총플라보노이드 함량; TFC)
[표 9]는 실험실 조건에서 생물 전환 된 시료의 항산화물질 생성도 (TFC)의 결과를 나타내었다.
| Sample | 반복1 | 반복2 | 평균 | QE μg/0.1g | QE mg/0.1g | QE mg/g | |
| C-1 | 1.236 | 1.231 | 1.23 | 817 | 0.817 | 8.2 | |
| C-2 | 1.479 | 1.485 | 1.48 | 983 | 0.983 | 9.8 | |
| C-3 | 1.512 | 1.512 | 1.51 | 1003 | 1.003 | 10.0 | 9.3 |
| P-1 | 1.504 | 1.496 | 1.50 | 995 | 0.995 | 10.0 | |
| P-2 | 1.417 | 1.419 | 1.42 | 940 | 0.940 | 9.4 | |
| P-3 | 1.417 | 0.419 | 0.92 | 607 | 0.607 | 6.1 | 8.5 |
| J1-1 | 1.329 | 1.333 | 1.33 | 882 | 0.882 | 8.8 | |
| J1-2 | 1.387 | 1.38 | 1.38 | 917 | 0.917 | 9.2 | |
| J1-3 | 1.371 | 1.377 | 1.37 | 911 | 0.911 | 9.1 | 9.0 |
[표 9]의 결과를 보면 대조군(C)일 때 9.3이고, J1 복합균일 때 9.0 및 순수균의 혼합균(P)일 때 8.5로 모든 균주 처리군이 대조군(C)에 비해 낮음을 확인할 수 있다.
4) 항산화물질 생성도 (총페놀함량; TPC)
[표 10]은 실험실 조건에서 생물 전환 된 시료의 항산화물질 생성도 (TPC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 반복1 | 반복2 | 평균 | GAE μg/0.2g | GAE mg/mL | Dilution (100X) | GAE mg/g | Avg. mg/g |
| C-1 | 1.239 | 1.237 | 1.24 | 1724 | 1.72 | 172.4 | 172.4 | |
| C-2 | 1.284 | 1.281 | 1.28 | 1798 | 1.80 | 179.8 | 179.8 | |
| C-3 | 1.425 | 1.441 | 1.43 | 2049 | 2.05 | 204.9 | 204.9 | 185.7 |
| P-1 | 1.585 | 1.597 | 1.59 | 2312 | 2.31 | 231.2 | 231.2 | |
| P-2 | 1.343 | 1.343 | 1.34 | 1899 | 1.90 | 189.9 | 189.9 | |
| P-3 | 1.351 | 1.357 | 1.35 | 1917 | 1.92 | 191.7 | 191.7 | 204.3 |
| J1-1 | 1.548 | 1.541 | 1.54 | 2235 | 2.23 | 223.5 | 223.5 | |
| J1-2 | 1.459 | 1.458 | 1.46 | 2092 | 2.09 | 209.2 | 209.2 | |
| J1-3 | 1.522 | 1.521 | 1.52 | 2197 | 2.20 | 219.7 | 219.7 | 217.4 |
[표 10]을 보면 순수균의 혼합균(P) 전환 결과인 204.3과 혼합균(J1) 전환 결과인 217.4이 대조군(C) 전환 결과 185.7에 비해 높음을 확인할 수 있다. 따라서 7일 발효에 비해서 14일 발효가 TPC의 함량증가에 기여를 함을 확인할 수 있다. 이는 본 실험실 발효조건(온도, 습도 등)에서는 발효기간이 연장이 될수록 TPC의 함량증가에 유리한 것임을 의미한다.
4. 항산화 효능 평가 결과(현장 PILOT 조건, 1차, 14일 발효, 생물전환 조건)
아래는 14일 동안 발효하여 현장 PILOT 조건에서 생물전환 조건의 실험결과를 나타내었다.
1) 항산화물질 생성도(DPPH)
[표 11]은 현장 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 항산화물질 생성도(DPPH)의 결과를 나타내었다.
| DPPH | Blank | 0.467(흡광도) | |||
| 반복1 | 반복2 | 평균 | % SCV | ||
| J-1 | 0.049 | 0.049 | 0.049 | 89.51 | |
| J-2 | 0.047 | 0.049 | 0.048 | 89.72 | |
| J-3 (Control) | 0.046 | 0.048 | 0.047 | 89.94 |
[표 11]의 결과를 보면 J-1 처리군은 89.51이고 J-2 처리군은 89.72이며 대조군(J-3)은 89.94로, 처리군과 대조군과의 차이가 없음을 확인할 수 있다.
2) 항산화물질 생성도 (TEAC)
[표 12]는 현장 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 항산화물질 생성도 (TEAC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 반복1 | 반복2 | 평균 | TEAC (mM/0.1g) | Dlution (10X) | TEAC (mM/g) |
| J-1 | 0.348 | 0.356 | 0.352 | 1.649 | 16.485 | 16.4 |
| J-2 | 0.362 | 0.361 | 0.362 | 1.693 | 16.931 | 16.9 |
| J-3(control) | 0.349 | 0.356 | 0.353 | 1.651 | 16.509 | 16.5 |
[표 12]의 결과를 보면 대조군(J-3)일 때 항산화물질 생성도 (TEAC)가 16.5이고 J-1처리군 일 때 16.4이며 J-2처리군 일 때 16.9임을 확인할 수 있다. 따라서 J-2처리군이 가장 높게 나타남을 확인할 수 있다.
3) 항산화물질 생성도 (TFC)
[표 13]는 현장 PILOT 조건에서 생물 전환 된 시료의 항산화물질 생성도 (TFC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 반복1 | 반복2 | 평균 | QE μg/0.2g | QE mg/0.2g |
QE mg/g
(50X) |
| J-1 | 0.149 | 0.152 | 0.15 | 95 | 0.095 | 4.8 |
| J-2 | 0.141 | 0.139 | 0.14 | 88 | 0.088 | 4.4 |
| J-3, control | 0.148 | 0.147 | 0.15 | 93 | 0.093 | 4.7 |
[표 13]의 결과를 보면 대조군(J-3)일 때 4.7이고, J-1 복합균일 때 4.8 및 J-2일 때 4.4로 혼합균(J1)전환이 대조군에 비해 높은 항산화도를 보임을 확인할 수 있다.
4) 항산화물질 생성도 (TPC)
[표 14]은 현장 PILOT 조건에서 생물 전환 된 시료의 항산화물질 생성도 (TPC)의 결과를 나타내었다.
| Sample | 반복1 | 반복2 | 평균 | GAE μg/0.2g | GAE mg/mL | Dilution (100X) | GAE mg/g |
| J-1 | 0.387 | 0.341 | 0.364 | 488 | 0.488 | 48.8 | 48.8 |
| J-2 | 0.441 | 0.43 | 0.4355 | 846 | 0.846 | 84.6 | 84.6 |
| J-3(control) | 0.381 | 0.379 | 0.38 | 568 | 0.568 | 56.8 | 56.8 |
[표 14]를 보면 J-1 혼합균 전환 결과는 48.8이고 J-2 혼합균 전환 결과는 84.6이며 대조군(J-3) 전환 결과는 56.8임을 확인할 수 있다. 따라서 혼합균(J-2)전환이 대조군에 비해 높은 항산화도를 보임을 확인할 수 있다.
5. 항산화 효능 평가 결과(현장 PILOT 조건, 2차, 7일 발효, 생물전환 조건)
아래는 7일 동안 발효하여 현장 PILOT 조건에서 생물전환 조건의 실험결과를 나타내었다.
1) 항산화물질 생성도(DPPH)
[표 15]는 현장 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 항산화물질 생성도(DPPH)의 결과를 나타내었다.
| PIILOT SCALE | |||
| Control | 흡광도 | % SCV | 평균 |
| 반복 1 | 0.151 | 81.45 | |
| 반복 2 | 0.157 | 80.71 | 81.00 |
| 반복 3 | 0.156 | 80.84 | |
| J-1 (P) | 흡광도 | 평균 | |
| 반복 1 | 0.124 | 84.77 | |
| 반복 2 | 0.125 | 84.64 | 84.73 |
| 반복 3 | 0.124 | 84.77 | |
| J-2 ( J1) | 흡광도 | 평균 | |
| 반복 1 | 0.143 | 82.43 | |
| 반복 2 | 0.144 | 82.31 | 82.19 |
| 반복 3 | 0.148 | 81.82 |
[표 15]의 결과를 보면 J-1 처리군(P)은 84.73이고 J-2 처리군(J1)은 89.19이며 대조군(CONTROL)은 81.00으로, 순수균의 혼합균(P)과 J-2 처리군(J1)의 전환이 대조군(CONTROL)에 비해 높음을 확인할 수 있다.
2) 항산화물질 생성도 (TEAC)
[표 16]은 현장 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 항산화물질 생성도 (TEAC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 반복 1 | 반복 2 | 반복 3 | 평균 | TEAC mM/0.1g | Dlution (10X) | TEAC (mM/g) |
| Control | 0.659 | 0.659 | 0.659 | 0.659 | 3.089 | 30.89 | 30.9 |
| P | 0.468 | 0.433 | 0.436 | 0.446 | 2.088 | 20.88 | 20.9 |
| J-1 | 0.514 | 0.52 | 0.533 | 0.522 | 2.447 | 24.47 | 24.5 |
[표 16]의 결과를 보면 대조군(Control)일 때 항산화물질 생성도 (TEAC)가 30.9이고 순수균의 혼합균(P)일 때 20.9 및 J-1 처리군 일 때 24.5임을 확인할 수 있다. 따라서 균주 처리군이 대조군에 비해 낮음을 확인할 수 있다.
3) 항산화물질 생성도 (TFC)
[표 17]는 현장 PILOT 조건에서 생물 전환 된 시료의 항산화물질 생성도 (TFC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 반복 1 | 반복 2 | 반복 3 | 평균 | QE μg/0.1g | QE mg/0.1g | QE mg/g |
| Control | 0.44 | 0.448 | 0.442 | 0.44 | 291 | 0.291 | 2.9 |
| P | 0.517 | 0.518 | 0.517 | 0.52 | 340 | 0.340 | 3.4 |
| J-1 | 0.437 | 0.451 | 0.461 | 0.45 | 295 | 0.295 | 2.9 |
[표 17]의 결과를 보면 대조군(Control)일 때 2.9이고, 순수균의 혼합균(P)일 때 3.4 및 J-1 처리군 일 때 2.9이다. 모든 순수균의 혼합균(P)의 전환이 대조군(Control)에 비해 17% 높음을 확인할 수 있다.
4) 항산화물질 생성도 (TPC)
[표 18]은 현장 PILOT 조건에서 생물 전환 된 시료의 항산화물질 생성도 (TPC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 1 | 2 | 3 | 평균 | GAE μg/0.2g | GAE mg/mL | Dilution (100X) | GAE mg/g |
| Control | 0.275 | 0.275 | 0.271 | 0.274 | 116.78 | 0.1168 | 11.68 | 1167.78 |
| P | 0.273 | 0.27 | 0.299 | 0.281 | 128.44 | 0.1284 | 12.84 | 1284.44 |
| J-1 | 0.253 | 0.251 | 0.253 | 0.252 | 81.22 | 0.0812 | 8.12 | 812.22 |
[표 18]을 보면 대조군(Control)일 때 1167.78이고, 순수균의 혼합균(P)일 때 1284.44 및 J-1 처리군 일 때 812.22이다. 모든 순수균의 혼합균의 전환이 대조군에 비해 10% 높음을 확인할 수 있다.
6. 항산화 효능 평가 결과(현장 PILOT 조건, 2차, 14일 발효, 생물전환 조건)
아래는 14일 동안 발효하여 현장 PILOT 조건에서 2차 생물전환 조건의 실험결과를 나타내었다.
1) 항산화물질 생성도(DPPH)
[표 19]는 현장 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 항산화물질 생성도(DPPH)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 흡광도 | % SCV | Average |
| Blank | 0.881 | ||
| Control | |||
| 반복 1 | 0.2 | 75.43 | |
| 반복 2 | 0.207 | 74.57 | 75.10 |
| 반복 3 | 0.201 | 75.31 | |
| P | Absorbance | Average | |
| 반복 1 | 0.171 | 78.99 | |
| 반복 2 | 0.173 | 78.75 | 78.83 |
| 반복 3 | 0.173 | 78.75 | |
| J1 | Absorbance | Average | |
| 반복 1 | 0.201 | 75.31 | |
| 반복 2 | 0.21 | 74.20 | 74.61 |
| 반복 3 | 0.209 | 74.32 |
[표 19]의 결과를 보면 대조군(CONTROL)은 74.61이고 순수균의 혼합균(P)은 78.83이며 J1처리군은 74.61으로, 순수균의 혼합균(P) 처리군의 전환이 대조군에 비해 높음을 확인할 수 있다.
2) 항산화물질 생성도 (TEAC)
[표 20]은 현장 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 항산화물질 생성도 (TEAC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 1 | 2 | 3 | 평균 | TEAC mM/0.1g | Dlution (10X) | TEAC (mM/g) |
| Control | 0.659 | 0.659 | 0.659 | 0.659 | 3.089 | 30.892 | 30.9 |
| P | 0.468 | 0.433 | 0.436 | 0.446 | 2.088 | 20.881 | 20.9 |
| J-1 | 0.514 | 0.52 | 0.533 | 0.522 | 2.447 | 24.478 | 24.5 |
[표 20]의 결과를 보면 대조군(Control)일 때 항산화물질 생성도 (TEAC)가 30.9이고 순수균의 혼합균(P)일 때 20.9 및 J-1 처리군 일 때 24.5임을 확인할 수 있다. 따라서 모든 균주 처리군이 대조군(Control)에 비해 낮음 을 확인할 수 있다.
3) 항산화물질 생성도 (TFC)
[표 21]는 현장 PILOT 조건에서 생물 전환 된 시료의 항산화물질 생성도 (TFC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 반복 1 | 반복 2 | 반복 3 | 평균 | QE μg/0.1g | QE mg/0.1g | QE mg/g |
| Control | 1.744 | 1.758 | 1.758 | 1.75 | 1164 | 1.164 | 11.6 |
| P | 1.867 | 1.851 | 1.862 | 1.86 | 1235 | 1.235 | 12.4 |
| J-1 | 1.812 | 1.824 | 1.821 | 1.82 | 1208 | 1.208 | 12.1 |
[표 20]의 결과를 보면 대조군(Control)일 때 11.6이고, 순수균의 혼합균(P)일 때 12.4 및 J-1 처리군 일 때 12.1이다. 모든 순수균의 혼합균과 J-1 처리군에 의한 전환이 대조(Control)군에 비해 다소 높음을 확인할 수 있다.
4) 항산화물질 생성도 (TPC)
[표 22]는 현장 PILOT 조건에서 생물 전환 된 시료의 항산화물질 생성도 (TPC)의 결과를 나타내었다.
| 시료명 | 반복 1 | 반복 2 | 반복 3 | 평균 | GAE μg/0.2g | GAE mg/mL | Dilution (100X) | GAE mg/g |
| Control | 1.889 | 1.881 | 1.886 | 1.885 | 2802.89 | 2.8029 | 280.29 | 280.3 |
| P | 1.598 | 1.595 | 1.602 | 1.598 | 2324.56 | 2.3245 | 232.46 | 232.5 |
| J-1 | 1.73 | 1.73 | 1.731 | 1.730 | 2544.56 | 2.5445 | 254.46 | 254.5 |
[표 22]를 보면 대조군(Control)일 때 280.3이고, 순수균의 혼합균(P)일 때 232.5 및 J-1 처리군 일 때 254.5이다. 모든 처리군의 전환이 대조군(Control)에 비해 낮음을 확인할 수 있다.
7. 항염 효능 평가 결과(실험실 조건, 2차, 7일 발효, 생물전환 조건)
아래는 7일 동안 발효하여 실험실 조건에서 2차 생물전환 조건의 실험결과를 나타내었다.
1) LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 NO 생성억제로 본 항염증정도의 비교
[도 1 내지 도 3]은 실험실 조건의 생물전환 조건에서 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 항염증 결과를 나타내었다. [도 1]은 대조군(C1, C2, C3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 항염증 결과이고, [도 2]는 J1 처리군(J1-1, J1-2, J1-3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 항염증 결과 및 [도 3]은 순수균의 혼합균(P) 처리군(P1, P2, P3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 항염증 결과를 나타내었다.
[도 2]에 나타난 바와 같이, J1 처리군이 100μg/ml의 농도에서도 대조군이나 순수균의 혼합균처리군에 비해 유의성이 있게 (**p<0.005 )NO의 생성을 억제하므로, 상대적으로 높은 항염증도를 보이는 것으로 확인되었다.
2) LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증정도의 비교
[도 4 내지 도 6]은 실험실 조건의 생물전환 조건에서 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과를 나타내었다. [도 4]는 대조군(C1, C2, C3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과이고, [도 5]는 J1 처리군(J1-1, J1-2, J1-3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과 및 [도 6]은 순수균의 혼합균(P) 처리군(P1, P2, P3)의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과를 나타내었다.
[도 4 내지 도 6]에 나타난 바와 같이, macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제정도는 모든 미생물 처리군과 대조군 시험구에 있어서 시료가 들어가지 않은 무처리시험군(0μg/ml)과 유의한 차이는 보이지 않으므로 제조된 시료간의 항염증도의 차이는 없음이 확인되었다.
8. 항염 효능 평가 결과(현상 PILOT 조건, 1차, 7일 발효, 생물전환 조건)
아래는 14일 동안 발효하여 현상 PILOT 조건에서 1차 생물전환 조건의 실험결과를 나타내었다.
1) LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 NO 생성억제로 본 항염증정도의 비교
[도 7]은 현상 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 항염증 결과를 나타내었다. [도 7(A)]는 J3 처리군, [도 7(B)]는 J1 처리군 및 [도 7(C)]는 J2 처리군의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 NO 생성억제도로 본 항염증 결과를 나타내었다.
[도 7]에 나타난 바와 같이, J3 처리군은 미생물발효시험시 대조군으로서 증류수가 처리된 경우로서, J1 및 J2 복합균이 처리된 시험구에 비해 100μg/ml의 농도에서 오히려 유의성 있게 NO 생성이 억제됨이 관찰되어 복합미생물의 발효효과가 인정되지 않았다.
2) LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증정도의 비교
[도 8]은 현상 PILOT 조건의 생물전환 조건에서 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과를 나타내었다. [도 8(A)]는 J3 처리군, [도 8(B)]는 J1 처리군 및 [도 8(C)]는 J2 처리군의 LPS 자극된 RAW 264.7 macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제로 본 항염증 결과를 나타내었다.
[도 8]에 나타난 바와 같이, J3 처리군은 미생물발효시험시 대조군으로서 증류수가 처리된 경우로서, macrophages 세포의 TNF-alpha 생성억제정도는 모든 미생물 처리군과 대조군 시험구에 있어서 시료가 들어가지 않은 무처리시험군(0μg/ml)과 유의한 차이는 보이지 않으므로 제조된 시료간의 항염증도의 차이는 없음이 확인되었다.
9. J2 발효산물의 인체복용을 통한 정장작용의 분석 결과(현상 PILOT 조건, 생물전환 조건)
상기의 결과를 종합하여 최종 선발된 J2 발효산물을 활용하여 현재 나이별(48, 52, 57, 64 및 78세) 성인 5인(PA-71, KS-67, LH-62, SH-55 및 KG-41)을 선택하여 약 1개월 복용 전 후의 채변을 실시하여 총 DNA를 추출한 다음 ㈜ 매크로젠의 장내 미생물 분석키트와 미생물유전자 분석 플랫폼서비스를 활용, 각 분석대상의 장내 건강도의 향상여부를 분석하였다.
[도 9 내지 도 13]은 시험대상자의 장내세균총(gut microbiome)의 다양성지수, 균형지수, 나의 장유형, 발생가능 장질병유형, 위험균 및 유익균의 분포변화를 분석한 것이다.
[도 9]에 나타난 바와 같이, 70대 대상자 (KG-41)의 경우 비만, 제2형 당뇨 및 실혈관 질환을 유발하는 유해균의 감소를 보였다.
[도 10]에 나타난 바와 같이, 60대 대상자 (SH-55)의 경우 감염성설사, 과민성대장증후군 및 복부팽만을 유발하는 유해균의 감소를 보였다.
[도 11]에 나타난 바와 같이, 50대 후반 대상자(LH-62)의 경우 감염성설사 및 대장암을 유발하는 유해균의 감소를 보였다.
[도 12]에 나타난 바와 같이, 50대 초반 대상자 (KS-67)의 경우 제2형 당뇨를 억제하는 미생물의 증가가 확인되었고 염증성 장질환, 과민성대장증후군, 변비, 복부팽만감, 비알코올성 지방간 및 대장암 등의 유발을 저해하는 미생물의 증가가 있음이 관찰되었다.
[도 13]에 나타난 바와 같이, 40대 대상자 (PA-71)의 경우 비만을 억제하는 미생물의 증가가 확인되었고 염증성 장질환, 변비 및 대장암 등의 유발을 저해하는 미생물의 증가가 있음이 관찰되었다.
나이별 전반적으로 섭취 후 통합미생물의 다양성이 증가하였으며(한국인 코호트 데이터베이스 기반), 장내질병을 야기하는 미생물의 감소 및 저해하는 미생물의 증가를 보여 발효식품의 섭취는 장내의 건강을 유지에 긍정적인 역할을 하는 것으로 판단된다.
10. J1 발효산물의 인체복용 시 장내 미생물군집의 종다양도 변화(현상 PILOT 조건, 생물전환 조건)
1) 염기서열 결정 유전자수에 따른 변화
[도 14]는 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 염기서열 결정 유전자수에 따른 Chao1의 변화를 나타내었다. J1 섭취 후 Chao1는 모든 연령대에서 감소하였으며 LH-62(ORANGE, 50 후반 대상자)가 가장 높은 수준을 보였다.
[도 15]는 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 염기서열 결정 유전자수에 따른 OTUs 의 변화를 나타내었다. J1 섭취 후 섭취 후 OTUs 는 모든 연령대에서 감소하였으며 LH-62(ORANGE, 50대 후반 대상자)가 가장 높은 수준을 보였다.
[도 16]은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 염기서열 결정 유전자수에 따른 PD whole tree 의 변화를 나타내었다. J1 섭취 후 PD whole tree는 모든 연령대에서 감소하였으며 LH-62(ORANGE, 50대 후반 대상자) 및 KS-67(BLUE, 50대 초반 대상자)이 가장 높은 수준을 보였다.
[표 23]은 J1 종균 발효식 섭취 전 및 [표 24]는 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 OTUs, Chao1, Shannon 및 Inverse Simpson 의 변화 비교를 나타내었다. 섭취 전에는 KG-41(70대 대상자)의 OTUs, Shannon 및 Inverse Simpson 가 가장 높은 수준으로 나타났고 섭취 후에는 LH-62(50대 후반 대상자)의 OTUs 및 Chao1이 가장 높은 수준으로 나타났다. PA-71(40대 대상자)은 섭취 전후에 관계없이 모든 지수에서 가장 낮은 수준을 보여 미생물의 다양성이 현저히 낮아서 장의 상태가 양호하지 않음을 증명되었다.
| 시료명 | OTUs | Chao1 | Shannon |
Inverse
Simpson |
Good's
Coverage |
| KG.41 | 178 | 181.600 | 4.445 | 0.912 | 1.000 |
| SH.55 | 150 | 207.750 | 3.992 | 0.880 | 0.999 |
| LH.62 | 175 | 177.813 | 4.258 | 0.886 | 1.000 |
| KS.67 | 166 | 174.077 | 3.257 | 0.744 | 0.999 |
| PA.71 | 119 | 120.750 | 2.098 | 0.530 | 1.000 |
| 시료명 | OTUs | Chao1 | Shannon |
Inverse
Simpson |
Good's
Coverage |
| KG.41 | 111.000 | 115.500 | 3.402 | 0.833 | 0.999 |
| SH.55 | 118.000 | 126.500 | 3.339 | 0.850 | 0.999 |
| LH.62 | 142.000 | 152.500 | 3.223 | 0.788 | 0.999 |
| KS.67 | 125.000 | 129.588 | 3.082 | 0.787 | 0.999 |
| PA.71 | 98.000 | 100.100 | 2.239 | 0.688 | 1.000 |
2) J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 미생물 알파 종다양성 지수 변화
[도 17]은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 OTUs 및 Chao1 의 변화 비교를 나타내었다. OTUs 및 Chao1는 전반적으로 섭취 후에는 감소하는 경향이었고 그 수준은 PA-71(40대 대상자)가 가장 낮음을 확인하였다.
[도 18]은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 Shannon 및 Inverse Simpson 지수의 변화 비교를 나타내었다. Shannon 지수는 PA-71(40대 대상자) 시료를 제외하고는 섭취 후에 모두 감소하는 경향을 보였으며 Inverse Simpson 지수는 KS-67(50대 초반 대상자) 및 PA-71(40대 대상자) 시료의 경우는 증가하는 경향을 보이나, 나머지는 섭취 후에 모두 감소하는 경향을 나타내었다.
[도 19]는 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 OTUs, Chao1, Shannon 및 Inverse Simpson 지수 의 변화율 비교를 나타내었다. 발효식 섭취 후의 모든 시료는 약 10-40%의 OTUs 및 Chao1의 감소를 보였으며, Inverse Simpson 지수는 KS-67(50대 초반 대상자) 및 PA-71(40대 대상자)의 경우는 오히려 5-30% 증가하는 경향을 나타내었다.
3) J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 베타 종다양도(UPGMA) 변화
[도 20]은 J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 Unweighted pair group method (UPGMA)의 변화 비교를 나타내었다. 섭취 전에는 전반적으로 나이별로 (KG-41, LH-62 및 SH-55 vs KS-67 및 PA-71) 그룹핑이 되는 경향을 보였다. 섭취 후에는 이러한 경향이 파괴되어 KS-67 및 PA-71이 따로 분리되어 PA-71이 보다 나이든 그룹 (SH-55 및 LH-62)와 유사한 그룹으로 묶이고, KS-67은 가장 나이든 그룹인 KG-41과 유사하게 나타나는 현상이 나타났다. 이 현상은 J1 종균 발효식을 1 개월간 섭취를 할 경우 나이와는 크게 관계없이 일정한 방향으로 미생물군집이 선택(예: 전반적으로 유익균의 증가 및 유해균의 감소 등)이 되고 있음을 의미한다.
4) J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 미생물군집의 문(phylum)의 분포
[도 21]은 J1 종균 발효식 섭취 전의 시료의 미생물군집의 문(phylum)의 분포를 나타내었다. 모든 시료에서 Bacteroidetes 및 Firmicutes가 가장 우점 하였으며, (15-80%) Firmicutes/Bacteroidetes의 비율은 0.21-0.56의 범위를 보였고 Proteobacteria는 LH-62(50 초반 대상자)가 가장 높은 비율(30%)을 나타내었다.
[도 22]는 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 미생물군집의 문(phylum)의 분포를 나타내었다. 모든 시료에서 Bacteroidetes 및 Firmicutes가 가장 우점 하였으며, (19-69%) Firmicutes/Bacteroidetes의 비율은 0.34-0.92의 범위를 보였고 Proteobacteria는 KG-41(70대 대상자)가 가장 높은 비율(24%)을 나타내었다. 대장에는 2 가지의 주요 미생물 문(Firmicutes및 Bacteroidetes)이 세균의 99%를 차지하며, 이들은 나이가 듦에 따라 큰 변화를 보이고 있으며(Mariat et al., 2009) Bacteroidetes에 대한 Firmicutes의 비율은 신생아, 중년 및 노년에서 0.4, 10.9, 0.6 으로 변화를 보이는 것으로 보고되었다. Firmicutes/Bacteroidetes의 비율이 증가할 경우 비만의 가능성이 높은 것으로 알려지고 있다(Ley et al., 2006; Koliada et al., 2017)
5) J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 미생물군집의 속(genus)의 분포
[도 23]은 J1 종균 발효식 섭취 전의 시료의 미생물군집의 속(genus)의 분포를 나타내었다. Prevotella는 모든 시료에서 12-51% 로서 우점하였으며, Bacteroides는 KG-41(70대 대상자)에서 가장 우점(24%) 하였다. Enterobacter는 LH-62(50대 후반 대상자)에서 우점(27%) 하였다.
[도 24]는 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 미생물군집의 속(genus)의 분포를 나타내었다. Prevotella는 모든 시료에서 29-48% 로서 우점 하였으며, Faecalibacterium는 LH-62(50대 후반 대상자) 및 SH-55(60대 대상자)에서 가장 우점(20-34%) 하였다. Porphyromonas는 SH-55(60대 대상자)에서 우점(20%) 하였다.
6) J1 종균 발효식 섭취 전후의 시료의 미생물군집의 종(species)의 분포
[도 25]는 J1 종균 발효식 섭취 전의 시료의 미생물군집의 종(species)의 분포를 나타내었다. Prevotella stercorea는 KG-41(70대 대상자) 및 SH-55(60대 대상자)에서 우점(21-22%) 하였으며, Prevotella copri는 KG-41(70대 대상자)를 제외한 모든 시료에서 매우 높은 수준(12-67%)으로 나타났다. Faecalibacterium prausnitzii는 SH-55(60대 대상자)에서 우점(12%) 하였다.
[도 26]은 J1 종균 발효식 섭취 후의 시료의 미생물군집의 종(species)의 분포를 나타내었다. Prevotella stercorea는 KG-41(70대 대상자) 및 SH-55(60대 대상자)에서 우점(17-33%) 하였다. Prevotella copri는 KG-41(70대 대상자)를 제외한 모든 시료에서 매우 높은 수준으로 나타나(28-48%) 섭취 전에 비해 상당히 감소하는 것으로 관찰되었다. Prevotella copri는 류마토이드성 관절염을 야기하는 것으로 보고 되었다(Moreno, 2015). Faecalibacterium prausnitzii는 모든 시료에서 우점하였으며(4-34%) PA-71(40대 대상자)에서 가장 낮은 수준으로 나타나며, 섭취 후 모두 증가하는 경향을 보였다. Faecalibacterium prausnitzii는 Firmicutes phylum의 주요 구성원이며 건강한 인간 미생물에서 가장 풍부한 장내 박테리아 중 하나이며 F. prausnitzii 고갈은 몇 가지 장 질환에서 보고되었으며, 더 자주 크론병 (CD) 환자에서 보고된다(Mart
n, 2017). 한편 동물의 치주염을 일으키는 병원균으로 알려진 Porphyromonas gulae (Inaba 외, 2019)는 섭취 후 모든 시료에서 전반적으로 다소 증가하는 경향을 보여 이에 대한 장기간 지속적 관찰이 필요하다. 따라서 본 발효식품의 섭취는 Prevotella copri와 같은 병원미생물의 감소와 Faecalibacterium prausnitzii 와 같은 유익한 probiotic의 증가에 기여하는 것으로 판단된다.
본 발명에서 진행된 모든 실험 과정은 [도 28]에 제시된 바와 같다.
본 발명은 기탁번호 KCTC13836BP 또는 기탁번호 KCTC13837BP 혼합균주를 포함한 기능성 식품을 개발하였다. 상기 기능성 식품은 해조류 중 감태를 포함하고, 보다 구체적으로 아래 표에 나타난 바와 같은 천연물의 종류 및 함량을 포함하고 있다.
| 원료명 | 비율(w/w, %) |
| 미강 | 40 |
| 쌀보리 | 10 |
| 감태 | 10 |
| 당귀분말 | 5 |
| 표고버섯분말 | 5 |
| 울금분말 | 3 |
| 인삼분말 | 2 |
| 기타 | 25 |
| 계 | 100 |
해조류는 전 세계적으로 약 8,000여 종이 알려져 있는데 그중에서 식용해조류는 50여종에 불과하며, 이들은 전통약제, 식재료, 건강보조식품으로 사용되어 왔지만, 수많은 비식용해조류에 대한 상업적 이용가치는 잘 알려져 있지 않다.
상기 감태는 식용해조류로서 그 주요 성분인 phlorotannin은 phloroglucinol을 기본 구성단위로 하는 폴리페놀화합물로 phlorotannin 생리활성에 관한 연구항산화성, 항암성, 항고혈압성 등 여러 가지 기능성들이 밝혀지고 있으므로 새로운 기능성 소재로서 충분한 가치가 있다.
(표고)버섯자실체는 다량의 다당류, 즉 lentinan, β-1,3 글루칸, β-1,6 글루칸 및 그리포란을 함유하여 여러 건강상의 이점 즉 면역억제, 항암, 항당뇨 등의 효과를 가지고 있으며 probiotics의 증식을 촉진한다(Bhakta, 외, 2013). 그리고 연근은 유산균에 대한 prebiotics로서 역할을 할 수 있다(서다솜, 2017).
울금(Curcuma longa)은 항염증제, 항진균제, 항간 독성 및 항염증제의 역할이 있다. 또한 Curcumae rhizoma는 특히 항암 효과의 연구에 중점을 두어 진행되었으나 Curcumae radix는 주로 항우울제, 간 보호 및 콜레스테롤의 효과의 연구에 집중이 되었다. 이들은 항종양 (Lim 외, 2010), 항바이러스 (Dong 외, 2013), 항염증제 (Qiu 외, 2014) 등의 활성이 있다. 울금 추출물은 prebiotics로 작용하여 Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) 및 Bifidobacterium animalis BB12에 분해되어 이들의 성장을 촉진할 수 있다(Yazdi 외, 2019).
당귀는 항산화, collagenase 저해에 의한 주름개선, 조직 재생, 미백 작용 및 항암작용 등의 효과를 가지고 있는 것으로 알려지며(Park SK 외, 2009), 특히 참당귀 내 다량 함유되어있는 decursin 및 decursinol angelate는 항균, 혈관형성억제, 항암 등의 약리적인 효과가 보고되고 있다(Park MJ 외, 2009).
Lactobacillus plantarum C88은 인삼다당류에서 배양했을 때 더 높은 세포 밀도와 성장률을 나타내는데 (He 외, 2015) 이는 인삼다당류의 prebiotic 역할을 의미한다.
상기에 언급된 주요 천연물들은 본 연구에 활용된 probiotics 미생물의 prebiotics의 역할을 할 수 있을 것으로 판단된다.
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명은 해조류 및 기타 유용한 기능성 천연물질을 이용하여 장서식 유익미생물 증식촉진 및 유해미생물 억제 프로바이오틱스 및 이를 이용한 기능성 식품을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 해조류 및 기타 유용 기능성 천연물질로부터 기능성물질 추출을 위한 전처리 공정을 확립할 수 있다.
또한, 본 발명은 프로바이오틱스 및 기능성 식품에 적절한 우수한 생물전환 미생물을 선발하고 선발된 미생물을 이용한 장서식 유익미생물 증식촉진 및 유해미생물 억제 프로바이오틱스 및 이를 이용한 기능성 식품을 제공할 수 있다.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (6)
- 기탁번호 KCTC13836BP로 기탁되어 정장작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혼합균주.
- 기탁번호 KCTC13837BP로 기탁되어 정장작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혼합균주.
- 기탁번호 KCTC13836BP의 혼합균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물.
- 상기 기탁번호 KCTC13837BP의 혼합균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물.
- 기탁번호 KCTC13836BP의 혼합균주 또는 이의 배양 발효물이 유효성분인 프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 기탁번호 KCTC13837BP의 혼합균주 또는 이의 배양 발효물이 유효성분인 프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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Non-Patent Citations (1)
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| Prebiotics and Probiotics Science and Technology, by Charalampopoulos, Dimitris; Rastall, Robert A., ISBN 978-0-387-79057-2. Springer-Verlag New York, 2009, p. 591 * |
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