KR102276689B1 - 곤충의 효소 가수분해물을 함유하는 항비만 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곤충의 효소 가수분해물을 함유하는 항비만 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 조성물은 지방세포에 대한 유의적인 분화 억제 효과를 나타내었는바, 비만의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

곤충의 효소 가수분해물을 함유하는 항비만 조성물{Composition for anti-obesity comprising enzymatic hydrolysates of insect}
본 발명은 곤충의 효소 가수분해물을 함유하는 항비만 조성물에 관한 것이다.
비만은 내분비적 요인, 유전적 요인, 사회 환경적 요인 등에 의해 대사 과정의 불균형이 발생하는 경우, 체내에 과잉된 에너지가 지방으로 축적됨으로써 야기되는 피하지방 조직의 이상 비대화에 기인한다. 지방조직의 비대화는 지방세포의 크기가 커지거나(지방세포 비대화) 그 수가 증가하는(지방세포 과형성) 현상으로, 이는 국소 정맥-림프 체계의 정체에도 영향을 미쳐 진피-피하 조직의 혈관조직 질환도 유발할 수 있다. 따라서 비만은 그 자체로서 독립된 질병으로 인식되며, 세계보건기구에서는 비만을 세계적인 영양문제로 다루어 건강을 해치는 단순 위험인자가 아닌 치료해야 할 질병으로 인식하고 있다.
현재 비만 치료제는 작용기전에 따라, 중추 신경계에 작용하여 식욕에 영향을 주는 약제와 위장관에 작용하여 흡수를 저해하는 약제로 분류될 수 있다. 중추 신경계에 작용하는 약물로는 세로토닌 (5-HT) 재흡수를 억제하는 펜플루라민과 덱스펜플루라민, 노르아드레날린 재흡수를 억제하는 에페드린 및 카페인, 및 최근에는 세로토닌과 노르아드레날린 신경계에 동시 작용하는 시부트라민 등이 있다. 위장관에 작용하여 비만을 저해하는 약물로는, 췌장에서 생성되는 리파아제를 저해하여 지방의 흡수를 줄여줌으로써 비만 치료제로 허가된 오를리스타트(orlistat)가 있다. 그러나 기존에 사용된 약물 중 식욕억제제인 펜플루라민은 마약 성분으로 분류되었을 뿐 아니라 원발성 폐고혈압이나 심장 판막 병변과 같은 부작용을 일으켜 사용이 금지되었으며, 다른 식욕억제 약물들도 혈압 감소 또는 유산 산증을 발생시킬 수 있어 심부전, 신장 질환 환자에는 사용이 제한되고 있다. 지방분해 억제제인 오를리스타트도 위장관 부작용을 일으켜 불쾌감을 유발하고 지용성 비타민의 흡수를 저해하며, 미국 FDA에 장기적 비만치료를 목적으로 승인받은 시부트라민은 심계 항진과 같은 심혈관계 질환 또는 현기증 등을 초래하여 시판이 금지되었다.
상기 약물들의 부작용을 줄이고, 보다 근본적인 비만의 예방 및 억제를 위한 대안으로서 제시되고 있는 것 중 하나가 지방세포 분화 억제제이다. 현재 밝혀진 분비 물질로, TNF-α, IL-6, IL-8, 플라스미노겐 활성화제 억제제-1, 안지오텐신-Ⅱ, 렙틴(leptin) 및 아디포넥틴(adiponectin) 등이 있으나, 이들은 각종 대사성 질환 및 심혈관 질환을 야기하는 것으로 알려졌다. 지방 조직에서의 에너지 저장 및 내분비 물질 분비는 지방세포의 분화 및 성장과 밀접한 관련이 있으며, 지방생성 과정과 동시적으로 발생한다. 지방세포의 성장은 지방세포 수에는 변화가 없이, 분화된 지방세포에 중성지방이 축적되어 비대형 지방세포가 형성되는 과정으로서, 비대형 지방세포 증가로 인한 비만은 성인에서 빈번하며 식이요법으로 조절 가능하다.
이러한 기술적 배경하에서, 새로운 항비만 물질에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 (한국 등록특허 10-1662062), 아직은 미비한 실정이다.
한국 등록특허 10-1662062
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 곤충의 효소 가수분해물 처리에 따른 유의적인 지방세포 분화 억제 효능, 즉 항비만 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 곤충의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 곤충의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 곤충의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 곤충은 장수풍뎅이, 집파리, 흰점박이 꽃무지, 갈색거저리, 동애등에, 누에, 메뚜기 및 귀뚜라미로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 장수풍뎅이일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 곤충의 가수분해물은 Pepsin(PS), trypsin(TS), Alcalase(AC), Neutrase(NT), Protease NP(PNP), Protamex(PMX), Pancreatin(P), Alphalase NP(ANP), Food Pro Alkaline protease(AK), 및 Promod 278P(PM)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소에 의해 제조될 수 있다.
상기 조성물은 지방 전구 세포의 지방세포로의 분화를 억제하는 활성을 가지거나 지방세포를 분화키시는 활성을 가짐으로써 비만을 예방하거나 치료할 수 있는 효능을 나타낼 수 있음을 실시예를 통하여 확인하였다.
또한, 본 발명은 곤충의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 곤충의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
상기 조성물에서 곤충의 효소 가수분해물과 관련한 내용은 전술한 바와 동일하므로, 중복된 내용에 대해서는 기술을 생략한다.
상기 조성물은 얼굴이나 복부, 허벅지, 둔부, 팔 등과 같은 피하 지방이 많은 국소부위에 직접 도포함으로써, 이들 부위의 지방을 국소적으로 감소시킬 수 있으며, 이러한 목적에 적합하도록 피부 외용제의 형태로 제형화될 수 있으나, 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여용으로 음용 또는 복용함으로써 체내의 지방을 감소시킬 수 있으며, 이러한 목적에 적합하도록 경구투여용 액체 투여 형태일 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 성분들 외에 해당 분야에서 일반적으로 이용되는 보조 성분들을 적절하게 배합하여, 정제, 캡슐제, 연질 캡슐제, 환제, 과립제 및 드링크제 등의 제형으로 건강 보조 식품 또는 의약품 등으로 사용할 수 있다.
본 발명은 곤충의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 조성물은 지방세포에 대한 유의적인 분화 억제 효과를 나타내었는바, 비만의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 장수풍뎅이의 추출물 (NO. 1) 및 장수풍뎅이의 효소 가수분해물 (NO. 2-11) 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 집파리의 추출물 (NO. 12) 및 집파리의 효소 가수분해물 (NO. 13-22) 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 흰점박이 꽃무지의 추출물 (NO. 23) 및 흰점박이 꽃무지의 효소 가수분해물 (NO. 24-33) 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 갈색저거리의 추출물 (NO. 34) 및 갈색저거리의 효소 가수분해물 (NO. 35-44) 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 동애등애의 추출물 (NO. 45) 및 동애등애의 효소 가수분해물 (NO. 46-55) 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 누에의 추출물 (NO. 56) 및 누에의 효소 가수분해물 (NO. 57-66) 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 메뚜기의 추출물 (NO. 67) 및 메뚜기의 효소 가수분해물 (NO. 68-77) 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 8은 귀뚜라미의 추출물 (NO. 78) 및 귀뚜라미의 효소 가수분해물 (NO. 79-88) 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 9는 장수풍뎅이-Trypsin 가수분해물의 분자량별 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 장수풍뎅이-Promod 278P 가수분해물의 분자량별 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 11은 집파리-Promod 278P 가수분해물의 분자량별 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 12는 장수풍뎅이-Trypsin 가수분해물의 농도를 62.5㎍/㎖로 희석하 분자량별 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
도 13은 장수풍뎅이- Promod 278P 가수분해물의 농도를 62.5㎍/㎖로 희석하 분자량별 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율을 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험예]
실험예 1. 실험 재료 및 실험 방법
1-1. 시료준비
시험에 사용된 곤충은 성충 2종(메뚜기, 귀뚜라미), 유충 6종(갈색거저리, 동애등에, 흰점박이꽃무지, 장수풍뎅이, 집파리, 누에) 등 총 8종의 곤충을 사용하였으며, 이들은 농업회사법인 나비 마을로부터 구입하여 사용하였다. 시료는 세척 후 동결된 상태로 구입하였으며, 동결 건조하여 시험시료로 사용하였다. 분쇄기를 이용하여 분쇄 후 분말을 이용하여 시험에 사용하였다.
1-2. 단백질 분해 효소의 처리 및 가수분해물의 수득
단백질 분해 효소는 단일 효소인 Pepsin(PS)과 trypsin(TS)는 시그마알드리치 사 제품을 사용하였고, 산업용 효소인 Alcalase (AC), Neutrase (NT), Protease NP (PNP), Protamex (PMX), Pancreatin (P), Alphalase NP (ANP), Food Pro Alkaline protease(AK), Promod 278P(PM)를 구입하여 사용하였다.
상기 실험예 1-1에서 제조된 곤충분 10mg을 400ml의 증류수에 용해시킨 후 진탕배양으로 6시간 배양하였다. 하기 표 1의 처리조건으로 단백질 분해 효소로 실활을 거친 효소처리액을 2000 rpm에서 원심 분리 후, 상청액을 진공감압여과기를 이용하여 여과 한 뒤, 동결건조를 통하여 시료를 제조하였다. 각 시료에 대한 구체적인 정보는 하기 표 2에 나타내었다 (PS : pepsin, TS : Trypsin, AC: Alcalase, P: Pancreatin, ANP : Alphalase NP, NT : Neutrase, PNP : Protease NP, PMX : Protamex , AK : Food Pro Alkaline protease, PM : Promod 278P).
Figure 112018110329010-pat00001
Figure 112018110329010-pat00002
1-3. 항비만 활성의 평가
비만세포인 3T3-L1 세포주는 ATCC에서 분양받아 사용하였으며, 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM에 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL)을 첨가하여 37℃, 5%, CO2에서 배양, 및 유지하였다. 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화를 위해 6 well plate에 5×105 cell/well의 세포를 분주하여 세포가 충분히 밀집된 상태로 배양하였다. 이로부터 2일 후, 0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin (MDI solution), 및 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 2일 동안 배양함으로써 분화를 개시하였다. 또한, 10 μg/mL insulin 및 10% FBS (fetal bovine serum)를 포함하는 DMEM으로 교환하여 3일 동안 다시 분화를 진행하였다. 이후, 10% FBS만을 포함하는 DMEM에서 배양함으로써 세포 내 지방적(lipid droplet)을 형성하는 지방세포로 분화시켰으며, 지방적의 양은 Oil Red O를 사용하여 확인하였다.
1-4. 한외여과법을 이용한 곤충가수분해물 peptide 분리 및 정제
곤충의 단백질 가수분해물을 membrane filter(molecular weight cut-off : 100kDa, 10kDa, 5kDa, 1kDa)가 장착된 ultrafiltration kit(Amicon사 제품)에 넣고 질소 가스로 5bar 압력을 가하여 분자량 100kDa이상, 100kDa~10k.Da, 10kDa~5kDa, 5kDa~1kDa, 1kDa 이하로 분획하여, 여과 하고 분획물을 동결건조 하였다.
[실시예]
실시예 1. 항비만 효능의 확인
본 발명에 따른 효소 가수분해물의 항비만 효과를 평가하기 위하여, 상기 실험예 1-2에 개시된 총 88종의 시료 (500ug/ml)를 3-L1 지방세포에 처리한 뒤, 이에 따른 lipid droplet 형성을 Oil red O 시험방법을 통하여 확인하였다. 한편, 비교군으로는 별도의 효소 처리 없이 곤충 추출물만을 처리한 군 (NO. 1, 12, 34, 45, 56, 67, 78)을 사용하였다 (이하, 상기 비교군은 무처리구로 명명함.)
그 결과, 하기 표 3, 또는 도 1 내지 도 8의 실험결과를 확인할 수 있었다.
Figure 112018110329010-pat00003
(1) 장수풍뎅이를 이용한 실험에서, 무처리구는 대조구에 비해 지방세포 분화율이 51%로서, 그 억제 효과가 매우 우수하였고, 이러한 효과는 효소에 따른 가수분해 처리에 따라 증가하였다. 구체적으로, AP 처리시 41.9%, NT 처리시 42%, PMX 처리시 36%, AK 처리시 34.2%, PNP 처리시 39%였으며, 즉, 무처리구에 비해서 각각 31.4%, 21.7%, 21.4%, 41.7%, 49.1%, 30.8% 향상되었다. 특히, 트립신과 PM 처리시 지방세포 분화율이 대조구 대비 각각 29.1%로 29.7%로 무처리구에 비하여 각각 75%, 72% 가량 지방세포 분화 억제 효과가 향상되었다 (도 1 참고).
(2) 집파리를 이용한 실험에서, 무처리구는 대조구에 비해 지방세포 분화율이 49%로서, 그 억제 효과가 매우 우수하였고, PM 처리시 38.8%, AC 처리시 40.3%였으며, 즉, 무처리구에 비해서는 각각 26.3%, 21.6% 가량 지방세포 분화 억제 효과가 향상되었다 (도 2 참고).
(3) 흰점박이 꽃무지를 이용한 실험에서, 무처리구의 지방세포 분화율은 78.3%였던 반면, AP 처리시 50.8%, AC 처리시 64%, NT 처리시 66.4%, 펩신 처리시 66.4%, P 처리시 59.2%였으며. 즉 무처리구에 비해서 각각 54%, 22.3%, 17.9%, 17.9%, 32.3% 가량 지방세포의 분화 억제 효과가 향상되었다 (도 3 참고).
(4) 갈색거저리를 이용한 실험에서, 무처리구의 지방세포 분화율은 112%였던 반면, PNP 처리시 79%, 트립신 처리시 85%였으며, 즉, 무처리구에 비해서 각각 41.8%, 31.8% 가량 지방세포의 분화 억제 효과가 향상되었다 (도 4 참고).
(5) 동애등에를 이용한 실험에서, 무처리구의 지방세포 분화율은 101%였던 반면, PMX 처리시 94%였으며, 즉, 무처리구에 비해서 7.4% 가량 지방세포의 분화 억제 효과가 향상되었다 (도 5 참고).
(6) 누에를 이용한 실험에서, 무처리구의 지방세포 분화율은 84.8%였던 반면, AC 처리시 70.3%, AK 처리시 75.8%였으며, 즉, 무처리구에 비해서 각각 20.6%, 11.9% 가량 지방세포의 분화 억제 효과가 향상되었다 (도 6 참고).
(7) 메뚜기를 이용한 실험에서, 무처리구의 지방세포 분화율은 94.2%였던 반면, AC 처리시 60.9%, AK 처리시 58%였으며, 즉, 무처리구에 비해서 각각 54.7%, 72.2% 가량 지방세포의 분화 억제 효과가 향상되었다 (도 7 참고).
(8) 귀뚜라미를 이용한 실험에서, 무처리구의 지방세포 분화율은 95.7%였던 반면, P 처리시 79.4%, AK 처리시 82.9%였으며, 즉, 무처리구에 비해서 각각 20.5%, 15.4% 가량 지방세포의 분화 억제 효과가 향상되었다 (도 8 참고).
실시예 2. 한외여과에 따른 크기별 항비만 효능 비교
상기 실시예 1의 시료 중 항비만 효능이 우수하였던 장수풍뎅이-Trypsin 가수분해물, 장수풍뎅이-Promod 278P 가수분해물, 및 집파리-Promod 278P 가수분해물을 대상으로 주요 성분을 동정하기 위하여 한외여과로 분자량별로 분리하고, 이들의 항비만 효능을 비교하였다. 구체적으로 상기 한외여과로 추출물을 1KDa 이하, 1~5KDa, 5~10KDa, 10~100KDa, 100KDa이상의 총 5 종류로 분리한 후, 500㎍/㎖의 농도에서 항비만 효능을 비교하였다.
그 결과, 하기 표 4, 또는 도 9 내지 도 11의 실험결과를 확인할 수 있었다.
분자량별 분획물 지방분화율(%)
집파리+PM 장수풍뎅이+트립신 장수풍뎅이+PM
con 99.68 ± 0.45 99.27 ± 1.03 100.00±0.00
1kDa 79.49 ± 0.00 96.20 ± 0.83 81.55 ± 0.73
1kDa pellet 57.57 ± 0.67 92.98 ± 2.48 83.27 ± 0.24
5kDa pellet 56.46 ± 0.45 37.57 ± 1.03 66.55 ± 0.49
10kDa pellet 44.00 ± 1.56 36.40 ± 0.62 38.10 ± 1.22
100kDa pellet 59.62 ± 0.45 34.65 ± 0.21 38.96 ± 0.98
(1) 장수풍뎅이 추출물을 Trypsin 효소로 가수분해한 시료는, 1KDa 이하에서 96.2%, 1~5KDa에서 93%, 5~10KDa가 37.6%, 10~100KDa 36.4%, 100KDa 이상이 34.7%로서, 5~10KDa, 10~100KDa, 100KDa 이상에서 항비만 효능이 우수하였다. 시료의 농도를 62.5㎍/㎖로 희석하여 동일분석을 하여도 10~100KDa가 25.3%, 100KDa 이상이 24.1%로 강한 활성이 유지되었다 (도 9, 12 참고).
(2) 장수풍뎅이 추출물을 Promod 278P 효소로 가수분해한 시료는, 1KDa 이하에서 81.6%, 1~5KDa에서 83.3%, 5~10KDa가 66.6%, 10~100KDa 38.1%, 100KDa이상이 39%로서, 10~100KDa, 100KDa 이상에서 항비만 효능이 우수하였다. 시료의 농도를 62.5㎍/㎖로 희석하여 동일분석을 하여도 10~100KDa가 23.9%, 100KDa 이상이 30.9%로 강한 활성이 유지되었다.(도 10, 13 참고).
(3) 집파리 추출물을 Promod 278P 효소로 가수분해한 시료는, 1KDa 이하에서 79.5%, 1~5KDa에서 57.6%, 5~10KDa가 56.5%, 10~100KDa 44.01%, 100KDa이상이 59.6%로서, 10~100KDa 에서 항비만 효능이 가장 우수하였다 (도 11 참고).
상기의 실험결과를 종합하면, 본 발명의 곤충들에 따른 효소 가수분해물은 각각 지방세포의 분화를 효과적으로 억제시킬 수 있었는바, 비만의 예방, 개선, 또는 치료에 활용될 수 있을 것이다.

Claims (6)

  1. 장수풍뎅이 유충의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하고, 상기 효소는 trypsin(TS), Protamex(PMX), Food Pro Alkaline protease(AK), 및 Promod 278P(PM)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항비만용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 지방 전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하는 것인, 항비만용 조성물.
  5. 제 1항 또는 제 4항의 조성물을 포함하는 항비만용 피부 외용제 조성물.
  6. 제 1항 또는 제 4항의 조성물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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