CN111707756A - 一种评价脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种评价脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性的方法，属于大豆肽生产技术领域，包括：将经过脱苦脱色的大豆肽分别利用LC‑Q‑TOF‑MS液相色谱‑四级杆‑时间飞行质谱联用系进行检测，分别得到色谱图，当色谱图中对应色谱峰的保留时间、色谱峰峰面积和色谱峰信号强度一致时，判断脱苦脱色大豆肽的生产工艺是稳定的。采用本发明提供的方法能够对脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性进行评价。

Description

一种评价脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性的方法
技术领域
本发明属于大豆肽生产技术领域，尤其涉及一种评价脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性的方法。
背景技术
大豆蛋白是优质的植物蛋白源，利用大豆分离蛋白通过蛋白酶水解得到的大豆肽是一种生物活性肽，具有独特的生理功能，如降血压、降胆固醇、抗肥胖、抗氧化和抗疲劳等。但是，大豆肽的产品存在颜色深、有苦味的等缺点，这些产品指标限制了大豆肽在食品、药品等领域的应用。通过脱色、脱苦的工艺处理后，产品的稳定性需要得到进一步的验证。
酶水解的各种蛋白质经常表现苦味的愿因是形成了苦味肽，大部分苦味肽的苦味是其中的疏水性氨基酸引起的。在完整的球蛋白分子中，大部分疏水性侧链藏在内部，它们不接触味蕾，感觉不到苦味。当蛋白质水解时，肽链含有的疏水性氨基酸充分暴露出来，接触味蕾产生苦味。随水解进程的继续，越来越多的疏水氨基酸侧链暴露出来使苦味增加。此外，大豆分离蛋白在酶解过程中会有大量色素生成，酶解液呈棕黄色或褐色，导致感官质量较差。作为功能性食品或食品添加剂，有色的大豆分离蛋白酶解液不易被人们接受，限制其应用范围，同时不利于生理活性的进一步研究。
随着对大豆肽脱色脱苦工艺的研究，建立评价大豆肽生产工艺稳定性的方法日益重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种评价脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性的方法，能够对脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性进行评价。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种评价脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性的方法，包括：
将经过脱苦脱色的大豆肽分别利用LC-Q-TOF-MS液相色谱-四级杆-时间飞行质谱联用系进行检测，分别得到色谱图，当色谱图中对应色谱峰的保留时间、峰面积和色谱峰的信号强度一致时，判断脱苦脱色大豆肽的生产工艺是稳定的。
优选的，所述检测的色谱条件包括：
梯度洗脱程序：0～2min97％A～97％A，3％B～3％B；2min～36min97％A～63％A，3％B～37％B；36min～38min63A％～10A％，37％B～90％B；38min～41min10％A～10％A，90％B～90％B；41min～42min10％A～97％A，90％B～3％B；42min～45min97％A～97％A，3％B～3％B；
流动相：A相：100％纯净水+0.1％甲酸；B相：100％乙腈+0.1％甲酸；流动相流速为0.5ml/min。
优选的，所述大豆肽与水混合、离心，将得到的上清液进行检测。
优选的，所述上清液的进样量为10μL。
优选的，所述大豆肽的质量与水的体积比为9mg:1ml。
优选的，所述离心的离心力为20000g，所述离心的时间为20min。
优选的，所述检测的质谱条件包括：质量扫描范围为50～150m/z，扫描模式为正离子模式。
本发明提供了一种评价脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性的方法，包括：将经过脱苦脱色的大豆肽分别利用LC-Q-TOF-MS液相色谱-四级杆-时间飞行质谱联用系进行检测，分别得到色谱图，当色谱图中对应色谱峰的保留时间、峰面积和峰高高度相似时，判断脱苦脱色大豆肽的生产工艺是稳定的。采用本发明提供的方法能够对脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性进行评价。
附图说明
图1为批次1～5的液相色谱-四级杆-时间飞行质谱图；
图2为批次6～10的液相色谱-四级杆-时间飞行质谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种评价脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性的方法，包括：将经过脱苦脱色的大豆肽分别利用LC-Q-TOF-MS液相色谱-四级杆-时间飞行质谱联用系进行检测，分别得到色谱图，当色谱图中对应色谱峰的保留时间、峰面积和峰高高度相似时，判断脱苦脱色大豆肽的生产工艺是稳定的。
本发明对脱苦脱色的大豆肽的生产方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的生产方法即可。
在本发明中，所述检测的色谱条件优选包括：梯度洗脱程序：0～2min97％A～97％A，3％B～3％B；2min～36min97％A～63％A，3％B～37％B；36min～38min63A％～10A％，37％B～90％B；38min～41min10％A～10％A，90％B～90％B；41min～42min10％A～97％A，90％B～3％B；42min～45min97％A～97％A，3％B～3％B；流动相：A相：100％纯净水+0.1％甲酸；B相：100％乙腈+0.1％甲酸；流动相流速为0.5ml/min。
本发明优选将大豆肽与水混合、离心，将得到的上清液进行检测。在本发明中，所述上清液的进样量优选为10μL。在本发明中，所述大豆肽的质量与水的体积比优选为9mg:1ml。在本发明中，所述离心的离心力优选为20000g，所述离心的时间优选为20min。
在本发明中，所述检测的质谱条件优选包括：质量扫描范围为50～150m/z，扫描模式为正离子模式。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中所使用的的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的结果如无特殊说明，均为三次结果的平均值。
以下实施例中大豆分离蛋白是以低温脱溶大豆粕为原料生产的一种全价蛋白类食品添加剂。大豆分离蛋白中蛋白质含量在90％以上，氨基酸种类有近20种，并含有人体必需氨基酸。
实施例1
脱色脱苦大豆肽的生产
(1)取大豆分离蛋白1000kg，按10％料液比加去离子水混合形成大豆分离蛋白溶液，搅拌机以1500r/min速度搅拌均匀，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至8.0，将溶液升温至50～55℃的温度条件下保持30～40min，并不断搅拌使其中的大豆分离蛋白充分溶解，获得大豆分离蛋白溶液。
(2)按步骤1)中称取的大豆分离蛋白原料重量的2％，称取大豆肽专用复合酶20kg，加入到步骤1)所得到的大豆分离蛋白溶液中，在50℃～55℃温度范围内进行酶解，酶解期间注意保温和保持不断搅拌，酶解时间控制在4h，获得大豆分离蛋白第一次酶解液。
(3)将步骤2)得到的大豆分离蛋白第一酶解液中加入风味蛋白酶进行脱苦酶解，酶解条件为：酶解温度与步骤1)一致，加酶量为1.5％，酶解时间4h，然后沸水浴10min灭酶，得到脱苦大豆分离蛋白第二酶解液。
(4)将步骤3)的第二酶解液通过孔径为20000Da的陶瓷膜，得到酶解液，截留脂肪以及大分子蛋白质，将分子量小于20000Da的大豆肽分离出来。
(5)将步骤4)所得到的酶解液调节pH值为5.0，将酶解液中加入3％的活性炭粉，升温至55℃进行脱色脱苦处理2.5h，然后进行过滤处理，去除活性炭渣，经过灭菌机得到大豆肽滤液。
(6)将步骤5)得到的大豆肽滤液通过1KD超滤膜，收集可以透过1KD超滤膜的大豆肽浓缩液。
(7)将步骤6)得到的大豆肽浓缩液进行喷雾干燥处理，得到脱色脱苦的大豆肽。
实施例2
脱色脱苦大豆肽生产工艺稳定性的评价
一种评价脱色脱苦大豆肽生产工艺的稳定性的方法，通过摸索脱色脱苦大豆肽在液相色谱-四级杆-时间飞行质谱联用(LC-Q-TOF-MS)的色谱条件，并进行检测分析。
第一步：随机选取10个生产批次的实施例1制备的脱色脱苦大豆肽10g。
第二步：分别称取9mg多肽样品置于EP管中，加入1ml纯净水涡旋充分溶解后于20000g离心20分钟，取上清进样分析测试。
1.色谱柱:
AcclaimTM120，反相C18色谱柱(3×150mm,3μm,
Figure BDA0002559701790000051
Dionex Bonded Silica)，Products(Lot No.01705107)，Thermo SCIENTIFIC。
2.色谱条件:
(1)流动相：A相：100％纯净水+0.1％甲酸；B相：100％乙腈+0.1％甲酸；
(2)流动相流速：0.5ml/min
(3)进样量：10μL上清
(4)流动相梯度程序：
表1流动相梯度程序
时间(分) 0 2.0 36.0 38.0 41.0 42.0 45.0
A(％) 97 97 63 10 10 97 97
B(％) 3 3 37 90 90 3 3
3.质谱仪器与条件
(1)质谱仪：Agilent Technologies 6530 Accurate Mass Q-TOF-MS；
(2)质量扫描范围：50-1500m/z；
(3)扫描模式：正离子模式；
(4)数据分析软件：MassHunter定性分析软件。
4.结果分析
利用离子从离子源到达检测器的时间不同达到区分不同质荷比的效果，通过比较不同批次的液相色谱-四级杆-时间飞行质谱联用(LC-Q-TOF-MS)分析的色谱图的高度相似(对应色谱峰的保留时间、峰面积和峰高等)可以看出产品的生产工艺比较稳定，结果见图1和2。
实施例3
实施例1制备的脱色脱苦大豆肽对ACE酶的抑制作用
以马尿酰-组氨酰-亮氨酰(HHL)为反应底物通过ACE酶(血管紧张素转化酶)催化反应产生马尿酸和二肽，马尿酸在紫外波长228nm处有特征的吸收峰，以马尿酸为检测指标，分别检测10个不同生产批次的ACE抑制作用，计算不同生产生产批次大豆肽的ACE抑制率。
计算公式：
Figure BDA0002559701790000061
其中A空白为不添加ACE抑制肽时马尿酸的峰面积；A抑制剂为添加ACE抑制肽时马尿酸的峰面积；IC50表示能抑制ACE一半活性时ACE抑制肽的浓度。
(1)试剂配置
pH8.3的磷酸盐缓冲溶液：用超纯水配制，其中含磷酸盐50mmol/L，NaCl 300mmol/L，用0.5mol/L NaoH调pH到8.3。
ACE酶液：将1U ACE溶于10mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.3)中。
HHL溶液：用磷酸盐缓冲液溶解，最终浓度为5mmol/L。
样品溶液：取适量样品，加入磷酸盐缓冲液混合。
(2)ACE抑制率的测定
将脱色脱苦的大豆肽配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0mg/ml的溶液，按照《姜瞻梅,田波,吴刚,霍贵成.高效液相色谱法快速测定降血压肽的血管紧张素转换酶抑制活性[J].食品与发酵工业,2007(08):122-126.》测定脱色脱苦大豆肽的ACE抑制率，每个浓度测定3次，取平均值，计算其IC50值。
(3)对不同生产批次的脱色脱苦大豆肽分子量分步进行测定，结果见表2。
表2不同生产批次脱色脱苦大豆肽的ACE抑制率
Figure BDA0002559701790000062
从表2中可以得出，连续生产的十个批次的脱色脱苦大豆肽对于ACE的抑制率接近，表明其生产工艺稳定性甚佳。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种评价脱苦脱色大豆肽生产工艺的稳定性的方法，其特征在于，包括：
将经过脱苦脱色的大豆肽分别利用LC-Q-TOF-MS液相色谱-四级杆-时间飞行质谱联用系进行检测，分别得到色谱图，当色谱图中对应色谱峰的保留时间、峰面积和色谱峰的信号强度一致时，判断脱苦脱色大豆肽的生产工艺是稳定的。
2.根据权利要去1所述的方法，其特征在于，所述检测的色谱条件包括：
梯度洗脱程序：0～2min 97％A～97％A，3％B～3％B；2min～36min 97％A～63％A，3％B～37％B；36min～38min 63A％～10A％，37％B～90％B；38min～41min 10％A～10％A，90％B～90％B；41min～42min 10％A～97％A，90％B～3％B；42min～45min 97％A～97％A，3％B～3％B；
流动相：A相：100％纯净水+0.1％甲酸；B相：100％乙腈+0.1％甲酸；流动相流速为0.5ml/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大豆肽与水混合、离心，将得到的上清液进行检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述上清液的进样量为10μL。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大豆肽的质量与水的体积比为9mg:1ml。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述离心的离心力为20000g，所述离心的时间为20min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测的质谱条件包括：质量扫描范围为50～150m/z，扫描模式为正离子模式。
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