KR101173546B1 - 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 항비만 조성물 및 이를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 항비만 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 또한 누에탈지번데기를 가수분해하는 단계를 포함하는 항비만 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법으로 제조한 항비만 조성물은 과체중을 포함하여 비만을 개선하는데 유효하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 항비만 조성물은 비만예방 및 개선용 식품 조성물, 비만예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

Description

누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 항비만 조성물 및 이를 제조하는 방법 {AN ANTI-OBESITY COMPOSITION CONTAINING FAT-REMOVED SILKWORM PUPA HYDROLYSATE AND ITS MANUFACTURING METHOD}

본 발명은 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 항비만 조성물 및 누에 탈지번데기를 가수분해하는 단계를 포함하는 항비만 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

대한민국 공개특허 공보 10-2009-0061859에서는 누에번데기를 건조, 분쇄하고, 번데기 분말에 한천분말과 물, 과당을 첨가하여 혼합하고, 농축, 겔화, 살균하여 제조되는 번데기를 이용한 건강식품에 대해서는 기재되어 있으나, 누에 번데기의 가수분해물을 포함하는 조성물에 대해서는 개시하고 있지 않다. 또한, 대한민국 등록특허 10-0732727호에서는 누에번데기 기름을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물과 건강식품으로서의 용도는 기재되어 있으나, 누에탈지번데기분말이나, 가수분해물의 항비만 효능에 대해서는 개시되어 있지 않다.

비만은 건강을 해칠 정도로 체내 지방이 피하조직이나 복부에 축적되는 현상으로, 유전적 또는 환경적인 요인 등에 의해 발생할 수 있는데, 최근 국내외적으로 비만인구가 급속히 증가하고 있는 추세이다. 또한 비만이 심혈관계 질환을 포함하여 여러 질병에 미치는 영향은 매우 심각하며, 비만에 의해 유발되는 질병치료에 관심이 집중됨에 따라 동물을 이용한 다양한 식이성 비만모델 개발이 진행되고 있다

이에 본 연구에서는 누에탈지번데기를 가수분해하여 얻은 가수분해물이 식이성 비만 동물모델에서 항비만 효과를 나타내는지를 확인하고, 지방생성 억제, 지방세포 크기 및 체지방 분포를 평가함으로써 비만 개선을 위한 조성물로의 개발 가능성을 제시하였다.

본 발명의 목적은 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 항비만 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 항비만 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 또한 누에탈지번데기를 가수분해하는 단계를 포함하는 항비만 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법으로 제조한 항비만 조성물은 과체중을 포함하여 비만을 개선하는데 유효하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 항비만 조성물은 비만예방 및 개선용 식품 조성물, 비만예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 항비만 효소가수분해물의 생산공정도를 나타내는 그림이다.
도 2는 항비만 알칼리가수분해물의 생산공정도를 나타내는 그림이다.
도 3은 항비만 산가수분해물의 생산공정도를 나타내는 그림이다.
도 4는 전지방세포주(3T3-L1 preadipocytes)를 인슐린으로 분화/성숙을 유도하였을 때의 지방 생성량을 나타낸 것이다.
도 5는 지방합성 관련 유전자인 leptin 및 Acrp30 유전자 발현을 RT-PCR로 분석한 것이다.
도 6은 지방합성 관련 단백질인 PPAR-γ및 Acrp30의 단백질 생성을 Western blot으로 분석한 것이다.
도 7은 고지방식이를 급여한 마우스의 체중변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 고지방식이를 급여한 마우스의 부고환주위 지방중량을 4주(a), 8주 (b)후 측정한 것이다.
도 9는 고지방식이를 급여한 마우스의 장간막 지방중량을 4주(a), 8주(b) 후 측정한 것이다.
도 10은 고지방식이를 급여한 마우스의 복부 지방조직 분포를 MRI를 이용하여 횡단면(a) 및 종단면(b)으로 분석한 것이다.
도 11은 고지방식이를 급여한 마우스의 부고환주위 지방세포의 크기를 4주(a) 및 8주(b) 후 분석한 것이다.
도 12는 고지방식이를 급여한 마우스의 간조직 내 지방축적 정도를 4주 (a) 및 8주 (b) 후 분석한 것이다.

본 발명은 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 항비만 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 비만예방 및 개선용 식품 조성물 및 비만예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 누에탈지번데기를 가수분해하는 단계를 포함하는 항비만 조성물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 자세히 설명한다.

이하, 본 발명에서 %는 별도의 기재가 없으면 중량%인 것으로 한다.

본 발명의 가수분해물은 상기 누에탈지번데기를 산, 알칼리 또는 효소가수분해 하는 것을 특징으로 한다.

상기 산 또는 알칼리 가수분해는 산 또는 염기를 가하고, 열처리하여 누에 탈지번데기를 가수분해하는 것이며, 상기 효소 가수분해는 효소를 통해 누에 탈지번데기를 가수분해하는 것이다.

상기 효소가수분해에 있어서, 효소는 단백질 분해효소일 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 프로타맥스(Protamax), 프로리테르 FG-F(Proleather FG-f), 플라보자임(Flavourzyme), 프로테아제 A(Protease A), 에이로즈 AP-10(Aroase AP-10), 피스칼레이즈(Pescalase), 파파인(Papain), 브로멜라인(Bromelain), Protease P, Protease N, Alcalase 2.4L, 피신(Ficin) 및 뉴트레이즈(Neutrase)로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 바람직하게는 상기 단백질 분해효소는 Protease N 및 Alcalase 2.4L이다. 그러나 본 발명의 특징은 누에탈지 번데기를 효소 가수분해하여 항비만 조성물을 제조하는 방법에 있는바, 상기 특징을 갖는 누에탈지번데기를 효소 가수분해하는 단백질 분해효소라면 본 발명의 범위에 포함 될 수 있다.

본 발명의 효소는 동시 또는 순차로 처리 할 수 있다. 상기 누에탈지번데기는 상기 효소를 순차로 처리하는 것이 가수분해율이 높아 수율도 높아진다는 점에서 바람직하다. 예컨대, 상기 효소를 순차로 처리하는 경우, Alcalase 2.4L, Protease N의 순으로 처리할 수 있다.

본 발명은 비만예방 및 개선용 식품 조성물 또는 비만예방 및 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물에 관한 것이다.

상기 항비만 조성물은 지방세포 분화 및 지방생성 억제, 체지방 또는 체중의 감소, 지방세포 크기 감소, 복부 지방조직 억제, 간 조직 내 지방축적 억제에 효과를 보이며, 체중 감량, 노화 지연, 비만 개선 효과를 가질 수 있다.

본 발명은 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품이란 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 조성물을 첨가한 것도 포함된다.

본 발명의 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 건강기능식품을 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01 내지 70.0%, 바람직하게는 0.01 내지 30.0%의 양으로 첨가될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10.0%의 양으로 첨가될 수 있다. 식품 조성물의 상기 가수분해물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

상기 가수분해물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 약학적 조성물은 지방세포 분화 및 지방생성 억제, 지방세포 크기 감소, 복부 지방조직 억제, 또는 간조직 내 지방 축적을 저해한다. 또한 본 발명의 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 약학적 조성물은 고지혈증, 지방간, 내장비만, 복부비만 등 부분적 비만 및 총체적 비만(즉, 일반적인 비만)을 예방 및 치료한다.

본 발명의 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1 mg 내지 10 g, 바람직하게는 10 mg 내지 1 g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명은 누에탈지번데기를 가수분해하는 단계를 포함하는 항비만 조성물의 제조방법을 제공한다. 상기 가수분해는 상기 누에탈지번데기를 산, 알칼리, 효소 가수분해하는 것을 특징으로 한다. 특히 상기 효소 가수분해에 의한 항비만 조성물의 제조방법에 있어서, 효소의 특징은 전술한 바와 같다.

상기 항비만 조성물의 제조방법에 있어서, 누에탈지번데기를 산, 알칼리 가수분해 하는 방법은

1) 산, 알칼리 용액을 희석하여 일정농도의 산, 알칼리 용액을 조제하는 단계;

2) 상기 단계1)에서 조제된 일정농도의 산, 알칼리 용액에 누에 탈지번데기분말을 투입하여 혼합하는 단계;

3) 상기 단계2)에서 혼합된 용액에 스팀으로 온도를 유지함으로써, 일정시간 이상 산 또는 알칼리 가수분해하는 단계;

4) 상기 단계3)에서 가수분해된 혼합액을 식힌 후 pH를 조정하고, 승온 하여 유해물질을 분해하는 단계;

5) 상기 단계4)에서 유해물질 분해가 끝난 후 식힌 액을 여과하는 단계;

6) 상기 단계5)에서 여과된 1차 여과액에 활성탄을 넣고 교반하여 탈색 및 탈취하는 단계;

7) 상기 단계6)에서의 수득액을 2차 여과하는 단계;

8) 상기 단계7)에서 여과된 2차 여과액을 탈염하고, 살균하는 단계; 및

9) 상기 단계8)에서 살균된 살균액의 pH를 조정하고 농축하여 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 누에탈지번데기를 산, 알칼리 가수분해 하는 방법은 하기와 같은 구체적인 제조예를 포함 할 수 있다.

[ 제조예1 ] 누에탈지번데기의 알칼리 가수분해에 의한 가수분해물

1) 33% NaOH 용액을 희석하여 2N-NaOH용액을 조제하는 단계;

2) 상기 단계1)에서 조제된 용액에 누에 탈지번데기분말을 투입하여 20 중량%가 되도록 혼합하는 단계;

3) 상기 단계2)에서 혼합된 용액에 스팀으로 100~120℃를 유지함으로써, 36 시간 이상 알칼리 가수분해하는 단계;

4) 상기 단계3)에서 가수분해된 혼합액을 40℃까지 냉각 후, 7% HCl을 이용하여 pH를 4.0~6.0로 조정하고, 90~95℃로 승온하여 3~4시간 반응시켜 유해물질을 분해하는 단계;

5) 상기 단계4)에서 유해물질 분해가 끝난 후, 40℃까지 냉각하고 기질대비 규조토를 15 중량% 투입하여 교반하고, 여과기공크기 20~25㎛ 여과포를 사용하여 필터 프레서로 여과하는 단계;

6) 상기 단계5)에서 여과된 1차 여과액에 활성탄을 기질대비 10중량% 넣고, 2시간 교반하여 탈색 및 탈취하는 단계;

7) 상기 단계6)에서의 수득액을 여과기공크기 1.0㎛ 여과포를 사용하여 필터프레서로 2차 여과하는 단계;

8) 상기 단계7)에서 여과된 2차 여과액을 전기투석하여 생성된 염을 제거하고, 염이 제거된 액을 80℃에서 30분 동안 살균하는 단계; 및

9) 상기 단계8)에서 살균된 살균액의 pH를 다시 4.5~6.5로 조정 후 10~20 brix로 농축하고 동결건조 하는 단계를 포함할 수 있다.

[ 제조예2 ] 누에탈지번데기의 산 가수분해에 의한 가수분해물

1) 35% HCl 용액을 희석하여 2N-HCl 용액을 조제하는 단계;

2) 상기 단계1)에서 조제된 용액에 누에 탈지번데기분말을 투입하여 20 중량%가 되도록 혼합하는 단계;

3) 상기 단계2)에서 혼합된 용액에 스팀으로 100~120℃를 유지함으로써, 36 시간 이상 산 가수분해하는 단계;

4) 상기 단계3)에서 가수분해된 혼합액을 40℃까지 냉각 후, 7% NaOH를 이용하여 pH를 8.8~9.0으로 조정하고, 90~95℃로 승온하여 3~4시간 반응시켜 유해물질을 분해하는 단계;

5) 상기 단계4)에서 유해물질 분해가 끝난 후, 40℃까지 냉각하고 7% HCl을 이용하여 pH를 4.0~6.0(등전점)로 조정 후, 기질대비 규조토를 15 중량% 투입하여 교반하고, 여과기공크기 20~25㎛ 여과포를 사용하여 필터 프레서로 여과하는 단계;

6) 상기 단계5)에서 여과된 1차 여과액에 활성탄을 기질대비 10중량% 넣고, 2시간 교반하여 탈색 및 탈취하는 단계;

7) 상기 단계6)에서의 수득액을 여과기공크기 1.0㎛ 여과포를 사용하여 필터프레서로 2차 여과하는 단계;

8) 상기 단계7)에서 여과된 2차 여과액을 전기투석하여 생성된 염을 제거하고, 염이 제거된 액을 80℃에서 30분 동안 살균하는 단계; 및

9) 상기 단계8)에서 살균된 살균액의 pH를 다시 4.5~6.5로 조정 후 10~20 brix로 농축하고 동결건조 하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 항비만 조성물의 제조방법에 있어서, 누에탈지번데기를 효소 가수분해 하는 방법은

1) 누에탈지번데기분말에 용매를 넣고 가용화 하는 단계;

2) 상기 단계1)에서 가용화된 누에탈지번데기를 1차 효소 처리하는 단계;

3) 상기 단계2)에서 1차 효소 처리한 액에 2차 효소 처리하는 단계;

4) 상기 단계3)에서 1차, 2차 효소를 사멸하는 단계;

5) 상기 단계4)에서 효소사멸이 끝난 후 식힌 액을 여과하는 단계;

6) 상기 단계5)에서 여과된 1차 여과액에 활성탄을 넣고 교반하여 탈색 및 탈취하는 단계;

7) 상기 단계6)에서의 수득액을 2차 여과하는 단계;

8) 상기 단계7)에서 여과된 2차 여과액을 살균하는 단계; 및

9) 상기 단계8)에서 살균된 살균액을 농축하고, 건조 또는 동결건조 하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 용매는 물을 주로 사용하나 필요에 따라 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올을 사용할 수 있다. 또한 상기 용매의 부피는 시료중량의 1 내지 20배, 바람직하게는 1 내지 10배 부피로 한다.

상기 단계 2)는 효소를 상기 단계 1)에서 가용화 공정에 투입된 누에탈지번데기 중량의 0.5% 중량으로 처리한다. 이는 상기 단계 3)의 2차 효소 처리하는 경우도 적용할 수 있다. 또한 효소처리 농도는 공정의 효율성에 맞도록 양을 조절하여 투입할 수 있다.

상기 단계 5)는 단계 4)에서 효소사멸 후에 식힌 액을 여과기공 크기 20 내지 25㎛의 여과막으로 1차 여과하여 잔류물을 제거한다.

상기 단계 7)에서 상기 단계 6)에서의 수득액은 여과기공 크기 1㎛의 여과막을 이용하여 2차 여과할 수 있다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예1 - 알칼리 가수분해에 의한 가수분해물

33% NaOH를 희석하여 2N-NaOH 용액을 조제한 후 누에 탈지번데기분말을 투입하여 20 중량% 가 되도록 2N-NaOH 용액에 혼합한다. 스팀으로 100~120℃를 유지함으로써, 36 시간 이상 가수분해하고, 40℃까지 냉각 후 7% HCl을 이용하여 pH를 4.0~6.0로 조정 후 90~95℃로 승온하고 3~4시간 반응시켜 유해물질을 분해한다. 스팀공급을 중지 후 40℃까지 냉각 후 기질대비 규조토를 15 중량% 투입하여 교반하고, 여과기공 크기 20~25㎛ 여과포를 사용해 필터프레서로 1차 여과한다. 여과된 액은 활성탄을 기질대비 10중량% 투입하여 2시간 교반 후, 여과기공 크기 1.0㎛ 여과포를 사용해 필터프레서로 2차 여과한다. 상기 여과액을 전기투석하여 생성된 염을 제거하고 80℃에서 30분 동안 살균한다. pH를 다시 4.5~6.5로 조정 후 10~20 brix로 농축하고 동결건조하여 알칼리 가수분해에 의한 가수분해물을 제조하였다.

실시예2 - 산 가수분해에 의한 가수분해물

35% HCl을 희석하여 2N-HCl 용액을 조제한 후 누에탈지번데기분말을 투입하여 20 중량%가 되도록 2N-HCl 용액에 혼합한다. 스팀으로 100~120℃를 유지함으로써, 36 시간 이상 가수분해하고, 40℃까지 냉각 후 7% NaOH를 이용하여 pH를 8.8~9.0으로 조정 후 90~95℃로 승온하여 3~4시간 반응시켜 3-MCPD, DCP 등과 같은 유해물질을 분해한다. 스팀공급을 중지 후 40℃까지 냉각 후 7% HCl을 이용하여 pH를 4.0~6.0으로 조정 후 기질대비 규조토를 15 중량% 투입하여 교반하고, 여과기공 크기 20~25㎛ 여과포를 사용하여 필터프레서로 1차 여과한다. 여과된 액은 활성탄을 기질대비 10중량% 투입하여 2시간 교반 후, 여과기공 크기 1.0㎛ 여과포를 사용해 필터프레서로 2차 여과한다. 상기 여과액을 전기투석하여 생성된 염을 제거하고 80℃에서 30분 동안 살균한다. pH를 다시 4.5~6.5로 조정 후 10~20 brix로 농축하고 동결 건조하여 알칼리 가수분해에 의한 가수분해물을 제조하였다.

실시예3 - 효소 가수분해에 의한 가수분해물

누에탈지번데기를 R/O수 1:10 중량비로 투입하고, 100~120℃에서 6시간 동안 가용한 한 후, Alcalase 2.4L를 기질대비 0.5%의 농도로, 55℃에서 6시간 동안 1차 효소 가수분해, Protease N을 기질대비 0.5%의 농도로 55℃에서 12시간 동안 2차 가수분해하였다. 가수분해 후 80℃에서 30분 동안 효소를 사멸하고 여과기공 크기 20~25㎛ 여과포를 사용하여, 필터 프레서로 1차 여과, 활성탄 기질대비 10%의 농도로 투입 후 1시간 동안 탈색/탈취, 여과기공 크기 1㎛ 여과포를 사용하여 필터 프레서로 2차 여과하였다. 마지막으로 80℃에서 30분 동안 살균하고 농축시킨 후 동결건조시켜 효소 가수분해에 의한 가수분해물을 제조하였다.

전지방세포주(3 T3 - L1 cells )

전지방세포주(3T3-L1 cells)는 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, USA)에서 구입하여 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에서 배양하였다.

실험동물 및 누에탈지번데기투여방법

실험동물은 대한바이오링크(Eumseong, Chungbuk, Korea)로부터 5주령 수컷 C57BL/6 마우스를 공급받아 약 1주간 순화과정을 거친 6주령(평균체중 약 20 g)에 항비만효능 평가에 사용하였다. 동물은 마우스용 케이지에 5마리씩 수용하였다. 동물실험실의 환경은 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12회/시간, 조명주기 12시간, 조도 150-300 Lux로 조절되었다.

실험예에 사용된 누에 번데기는 20.69%의 lard가 함유된 분말 고지방식이 (D12451; Research Diets Inc., New Brunswick, USA, HFD(High Fat Diet))에 0.3, 1.0 또는 3.0%의 농도로 혼합하여 8주간 자유 급여하였으며, 정상 대조군에는 기초식이 (D12450B)를 급여하였다. 또 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다 (표1).

본 실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 동 기관의 표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행되었다.

구성	기초식이(D12450B)(%)	고지방식이(D12451)(%)
Cornstarch	29.86	8.48
Casein	18.96	23.31
Dextrose	3.32	11.65
Sucrose	33.17	20.14
Soybean oil	2.37	2.91
Lard	1.90	20.69
Cellulose	4.74	5.83
Vitamin mix (V10001)	0.95	1.17
Mineral mix (S10026)	0.95	1.17
Dicalcium phosphate	1.23	1.51
Calcium carbonate	0.52	0.64
Potassium citrate, 1H2O	1.56	1.92
L-Cystine	0.28	0.35
Chiline bitartrate	0.19	0.23

< 실험예 1> 효소가수분해로 인한 가수분해물 제조시 탈지번데기 투입량에 따른 수율변화

누에탈지번데기를 R/O 수 중량대비 10%, 20%, 30%로 투입하고, 나머지 공정은 실시예3과 동일하게 처리하여 누에탈지번데기 투입량에 따른 수율 변화를 조사하였다. 그 결과 10%를 투입하였을 때 가장 수율이 좋았다(표2). 따라서, 누에탈지번데기 : R/O수 비율을 1:10으로 선정하는 것이 현장생산 적용시에 가장 유리함을 알 수 있었다.

누에탈지번데기 R/O수 대비 투입량	10%	20%	30%
수율(%)	75.4	61.8	49.9

< 실험예 2> 효소가수분해에 의한 가수분해물 제조시 가용화 온도 및 시간에 따른 수율변화

누에탈지번데기를 R/O 수 중량대비 10% 투입 후, 나머지 공정은 상기 실시예3과 동일하게 처리하여 가용화 온도 및 시간에 따른 수율 변화를 조사하였다. 그 결과 시간과 가용화 온도에 비례하여 효소분해가 일어나는 바, 120℃에서의 처리가 수율이 가장 좋음을 알 수 있었다(표3). 그러나 탱크압력으로 인한 안전상의 문제 및 연료 대비 공정 효율을 생각했을 때 100℃에서 6시간 가용화 하는 것을 선정하였다.

	온도 및 시간에 따른 Brix(%)
온도	2hr	4hr	6hr	8hr
60℃	60.1	62.6	65.1	70.7
80℃	68.8	70.4	72.6	73.1
100℃	70.1	73.2	75.6	75.8
120℃	70.4	73.4	76.7	78.4

< 실험예 3> 효소가수분해로 인한 가수분해물 제조시 1차 효소처리

누에탈지번데기를 R/O수 중량대비 10% 투입 후 가용화 온도 100℃에서 6시간 동안 가용화 한 후 Alcalase 2.4L, Protease N, Neutrase 8.0L, Protease P, Protamax, Flavourzyme 의 효소를 기질대비 0.5% 농도로 55℃에서 6시간 동안 각각 처리하였다. 그 후 80℃에서 30분 동안 효소를 사멸하고 여과기공 크기 20~25㎛ 여과포를 사용하여, 필터 프레서로 1차 여과, 활성탄 기질대비 10%의 농도로 투입 후 1시간 동안 탈색/탈취, 여과기공 크기 1㎛ 여과포를 사용하여 필터 프레서로 2차 여과하였다. 마지막으로 80℃에서 30분 동안 살균하고 농축시킨 후 동결건조시켜 효소 가수분해에 따른 수율 변화를 조사하였다. 그 결과 4시간 이상 반응시킨 경우 Alcalase 2.4L와 Protease N이 Brix가 가장 유의하게 증가한 것을 알 수 있었다(표4).

	효소 분해 시간에 따른 Brix(%)
효소종류	0hr	4hr	6hr	10hr	12hr	14hr	증감
Alcalase 2.4L	3.0	7.9	8.3	8.5	8.5	8.5	5.5
Protease N	2.9	7.2	7.8	8.3	8.9	8.9	6.0
Neutrase 8.0L	2.8	4.8	5.5	5.5	5.5	5.5	2.7
Protease P	2.9	6.3	7.1	7.1	7.1	7.1	4.2
Protamax	3.1	6.0	6.8	6.8	6.8	7.8	3.7
Flavourzyme	3.1	5.1	6.2	6.2	6.2	6.3	3.1

< 실험예 4> 효소가수분해로 인한 가수분해물 제조시 2차 효소처리

누에탈지번데기를 R/O 수 중량대비 10% 투입 후 가용화 온도 100℃에서 6시간 가용화 후, 상기 <실험예3>에서 Brix가 가장 유의하게 증가한 Alcalase 2.4L 및 Protease N을 동시 또는 순차로 처리하여, 효소가수분해에 따른 수율(Brix) 변화를 조사하였다. 가수분해 후의 공정은 실시예3과 동일하게 처리하였다.

그 결과 Alcalase 2.4L를 1차 처리 후 Protease N을 2차 처리한 것이 가장 수율이 좋았다(표5). 그러므로 처리시간은 상기 <실험에 3> 의 결과를 반영하여 처리 시간에 따라 Alcalase 2.4L를 6시간 1차 처리 후 Protease N을 12시간 2차 처리 하는 것으로 선정하였다.

1차 효소처리	Protease N	Alcalase 2.4L	Protease N Alcalase 2.4L 동시처리
2차 효소처리	Alcalase 2.4L	Protease N
수율(％)	72.87	75.17	73.18

< 실험예 5> 지방세포 분화 및 지방생성 억제효능 평가

1~50㎍/mL의 가수분해물을 가하고 인슐린 5㎍/mL으로 2일간 분화(differentiation)를 유도하였으며, 이어 인슐린만을 첨가한 배지에서 4일간 세포를 성숙(maturation)시켰다.

그 후 상기 세포를 7% formaldehyde가 함유된 phosphate buffer로 1시간 동안 고정한 후 1% Oil red O가 함유된 99% 이소프로판올로 10분간 염색하였다. 그 후 광학현미경으로 Oil red O에 염색된 분화/성숙 지방세포를 관찰하여 세포분화 정도를 분석하였고, 이어 생성된 지방량을 정량하기 위해 Adipogenesis kit 를 이용하여 Oil red O를 이소프로판올로 용출시켜 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 3T3-L1 preadipocytes를 호르몬 유도체로 분화/성숙을 유도하였을 때 지방생성량이 50-75% 증가하였다. 또한 실시예1 및 2는 50 ㎍/mL에서만 유의한 억제효과가 나타난 것에 비해 실시예3은 10㎍/mL 이상의 농도에서 유의한 억제효과를 나타내었다(도4). 나아가 실시예3은 10㎍/mL 에서도 호르몬을 처리하지 않은 정상 수준으로 억제하였으며, 50 ㎍/mL에서는 지방생성을 대조군 이하로 억제하였다. 본 실험예에서의 대조군은 인슐린 처리 없이 세포배양 배지만 처리한 것을 나타낸 것이다.

< 실험예 6> 지방생성 관련 유전자 발현 및 단백질 생성에 미치는 영향 평가

3T3-L1 세포를 6-well plate (1 x 10⁶ cells/mL)에 분주한 다음 1~50 ㎍/mL의 가수분해물을 가하고 인슐린으로 분화/성숙시킨 후 adipogenesis 관련 유전자인 leptin과 Acrp30 (adiponectin)의 mRNA 발현을 reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)으로 분석하였다.

그 결과 호르몬 유도제 인슐린에 의해 leptin과 Acrp30 모두 크게 상승하였고, 실시예 1 내지 실시예3은 1㎍/mL와 50㎍/mL에서 leptin과 Acrp30을 모두 강하게 억제하였다(도5).

또한 지방합성 관련 단백질인 PPAR-γ 및 Acrp30의 생성을 Western blot으로 분석하였다. 그 결과 호르몬 유도제 인슐린에 의해 PPAR-γ와 Acrp30 모두 크게 상승하였다. 이 때 실시예1 및 실시예2는 PPAR-γ와 Acrp30 단백질 생성을 모두 저하시켰는데, 특히 Acrp30을 특이적으로 억제하였다. 이에 비해 실시예3의 처리는 PPAR-γ과 Acrp30 생성을 실시예1 및 2 의 처리보다 더 강하게 감소시켰는데, 특히 50μg/mL에서 Acrp30을 거의 완전히 억제하였다 (도6).

< 실험예 7> 체중 및 지방중량 측정

8주간의 비만유도 및 상기 시험물질 투여기간 중 매일 오전 10시경 체중을 측정하였다. 그 결과, 고지방식이(D12451)를 급여한 마우스의 체중은 정상사료 (D12450B)를 급여한 동물에 비해 빠른 체중증가를 보여주었다(도7). 실시예 1 내지 3의 투여군들은 급여 10일 후부터 체중증가 억제효과를 나타냈으며, 실시예 1 및 2의 투여군은 3.0%로 사료에 혼합 급여시 약 20~25%의 강하효능을 보여 주었고, 실시예3은 약 50%의 체중 강하 효과를 보여주었다.

또한 4주째 및 8주째에 부검하여 부고환주위 지방조직(epididymal adipose tissue) 및 장간막 지방조직(mesenteric adipose tissue)을 적출하여 중량을 측정하였다.

그 결과 고지방식이를 급여한 마우스의 부고환주위 지방중량은 4주째에 정상동물에 비해 약 50% 증가하였다(도8(a)). 이러한 지방중량의 증가는 가수분해물의 급여로 억제되었는데, 실시예 2 및 3에 의해서는 1.0% 및 3.0%에서 모두 정상 수준으로 저하되었으나 실시예1은 3.0%에서는 유의한 효과가 나타나고 1.0%에서는 유의한 효과가 나타나지 않았다. 또한 실시예2 및 3의 투여군은 1.0%, 3.0% 농도에서 모두 용량의존적인 억제효과를 나타내었다.

한편 8주째에도 고지방식이 급여에 의해 부고환주위 지방중량이 약 60% 증가하였는데(도8(b)), 3.0%의 실시예3의 급여에 의해서만 유의한 억제효과가 나타났을 뿐 모든 농도의 실시예1 및 2의 급여에 의해서는 유의한 효과가 나타나지 않았다.

또한 고지방식이를 급여한 마우스의 장간막 지방중량은 4주째에 정상동물에 비해 140-150% 증가하였다(도9(a)). 이러한 지방중량의 증가는 1.0%, 3.0% 가수분해물의 모든 급여군에서 탁월하게 억제되었고, 실시예 1의 1.0%를 제외한 모든 농도의 가수분해물 급여군에 의하여 정상 수준으로 억제되었다.

8주째에도 고지방식이 급여에 의해 장간막 지방중량이 45-75% 증가하였지만(도 9(b)) 실시예 1의 1.0% 투여군을 제외한 1.0%, 3.0%의 모든 가수분해물 급여군에서 탁월하게 지방중량이 억제되었다

< 실험예 8> 복부 지방분포 및 지방세포 크기 분석

8주째에 일부의 동물에 대하여 부검 전 magnetic resonance image (MRI) analyzer(기초과학지원연구원, Ochang, Chungbuk, Korea)를 이용하여 횡단면(transverse section) 및 종단면(coronal section)의 복부 영상을 얻어 지방조직의 분포를 분석하였다.

그 결과 정상동물에서의 지방분포 면적 30-33%에 비해 고지방식이를 급여한 동물에서는 47-52%로 60-65% 증가하였다(도10(a),(b)). 이러한 복부 지방조직 증가에 대해 실시예 1 및 실시예2의 급여는 복부지방중량 억제효과를 나타냈는데, 3.0% 급여에서 유의한 감소를 보여 주었으며, 특히 3.0%의 실시예 3의 급여시에는 정상 수준까지 떨어졌다.

한편 8주간의 비만유도 및 상기 시험물질 투여기간 중 4주째 및 8주째에 부고환주위 지방조직을 채취하여 4% formaldehyde가 함유된 neutral formalin 용액으로 고정하였고, 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 paraffin 조직 슬라이드를 제작한 후 hematoxylin-eosin으로 염색하였다. 그 후 200배 광학현미경 하에서 image analyzer를 이용하여 시야당 평균크기에 가까운 10개의 세포를 선정하여 그 크기를 측정하였다

그 결과 고지방식이를 급여한 마우스의 부고환주위 지방세포의 크기는 4주 및 8주째 정상동물에 비해 75-90% 증가하였다.

또한 지방세포의 크기 증가는 가수분해물 급여로 억제되었는 바, 4주째에는 실시예1 및 2에 의해 유의하게 감소하였으며, 특히 실시예3의 급여에 의해서는 정상 수준까지 감소하였다(도11(a)). 8주째에도 실시예1 및 2에 의해 유의하게 억제되었는데, 실시예3의 급여에 의해서 거의 정상 수준으로 회복되었다(도11(b)).

< 실험예 9> 간 조직 내 지방축적 분석

8주간의 비만유도 및 상기 시험물질 투여기간 중 4주째 및 8주째에 간조직을 4% formaldehyde가 함유된 neutral formalin 용액으로 고정하였고, 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 paraffin 조직 슬라이드를 제작한 다음 hematoxylin-eosin으로 염색하였다. 그 후 간조직 및 세포 내 지방축적 현상을 광학현미경을 이용하여 분석하였다.

그 결과 4주 및 8주째에 많은 수의 지방적이 관찰되었다. 이러한 식이성 지방간 현상은 가수분해물 급여로 억제되었는 바, 4주째에는 모든 가수분해물 급여군에서 정상에 가까운 탁월한 효과가 나타났다(도12(a)). 8주째에도 유의하게 억제되어 농도에 따라 정상 수준 또는 그 이하로 회복되었다(도12(b)).

< 실험예 10> 식이성 비만동물의 혈액분석 지표에 미치는 영향

24시간 절식시킨 동물을 ether로 마취시킨 후 복대정맥에서 채혈하여 얻은 혈액을 혈청분리용 원심분리관(SST-tube, BD vaccutainer, USA)에 넣고 30분간 방치하여 응고시킨 다음 원심분리(3,000 rpm × 15 min)하여 혈청을 얻었다. 그 후 생화학자동분석기(Hitachi-7180, Hitachi Medical Co., Ltd., Japan)로 지방합성 관련 지표로써 Acrp30 및 leptin을, 지질축적 지표로써 Triglycerides와 total cholesterol을, 간세포 손상의 지표로써 Alanine Transaminase를, 에너지 생산의 지표로써 glucose를 측정하였다.

고지방식이를 급여한 마우스의 혈액에서는 정상 동물에 비해 높은 Acrp30(adiponectin)과 leptin이 관찰되었다(표6). 고지방식이에 의해 증가된 Acrp30에 대해 가수분해물군 모두 유의한 억제효과를 보여 주었다. 또 leptin에 대해서는 실시예2 및 3의 처리에서만 효과가 있었다. 고지방식이는 중성지방과 콜레스테롤 역시 유의하게 증가시켰는바, 가수분해물은 모든 군에서 유의한 효능을 보여 주었으며, 콜레스테롤에 대해서는 실시예3에서만 유의성이 확인되었다.

고지방식이는 혈중 인슐린 농도도 증가시켰는데, 실시예2 및 3에 의해 유의하게 억제되었으며, 증가된 간세포 손상의 지표인 Alanine Transaminase는 모든 가수분해물군에 의해 현저하게 완화되었다.

Treatment (%)	Acrp30	Leptin	Triglyceride	Cholesterol	Glucose	Alanine Transaminase
	(ng/mL)	(ng/mL)	(mg/dL)	(mg/dL)	(mg/dL)	(IU/L)
Normal	133.0±11.2	3.1±0.4	84.0±12.7	95.8±26.8	113.0±13.9	1.1±0.2
HFD	230.1±25.2	5.2±1.1	154.3±12.5	117.3±12.1	159.7±14.1	5.8±1.2
실시예1	90.5±18.6	4.3±1.2	131.2±9.8	115.3±14.5	134.0±12.6	2.0±1.0
실시예2	185.3±31.9	3.5±0.3	120.8±22.4	108.3±9.3	118.3±13.5	1.3±0.9
실시예3	152.5±48.6	3.0±0.9	94.3±13.6	106.3±3.6	129.1±13.3	1.3±0.6

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하고,
   상기 가수분해물은 상기 누에 탈지번데기를 Alcalase 2.4L 및 Protease N의 순서로 가수분해하여 제조하는 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 3항에 있어서,
   비만예방 및 개선용 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
   
6. 제 3항에 있어서,
   비만예방 및 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
   
7. 제 3항에 있어서,
   지방세포 분화, 지방생성 억제, 체지방 또는 체중의 감소, 지방세포 크기 감소, 복부 지방조직억제 또는 간 조직 내 지방 축적 억제 활성을 갖는 항비만 조성물.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 누에 탈지번데기를 Alcalase 2.4L 및 Protease N의 순서로 가수분해하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만 조성물의 제조방법.
11. 삭제

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