KR20080066663A - 맞춤화된 항암 화학요법（ｐａｃ）을 위한 종합적인 진단테스트 방법 - Google Patents

맞춤화된 항암 화학요법（ｐａｃ）을 위한 종합적인 진단테스트 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암의 치료 방식(modality)을 평가하고 선택하는 방법을 제공한다.
맞춤화된 항암 화학요법(PAC), CCC, DRIT, 약물 반응 지표(DRI).

Description

맞춤화된 항암 화학요법（ＰＡＣ）을 위한 종합적인 진단 테스트 방법{Comprehensive diagnostic testing procedures for personalized anticancer chemotherapy(PAC)}
본 출원은 2005년 9월 21일에 제출된 미국 임시 특허출원 제60/718,724호 및 2006년 3월 6일에 제출된 미국 임시 특허출원 제60/778,901호에 기초해 우선권을 주장하며, 상기 두 출원은 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 구체적으로 포함된다.
연방정보 지원 연구에 대한 진술
본 출원의 발명은 CCC Diagnostics, LLC에 제공된 NCI SBIR Grant CA081903에 의해 부분적으로 지원된다. 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 암 치료의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 개별적인 환자에서 암에 대한 가장 효과적인 치료법을 식별하는 방법에 관한 것이다.
암은 고도로 개별화된(individualized) 질병이고 단일 약물에 의한 치료에 대한 현재의 우호적 반응률이 낮다(~20%). 반응률을 높이기 위해, 각 환자에 대해 올바른 약물을 선택하는 것이 매우 중요하다. 상이한 환자들이 동일한 약물에 대 해 상이한 방식으로 반응하며, 이는 유전적 소인으로부터 초래된 개별적인 변이성 때문일 가능성이 높다는 것이 정립되어 있다. 약물 효과에서 유전적 차이의 임상적 관찰이 약물 유전체학(pharmacogenomics)의 분야를 생성시켰다. 약물 반응에서 개인들간 차이가 약물-대사 효소, 약물 수송체(drug transporter) 또는 약물 표적을 코딩하는 유전자의 서열 변이에 의한 것인 다수의 사례들이 보고되었다(예를 들면, Evans, W.E. Johnson, J. A. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2 : 9-39 및 McLeod, H.L. Evans, W.E. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2001; 41: 101-121 참조).
약물 대사에 대한 숙주의 이질성 외에, 주어진 약물에 대한 종양의 반응에 영향을 미치는 종양의 변이가 있으며, 예를 들면 하기와 같다.
1) 대부분의 결장암 환자들은 그들이 티미딜레이트 신타아제, 티미딘 포스포릴라아제 및 디히드로피리미딘 데히드로게나아제의 낮은 발현 수준을 갖는 경우 5-FU 화학요법에 반응한다. 하나 이상의 상기 효소들의 발현이 높은 수준인 경우, 환자들은 매우 낮은 반응을 갖는다;
2) 베타-투불린(beta-tubulin) 돌연변이를 갖는 환자들은 파클리탁셀-기반 화학요법에 잘 반응하지 않으나, 야생형 베타-투불린을 갖는 환자의 약 40%는 완전한 또는 적어도 부분적인 반응을 가졌다. 또한, 야생형 베타-투불린 유전자를 갖는 환자의 경우 생존 중앙값(median survival)이 개선되었다;
3) HER-2/neu 유전자 증폭 또는 수용체 단백질의 강한 과다발현(면역조직화학에 의해 +3)이 세포독성 화학요법 및 트라스투주마브의 조합에 대해 보다 더 반 응할 것 같은 서브세트의 환자들을 식별하기 위해 이용될 수 있다. 단일 작용제 트라스투주마브는 HER-2/neu 과다발현 또는 유전자 증폭을 보이는 전이성 유방암을 갖는 여성의 최선 치료제(first-line treatment)로 활성을 가지며 양호하게 내약된다(well-tolerated); 및
4) 높은 뉴클레오티드 절단 복구 활성은 비소 폐암 세포(non-small lung cancer cell)에서 시스플라틴 내성과 밀접하게 상관되며 인간 난소암 세포에서 ERCC-I 발현 수준과 시스플라틴-유도 DNA 손상의 복구 간의 연관성이 보고되었다.
전술된 예들은 종양의 세포 상에서 하나 이상의 특정한 바이오마커의 발현 수준이 특정한 약물에 대한 종양의 반응에 관련된다는 것을 시사한다. 보다 최근의 항암제는 생명 유지 프로세스(vital process)(예를 들면, 복구, 유사분열)의 특정한 세포 성분(예를 들면, 수용체, 효소)에 대해 설계되기 때문에, 메카니즘에 의해 관련된(mechanistically related) 항암제로 처리될 때, 종양 세포의 반응을 표시할 수 있는 바이오마커가 발견될 수 있을 것이다(예를 들면, Park, et al, Clinical Cancer Research 2004 ; 10 :3885-3896 and Vande Woude, G.F. et al, Clinical Cancer Research 2004 ; 10 :3897-3907 참조).
본 발명이 속하는 기술 분야에서 개체의 특정한 종양을 가장 효과적인 치료 방식(treatment modality)에 조화시킬 필요성, 즉, 맞춤화된 항암 화학요법(Personalized Anticancer Chemotherapy: PAC)에 대한 요구가 존재한다는 것이 일반적으로 인정된다. 본 발명은 이 요구 및 다른 요구를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 인 비트로 이미징 기술을 통해 맞춤화된 항암 화학요법(PAC)을 위한 분자적 진단 테스트를 정립한다. PAC는 개별적인 환자로부터 수득된 종양 세포의 약물 반응 지표/바이오마커(DRI)에 대한 특성 규명을 포함한다. 이 방식은 표적화된 화학요법제의 출현 및 메카니즘에 의해 관련된 약물에 대한 종양의 내성과 상관될 수 있는 종양 세포 바이오마커 발현의 규명에 의해 유용해진다. 신선한 세포 또는 파라핀 블럭으로 보존된 오래된(archival) 세포인 종양의 인 비트로 이미징이 전산화된 형광 현미경 시스템에 의해 수행되었다. 수치 측정값은 형광 미소구체(microsphere)를 기준(reference)으로 정규화(normalized)된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 환자로부터 하나 이상의 종양 세포를 수득하는 단계 및 상기 종양세포의 특성을 규명하는 단계를 포함한다. 특성을 규명하는 단계(characterizing)은 항체, 특히 단일클론 항체에 의해 종양의 특성을 규명하는 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 그와 같은 항체는 화학요법제의 작용 메카니즘에 관련되는 종양 세포 성분(tumor cellular component)에 대해 표적화될 것이다. 이 성분들의 존재, 부재 또는 양은 치료에서 사용되는 관련 약물(들)에 대한 종양 세포의 감수성 또는 내성을 반영한다. 본 명세서에서 사용된, 특정한 화학요법제의 작용 메카니즘과 관련되는 세포 성분은 상기 화학요법제에 대한 약물 반응 지표(Drug Response Indicator: DRI)로 간주될 수 있다.
일부 구체예에서, 항체는 표지될 수 있고, 예를 들면, 각 항체는 동시 개별 검출(concurrent individual detection)을 위해 상이한 여기(excitation) 스펙트럼 및 중첩되지 않는 발광(emission) 스펙트럼을 갖는 상이한 형광 염료로 표지될 수 있다. 이와 같은 상이한 형광 표지된 항체의 결합은 측정될 수 있고, 예를 들면, 정량적으로 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 측정은 광학 및 기록 시스템의 표준화를 위한 기준 대비 형광 강도를 정량하는 것에 의해 전산화된 형광 현미경 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 세포 내의 약물 반응 지표에 표적화된 염료-표지된 항체의 형광에 의해 측정되는, 다양한 화학요법제에 구체적으로 상응하는 다양한 반응 지표들의 양은 주어진 항암 화학요법제에 대한 다양한 수준의 세포독성 반응을 보이는 다양한 관련된 암세포주와 비교될 수 있다. 환자의 종양으로부터 수득된 약물 반응 지표 데이터의 해석은 배양에서 관련된 약물 처리에 반응하는 다양한 세포독성 감수성을 갖는 다양한 관련 암세포주로부터 수득된 약물 반응 지표의 외삽(extrapolation)에 의해 정립된다. 화학요법제의 예측적 효능은 주어진 약물에 대한 약물 반응 지표의 긍정적 및/또는 부정적 영향을 파악하는 것에 의해 평가되며, 즉, 종양 세포에서 특정한 약물 반응 지표(들)의 부재 또는 존재, 및 낮은 양 또는 많은 양은 종양 세포가 주어진 약물 치료에 반응하지 않게(또는 민감하지 않게) 할 것이다. 이 예측은 어떤 정부(FDA) 승인 화학요법제가 개별적인 환자에서 종양에 대해 효과적이지 않을 가능성이 가장 높을지를 기술할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 개별적인 환자에 대한 효과적인 화학요법제(들)의 선택은 개별적인 암 환자로부터 유래된 종양 세포들의 약물 반응 지표에 의해 효과가 없는 것으로 파악된 모든 치료제를 배제시키는 것에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명은 약물 치료에 대한 세포 배양 데이터의 통계적 분석에 의해 약물 반응 지표의 양과 약물의 작용과의 직접적인 상관관계를 확인한다.
일부 구체예에서, 종양 세포 시료는 신체 내의 전이성 암을 나타내는 혈액 내에서 순환하는 암세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 세포 시료는 기관지경 생검(bronchoscopic biopsy)와 같은 생검에 의해 수득될 수 있는, 림프계에서 순환하는 종양 세포로서 원발성 종양(primary tumor)에 인접한 림프절로부터 수득될 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 세포 시료는 종양 조직이 생검 또는 외과수술에 의한 표본(surgical specimen)에 의해 수득되기 때문에 원발성 종양으로부터 수득될 수 있다. 일부 구체예에서, 시료가 원발성 종양으로부터 수득되는 경우와 같이, 종양 조직이 포르말린에 고정되고 파라핀 블럭 내에 포매되며 얇은 절편들로 절단되어 검사를 위해 현미경 슬라이드 상에 배치될 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 조직의 파라핀 블럭으로부터의 절편 슬라이드는 크실렌 및 알코올 세척에 의해 파라핀이 제거되고 항원 재생 절차(antigen retrieval procedure), 예를 들면, 가열/가수분해/재생(renaturing)에 의해 처리되고, 그 후, 식별 과정 및 약물 반응 지표의 정량적 측정을 위해 다양한 세포 성분에 대한 적합하게 형광-표지된 단일클론 항체로 염색될 수 있다. 일부 구체예에서, 처리된 슬라이드 상의 조직이 전산화된 형광 현미경 시스템에 의해 조사되고, 이미징되며, 분석되고 기록된다. 일부 구체예에서, 절편 슬라이드 상의 동일한 시야 범위(field of view)로부터 5개 이상의 형광 항체들이 동시에 측정되고, 분석되며 기록될 수 있다.
본 발명은 임의의 기원의 암 및 임의의 치료 방식(therapeutic modality)을 분석하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 암세포주는 유방, 폐, 결장 및 다양한 정부(FDA) 승인 세포독성제에 대해 상이한 정도의 내성(또는 감수성)를 보이는 상피세포 기원의 기타 암으로부터 유래될 수 있다. 세포독성제는 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 도세탁셀, 파클리탁셀, 탁솔, 비노렐빈(빈가 알칼로이드), 5-플루오로우라실 관련 약물(예를 들면, 젤로다(xeloda)), 겜시타빈 및 안트라시클린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 항암제는 트라스투주마브(허셉틴), 세툭시마브(에르비툭스), 및 베바시주마브(아바스틴)와 같은 인간화 단일클론 항체를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 약물 반응 지표는 하기의 세포 성분들(항원)을 포함하고, FDA에 의해 승인된, 상응하는 항암제의 효과를 평가하기 위해 이용될 수 있다:
약물 반응 지표(Drug Response Indicator) 약물
ERCCl 카르보플라틴
시스플라틴
옥살로플라틴
에스트로겐 수용체 타목시펜
아로마타아제 억제제
β-투불린 III 이소형 도세탁셀
파클리탁셀
탁산
비노렐빈
티미딜레이트 신타아제 5-FU 관련 약물
젤로다
리보뉴클레오티드 리덕타아제 겜시타빈
토포이소머라아제 II 안트라클린
HER-2/neu 수용체, PTEN 트라스투주마브(허셉틴)
일부 구체예에서, 약물 반응 지표는 적합하게 형광 표지된 트라스투주마브(허셉틴), 세툭시마브(에르비툭스), 및 베바시주마브(아바스틴)와 같은 적합하게 표지된 단일클론 항체 치료제에 의해 표적화된 항원을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 환자로부터 종양 세포 시료를 수득하는 단계, 항체를 이용하여 상기 시료에서 복수의 약물 반응 지표를 결정하는 단계, 및 화학요법제를 선택하는 단계를 포함하는, 개별적인 암 환자에 대한 암치료용 화학요법제를 선택하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 항체는 형광 표지될 수 있고, 예를 들면, 단일클론 항체일 수 있다. 항체가 형광 표지된 경우, 결정될 각각의 약물 반응 지표에 특이적인 항체는 상이한 여기 및 중첩되지 않는 발광 스펙트럼을 갖는 상이한 형광 염료로 표지되어, 복수 개의 약물 반응 지표의 동시 정량을 가능하게 할 수 있다. 일반적으로, 약물 반응 지표는 화학요법제의 작용 메카니즘과 관련된 세포 성분이고 선택은 시료의 세포 내에 존재하는 약물 반응 지표의 존재/부재 또는 양에 근거할 수 있다. 하나 이상의 약물 지표의 존재가 검출되고, 상기 존재하는 약물 반응 지표들을 정량하는 것이 바람직한 경우, 그와 같은 정량은 하나 이상의 참고 표준(reference standard)대비 시료 내의 약물 반응 지표의 형광 강도의 비교를 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 5개 이상의 약물 반응 지표를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 결정하는 단계는 시료 내의 복수 개, 예를 들면, 5개 이상의 약물 반응 지표의 양을 상기 약물 반응 지표를 통해 작용하는 화학요법제에 대한 공지된 반응의 세포에서의 동일한 약물 반응 지표의 양과 비교하는 단계를 포함한다. 임의의 시료 종류가 본 발명의 실시에서 이용될 수 있고, 예를 들면, 시료는 환자의 혈액에서 순환하는 종양 세포로부터 수득되거나, 환자의 원발성 종양(primary tumor)에 인접한 림프절로부터 수득되거나, 또는 원발성 종양으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 화학요법제를 선택하기 위해, 예를 들면, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 도세탁셀, 파클리탁셀, 탁솔, 비노렐빈, 빈카 알칼로이드, 5-플루오로우라실 관련 약물, 젤로다, 겜시타빈, 안트라시클린, 인간화 단일클론 항체, 트사스투주마브(허셉틴), 세툭시마브(에르비툭스), 및 베바시주마브(아바스틴)를 선택하기 위해 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 약물 반응 지표는 ERCC1이고 화학요법제는 카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살로플라틴으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 약물 반응 지표는 베타-투불린 III 이소형(isoform)이고 화학요법제는 도세탁셀, 파클리탁셀, 탁산, 및 비노렐빈으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 약물 반응 지표는 티미딜레이트 신타아제(Thymidylate Synthase)이고 화학요법제는 5-FU 관련 약물, 류코보린, 페메트렉셀 및 젤로다로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 약물 지표 반응 지표는 토포이소머라아제 II이고 화학요법제는 안트라시클린, 독소루비신 및 에피루비신으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 약물 지표 반응 지표는 토포이소머라아제 I이고 화학요법제는 이리노테칸이다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 약물 지표 반응 지표는 리보뉴클레아제 리덕타아제이고 화학요법제는 겜시타빈이다.
이 방법을 수행하기 위해 세 개의 진단 테스트가 정립되었다. 이와 같은 세 개의 진단 테스트는: (1) 약물 반응 지표 테스트(Drag Response Indicators Test: DRIT); (2) HER-2/neu 과다발현 양성인 유방암 환자를 위한 허셉틴-탁산 반응 테스트(Herceptin- taxane Response Test: HER-Tax Test); (3) 순환 암세포 테스트(Circulating Cancer Cell Test: CCCT)이다.
DRIT 및 HER-Tax는 DRF의 정량적 측정을 위한 테스트이고, CCCT는 순환하는 암 세포(CCC)의 수 및 CCC에서 DRI 바이오마커 발현을 측정한다. 이와 같은 세 개의 테스트는 개별적인 환자에서 종양의 약물 반응에 관한 포괄적인 정보를 제공하고, 이를 통해, 가장 효과적인 화학요법제가 선택될 수 있다.
예를 들면, 유방암 및 폐암 세포, 또는 종양 조직 절편 슬라이드에서 DRI 발현 수준은 표본을 염색하는 형광 염료에 의해 표지된 단일클론 항체(MAB)를 이용하기 위해 측정될 수 있다. 약물에 대한 상이한 내성을 갖는 다양한 암세포주의 DRI 발현과 세포독성 반응(IC50)을 상관시키는 지표화 시스템(indexing system)이 수립될 것이다. 이와 같은 세포독성 반응의 상관관계는 파라핀 블럭으로부터 절단된 인간 종양 조직 절편에서 DRI의 발현을 위한 참고 기준(reference)으로 작용할 수 있는 세포주 표준을 수립하기 위해 파라핀 블럭에 포매된 암세포의 DRI 측정값까지 확장될 수 있다. 배양된 암 세포의 (IC50)에 근거한 약물에 대한 상응하는 내성/반응 확률로부터 종양 절편에서 측정된 각 DRI에 대한 참고기준 범위가 구축될 수 있다. DRI 지표에 대한 참고기준 범위를 기록된 임상적 결과로 확인하기 위해 후향적 임상 연구(retrospective clinical study)가 수행될 수 있다. 이 응용의 혁신은 : (1) 인 비트로 이미징 시스템의 진보; (2) DRI 수준과 상관된 세포독성 반응의 지표 시스템(index system); (3) 종양 내성의 확률에 의해 표시된 종양 반응에 상응하는 DRI 지표에 대한 기준 범위에 근거한다. 환자의 DRI 지표, 및 임상적 반응의 기준 범위를 고려한 후, 담당 의사는 상기 환자에 대한 약 처방에 관해 정보에 근거한 결정을 내릴 수 있다.
발명의 상세한 설명
용어 생물학적 마커(biological marker)(바이오마커)는 치료적 개입(therapeutic intervention)에 대한 정상적인 생물학적 과정, 발병 과정, 또는 약리적 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가되는는 특징"으로 정의된다. 이 응용을 위해, 세포에서 약물 반응 지표는 상기 세포가 약물에 대해 어떻게 반응하는 지에 대한 정보를 제공하는 바이오마커이다.
본 발명은 하기에 근거한 PAC의 개발을 제공한다:
(1) 참고 표준에 대해 정규화된, 형광 강도에 근거한, 각 세포의 목적 영역(area of interest)에서 약물 반응 지표(DRI)의 정량적 및 동시 측정. 형광은 DRI에 대한 표지된 MAB의 염색 양을 나타낸다.
(2) 다양한 항암제에 대한 상이한 저항성을 갖는 일련의 암세포주의 이용 및 각 약물에 의한 인-비트로 세포 성장의 억제와 상기 약물에 관련된 DRI 측정의 통계적 상관관계 수립.
(3) 개별적인 암 환자로부터 유래된, DRI의 측정을 위한 암세포 및 종양 조직의 공급원(source).
PAC의 개발은 화학요법제의 낮은 효능 및 실질적인 부작용, 및 새로운 항암제를 개발하기 위해 요구되는 높은 비용 및 시간에 의해 추진된다. 개별적인 환자를 위해 기존의 항암제를 보다 효과적으로 이용해야 할 필요가 높다. PAC의 임상적 적용은 하나 이상의 하기 효과를 제공할 수 있다:
1) 의사에 의한 약물 또는 일련의 약물의 처방은 환자의 DRI 발현에 의해 표시된, 처방된 약물에 대한 상기 환자의 약물 내성의 확률에 대한 기준을 제공하는 지표화 시스템에 의해 안내될 것이다.
2) 테스팅은 여러 개의 FDA-승인 약물(3-6) 및 동일한 약물에 대한 여러 개의 적합한(qualifying) 바이오마커에 동시에 적용될 수 있다. 이와 같은 방식으로, 효과가 없는 약물은 치료제로서의 고려로부터 신속하게 제거되고 대안인 보다 효과적인 약물로 대체될 수 있다.
3) 테스팅은 실시간(2-3일)으로, 다소 저비용으로(천 달러 미만), 대량으로(전속 연구소의 경우, 1일 최대 100 건의 테스트) 수행될 수 있고 종합병원에서 수행될 수 있다.
4) 이미징 기술은 종양 이질성(tumor heterogeneity)의 평가를 포함한, 종양의 DRI 값의 정량적 측정을 위한 기반을 제공한다. 이와 같은 이질성의 측정은 약물에 대한 환자의 반응의 지속기간(duration)을 표시할 수 있다.
유방암, 폐암 및 결장암에 대한 문헌, FDA에 의해 승인되고 널리 이용되는 약물의 상세 조사로부터, 그들의 개별적인, 메카니즘에 의해 관련된 DRI가 하기의 표에 열거된다.
표
항암제 DRI 암 종류 비고
허셉틴 Her-2/neu 수용체 PTEN 유방암 유방암 FDA-요구, 확인 허셉틴에 대한 반응을 정의하는 또 다른 인자
타목시펜 아로마타아제 억제제 에스트로겐 수용체 에스트로겐 수용체 유방암 유방암 잘 수용되고 확인된 것으로 정립됨
탁산 패밀리 도세탁셀 파클리탁셀 탁솔 빈카 알칼로이드 클래스 III β-투불린 유방암 결장암 NSC-폐암 클래스 I, II 및 IV β-투불린 이소형이 관련된 것으로 보고됨
겜시타빈 리보뉴클레오티드 리덕타아제(RR) 폐암 종종 플라티늄, 탁산과 조합되어 이용됨
플라티늄 패밀리 옥살리플라틴 시스플라틴 및 카르보플라틴 ERCCI ERCCI 결장암 NSC-폐암 폐암에 대한 주요 약물. 종종 5-FU, 탁산 등과 조합되어 이용됨 옥살리플라틴은 결장을 위한 것이고, 시스플라틴 및 카르보플라틴은 폐를 위한 것임. XPP 또는 ERCCII도 DRI로서 이용되었음
5-FU 패밀리 5-FU FUDR 카페시타빈 티미딜레이트 신타아제(TS) 티미딜레이트 포스포릴라아제(TP) 디히드로피리미딘 데히드로게나아제(DPD) 유방암 결장암 종종 옥살로플라틴 이리노테신과 조합되어 이용됨
안트라시클린 독소루비신(및 아드리아르마이신) 토포이소머라아제 II 유방암 종종 약물 탐색용(drug-exploratory)으로 이용됨
6개 암에 대한 표적화된 항암 화학요법에 대한 약물 반응 지표(Drug Response Indicators (DRI) to the Targeted Anticancer Chemotherapy for 6 Cancers)를 제공하는 추가적인 약물 반응 지표가 하기의 표에서 제공된다. 열거된 화학요법은 National Comprehensive Cancer Network (NCCN) Clinical Practice Guidelines in Oncology, 2006에서 유래되었다. 상기 화학요법에 관련된 DRI는 문헌으로부터 유래되었다.
Figure 112008020329963-PCT00001
주:
1) DRI는 파라포름알데히드에서의 고정 후 생검 내의 신선한 암세포로부터 및 포르말린으로 고정되고 파라핀 블럭 내에 포매된 종양 조직의 절편으로부터 결정될 수 있다.
2) DRI 테스트에 대한 상관적 임상 연구(correlative clinical study)는 IV기(stage IV), 또는 전이단계 환자를 대상으로 실시될 것이다. 보다 한정된 임상적 반응은 이 코호트(cohort)의 환자들로부터 유래된 종양의 크기 또는 수로부터 이루어질 수 있다. 그러나, 그 결과는 보조 단계(adjuvant stage)를 포함한 모든 단계에서의 화학요법을 위해 적용될 수 있다.
3) 폐암의 경우, 독소루비신이 소세포 폐암(small cell lung cancer)을 위해 이용된다는 것을 제외하고는, 이 약물들은 소세포 폐암(아스테리스크로 표시됨) 및 비-소세포 폐암 모두를 위해 이용된다.
4) 유방암, 결장암, 폐암에 대해 조합으로 베바시주마브(아바스틴)가 이용된다. 아바스틴의 종양 세포로의 결합을 평가하기 위해 별개의 DRI 테스트가 정리될 수 있다.
전술된 바와 같이, 지표 시스템(index system)을 구축하기 위해 다양한 항암제에 대한 상이한 내성을 갖는 일련의 암세포주가 요구된다. 종양으로부터 유래된 불멸 세포주(tumors derived immortal cell line)는 일반적으로 강건한 증식을 보이며 기능적 암세포 모델 시스템을 위한 필요를 충족시킨다. 암세포주는 항암제에 대한 반응의 예측을 위해 어느 정도의 성공률로 이용되었다. 하나의 연구에서, 39종의 인간 암세포주가 55개의 세포독성 암 치료제에 대한 감수성에 대해 분석되었다. 유전자 발현과 약제감수성(chemosensitivity) 프로파일의 통합된 데이터베이스가 약물 효능의 예측을 위한 시스템을 개발하기 위해 유용할 수 있다는 결론을 얻었다. 또 다른 연구에서, 31개의 세포독성 약물의 2상 임상(Phase II trial) 결과는 국립 암연구소 인간 종양 세포주 패널(National Cancer Institute Human Tumor Cell Line Panel)의 스크리닝과 상관되었다. 인 비트로 세포주 모델이 상이한 접근방식에서 비-소세포폐암, 유방암 및 난소암에 대해 예측적이라는 결론을 얻었다. 어떠한 연구도 임상적 응용을 위한 시스템을 특정하지 않았으나, 그들은 인간 암세포주의 세포독성 감수성이 임상 시험 결과와의 상관관계 또는 예측을 위해 유용할 수 있다는 것을 보여주었다.
표적화된 항암 요법의 효과적 적용은 맞춤화된 항암 화학요법(PAC)을 수립하기 위해 이를 분자적 진단 기술(molecular diagnostic technology)과 결합시키는 것이다. PAC는 현재 암 치료를 위해 가장 유망한 발전이다. 전이성 유방암(MBC) 환자를 위한 트라스투주마브 치료와 결합된 HER-2/neu 발현은 최초의 FDA 승인된 Rx-Dx 결합(coupling)이고 PAC를 위한 모델 시스템으로 작용한다.
본 발명은 약물 반응 지표/바이오마커(DRI)를 정량하고 이 정보를 환자에 대한 적합한 치료방식을 선택에 이용하기 위해 개별적인 환자로부터 수득된 종양 세포의 특성 규명에서 인 비트로 이미징 기술과 분자적 진단의 이용을 포함한다. 분자적 진단 절차는 하기의 세 단계로 구성된다:
(1) 개별적인 암 환자로부터 암 세포 시료를 수득하는 단계; 이 암 세포들은 동결된 종양 절편으로부터 수득된 신선한 종양 세포, 생검 시료, 혈액 내의 순환하는 종양 세포, 또는 파라핀 블럭에 포매된 포르말린 고정 종양 조직으로부터 절단된 연속 절편(serial section)으로부터 수득된 오래된 세포일 수 있다.
(2) 바이오마커(약물 반응 지표, DRI)의 발현 수준이 주어진 표적화 요법에 대한 종양 세포의 내성과 관련되기 때문에, 종양 세포에서 발현된 바이오마커를 정량적으로 평가하는 단계. 상기 평가하는 단계는 상기 종양 세포의 표적화 요법에 대한 내성을 담당하는, 세포 바이오마커(cellular biomarker)에 대해 표적화된 적합하게 표지된 형광 단일클론 항체(Mab)의 적용을 포함할 수 있다. 정량은 전산화된 형광 현미경 시스템, 적합한 소프트웨어, 및 참고 표준에 의해 달성될 수 있다.
(3) 종양 세포에서 약물 반응 지표 발현과 메카니즘에 의해 관련된 약물(mechanistically related drug)에 대한 종양 세포의 세포독성 반응의 상관관계에 기반하여 적합한 치료양식을 선택하는 단계. 다양한 항암제에 대한 상이한 내성을 갖는 일련의 관련된 암세포주가 이용될 수 있다. 이 약물들의 배양되는 암세포주의 증식에 대한 효과가 이 세포주에서의 상응하는 DRI의 발현 수준과 함께 결정된다. 이 데이터는 표적화 요법용 약물의 종양 내성과 상관된 종양 세포의 DRI 발현 수준(형광에 의함)의 해석을 가능하게 한다. 인 비트로 약물 세포독성-DRI 관계는 주어진 약물에 대한 DRI 발현과 상기 약물에 의한 치료에 대한 환자의 임상적 반응의 상관 관계로 확대 해석하는 것에 대한 실험적 기반을 형성한다. 이 상관관계는 파라핀 블럭에 포매된 암세포의 DRI 측정값까지 확대되며, 이는 파라핀 블럭으로부터 절단된 인간 종양 조직 절편에서 DRI 발현에 대한 기준으로 작용할 수 있다. 배양된 종양 세포의 (IC50)에 근거한 약물에 대해 상응하는 내성/반응 확률을 보여주는, 종양 절편에서 측정된 각 DRI의 기준 범위가 구축될 수 있다.
환자의 종양에 적용되는 표적화 요법의 효능 예측은 종양 세포에서 DRI의 긍정적 및/또는 부정적 영향에 근거하며, 즉, 종양 세포에서 DRI의 부재/존재 또는 저량/고량은 종양이 주어진 약물 치료에 대해 반응하지 않게 할 것이다. 따라서, 환자를 위한 효과적인 표적화 요법의 선택은 종양 환자로부터 유래된 종양 세포의 DRI 측정에 의해 밝혀진 효과가 없는 약물에 의한 모든 치료법을 배제하는 것에 의해 달성된다.
또한, 개별적인 환자의 종양에 의한 주어진 약물에 대한 반응의 지속시간은 상기 약물에 내성을 갖는 종양 세포의 백분율 대비 상기 약물에 내성을 갖지 않는 종양 세포의 백분율에 의해 평가될 수 있다(종양의 이질성). 종양의 내성을 갖지 않는 부분은 약물에 의해 공격받고 사멸되며, 나머지 내성 세포들이 우세해지고, 전체 종양이 약물에 내성을 갖게 된다. 이 추론은 종양의 이질성 측정이 내성의 마커라는 것을 시사하고 또한 또 다른 효과적인 약물이 환자의 생존을 연장하기 위해 조합 및/또는 후속 치료로 이용되어야 한다는 것을 나타낸다.
임상적 응용에서, 환자의 반응률(RR) 및/또는 TTP(time to progression)는 그들의 종양의 DRI 측정값과 통계적으로 상관될 수 있고 상이한 DRI 지표에서 개별적인 환자에 대한 내성(무반응성)의 확률의 기준 범위가 구축될 것이다. 개별적인 환자의 DRI 지표, 및 임상적 반응의 기준 범위를 고려한 후, 담당 의사가 이 환자에 대한 약 처방에 관해 정보에 근거한 결정을 내릴 수 있다.
PAC의 접근방식을 실행하기 위해, 암 환자에 적용하기 위한 세 개의 진단 테스트를 구축하였다. 이 진단 테스트는: (1) DRIT(Drug Response Indicators Test); (2) HER-TAX 테스트(Herceptin-taxane response test); 및 (3) CCCT(Circulating Cancer Cell Test) 였다. 이 테스트들은 하기에서 더 설명될 것이다.
암성 세포(cancerous cell)는 두 가지 명백한 특징을 갖는다:
1) 숙주의 제어하에 있지 않은 복제는 종양이 될 수 있고, 및
2) 종양은 확대되고, 확산되며, 신체의 필수적인 기능을 방해하여 사망을 초래한다.
암/종양이 물리적 힘(수술 또는 방사선 조사)에 의해 제거되거나 파괴될 수 없는 경우, 전신성 항암 화학요법이 필요하다.
항암 화학요법의 성공의 핵심은 숙주에서 절대 대다수의 세포인 정상 세포를 손상시키지 않으면서 암세포를 파괴하는 능력이다. 제어될 수 없는 복제는 암세포의 특징일 뿐 아니라, 정상적 기능을 방해하기 때문에, 대부분의 암에 대한 세포독성 약물은 복제 과정에 관여된 세포 단위(cellular entity) 및 과정을 공격하도록 설계된다.
현대의 항암 세포독성제는 DNA 복제 효소, 뉴클레오티드(핵산의 구성 단위(building block)) 효소, DNA 복구 효소, 복제 신호 전달을 위한 수용체, 등과 같은 생명유지에 필수적인 과정에 관여된 세포 성분을 목표로 하는 표적화된 치료제이다. 이와 같은 핵심적인 단백질 모이어티로부터, 1011-13 Mol-1 범위의 높은 친화도 상수를 가질 수 있는, 항체, 특히, 단일클론 항체(Mab)가 용이하게 생성될 수 있다. 따라서, 이 Mab는 이 표적 단백질에 선택적으로 및 강하게 결합할 수 있다. 또한, 이 Mab가 형광 염료에 화학적으로 연결되면, 형광 Mab-표적 복합체의 양 및 위치가 검출되고, 이미징되고, 기록될 수 있다. 상이한 Mab가 각각 상이하고 중첩되지 않는 여기/발광 스펙트럼 위치를 갖는 상이한 형광 염료로 표지되는 경우, 이 상이한 Mab-표적은 목적 영역(ROI)에서 동시에 그러나, 별개의 검출로 이미징될 수 있다.
형광 복합체를 측정하는 하나의 효과적인 장치는 전산화된, 형광 현미경 시스템(FMS)이다. 이 복합체들을 포함하는 세포 내 영역들이 정의될 수 있고, 형광의 측정은 정의된 공간적 영역의 전체 형광 또는 이 영역에서 픽셀 당 평균 형광, 픽셀 당 최대 강도로 표현될 수 있다. 이 특성은 실시예 1에서 확인될 것이다.
수치로 정량화될 수 있는 측정을 갖는 것 외에, FMS에 의한 측정값은 형광 미소구체(microsphere)의 이용을 통해 표준화될 수 있다. 형광 미소구체를 통한 상이한 파장에서의 FMS의 보정 후에, 시간적 차원 및 상이한 FMS로부터의 FMS 측정값이 비교될 수 있다. 이 작업은 실시예 2에서 확인될 것이다.
개별적인 환자로부터 유래된 종양 조직은 일반적으로 세 개의 출처(source)로부터 수득된다: (1) 종양 또는 상기 종양에 인접한 림프절의 탐색으로부터 수득된 생검 물질, (2) 종양 제거 수술로부터 수득된 외과수술 물질(surgical material), (3) 전이성 종양을 나타내는 혈액에서 순환하는 암세포. 본 발명자들은 상기 모든 출처로부터 유래된 종양 세포를 조사했고, 각 출처는 그의 독특한 요건을 제시한다. 생검으로부터 유래된 종양 세포의 특성을 규명하기 위해서, 가장 중요한 요건은 정상 세포로부터 종양 세포를 식별하는 것이다. 종양 세포가 기원상 상피 세포이고, 주변 세포들(혈액 세포 또는 림프 세포)은 상피 세포가 아닌 경우, 식별은 상피 세포의 특징적인 시토케라틴 골격(cytokeratin skeleton)을 통해 비교적 용이하다. 세포골격 내의 단백질에 대해 특이적인 Mab가 입수가능하다. 대부분의 정상 혈액 세포가 배제되고, 암성 상피 세포만 특성규명을 위해 남겨지는 농축 과정(enrichment process)이 혈액으로부터 유래된 순환하는 종양 세포의 특성을 규명하기 위해 이용된다. 가장 흔하게는, 종양 조직은 외과수술 표본으로부터 수집되고; 이 조직들은 포르말린으로 고정되고 파라핀 블럭에 포매되어 보관된다. 그 후 절편 슬라이드가 이 블럭으로부터 파라핀 제거, 세척, 및 항원 재생의 과정 후에 수득될 수 있다. 실시예 3는 이 제조를 보여준다. 각 항원, 또는 심지어 단백질 표적은 별개의 활성화/재생 절차를 요구할 수 있다.
실시예 4에서, 본 발명자들은 FMS에 의한 절편 슬라이드의 관찰 영역(ROI)에서 형광 Mab-항원 복합체의 정량적 측정 및 기록을 위한 실험적 절차를 설명할 것이다. 상기 절차는 전산화된 시스템에 의한 백그라운드 자가형광의 감산을 요구한다. 이 백그라운드는 형광 Mab에 의한 염색 없이, 파라핀 블럭의 연속적인 절편화(sectioning)에 의해 유사한 영역을 관찰하는 것에 의해 FMS로부터 수득된다. 그 외에는, 광학적 측정 과정은 동일하고 백그라운드에 대한 정보는 이후에 감산시 이용하기 위해 백그라운드로서 저장된다.
실시예 5는 파라핀 블럭에 포매된 포르말린-고정 종양의 조직 절편에서 염색 및 약물 반응 지표의 수치 측정을 기재한다.
실시예 6은 종양 절편의 상이한 영역 내에서 이질성의 평가를 기재한다. 또한, 개별적인 환자의 종양에 의한 주어진 약물에 대한 반응의 지속시간이 상기 약물에 내성을 갖는 종양 세포의 백분율 대비 상기 약물에 내성을 갖지 않는 종양 세포의 백분율에 의해 평가될 수 있다(종양의 이질성). 종양의 이질성 측정은 내성 마커를 구성하고 또한 또 다른 효과적인 약물이 환자의 생존을 연장하기 위해 후속 치료로서 이용되어야 한다는 것을 나타낸다.
화학요법제의 세포독성 작용을 메카니즘에 의해 관련된 DRI의 발현과 상관시키는 DRI 지표의 구축이 실시예 7에서 기재된다. 이 방법은 배양된 인간 종양 세포의 화학요법제에 대한 반응과 약물의 작용 모드와 메카니즘에 의해 관련된 DRI의 발현 간의 통계적으로 유의성 있는 상관관계를 정립한다. 이 두 개의 값들을 상관시키고 임상적 반응을 표시하기 위한 지표로 이용될 수 있는 DRI 발현 수준을 정립하는 통계적 분석이 실시예 9에 기재될 것이다.
전술된 인 비트로 지표화 시스템의 파라핀 포매된 배양 세포 표준에 근거한 DRI 지표 시스템의 구축으로의 확장이 실시예 8에 기재된다. 이 기법은 조직 고정 및 가공의 영향을 반영하는 대조구 표준(control standard)을 정립한다.
개별적인 암 환자에 대한 질병 관리를 위한 정보를 제공할 수 있는 세 개의 분자적 진단 테스트가 실시예 10에 상세하게 기술된다. PAC의 접근방법을 실시하기 위해, 이 진단 테스트들이 암환자에 대한 제공을 위해 정립되었다. 진단 테스트는 (1) DRIT(Drug Response Indicators Test); (2) HER-TAX 테스트(Herceptin-taxane response test); 및 (3) CCCT(Circulating Cancer Cell Test) 였다. 각각은 이 실시예에서 상세하게 기재된다.
실시예 11은 유방암 환자에서 PAC의 정립을 위해 필요한 단계들을 상세하게 기재하고 이 전략을 지원하는 관련 데이터를 제공한다.
PAC 시스템을 확인하기 위해 필요한 임상적 상관 연구 설계가 실시예 12에 기재된다. 공지된 임상 결과를 동일한 환자의 종양 세포로부터 유래된 DRI 측정값과 상관시키기 위한 후향 연구(retroscpective study)가 먼저 수행될 것이다. 뒤이어, DRI 데이터의 전향 연구(prospective study)가 치료 중인 환자의 결과와 상관될 것이다. 이 시험으로부터 수득된 데이터가 IDE로 작용하고 FDA로부터의 PMA로 이어질 것이다.
전술된 전략이 특별히 잘 작용하는 상황은 유방암에 대한 트라스투주마브(허셉틴) 및 결장암에 대한 세툭시마브(에르비툭스)와 같은 인간화 단일클론 항체 치료제이다. 이 접근방법에서, 본 발명자들은 단일클론 약물 자체를 치료적 Mab에 대한 형광 염료의 부착 후에 표적-수용체에 대한 프로브로 사용하였다. 명확하게, 치료적 Mab가 종양 세포에 부착할 수 없는 경우, 종양 세포는 상기 치료적 Mab에 반응하지 않을 것이다. 그 반대가 진실이 아닐 수 있다는 것, 즉, Mab의 종양 세포로의 부착이 세포독성 반응을 일으키지 않을 수 있다는 것에 유의해야 한다. 따라서, 약물 반응 지표의 정량적 측정의 이 방법으로부터 도출되는 필수적 정보는 약물 반응 지표의 부재 때문에 어느 세포가 세포독성 반응을 보이지 않는지 여부의 결정이다. 그러나, 약물 반응 지표의 유망한 측정이 이 종양 세포들이 세포독성 반응을 보일 것이라는 확실한 정보를 제공할 수 없다. 다시 말하면, 부정적 약물 반응 지표는 종양 세포가 세포독성 반응을 보이지 않을 것이라는 것을 예측하나, 긍정적 약물 반응 지표는 다른 중요한 인자들의 영향 때문에 종양 세포가 세포독성 반응을 보일 것이라는 것을 보장하지 않을 것이다. 따라서, 본 발명자들은 개별적인 환자에서 종양에 대한 효과 없는(그러나, 여전히 부작용을 보이는) 약물의 이용을 배제하기 위해 "무효 약물 지표(ineffective drug indicator)"를 가질 수 있다. 무효 약물 지표의 지식은 매우 유용하고 신뢰할 만하고, 이는 이 결론이 세포 배양에서 정의된 세트의 조건 하에 통계적으로 뒷받침되기 때문이다.
전반적으로, 전술된 기재는 "맞춤화된 항암 요법"(PAC)에 포함된 성분들을 요약한다. 첫째, 표적화 치료제는 FDA에 의해 개발되고 승인된다. 둘째, 필수적인 세포 표적이 연구실 및 임상 연구에서 식별되었다. 셋째, 이 단백질 표적에 대해 특이적인 항체(특정한 단일클론 항체)가 생성되었고 적합한 형광 염료에 의해 표지되었다. 넷째, 종양 세포에서 이 형광 Mab-표적 복합체의 양 및 위치를 측정하고, 이미징하고, 기록하기 위해 전산화된 형광 현미경 시스템이 조립된다. 다섯째, 대표적인 종양 세포의 공급원은 생검 절차, 외과수술적 표본, 또는 혈액 내의 순환하는 종양 세포를 통해 수득될 수 있다. 여섯째, 잘-정립된 인 비트로 상황에서 약물 반응 마커의 양이 종양 세포의 세포독성 반응과 통계적으로 상관된다는 것을 보여주기 위해 수행된 상관관계 연구를 이용하여 적합한 화학요법제를 선택한다.
상기 여섯 개의 성분들의 연결은 주어진 암환자를 위한 효과 없는 약물의 이용을 배제하는 정보에 기반한 권고와 함께 "맞춤화된 항암 요법"의 기반을 형성한다. 이 전략은 "무효 약물 지표"에 관한 정보의 의학적 기여에 대한 임상적 상관 연구에서 입증되었다. 이 입증의 초기 단계가 트라스투주마브의 이용에 대한 FDA 승인 절차에서 주어지고, 별개의 섹션에서 기재될 것이다.
PAC 시스템를 구성하여, 본 발명자들은 개별적인 환자들로부터 수득된 종양 세포로부터 바이오마커를 정량적으로 측정하기 위한 FMS의 적용에서 절차를 제공했다. 상이한 출처로부터 수득된 종양 세포를 위한 구체적 절차가 실시예에 기재될 것이다.
도 1은 다양한 종양 세포 제조로부터의 HER-2/neu 정량적 데이터를 비교하기 위해 이용하는 InSpeck Microscope Image Intensity Calibration Kit(6 마이크론 형광 미소구체)에 의해 생성된 표준 곡선(standard curve)이다.
도 2는 유방암 환자로부터의 조직 절편에서 HER-2/neu 형광 신호를 보여주는 디지털 이미지이다. 상기 절편은 파라핀 블럭에 포매된 종양 조직으로부터 절단되고, 트라스투주마브-알렉사 532(Trastuzumab-Alexa 532)에 의한 염색을 위해 처리되고, 형광 현미경에 의해 분석되고, CCD 카메라로 촬영되었다.
도 3은 HER-2/neu의 정량을 위해 선택된 트라스투주마브-알렉사 532로 염색된 세포막의 목적 영역(AOI)을 도시한다.
실시예 1
현미경 슬라이드 상의 고정된 세포에서 형광 복합체의 측정
사용된 시스템은 CCD 카메라, 8-필터 큐브 터렛(8-filter cube turret) 및 이미지 획득 및 이미지 처리를 위한 Image-Pro Plus 소프트웨어가 장착된 컴퓨터 보조 Leica DMRXA 형광 현미경이다. 현재, 본 발명자들은 동일한 세포로부터의 5개의 스펙트럼 영역의 형광을 측정할 수 있고; 두 개는 세포 식별을 위해 이용되고 세 개는 바이오마커를 측정하기 위해 이용된다. 세포를 복수 개의 마우스 단일클론 항체로 염색하기 위해, 각 항체를 직접 표지시키는 것이 필요하다. 이는 플루오레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate) 및 Molecular Probes로부터의 알렉사(Alexa) 염료의 숙시니미딜 에스테르 유도체에 의해 이루어진다.
본 실시예에서, 유방암 세포주에서의 HER-2/neu의 정량이 예시된다. 단일클론 항체, 트라스투주마브를 알렉사 532로 표지시키고 항-판시토케라틴(anti-pancytokeratin)을 FITC로 표지시켰다. 유방암 세포주(SKBR-3)를 상기 항체들과 인큐베이션시키고, 세척하고 안티페이드 매질(antifade medium)에 담긴 DAPI에 의한 역염색(counter-staining)을 위해 배치시켰다(mount). 동일한 세포에서 DAPI, FITC 및 알렉사 532 신호의 구별을 가능하게 하는 필터 큐브를 이용하여 적합한 노출 시간에 디지털 이미지를 수득했다. 각 세포의 공간적 영역을 시토케라틴 형광을 이용하여 그 외형선을 표시하였다(outline). 이 외형선(outline)을 저장하고 불러들여 알렉사 532 이미지, 즉, HER-2/neu 신호 상에 중첩시켰다. 하기의 표는 4개의 세포에서 HER-2/neu 발현에 대한 정량적 데이터를 제시한다. 컬럼 1은 객체 번호를 제시하고, 컬럼 2는 세포 영역을 픽셀 수로 제시하고, 컬럼 3은 각 세포에서 픽셀 당 평균 형광 강도를 제시하며, 컬럼 4는 각 세포에 대한 통합된 형광 강도를 제시한다. 데이터는 세포에서 HER-2/neu 발현이 변할 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure 112008020329963-PCT00002
실시예 2
현미경 시스템의 보정(calibration).
정량적 면역형광 연구를 수행하기 위해, 먼저 다양한 시간 간격에 대해 상이한 현미경 상에서 디지털 이미지를 수득하고 수득된 디지털 이미지를 비교할 수 있어야 한다. 이는 Molecular Probes로부터 수득된 용이하게 입수가능한 형광 표준으로 Leica 현미경 시스템을 보정하는 것에 의해 수행하였다. 상기 형광 표준은 6 미크론-직경 형광 미소구체로 구성되었다(Inspeck Microscopy Image Intensity Calibration Kit). 미소구체의 현탁액을 현미경 슬라이드 상에 놓고, 자연건조시키고 안티-페이드 매질 상에 배치하고 커버슬립을 덮었다. 포화 수준, 즉, 12-비트 이미지의 경우 픽셀 당 4096 형광 단위(fluorescence unit)를 초래하는 시간을 초과하지 않도록 주의하면서 다양한 노출 시간에서 이미지를 수득하였다. 즉, 각 노출 시간에, 픽셀 당 약 4 또는 5 개의 미소구체의 평균 형광 강도를 수득하기 위해 Image-Pro Plus 소프트웨어로 처리했다. 밀리세컨드 단위의 노출 시간에 대해 픽셀 당 평균 형광 강도를 플롯팅하여 각 필터 큐브에 대해 표준 곡선을 수득하였다. 그와 같은 선형 표준 곡선의 일 예가 도 1에 제시된다. 기울기 및 절편(intercept)을 이용하여 참고 표준으로 2000 유닛의 표준 형광을 생성하기 위해 요구되는 노출 시간을 계산하였다; 도 1에 도시된 플롯의 경우, 176 밀리세컨드의 값을 수득하였다. 따라서, 동일한 형광 표준을 이용하여, 각 현미경/필터 큐브가 적합한 노출 시간을 선택하는 것에 의해 동일한 형광 강도를 주도록 보정될 수 있다.
실시예 3
식별(identification) 및 특성 규명(characterization)을 위한 종양 세포 제제의 제조 및 염색
기관지경 생검(bronchoscopic biopsy)에 의해 폐암 세포를 수득할 수 있다. 환자로부터 제거한 후, 생검 물질을 중성의 염수에 넣었다. 세포들을 PBS로 세척하고 계수(counting)를 위해 특정된 부피로 준비했다. 적합한 수의 세포들을 PapPen으로 표시된 영역 내에서 현미경 슬라이드 상에 침착시켰다. 건조 후에, 상기 세포들을 2% 파라포름알데히드로 고정시키고, 항-판시토케라틴-FITC와 인큐베이션시키고 상피 세포를 식별하기 위해 DAPI로 역염색시켰다. 이미지를 수득하고 온전한 핵(intact nucleus)을 갖는 상피 세포의 수를 계수하였다. 이수배수 체(aneuploidy)의 척도로서 슬라이드 상에서 상피세포/세포의 wbc 핵 DNA 비를 결정하고 특이적 단일클론 항체에 의한 염색으로 상피 세포에서 알파 태아단백질(fetoprotein) 수용체의 발현을 정량하는 것에 의해 종양 세포를 정상 상피세포로부터 식별할 수 있었다. 형광 표지된 항체를 이용한 정량은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
외과적 수술 동안 또는 생검에 의해 수득된 조직 절편들을 포르말린으로 고정시키고 파라핀 블럭에 포매시켰다. 일련의 4 미크론 절편들을 이 파라핀 블럭으로부터 절단하고 현미경 슬라이드 상에 고정시켰다. 상기 절편을 하기와 같이 처리하여 파라핀을 제거하였다: 각각 5분씩 2회 크실렌 처리; 각각 3분씩 2회 95% 에탄올 처리; 각각 3분씩 2회 70% 에탄올 처리; 10분 이상 수돗물 처리. 항원 재생을 위해, 슬라이드를 10 mM EDTA, pH 8, 또는 10 mM 시트레이트, pH 6에서 95℃에서 30분간 인큐베이션하고 뒤이어 동일한 용액에서 실온에서 20분간 인큐베이션하였다. 상기 슬라이드를 PBS로 세척하고 항-판시토케라틴-FITC 및 기타 형광 표지된 목적 항체로 염색하였다.
혈액 내의 순환하는 암세포(CCC)는 하기의 프로토콜을 통해 분리하고 식별하였다: 이중 구배(double-gradient) 원심분리 및 뒤이은 면역자기 비드(immunomagnetic bead)를 사용하여 15-20 ml의 혈액으로부터 대부분의 혈액 세포를 제거하여(음성 선택) 암세포를 농축하는 단계; 상기 세포를 PapPen으로 표시된 영역 내에 현미경 슬라이드 상에 세포를 침착시키는 단계 및 항체 칵테일(9개의 시토케라틴 펩티드 및 인간 암종 상에서 발현되는 종양-관련 당단백질(glycoprotein) 에 대한 반응성을 갖는 FITC-표지된 항체)와 인큐베이션 시키는 단계; DAPI-함유 안티-페이드 매질로 고정시키는 것에 의해 역염색시키는 단계; 형광 현미경으로 슬라이드를 스캐닝하는 단계 및 온전한 핵을 갖는 FITC 양성 세포를 계수하는 단계.
표준 CCC 테스트에서, 100,000개 이상의 백혈구(WBC)를 CCC로 회수하였다. WBC는 일부 경우에 염료-MAB 복합체에 의한 암세포의 염색을 방해한다(그러나, HER-2/neu 또는 시토케라틴에 의한 염색은 방해하지 않음). 따라서, 암세포와 함께 3000개 미만의 WBC의 회수를 가져오는 수퍼농축(superenrichment) 절차를 개발하였다. 이 제조에서, 상기 세포들의 염색은 소수의 WBC에 의해 영향받지 않았다. 이 절차는 하기에 상세하게 기재된다:
CCC 수퍼농축(SuperEnrichment) 프로토콜:
15-20 ml의 항응고처리(anticoagulated) 말초 혈액(6시간, 100개의 MCF-7 유방암 세포가 첨가됨(spike))을 PBS로 총 30 ml까지 희석시키는 단계;
50-ml 원추형 튜브에서 15 mL 1.093 구배 상에 희석된 세포 현탁액을 조심스럽게 층으로 배치하고 스윙윙-버킷 로터(swinging-bucket rotor)(브레이크(brake) 없음)에서 20℃에서 2000 rpm으로 30분간 원심분리하는 단계;
피펫으로 상층액을 완전히 제거하고 1.083G 인터페이스의 상부 6-8 ml 회수하는 단계;
1200 rpm으로 10분간 원심분리하여 행크 용액(Hanks's solution)으로 2회 세척하는 단계;
상층액을 조심스럽게 완전히 제거하는 단계;
1x 희석 완충액을 40 ml의 최종 부피까지 첨가하고 잘 혼합하는 단계;
5 ml의 MACS CellPerm 용액을 첨가하고, 잘 혼합하며, 실온에서 정확히 5분간 인큐베이션하고, 뒤이어 5 ml의 MACS CellPerm 용액을 첨가하고, 잘 혼합하며, 30분간 인큐베이션하는 단계;
세포 현탁액을 1200 rpm으로 10분간 원심분리하는 단계;
세포 펠렛을 1x MACS CellStain 용액에 600 ㎕의 최종 부피로 재현탁시키는 단계;
200 ㎕의 FcR Blocking Reagent를 첨가하고 잘 혼합하는 단계;
200 ㎕의 MACS CK Microbeads를 첨가하고 20-25℃에서 45분간 인큐베이션하는 단계;
100 ㎕의 항-시토케라틴-FIT를 첨가하고 추가로 10분간 인큐베이션하는 단계 ;
4 ml의 1x MACS Cell Stain 용액을 첨가하고 1200 rpm으로 세포 현탁액을 원심분리하는 단계;
MACS 분리기(separator)의 자기장에서 양성 선택 컬럼(positive selection column)을 배치하는 단계;
재현탁된 세포를 상기 컬럼에 적용하고, 백혈구(WBC)를 상기 컬럼을 통해 통과시키고, 및 가스를 제거시킨(degassed) 1x 희석 완충액 500 ㎕에 의한 세척을 3회 반복하는 단계;
분리기로부터 컬럼을 제거하고, 컬럼을 15 ml 튜브에 배치하는 단계;
가스를 제거시킨 1X 희석 완충액 1 ml을 피펫으로 컬럼의 상부에 배치하고, 컬럼에 적용된 플런저(plunger)를 이용하여 보유된 순환하는 암세포를 용출시키는 단계;
세포 펠렛을 스핀 다운시키며 실온에서 8-24 시간 동안 자연건조시켜 슬라이드 상에 직접-침착시키는 단계; 및
고정 매질(mounting medium)에 DAPI를 첨가하고 시료에 컴퓨터 보조 현미경 분석을 적용하는 단계.
실시예 4
파라핀 블럭으로부터 절단된 종양 조직 절편에서 바이오마커 발현의 정량
조직 절편 전체에서 측정된 형광 강도는 항원에 결합된 형광 표지된 1차 항체의 양을 반영하며, 이는 다시 세포 내의 표적 단백질(바이오마커)의 양을 나타낸다. 그러나, 재현가능한 정량적 데이터를 생성하기 위해, 포르말린-고정 조직에 내재된 자가형광이 파악되어야 한다. 자가형광은 프로토콜에서, 대조구 슬라이드, 즉, 동일한 종양의 연속 절편을 형광 표지된 1차 항체 없이 처리하는 것에 의해 측정하였다.
본 발명자의 기준 표준으로 2000 형광 단위를 생성하는 노출 시간을 이용하여, 각 종양으로부터의 3개 내지 4개의 상이한 영역의 디지털 이미지, Cl(DAPI), C2(FITC), C3(Alexa 532), C4(Alexa 594) 및 C5 (Alexa 647) 필터 큐브를 수득하였다(실시예 2 참조). 대조구 슬라이드 및 실험군 슬라이드를 정확하게 동등하게 처 리하였다. 또한, 조직을 포함하지 않는 슬라이드 상의 백그라운드 영역의 이미지를 각 필터로 수득하였다. 상기 이미지를 Image-Pro Plus 소프트웨어로 처리했다. 각 백그라운드 이미지에 대해, 픽셀 당 평균 형광을 막대그래프로부터 수득하고 그 값을 적합한 실험군 이미지로부터 차감했다. 바이오마커의 정량을 위해 각 이미지에서 각각 약 10개의 세포를 포함하는 3개 내지 4개의 목적 영역을 선택했다. HER-2/neu-염색된 유방암 절편의 대표적 이미지가 도 2에 제시된다. 막의 강한 완전한 염색을 관찰할 수 있었다. 막 영역의 형광 강도를 정량하였고 5명의 상이한 유방암 환자에 대한 데이터가 하기의 표에 제시된다. 상기 환자들 중 4명의 HER-2/neu 발현은 자가형광보다 약 2 내지 4배 높았다. 한 명의 환자에서, 자가형광 및 HER-2/neu 신호는 유사했다. 종양의 다양한 영역에서 HER-2/neu 발현의 이질성이 있었다. 본 발명자들은 높은 발현 영역과 보다 낮은 발현 영역 간에 3.3-배 차이를 관찰했다.
UMM 및 WR-877 밀리세컨드 노출로부터 유방암 조직의 허셉틴-Al 532 염색
Figure 112008020329963-PCT00003
* 각 이미지의 3개 내지 4개의 영역을 분석하고 평균을 표시하였다. ABY는 염색을 위해 사용된 표지된 단일클론 항체를 나타낸다.
본 발명자들은 유방암 조직에서 에스트로겐 수용체의 발현 및 결장암 조직에서 베타-투불린 이소형 III 및 ERCC-1(DNA 복구 효소)의 발현을 정량하였다. 데이터가 하기의 표에 제시된다. 염색된 조직의 평균 형광 대 자가형광(항체 불포함)은 ERCC-1, 베타-투불린 III 및 에스트로겐 수용체에 대해, 각각 5.7, 3.6 및 15.8 이었다.
파라핀 블럭으로부터 절단된 조직 절편에서 약물 반응 지표의 측정
Figure 112008020329963-PCT00004
실시예 5
유방암을 예로 이용한, 파라핀 블럭에 포매된 포르말린-고정 종양의 조직 절편의 염색 및 약물 반응 지표의 수치 측정.
본 발명자들은 파라핀 블럭으로부터 절단된 유방암 조직 절편에서 HER-2/neu 수용체 발현을 정량하는 재현가능한 형광 현미경 절차를 정립하였다. 현미경 슬라이드 상에 고정된 조직 절편으로부터 하기와 같이 파라핀을 제거하였다: 슬라이드를 크실렌에 5분간 넣고, 이를 1회 반복하는 단계; 슬라이드를 3분간 95% 에탄올에 넣고, 이를 1회 반복하는 단계; 슬라이드를 3분간 70% 에탄올에 넣고, 이를 1회 반복하는 단계; 슬라이드를 증류수로 세척하는 단계. 그 후, 항원 재생을 위해 슬라이드를 10 mM 시트레이트, pH 6.0에서 95도로 30분간 가열하고 뒤이어 실온에서 20분간 냉각시키는 단계로 처리하였다. 슬라이드를 트라스투주마브-알렉사 532 컨쥬게이트 및 항판시토케라틴-FITC와 동시에 인큐베이션시켰다. 기준 표준으로 2000 형광 단위를 생성시키는 노출 시간을 이용하여 각 종양 절편의 3개 내지 4개의 디지털 이미지를 수득하였다. HER-2/neu를 과다발현하는 세포는 완전한 세포막의 매우 강한 형광 염색을 보였다. 각 디지털 이미지에서 3개 내지 4개의 목적 영역(AOI)을 조사했다. AOI에 대한 정량적 형광 데이터(픽셀 당 평균 형광, 표준편차, 최대값 및 최소값, 및 통합된 형광 강도)를 보여주는 막대그래프를 생성했다. 이 형광 데이터를 이용하여 HER-2/neu 발현의 정량을 위해 염색된 막의 영역들을 선택하였다. 도 3은 정량을 위해 선택되고 표시된(outlined) 상기 AOI 중 하나 상의 영역들을 보여준다. 정량적 측정값 데이터(픽셀 수로 표시된 면적 및 픽셀 당 표준 형광, 밀도 1um)가 하기의 표에 도시된다.
Figure 112008020329963-PCT00005
실시예 6
종양 절편의 상이한 영역 내에서 HER-2/neu 발현의 이질성 평가
환자 종양의 세포들 간 HER-2/neu 발현의 이질성이 트라스투주마브에 의한 치료에 대한 전체 반응 및 지속기간을 결정할 수 있다. 본 발명자들은 전술된 정량적 분석을 이용하여 환자 종양 조직 절편에서 이 이질성을 평가할 수 있었다. 두 명의 유방암 환자에 대한 종양 조직의 디지털 이미지의 4개의 AOI로부터의 데이터가 하기의 표에 제시된다. 본 발명자들은 HER-2/neu 염색된 막의 최대 형광강도 와 최소 형광강도 간에 2.1(환자 1) 내지 3.3(환자 2) 배의 차이를 관찰했다.
환자 종양의 상이한 영역 내에서 HER-2/neu 발현의 이질성 평가
Figure 112008020329963-PCT00006
** 막 측정값의 수
실시예 7
화학요법제의 세포독성 작용과 메카니즘에 의해 관련된 약물 반응 지표의 발 현을 상관시키는 인 비트로 시스템.
본 실시예는 배양된 인간 암세포주의 항암제에 대한 세포독성 반응을 상기 세포의 메카니즘에 의해 관련된 약물 반응 지표(DRI)와 상관시키는 인 비트로 시스템을 설명한다. 세포독성 반응을 명확하게 표시하기 위해 이용될 수 있는 DRI 발현 수준을 정립하기 위해 이 데이터에 대한 통계적 분석을 실시하였다.
종양으로부터 유래된 불멸 세포주(tumors derived immortal cell line)는 일반적으로 강건한 증식을 보이며 기능적 암세포 모델 시스템을 위한 필요를 충족시킨다. 암세포주는 항암제에 대한 반응의 예측을 위해 어느 정도의 성공률로 이용되었고, 이는 약제감수성 프로파일이 약물 효능의 예측을 위한 시스템을 개발하기 위해 유용할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 실시예에서, 다수의 유방암 유래 세포주에서 형광 염료에 연결된 단일클론 항체를 프로브로 이용하여 DRI를 정량하였다. DRI 발현 수준은 데이터의 일간(inter-day) 및 연구소간(inter-laboratory) 비교를 가능하게 하기 위해 용이하게 입수가능한 형광 표준으로 정규화된 디지털 값으로 표현된다. 모든 약물은 메카니즘상 작용 모드와 관계된 잠재적인 세포 표적을 가질 것이다.
유방암 세포주를 고정하고 알렉사-532에 의해 컨쥬게이트된 허셉틴(트라스투주마브, 항-HER-2/neu 수용체) 또는 알렉사-594에 의해 컨쥬게이트된 항-ER, 또는 알렉사-647에 의해 컨쥬게이트된 항-TUB III 및 FITC에 의해 컨쥬게이트된 항-시토케라틴과의 동시 인큐베이션에 의해 현미경 슬라이드 상에서 염색시켰다. FITC 신호(470 nm/497 nm/522 nm), 알렉사 647 신호(630 nm/649 nm/667 nm), 알렉사 594 신호(581 nm/593 nm/617 nm) 및 알렉사 532 신호(546 nm/557 nm/567 nm)의 디지털 이미지를 적합한 노출 시간(형광 표준에 의해 2000의 값을 생성하는 노출 시간)에서 수득하고 각 ROI(암세포)에서 픽셀 당 평균 형광을 결정하기 위해 분석하였다. 각 ROI의 공간적 면적은 매우 강한 시토케라틴 형광으로부터 결정하였다. 외형선(outline)을 저장하고, 재생하여 세포의 동일한 영역의 알렉사 532 이미지, 알렉사 594 이미지 또는 알렉사 647 이미지에 중첩시켰다. 소프트웨어는 각 ROI의 면적 및 픽셀 당 평균 형광을 보여주는 표를 생성했다.
실험적 조건의 경우, 100 ㎕의 배지에 담긴 104개의 생존가능한 세포를 포함하는 세포 현탁액을 96 웰 플레이트에 도말하고(plate), 37℃ 5% CO2 대기에서 24시간 동안 부착시켰다. 이 인큐베이션 기간 후에, 세포를 공개된 약동학적 분석에 의해 결정된 피크 혈장 농도(PPC)에 근거하여 표시된 투여량의 약물에 노출시켰다. 타목시펜의 경우, 세포를 합류 상태(confluent)에 도달할 때까지 72시간 동안 배양했다. 그 후, ER 발현을 최대화하기 위해 0.5% FCS를 함유한 배지를 각 웰에 첨가하였다. 대조구 웰은 100 ㎕의 적합한 배지를 포함했고 테스트 웰과 동일하게 처리했다. 처리 후 72시간 경과 시, 플레이트를 대상으로 WST-8 분석을 수행하였다. WST-8은 유색의 포르마잔 생성물을 생성하기 위해 세포 데히드로게나아제(cellular dehydrogenase)에 의해 생물환원되는(bioreduced) 테트라졸리움 염이다. 상기 포르마잔 생성물의 양은 살아있는 세포의 수에 직접적으로 비례한다. 약제감수성 테스트를 위해 포르마잔 기반 분석법을 성공적으로 이용하였다. 각 웰의 흡광도는 Biotek 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 460 nm에서 측정하였다. 약물의 각 농도에 대해, 평균 흡광도 ± SE를 계산하였다. 결과는 약물 농도 대비 % 성장 억제율로 표현하였다. IC50 값은 fu = 영향받지 않은 분획(fraction unaffected), fa = 영향받은 분획(fraction affected) 및 C= 약물 농도(drug concentration)인 (log fa/log fu) vs log C의 중앙값 효과 플롯을 이용하여 결정하였다.
화학요법제에 대한 다양한 유방암 세포주의 생물학적 반응은 관련된 DRI의 발현과 잘 일치되었다. 초기 연구는 모델 시스템을 확인하기 위해 두 개의 잘 규명된 DRI, HER-2/neu 및 에스트로겐 수용체(ER)로 수행하였다. HER-2/neu 종양 유전자는 상피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)에 대해 광범위한 상동성을 갖는 막관통 티로신 키나아제 수용체(transmembrane tyrosine kinase receptor)를 코딩한다. HER-2/neu 과다발현은 허셉틴(트라스투주마브) 요법에 대한 증가된 감수성을 초래한다. 유방암에 대한 또 다른 효과적인 표적화된 치료제는 타목시펜이고, 이는 암세포의 표면상에 있는 에스트로겐 수용체에 결합하고 에스트로겐의 세포 성장에 대한 효과를 차단한다. ER은 타목시펜 요법에 대한 감수성을 결정하는데 있어서 유의성 있는 예측 가치를 갖는 것으로 알려져 있다.
그들의 표면상에서 가장 높은 수준의 형광 표지된 허세틴 결합을 보이는 세포주들이 허셉틴에 의한 치료에 대해 가장 큰 반응을 보였다. 이 특정한 세포주들, HCC2218 및 SKBR-3은 증식의 투여량-관련 억제를 보였고, 각각 0.032 및 0.125 mg/ml의 낮은 농도에서 반응을 보였다. 이와 대조적으로, 하기의 표에 표시된 바 와 같이, 낮은 수준의 허셉틴 결합을 보이는 유방암 세포주에서 증식은 영향받지 않거나, 또는 약물의 높은 투여량으로만 반응이 유도되었다.
배양된 유방암 세포에서 생물학적 반응과 DRI 발현 수준의 비교. - Her-2/neu/ 허셉틴
Figure 112008020329963-PCT00007
주: * NR - 2 mg/ml까지의 허셉틴 처리에 대해 무반응
** 정의된 노출 시간 적용시, 2000 유닛을 생성하는 기준 표준 대비 평균 형광/픽셀
유사한 방식으로, 높은 ER 발현을 보이는 세포주(MCF-7)는 타목시펜에 의한 처리에 대해 높은 감수성을 보였다. 대조적으로, 보다 낮은 정도의 ER 결합을 보이는 세포주(SKBR-3, MDA-MB 231)는 하기의 표에 표시된 바와 같이 타목시펜에 의한 처리에 대해 훨씬 덜 민감한 반응을 보였다.
배양된 유방암 세포에서 생물학적 반응과 DRI 발현 수준의 비교. - 에스트로겐 수용체/타목시펜
Figure 112008020329963-PCT00008
주: * NR - 50 ㎍/ml 까지의 타목시펜 처리에 대해 무반응
** 정의된 노출 시간 적용시, 2000 유닛을 생성하는 기준 표준 대비 평균 형광/픽셀
이 실험들을 베타-투불린 III(TUB III) 발현과 항암제, 파클리탁셀(PTX) 및 도세탁셀(DTX)에 대한 생물학적 반응 간의 상관관계를 고려하기 위해 확장했다. 이 약물들을 TUB III에 결합하고 미세소관(microtubule)의 안정화를 통해 그들의 성장 억제 효과를 발휘한다. 이 약물들의 항종양 작용은 유방암을 포함한 여러 인간 암에서 TUB III의 발현 수준에 의해 변형될 수 있다.
배양된 유방암 세포에서 생물학적 반응과 DRI 발현 수준의 비교. - 파클리탁셀/베타-투불린 III
Figure 112008020329963-PCT00009
주: * NR - 50 ㎍/ml까지의 파클리탁셀 처리에 대해 무반응
** 정의된 노출 시간 적용시, 2000 유닛을 생성하는 기준 표준 대비 평균 형광/픽셀
배양된 유방암 세포에서 생물학적 반응과 DRI 발현 수준의 비교. - 도세탁셀/베타-투불린 III
Figure 112008020329963-PCT00010
주: ** 정의된 노출 시간 적용시, 2000 유닛을 생성하는 기준 표준 대비 평균 형광/픽셀
허셉틴과 타목시펜의 경우에서와 같이, PTX 및 DTX에 대한 다양한 유방암 세포주의 생물학적 반응은 TUB III의 발현과 잘 일치되었다. 낮은 수준의 TUB III 결합을 보이는 세포주(T47D, MCF-7, SKBR-3)는 PTX 및 DTX에 의한 처리에 민감했다. 대조적으로, 보다 높은 수준의 TUB III을 보이는 세포주(HCC 2218, HCC 38)는 보다 높은 투여량의 DTX에만 반응을 보였다. 이 세포주들은 또한 PTX에 대해 반응을 보였으나, IC50 값을 표현하지 않았다. 하나의 세포주(HCC 202)는 DTX 및 PTX 처리 모두에 내성을 갖는 것으로 입증되었다.
또 다른 실시예에서, 티미딜레이트 신타아제(TS)의 발현은 화학요법제 5-플루오로우라실(5-FU)에 대한 유방암 세포의 반응과 상관관계를 가졌다. TS는 DNA 생합성에서 핵심적인 효소이고 5-FU 기반 화학요법에 대한 반응의 예측에 주요한 역할을 하는 것으로 간주되었다. 이 관계를 조사하기 위한 실험을 수행하였다. 실험 조건 및 분석 방법은 허셉틴에 대해 이용되었던 것들과 유사했다. 투여량은 5 - 300 ㎍/ml 범위였다.
배양된 유방암 세포에서 생물학적 반응과 DRI 발현 수준의 비교. - 5-플루오로우라실/티미딜레이트 신타아제
Figure 112008020329963-PCT00011
주: ** 정의된 노출 시간 적용시, 2000 유닛을 생성하는 기준 표준 대비 평균 형광/픽셀. ND=not determined(미정)
5-FU에 대한 다양한 유방암 세포주의 생물학적 반응은 관련된 TS의 발현과 잘 일치되었다. 보다 낮은 투여량의 5-FU에 반응하는 세포주들(T47D, MCF-7 및SKBR-3)은 보다 높은 투여량에만 반응하는 세포주들(HCC 38, HCC 202, HCC 2218)보다 TS의 더 높은 발현을 보였다. 5-FU에 대한 반응의 등위(rank)와 TS 발현의 상관관계는 하기에 기재된 바와 같은 피어슨 상관 계수(Pearson's Correlation Coefficient)에 의해 결정된 바와 같이 통계적으로 유의성 있었다.
DRI는 피어슨 상관 계수를 이용하여 메카니즘에 의해 관련된 약물에 의한 인 비트로 세포 성장의 억제와 통계적으로 상관될 수 있었다. 이 방법은 두 변수 간의 선형적 관계(linear relationship)의 강도를 측정한다. 피어슨 상관 계수는 통 상적으로 r(rho)로 표시되고, -1.0 내지 1.0의 값을 취할 수 있으며, -1.0은 완전한 음성(역) 상관관계이고, 0.0은 상관관계의 부재이며, 1.0은 완전한 양성 상관관계이다. 피어슨 상관 계수는 하기의 식을 이용하여 계산될 수 있다:
Figure 112008020329963-PCT00012
피어슨 계수 상관관계 분석은 하기의 표에 표시된 바와 같이 IC50 값과 DRI 발현 간의 강하고 유의성 있는 통계적 상관관계를 나타냈다.
생물학적 반응과 DRI 발현의 상관관계
Figure 112008020329963-PCT00013
명확하게 생물학적 반응을 나타내기 위해 이용될 수 있는 DRI 발현 수준이 있는지 여부를 결정하기 위해 단순 클러스터 분석 또는 변화점 분석(change point analysis)을 통해 DRI 발현 차단점(cut-off point)을 더 확인하기 위해 이 상관관계 표가 분석될 것이다.
실시예 8
파라핀 포매된 배양 세포 표준에 근거한 DRI 지표 시스템.
파라핀 블럭으로 보존된 인간 종양 조직의 DRI 발현을 지표로 나타내기 위해, 조직 고정 및 처리의 영향을 반영하는 대조 표준(control standard)을 수립하는 것이 필요하다. 다수의 연구소들이 이 목적을 위해 표적화된 항원의 가변적 발현을 보이는 세포주를 이용하였다. 이 세포들을 임상 시료와 동일한 방식으로 고정하고 처리하고 분석하였다. 이 기술은 HER-2/neu 분석 민감도의 표준화, 에스트로겐 수용체의 면역화학적 분석, 증식 마커 MIB-1의 DNA 배수성 분석 및 품질 관리에 성공적으로 적용되었다.
배양된 인간 유방암 세포를 배양된 인간 종양 세포 시스템을 위해 사용되었던 것과 동일한 배치(batch)로부터 수집하였다. 이 세포들을 아가 플러그(agar plug)에 포매(embed)시키고 파라핀까지 처리하였다. 슬라이드들을 4㎛ 절편으로 준비하고 고정시키고 HER-2-알렉사 532(546 nm/557 nm/567 nm)로 염색시켰다. 그 후, 전술된 바와 같이, 시료를 대상으로 형광 현미경 분석을 수행하였다. 결과(하기의 표)는 배양된 종양 세포 표준 시스템에서 관찰된 것과 매우 유사했다. HCC 2218 및 SKBR-3은 높은 허셉틴 결합값(binding value)을 보이나, MCF-7 및 HCC 38은 보다 낮은 값을 보였다. 이 세포들의 허셉틴으로의 노출로부터 유래된 IC50 및 허셉틴 결합은 -0.9의 피어슨 상관 계수를 가져왔고, 이는 또한 배양된 종양 세포 표준 시스템에서 관찰된 값에 매우 유사했다. 이 모델은 파라핀 포매된 배양 세포 표준이 파라핀 포매된 인간 암 조직의 생물학적 반응을 지표로 나타내기 위한 유용한 내부 표준(viable internal standard)으로 작용할 수 있다는 것을 보여준다.
배양된 인간 유방암 세포의 생물학적 반응과 DRI 발현 수준의 비교 - 트라스투주마브/트라스투주마브-결합
Figure 112008020329963-PCT00014
ND= not determine(미정) NR=No Response(무반응)
실시예 9
DRI 기준 범위 지표의 수립을 위한 DRI 발현과 항암제에 대한 반응의 상관관계의 통계적 분석.
종양 반응의 DRI 기준 범위의 구축을 위한 근거 및 접근방법은 (1) 인 비트로 지표화(indexing) 시스템; (2) 파라핀 블럭 인 비트로 지표화 시스템에 근거한다. 상기와 같은 두 개의 인 비트로 시스템의 구축의 성공은 종양 세포의 세포독성 반응이 파라핀 포매 후 DRI 측정값에 통계적으로 상관될 수 있다는 확신을 제공한다.
이 지표의 목적은 개별적인 환자의 종양의 DRI 발현의 상이한 수준에서 약물에 대한 내성의 확률을 계산하는 것이다. 이 기준 범위는 그 후, 특정 수준의 DRI 발현을 갖는 암 환자에 대한 항암제 처방을 위해 담당 의사에 의해 참조될 수 있다.
본 발명자들은 각 약물에 의한 인 비트로 세포 성장의 억제를 상기 약물에 관련된 DRI 발현의 수준으로 모델링하기 위해 통계적 회귀 접근방식을 이용할 것이다. 이 방법은 배양된 종양 세포 표준 및 파라핀에 포매된 배양된 세포 표준에 모두 적용될 것이다. 결과 변수(outcome variable)는 세포주에 대한 투여량 반응 곡선으로부터 결정된 IC50의 로그값이고 독립 변수는 DRI 수준이다. 본 발명자들의 예비 데이터 및 문헌에 기재된 데이터 때문에, log IC50을 이용한다. 이 제안된 연구에서, 13개의 세포주로, 본 발명자들은 진정한 상관관계는 5% 유의성 수준에서 60% 이상이라는 것을 입증하기에 적합한 검정력(power)(80% 가능성)을 가질 것이다. 본 발명자들은 상관관계가 계산에서 0.90이라는 대안적인 가설을 수립하였고, 이는 피어슨 상관관계가 앞서 인용된 실험예에서 0.90보다 높은 것으로 관찰되었기 때문에 타당해 보인다.
본 발명자들은 단순 클러스터 분석 또는 변화점 분석(change point analysis)를 통해 이 상관관계 데이터를 더 분석할 것이다. 이 분석은 생물학적 반응 확률을 명확하게 나타내기 위해 이용될 수 있는 DRI 발현 수준이 있는지 여부를 결정할 것이다.
실시예 10
개별적인 암 환자의 질병 관리를 위한 정보를 제공하는 세 개의 분자적 진단 테스트.
DRIT(Drug Response Indicators Test)
설명
1) (파라핀 블럭에 포매된) 원발성 종양의 세포들에서 발현되고, 종양 내성 및 표적화된 화학요법과 관련된 6-8개의 세포 바이오마커를 형광 표지된 단일클론 항체(fMAb)로 염색시킨다. 이 마커들의 발현 수준은 컴퓨터-보조 현미경 시스템을 이용하여 정량화되고 표적화된 화학요법을 위해 이용될 수 있다.
2) 이 바이오마커들의 수치 형광 측정값은 일간-연구소간 데이터(interday-interlaboratory data)의 비교를 가능하게 하기 위해 상업적으로 구입가능한 형광 표준으로 정규화된다.
3) 표적화된 치료제에 의한 치료에 대해 상이한 정도의 내성을 갖는 종양 유형(예를 들면, 유방암, 폐암 등)의 세포주로부터 유래된 배양된 암세포로 구성된 인 비트로 보정 시스템을 구축하였다. 피어슨 계수에 의해 내성의 정도(IC50으로 측정됨)와 바이오마커의 발현(픽셀 당 형광) 간의 유의성 있는 상관관계를 정립하였다. 각 약물에 의한 인 비트로 세포 성장의 억제를 상기 약물에 관련된 DRI 발현의 수준으로 모델링하기 위해 통계적 회귀 접근방식을 이용할 것이다. 결과 변수는 세포주에 대한 투여량 반응 곡선으로부터 결정된 IC50의 로그값이고 독립 변수는 DRI 수준이다. 불리한(unfavorable) 생물학적 반응의 확률을 표시하기 위해 이용될 수 있는 DRI 발현 수준이 있는지 여부를 결정하기 위해 단순 클러스터 분석 또는 변화점 분석이 이용될 것이다.
4) 이 세포들을 또한 원발성 종양과 동일한 방식으로 고정시키고 파라핀 블 럭에 포매시켰다. 슬라이드 상의 이 세포들의 절편을 전술된 바와 같이 염색하고 측정하였다. 또한, 이 세포들의 IC50과 상응하는 바이오마커의 발현 간의 상관관계를 정립하였다.
5) IC50과 상응하는 바이오마커의 발현 간의 상관관계 연구(암세포주 대상)를 이용하여 바이오마커에 대한 DRI 지표를 수립하였다. 종양의 바이오마커 발현과 메카니즘에 의해 관련된 약물에 의한 치료에 대한 이 종양의 내성(resistance)의 정도를 상관시키기 위해 그와 같은 지표를 이용할 수 있다. DRI 지표는 내성의 확률(치료 실패)을 기술하기 위해 이용될 수 있다.
6) 이와 같은 실험실 연구는 후향 임상적 상관관계 연구 및 전향 임상적 상관관계 연구에 의해 확인되고 변형되어, DRI 지표 및 그의 확률 기준 범위가 임상적 데이터에 근거할 수 있게 할 것이다.
7) 원발성 종양의 4 미크론 두께의 파라핀 블럭 절편을 대상으로 테스트를 수행하였고(이배수 측정을 위해 6개의 슬라이드가 요구됨) 이는 2일을 소요했다. 포매되지 않은, 고정된 종양 세포들이 또한 용이하게 테스트될 수 있다.
적용
1) 상기 테스트의 비공개 보고서는 국립암학회(the National Cancer Society)에 의해 제공된 국가 종합 암 네트워크(the National Comprehensive Cancer Network: NCCN)의 가이드라인에 포함된 5-6개의 FDA 승인되고 널리 이용되는 화학요법제에 대한 개별적인 환자의 종양의 내성에 관한 통계적으로 계산된 확 률 및 DRI 지표를 제공할 것이다. 의사는 테스트 결과에 근거하여 이 환자에 대한 가장 적합한 치료법에 관해 정보에 근거한 결정을 내릴 수 있다.
HER-tax 테스트
설명
1) HER-tax 테스트는 HER-2/neu 수용체 양성(IHC 3+ 또는 FISH+에 의해 확인된 과다발현)인 유방암 환자에 적용된다.
2) 이 테스트는 HER-2/neu 수용체, (형광 표지된 허셉틴에 의해), PTEN 및 β-투불린 III(탁산에 대한 DRI)에 대해 염색하는 경우를 제외하고는, DRIT와 유사한 방식으로 파라핀 블럭에 포매된 원발성 종양을 대상으로 수행된다.
3) 목적은 낮은 범위에서 HER-2/neu 과다발현을 보이고(그러나, 여전히 IHC3+), 또한 낮은 PTEN 발현값 및 높은 β-투불린 III 발현값을 보이는 환자에서 종양을 스크리닝하는 것이다. 이 환자 집단의 종양은 허셉틴 및 탁산 모두에 내성일 수 있다. 내성의 확률이 제공될 것이다.
4) HER-2/neu 및 β-투불린 III의 발현에 대한 종양 내의 암세포들의 이질성을 측정할 것이다. 이질성의 정도는 허셉틴-탁산 치료법에 대한 양호한(favorable) 반응의 지속기간과 관련될 수 있다.
적용
1) HER-2/neu 양성 환자의 40-50% 만이 제한된 지속기간 동안(1년 이하일 가능성이 높음) 허셉틴-탁산 치료법에 순조롭게 반응할 것이기 때문에, 이 HER-tax 테스트는 내성 환자들을 선택하고 치료 중인 환자에 대해 양호한 반응의 지속기간을 예측할 것이다. 허셉틴은 상당히 비싼 약물이며 심장 독성을 갖는다.
유방암 환자에 대한 순환 암세포 테스트(CCCT)
설명
1) 20 ml의 환자의 정맥혈을 채취하고 밀도 구배 원심분리 및 자기력 세포 분류(magnetic cell sorting)에 의해 정상 혈액 세포를 제거하여 순환하는 암세포(CCC)를 농축시킨다. 이 암세포들을 음성 선택 방법(negative selection) 방법을 통해 회수하고, 현미경 슬라이드 상에 배치하며, 형광 단일클론 항체로 염색하고 전산화된 형광 현미경 시스템을 이용하여 계수한다.
2) 이 테스트는 혈액 시료의 채취 후 24시간 이내에 수행된다. 시료를 CCC Diagnostics에 의해 인증된 특수 수송 용기(special shipping container)에 넣어 특급 우편으로 발송할 수 있다.
3) CCC에서 발현된 약물 반응 바이오마커가 규명될 수 있다.
4) 전이성 암(IV기)에서 발견되는 CCC의 수는 I기, II기, 및 III기 암에서 발견되는 CCC의 수보다 높다. 높은 수효의 CCC는 약물 치료에 대한 열등한(poor) 예후 및 열등한 반응과 통계적으로 관련된다.
5) 제안된 약물 치료 연구에서, 치료전 테스트 및 치료 동안 및 치료 후의 2-3회 테스트(2-3개월 간격)에서 CCC의 계수(enumeration)는 치료 효과를 반영할 수 있다. 치료 후에, CCC의 수가 높게 남아있는 경우, 약물은 효과적이지 않을 것 이고, 치료 후에 CCC의 수가 훨씬 더 낮은 경우, 약물은 효과적일 것이다. 이와 같은 예비 발견이 임상적으로 테스트될 것이다. 혈액에서 CCC를 찾는 기법이 7종(전립선, 폐, 위, 췌장, 간, 결장 및 유방)의 암에 대해 개발되었다.
적용
1) III기 또는 IV기 유방암 환자에 대해, 예후를 평가하기 위해 치료 전에 CCCT가 수행될 수 있고, 반응을 확인하기 위해 치료 후에 2-3회의 CCCT가 수행될 수 있다. 환자의 이미징 검사(x-선 및 CT) 전에 결과를 수득할 수 있다.
2) 종양의 약물 내성이 일어나는 경우, 후속 약물 치료에 대한 새로운 선택을 결정하기 위해, CCC에서 바이오마커 상태의 변화를 측정하기 위한 CCCT가 수행될 수 있다. 이 결과는 표적화된 치료제에 의한 치료에 대해 다양한 정도의 내성을 갖는 암 유형(예를 들면, 유방 또는 폐 등)으로부터 유래된 배양된 암세포로 구성된 인 비트로 보정 시스템과 상관될 수 있다. 상관관계는 표시된 DRI와 배양된 세포의 약물 치료에 대한 반응에 근거할 것이다.
3) CCC의 수에 대한 데이터가 이미징 조사를 대체할 수 없으나, CCCT는 보다 신속하고 전이성 종양의 약물 내성 특성의 변화에 대한 이해를 제공한다. 바이오마커에 대한 종양의 내성의 특성규명은 이미징 방법에 의해 이루어질 수 없다.
실시예 11
PAC는 세 개의 전략적 단계를 필요로 한다. 단계 I: 종양에서 여러 표적의 동시 정량적 측정. 약물 반응 지표(DRI)로 불리는 이 표적들은 표지된 단일클론 항체 및 전산화된 형광 현미경을 이용한 면역형광법에 의해 평가될 수 있다. 수치값을 얻고 비교를 위해 형광 기준 표준으로 정규화시킬 수 있다.
단계 II: DRI 발현과 종양 세포의 관련 약물에 대한 세포독성 반응의 통계적으로 유의성 있는 상관관계의 수립. 각 약물의 세포독성 효과를 상응하는 DRI 측정값에 상관시키기 위해 인 비트로 지표화 시스템을 구축하였다. 다양한 항암제에 대해 상이한 감수성을 갖는 7종의 유방암(BC) 세포주를 이용하였다. 이 세포주들에서 타목시펜, 파클리탁셀, 트라스투주마브, 및 독소루비신의 효과를 각 약물에 대한 DRI 발현과 상관시켰다. 상기 DRI는 각각 에스트로겐 수용체, 베타-투불린III, HER-2/neu 및 토포이소머라아제 II였다. 피어슨 등위 상관 계수(Pearson rank correlation coefficient)는 0.77 내지 1의 범위로 확인되었으며 p값은 0.005 내지 0.02의 범위였다.
단계 III: 개별적인 암 환자로부터 암세포를 수득하는 기술. 전이성 암의 경우, 음성 선택 방법을 이용하여 말초혈액으로부터 순환하는 암세포(CCC)를 수득하고(Cancer 2000: Vol. 88, no. 12, p. 2787), 계수하고, 표지된 트라스투주마브로 염색하여, HER-2/neu 발현을 정량하였다. 101명의 BC환자를 연구하여 402개의 혈액시료를 얻었다: 환자당 수득된 시료 수의 중앙값은 4였다(1-7). CCC는 원격전이(distant metastasis)와 관련된다: IV기 환자의 88%가 시료채취 동안 특정 시점에 CCC를 가졌다. 시료당 CCC 수는 1 내지 1283이었다.
20명의 환자는 HER-2/neu 발현을 테스트하기 위한 4개 이상의 CCC를 가졌고, 또한 입수가능한 종양 조직 데이터를 가졌다. 18명의 환자에서, CCC 및 원발성 종 양 데이터는 일치했고(90%), 6명은 HER-2/neu 양성이고, 12명은 HER-2/neu 음성이었다. 1명의 환자는 종양 조직에서 HER-2/neu 음성이었으나, CCC에서 HER-2/neu 양성이었다.
치료법(트라스투주마브)-진단(HER-2/neu 발현) 결합은 BC용 PAC에 대해 FDA가 승인한 최초의 모델이었다. 그러나, HER-2 양성인 전이성 BC 환자들 중 30% 미만이 단일 작용제 요법인 트라스투주마브에 반응했으나, HER-2 음성 환자들은 훨씬 덜 반응적이었다. BC 종양 조직에서 DRI 측정값 및 CCC의 개선은 보다 예측가능한 치료 결과를 가져올 수 있다. BC 환자의 원발성 종양 조직으로부터 절단된 절편 슬라이드로부터의 DRI 측정값도 보고될 것이다.
실시예 12
유방암, 결장암 및 폐암 환자로부터의 포르말린-고정 파라핀-포매된(FFPE) 조직에서 DRI의 정량
현미경 슬라이드 상에 고정된 FFPE 조직 절편의 제작 및 형광-표지된 단일클론 항체와의 인큐베이션이 실시예 1 및 4에 기재된다. 세포들의 동일한 영역의 디지털 이미지를 실시예 2에서 기재된 바와 같이 표준 곡선으로부터 결정된 노출 시간을 이용하여 DAPI, FITC, 알렉사 532, 알렉사 594 및 알렉사 647 형광을 구별하는 필터 큐브에 의해 수득하였다. 각 종양 절편으로부터의 5개의 상이한 영역의 이미지를 수득하여 저장하였다. 조직을 포함하지 않는 슬라이드를 이용하여 적합한 노출 시간에 각 필터에 의해 백그라운드 이미지를 수득하였다. 조직 자가형광 을 평가하기 위해, 각 종양으로부터 연속 절편을 수득하고 항-판시토케라틴-FITC 및 전술된 필터 큐브 각각과 함께 인큐베이션시키고 테스트 시료와 정확히 동일하게 처리하였다.
DRI 형광 강도를 정량하기 위해, DRI 이미지로부터 적합한 백그라운드 이미지를 차감하여 먼저 이미지를 보정(flat-field)시켰다. 이는 조명 영역(illumination field)에서 변이를 제거한다. 그 후, 백그라운드 이미지의 픽셀 당 평균 형광(F/P)(이미지 히스토그램으로부터 수득)을 상기 보정된 이미지로부터 차감했다. 이와 같이 처리된 DRI 이미지를 쌍방향으로(interactively) 조사하고, 가장 밝은 형광을 갖는 영역을 표시하였다(통상적으로 50 내지 100개의 세포). 이 목적 영역(AOI)를 복사하고 불필요한 부분을 잘라낸(cropped) 이미지로 저장하였다. 상기 저장된 잘라낸 이미지를 불러서 AOI 내의 모든 세포들이 시토케라틴-양성 상피세포일 수 있도록 FITC 필터로 수득된 세포들의 동일 영역의 이미지 상에 배치했다. Image-Pro 소프트웨어로 각각의 잘라낸 DRI 이미지의 형광 신호를 분석하여 백그라운드로부터 형광 객체(세포 또는 세포 클러스터)를 구별시키는 강도들을 선택했다. 그 후, Image-Pro는 상기 잘라낸 DRI 이미지 내의 객체를 표시하고 계수하고 그에 대한 정량적 데이터를 제시했다. 상기 데이터를 엑셀(Excel)로 보내서 각 종양으로부터의 다섯 개의 이미지 각각에서 객체에 대한 평균 F/P의 평균값을 계산하고 기준 표준으로 정규화시켰다. 테스트 슬라이드에 대해 사용된 것과 동일한 절차를 이용하여 각 필터 큐브에 대해 동일한 종양의 연속 절편의 자가형광을 계산하였다. 각 DRI 이미지(종양 당 5개, 총 250 내지 500 개의 세포)의 픽셀 당 평균 형광을 기준 표준 대비 퍼센트로 기록하였다.
6명의 유방암 환자의 FFPE 조직에 대한 DRI 결과가 하기의 첫째 표에 제시된다. 에스트로겐 수용체(ER), 베타-투불린 이소형 III(TUB), 티미딜레이트 신타아제(TS), 토포이소머라아제 II(TOP), 리보뉴클레오티드 리덕타아제(RR), HER-2/neu(HER) 및 절단 복구 교차-상보적-1 효소(excision repair cross complementary-1 enzyme)(ERCC-I)를 정량하였다. 6명의 상이한 환자에서 측정된 각 DRI의 5개의 잘라낸 이미지에서 선택된 객체의 평균 F/P(기준 표준으로 정규화됨)가 다섯 개의 값의 평균(굵게 표시됨) 및 5개의 값의 변동 계수(CV)(괄호 안에 표시됨)와 함께 제시된다. 6명의 환자로부터 수득된 5개의 DRI 이미지에 대한 CV 값은 8.9(환자 39의 TS) 내지 37.4(환자 39의 ER)의 범위였고; 18개의 측정값 중 5개에서는 매우 낮은 DRI 값 때문에 CV를 적용하지 않았다. 동일한 환자의 이배수 연속 절편들을 분석했을 때, 하기의 표에서 보는 바와 같이, DRI 값들은 동일한 상대적 범위에 있었다.
유방암 연구
Figure 112008020329963-PCT00015
DRI 값은 표준 기준(형광 미소구체) 대비 퍼센트로 제시되며, *사용된 제2 항체, 염소 항-마우스 IgG-알렉사 532, 괄호 내의 숫자는 종양 조직의 5개의 상이한 영역에서 측정된 DRI 값에 대한 변동 계수이다.
유방암, 폐암 및 결장암 환자의 FFPE 조직의 슬라이드는 NCI Cooperative Human Tissue Network(CHTN), Mid-Atlantic Division으로부터 얻었다. 하기의 표는 3개의 상이한 유형의 암환자에 대한 DRI 측정값을 보여주며 두 개의 상이한 현미경 상에서 2명의 기사에 의해 수득된 동일한 환자로부터의 연속 절편의 ERCC-1 발현값을 비교한다. 종양 조직의 5개의 상이한 영역으로부터의 5개의 잘라낸 이미지에서 측정된 DRI 값들이 변동계수와 함께 표시된다. 결과는 이 4개의 DRI가 세 개의 암 유형으로부터 유래된 FFPE 조직의 상피 세포(포지티브 시토케라틴 염색)에서 측정될 수 있고, 유사한 데이터가 두 명의 기사에 의해 두 개의 상이한 현미경 상에서 DRI 측정값으로 수득되었다는 것을 보여준다. 개별 환자에 대한 적합한 약물의 선택 시 의사에 의한 이용에 대한 이 분석법의 잠재력을 평가하기 위해, 각 DRI 측정값은 관련된 항암제에 대한 환자의 반응과 상관될 것이라는 것에 유의해야 한다. 그와 같은 정보는 먼저 후향적 연구 및 뒤이은 전향적 임상 시험에서 수득될 것이다.
유방암, 결장암 및 폐암 조직 절편에서 DRI 정량의 비교
Figure 112008020329963-PCT00016
CV는 종양 조직의 5개의 상이한 영역에서 측정된 DRI 값에 대한 변동계수(coefficient of variation)이다. DRI 값은 굵게 표시된 평균과 함께 참고 표준 대비 퍼센트로 표현된다.
본 발명이 명확한 이해를 제공하기 위한 목적으로 예시 및 실시예에 의해 어느 정도 상세하게 완전히 기술되었기 때문에, 본 발명 또는 그의 특정한 구체예의 범위에 영향을 미치지 않으면서 조건, 제제 및 기타 파라미터의 광범위하고 균등한 범위 내에서 본 발명을 변형 또는 수정하여 동일한 발명을 실시할 수 있고 그와 같은 변형 또는 수정은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되도록 의도된다는 것이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 본 출원에서 언급된 모든 문헌, 특허 및 특허출원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자의 수준을 나타내며, 각각의 개별적인 문헌, 특허 또는 특허출원이 참조에 의해 포함되도록 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조에 의해 포함된다.

Claims (20)

  1. 암 환자가 앓고 있는 종류의 암의 치료를 위한 일련의 정부 승인 화학요법제를 선택하는 단계;
    상기 환자로부터 종양 세포 시료를 수득하는 단계;
    상기 종양 세포 시료의 하나 이상의 세포에서 항체를 이용하여 상기 일련의 화학요법제에 상응하는 일련의 약물 반응 지표(drug response indicator)의 발현을 결정하는 단계; 및
    상기 약물 반응 지표의 발현에 근거하여 화학요법제를 선택하는 단계를 포함하는, 개별적인 암 환자에 대한 암 치료용 화학요법제를 선택하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 형광 표지된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약물 반응 지표는 화학요법제의 작용 메카니즘과 관련된 세포 성분인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 상이한 여기 스펙트럼 및 중첩되지 않는 발광 스펙트럼을 갖는 상이한 형광 염료로 형광 표지된 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 상기 약물 반응 지표를 정량하는 단 계를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 정량하는 단계는 기준 표준(reference standard) 대비 형광 강도의 비교를 포함하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 하나의 테스트에서 5개 이상의 약물 반응 지표를 정량하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 상기 시료에서 복수 개의 약물 반응 지표의 발현량을 상기 약물 반응 지표를 통해 작용하는 화학요법제에 대한 공지된 반응의 세포에서 동일한 약물 반응 지표의 양과 상관시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 테스트에서의 5개 이상의 약물 반응 지표의 발현량이 비교되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 종양 세포 시료는 순환하는 종양 세포, 원발성 종양(primary tumor)에 인접한 림프절로부터 수득된 시료, 원발성 종양으로부터 수득된 시료, 및 고정되고 파라핀 블럭에 포매된 원발성 종양으로부터 수득된 시료로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 화학요법제는 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 도세탁셀, 파클리탁셀, 탁솔, 비노렐빈, 빈카 알칼로이드, 5-플루오로우라실 관련 약물, 젤로다(xeloda), 겜시타빈, 안트라시클린, 및 이리노테칸으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 화학요법제는 인간화 단일클론 항체인 트라스투주마브(허셉틴), 세툭시마브(에르비툭스), 및 베바시주마브(아바스틴)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 약물 반응 지표는 ERCCl이고 상기 화학요법제는 카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살로플라틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 약물 반응 지표는 베타-투불린 III 이소형(isoform)이고 상기 화학요법제는 도세탁셀, 파클리탁셀, 탁산, 및 비노렐빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 약물 반응 지표는 티미딜레이트 신타아제(Thymidylate Synthase)이고 상기 화학요법제는 5-플루오로우라실 관련 약물, 류 코보린, 페메트렉셀 및 젤로다로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 약물 반응 지표는 토포이소머라아제 II이고 상기 화학요법제는 안트라시클린, 독소루비신 및 에피루비신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 약물 반응 지표는 토포이소머라아제 I이고 상기 화학요법제는 이리노테칸인 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 약물 반응 지표는 리보뉴클레아제 리덕타아제이고 상기 화학요법제는 겜시타빈인 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 유방암, 폐암, 결장암, 위암, 췌장암, 및 십이지장암으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 암에 대한 약물 반응 지표 테스트(Drug Response Indicator Test)를 수행하는 단계를 포함하고, 상기 약물 반응 지표 테스트는 진단된 암의 종류별 환자에 대한 국가 종합 암 네트워크 치료법(National Comprehensive Cancer Network Treatment for Patients)의 가이드라인에 열거된 모든 화학요법제에 대한 종양 내성/감수성 데이터를 제공하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 종양 내성/감수성 데이터는 상관적인 임상 연구의 통계적 분석에 근거하여 테스트된 개별 환자에 대한 약물 반응 실패의 백분율 확률에 의해 해석될 수 있는 것인 방법.
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