KR20140020318A - 위암 환자의 생존률 예측 및 개선 방법 - Google Patents

위암 환자의 생존률 예측 및 개선 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 수술 후 초기 위암을 갖는 대상의 수술후 생존률을 예측하기 위한 검정법 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 암에서 활성화되는 신호 전달 바이오마커에 맞춤임 조합 요법을 투여함으로써 초기 위암을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상으로부터 수득된 암 세포 중 특정 조합의 신호 전달인자 분석물의 활성화 상태 또는 수준의 탐지에 의존한다. 따라서, 본 발명의 방법은 특히 초기 위암을 갖는 대상의 생존률 또는 예후를 예측하고, 단일요법보다는 조합 요법으로부터 이익을 얻을 대상을 식별함으로써 수술 전 및 후 치료 결정을 안내하는데 유용하다.

Description

위암 환자의 생존률 예측 및 개선 방법 {METHODS FOR PREDICTING AND IMPROVING THE SURVIVAL OF GASTRIC CANCER PATIENTS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2011 년 4 월 4 일에 제출된 미국 가 출원 번호 61/471,678, 및 2012 년 1 월 25 일에 제출된 미국 가 출원 번호 61/590,787 에 대한 우선권을 주장하며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 배경
유방, 간, 폐, 난소, 신장, 위 및 갑상선의 암종을 포함하는, 다양한 인간 악성종양은 지속되는 c-Met 자극, 과발현, 또는 돌연변이를 나타낸다. 특히, 인간 종양형성에서 c-Met 이 직접 연루되는, 특정 유전 형태의 유두 신 암 환자에서 c-Met 내의 활성화 돌연변이가 양성으로 확인되었다. c-Met 수용체의 이상조절 또는 그것의 리간드인 간세포 성장 인자 (Hepatocyte Growth Factor: HGF) 의 과발현으로 인한, c-Met 신호전달 경로의 이상 신호전달이 공격적 표현형과 연관되었다. c-Met 신호전달이 여러 암의 진행과 확산에 연루됨에 대한 광범위한 증거 및 그것의 질환에서의 역할에 대한 향상된 이해는, 암 약물 개발에서 주요 표적으로서 c-Met 및 HGF 에 대한 큰 관심을 불러일으켰다.
이러한 관심은 잠재적 임상적 적용을 갖는 다양한 c-Met 경로 길항제의 개발을 초래했다. 경로-선별적 항암 약물 개발의 3 가지 주요 접근법은 리간드/수용체 상호작용의 길항작용, 티로신 키나제 촉매 활성의 저해, 및 수용체/효과기 상호작용의 차단을 포함했다.
c-Met 은 산란 인자로도 알려진 간세포 성장 인자 (HGF) 에 대한 세포 표면 수용체이다. HGF 는 플라스미노겐 세린 프로테아제 패밀리의 일원과 고도로 관련되는 다중도메인 당단백질이다. 그것은 간엽 세포에 의해 단일-사슬, 불활성 폴리펩티드로서 분비되고, 다수의 프로테아제에 의해 그것의 활성 이종이합체로 절단된다.
HGF 결합은 c-Met 수용체 동종이합체화 및 촉매 자리 내의 2 개의 티로신 잔기 (Y1234 및 Y1235) 의 인산화를 유도하여, 키나제 활성을 조절한다. 카르복시-말단 꼬리는 티로신 Y1349 및 Y1356 을 포함하며, 이들은 인산화되었을 때 세포내 어댑터 단백질의 도킹 자리 (docking sites) 로서의 역할을 하여, 하류 신호전달을 초래한다. c-Met 수용체는 배아형성 동안 및 성인기에, 간, 췌장, 전립선, 신장, 근육, 및 골수를 포함하는, 많은 기관의 상피 세포에서 발현된다.
하나의 관심의 c-Met 매개성 암은 위암이다. 위암은 전세계적인 암 사망의 선두적 원인이며, 연간 발생빈도가 18.9/100,000 이다. 위암의 발생빈도는 934,000 사례인 것으로 추정되며, 새로운 사례의 56% 가 동아시아에서 발생한다. 2002 년도 Central Tumor Registry 데이타에 따르면 위암은 한국에서의 전체 암의 20.8% 를 차지한다. 위절제술은 위암 환자에서 유일한 치유적 치료법이지만, 치유적 수술 후 40-60% 의 높은 재발율은 여전히 불량한 전체 생존률의 원인이 된다.
여러 c-Met 길항제의 예비 임상 결과가 현재 임상 연구 중이다. 모노클로날 항체, 리간드/수용체 상호작용의 교란물질, 및 소분자 티로신 키나제 저해인자를 포함하는, 이들 물질은 유망하다. 또한 여러 다중-표적지향형 요법이 임상 연구 중이고, 특히 티로신 키나제 저해에 관해, 장래성이 입증되었다. 다양한 암에서 c-Met 가 수행하는 역할을 고려하여, 개체를 위한 요법의 적절한 선별 및 전략이 필요하다. 이는 c-Met 매개성 위암에 있어서 특히 그러하다. 본 발명은 이들 및 기타 필요를 충족시킨다.
본 발명은 종양 수술 후 초기 (예를 들어, I 또는 II 기 또는 시기 간 이행) 위암을 갖는 대상의 생존률을 예측하기 위한 검정법 및 방법을 제공한다. 특정 양상에서, 본 발명은 초기 위암을 갖는 대상에서 조합 요법에 대한 치료 효능 및/또는 반응을 예측하기 위한 검정법 및 방법을 제공한다. 본 발명은 위암에서 활성화되는 신호 전달 바이오마커에 맞춤인 조합 요법을 투여함으로써 초기 위암을 갖는 대상을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 초기 위암을 갖는 대상으로부터 수득된 암 세포 중 특정 조합의 신호 전달인자 분석물의 활성화 상태 또는 수준의 탐지에 의존한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 분석물에 대해 탐지된 활성화 상태 또는 수준을 고려하여 단일요법보다는 조합 요법으로부터 이익을 얻을 대상을 식별함으로써 초기 위암을 갖는 대상의 생존률 또는 예후를 예측하고 종양 수술 전 및 후 둘다의 치료 결정을 안내하는데 특히 유용하다.
하기 실시예 3 에 제시된 연구는 다중 CEER™ 플랫폼을 사용하여 신선 동결 위암 조직 중 활성화된 RTK 의 수준을 확인하고, 위암 환자를 잠재적 아군 (예를 들어, HER1, HER2, HER2 의 절두된 변이체, p95HER2, HER3, cMET, PI3K, 및 IGF1R) 내로 분류하는 것을 기술한다. 그들의 경로 단백질 활성화 패턴에 기초하여, 다중 신호 단백질 활성화가 종양의 아군에서 관찰되었고, 중복 경로 활성화 입력은 잔류 하류 신호전달을 초래하여, 단일 RTK 를 표적으로 삼는 단일요법의 항종양 효능을 제한했다. cMET- 및 HER-동시활성화된 위암 세포주에서 cMET 저해인자와 조합된 HER1/2 저해인자의 항종양 효과가 확인되었다. 임상의가 순환 종양 세포 및 복막액 (복수) 으로부터 단리된 악성 세포를 사용하여 치료 동안 RTK 활성화 프로파일의 기준선 및 진화적 변화를 모니터링할 수 있게 해주는 강력한 도구가 개발되었다. 종합하면, 이러한 연구는 위암 인간 조직 중 수반 RTK 활성화에 대한 증거를 제공하고, 치료 및 경과 동안 암이 진화함에 따른 RTK 활성화를 모니터링하는 임상 도구를 확립한다.
그와 같이, 특정 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 종양 수술 후 I 또는 II 기 위암을 갖는 대상의 생존률을 예측하는 방법을 제공한다:
(a) 대상으로부터 수득된 암 세포 중 cMET 및 HER1 을 포함하는 둘 이상의 분석물의 활성화의 존재 또는 수준을 확인하는 단계; 및
(b) 단계 (a) 에서 확인된 둘 이상의 분석물의 활성화의 존재 또는 수준에 기초하여 대상의 생존률을 예측하는 단계.
일부 구현예에서, 방법은 I 또는 II 기 위암을 갖는 대상의 무질환 생존기간 또는 무진행 생존기간을 예측한다. 특정 경우에, I 기 위암은 IA 기 또는 IB 기 위암이다. 특정 다른 경우에, II 기 위암은 IIA 기 또는 IIB 기 위암이다.
특정 구현예에서, 암 세포 중 cMET 및 HER1 이 동시활성화된다. 그러한 구현예에서, 대상은 HER1 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 (예를 들어, 더 불량한 예후) 을 가질 것으로 예측된다.
일부 구현예에서, I 또는 II 기 위암은 조직학적 아형 예컨대, 예를 들어, 장형, 미만형, 또는 혼합형 위암에 해당한다. 특정 구현예에서, I 또는 II 기 위암은 미만형 위암이다.
다른 구현예에서, 단계 (a) 는 암 세포 중 HER2 및/또는 HER3 을 포함하는 하나 이상의 부가적 분석물의 활성화의 존재 또는 수준을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 특정 경우에, 암 세포 중 cMET 및 HER1 은 동시활성화되지만 HER2 는 활성화되지 않는다. 그러한 경우에, 대상은 HER1 및/또는 HER2 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 (예를 들어, 더 불량한 예후) 을 가질 것으로 예측된다. 특정 다른 경우에, 암 세포 중 cMET, HER1, 및 HER3 은 동시활성화되지만 HER2 는 활성화되지 않는다. 그러한 경우에, 대상은 HER1, HER2, 및/또는 HER3 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 (예를 들어, 더 불량한 예후) 을 가질 것으로 예측된다.
특정 구현예에서, 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
(c) 단계 (a) 에서 확인된 적어도 cMET 및 HER1 의 활성화의 존재 또는 수준에 기초하여 cMET 저해인자를 단독으로 또는 cMET 저해인자를 HER1 과 조합하여 대상에게 투여하는 단계.
일부 구현예에서, 암 세포 중 cMET 및 HER1 이 동시활성화될 때, 및 임의로 암 세포 중 HER2 는 활성화되지 않고/거나 HER3 은 활성화될 때 cMET 저해인자는 HER1 저해인자와의 조합으로 투여된다.
신호 전달 분자의 총 발현 및 활성화 (예를 들어, 인산화) 수준 및/또는 상태는 임의의 다양한 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플 예컨대 암 세포의 세포 추출물 중 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어, 인산화) 수준 및/또는 상태가 면역검정법 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 단일 탐지 검정법 또는 근접 이중 탐지 검정법 (예를 들어, 합동 효소 증강 반응성 면역검정법 (Collaborative Enzyme Enhanced Reactive-immunoassay: CEER™)) 으로 탐지된다.
특정 구현예에서, 단계 (a) 는 분석물 (예를 들어, 적어도 cMET 및 HER1 및 임의로 HER2 및/또는 HER3) 의 활성화의 존재 또는 수준을 CEER™ 로 확인하는 것을 포함한다.
CEER™ 기술은 본원 및 각각 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 하기 특허 문헌에 기재되어 있다: PCT 특허 공개 번호 WO 2008/036802, WO 2009/012140, WO 2009/108637, WO 2010/132723, WO 2011/008990, 및 WO 2011/050069; 및 PCT 출원 번호 PCT/US2011/066624.
추가 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, I 또는 II 기 위암을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다:
I 또는 II 기 위암에서 cMET 및 HER1 이 동시활성화되는 경우, cMET 저해인자 및 HER1 저해인자를 포함하는 조합 요법을 대상에게 투여하는 단계.
일부 구현예에서, 방법은 I 또는 II 기 위암을 갖는 대상의 예후를 개선한다 (예를 들어, 무질환 생존기간 또는 무진행 생존기간을 증가시킨다). 특정 경우에, I 기 위암은 IA 기 또는 IB 기 위암이다. 특정 다른 경우에, II 기 위암은 IIA 기 또는 IIB 기 위암이다.
다른 구현예에서, 대상은 (예를 들어, 조합 요법을 시작하기 전에) HER1 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 및/또는 더 불량한 예후를 갖는다.
추가 구현예에서, I 또는 II 기 위암에서 cMET 및 HER1 이 동시활성화되지만 HER2 는 활성화되지 않는다. 그러한 구현예에서, 대상은 (예를 들어, 조합 요법을 시작하기 전에) HER1 및/또는 HER2 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 및/또는 더 불량한 예후를 갖는다.
또다른 구현예에서, I 또는 II 기 위암에서 cMET, HER1, 및 HER3 이 동시활성화된다. 그러한 구현예에서, 대상은 (예를 들어, 조합 요법을 시작하기 전에) HER1, HER2, 및/또는 HER3 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 및/또는 더 불량한 예후를 갖는다.
일부 구현예에서, 조합 요법은 대상에게 일차 요법으로서 (예를 들어, 위 종양의 크기를 수축시키는 수술 전 치료로서) 투여된다. 다른 구현예에서, 조합 요법은 대상에게 수술후 보조 요법으로서 (예를 들어, 종양 수술 후) 투여된다. 특정 구현예에서, 조합 요법은 수술 전에 일차 요법으로서 뿐만 아니라 수술 후에 보조 요법으로서 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, cMET 저해인자는 포레티닙 (GSK1363089/XL-880), PHA-665752, AMG102, MetMAb, ARQ197, JNJ-38877605, PF-2341066, PF-04217903, SGX523, XL184, MGCD265, MK-2461, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 다른 구현예에서, HER1 저해인자는 에를로티닙, 라파티닙, 게피티닙, BIBW-2992, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 조합 요법은 cMET 저해인자(들) 포레티닙 및/또는 PHA-665752 및 HER1 저해인자 라파티닙을 포함한다.
특정 구현예에서, 대상으로부터 수득된 암 세포 중 분석물 예컨대 cMET 및 HER1 및 임의로 HER2 및/또는 HER3 (뿐만 아니라 기타 신호 전달 바이오마커) 의 활성화의 존재 또는 수준이 확인된다. 일부 경우에, 암 세포는 일차 종양 세포, 순환 종양 세포 (Circulating Tumor Cell: CTC), 복수 종양 세포 (Ascites Tumor Cell: ATC), 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 방법은, 예를 들어, I 또는 II 기 위암에서 cMET 및 HER1 이 동시활성화되는지 여부를 확인하기 위해, 조합 요법을 투여하기 전에 대상으로부터 수득된 암 세포 중 분석물 예컨대 cMET 및 HER1 및 임의로 HER2 및/또는 HER3 (뿐만 아니라 기타 신호 전달 바이오마커) 의 활성화의 존재 또는 수준을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 그러한 분석물의 활성화의 존재 또는 수준은 CEER™ 로 확인된다.
본 발명의 다른 목적, 특색, 및 장점은 하기 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
2010 년 7 월 15 일에 제출된 PCT 공개 번호 WO 2011/008990 (PCT/US2010/042182), 및 2012 년 1 월 19 일에 제출된 미국 출원 번호 13/354,257 의 도면들은 전부가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
도 1 은 생물학적 샘플 중 활성화된 (예를 들어, 인산화된) 및 총 분석물 수준을 확인하는데 특히 유용한 본 발명의 근접 검정법 형식 (예를 들어, 합동 효소 증강 반응성-면역검정법 (CEER™)) 의 하나의 구현예를 보여준다.
도 2 는 CEER™ (상단) 및 IHC (좌측 하단) 에 의해 RTK 의 발현을 보여준다. 도표 생성 전에 각 환자 중 신호 단백질의 수준이 "HER2, PI3K, HER3, cMET, HER1, IGF1R" 의 순서로 순위매겨졌다. GCA 환자 중 p95HER2 의 존재 (좌측 하단) 및 IHC 아형에 따른 각 HER2 중 그들의 수준 (우측 하단) 이 또한 제시되어 있다.
도 3 은 다차원 척도법으로 생성된 예시적 동시-활성화 상관지수 (A) 및 패턴 (B) 을 보여준다.
도 4A-G 는 실시예 2 에 기재된 위암 세포주의 패널 중 경로 단백질의 포괄적 프로파일링의 결과를 보여준다.
도 5 는 CEER™ 검정법 및 어레이 배치의 원칙을 도시하는 예시적 도해를 보여준다.
도 6 은 위암에서의 HER2 및 p95HER2 발현을 보여준다. (A) 0.25 ㎍ 용해물에서 환자 샘플의 HER2 발현에 대한 CU 분포. x-축은 IHC/FISH 상태를 나타내고, y-축은 BT474 표준 곡선으로부터 확인되는 CEER™ 검정법으로부터의 CU 값을 나타낸다. IHC/FISH 양성 집단 (434 중 50) 에 대한 중앙값 11 과 비교되게 IHC/FISH 음성 집단 (434 중 384) 에 대한 중앙값은 0 으로 2 개의 군 사이에 분리가 보인다. 정량의 한계를 초과하는, 1 개의 포화된 샘플이 제시되어 있지 않다. 박스는 사분위수간 범위를 나타내며, 맨 위가 75 번째 백분위수이고, 맨 아래가 25 번째 백분위수이다. 박스 가운데에 있는 선은 중앙값을 나타낸다. Whiskers 는 사분위수간 범위의 1.5 배 내의 최고 및 최저 값까지 미친다. P 값 < .001 이 윌콕슨 (Wilcoxon) 부호 순위 검정에 의해 확인되었다. (B) 20 ㎍ 용해물에서 종양 샘플의 아집합 (434 중 58) 중 p95HER2 에 대한 CU 분포. x-축은 IHC 상태를 나타내고, y-축은 p95 에 대한 CEER™ 검정법으로부터의 CU 값을 나타낸다. 전장 HER2 가 검정 전에 면역-고갈 (immuno-depletion) 에 의해 제거되었다. 데이타 점은 IHC 및 FISH 에 의한 HER2 상태에 기초하여 착색되어 있다. 보여지는 바와 같이, IHC 가 2 인 하나의 데이타 점은 FISH 분석에 의해 양성인 것으로 확인되었다. 맨 아래 그래프에, IHC 가 3 인 샘플에 대해 CU 값이 나타나 있다. CEER™ 에 의해 p95 에 대해 양성인 것으로 확인된 34 개의 샘플 중에서, 그들 중 24 개 (71%) 는 IHC/FISH 에 의해 HER2(+) 였다.
도 7 은 IHC 및 CEER™ 을 통한 유방암에서의 HER2 발현의 비교를 보여준다. 유방암에서 각각의 IHC 아군에서 CEER™ 에 기초한 HER2 발현의 분포가 (A) 에 제시되어 있다. IHC 및 CEER™ HER2 상태 사이에 17% (38/227) 불일치 판정 (call) 이 있었다 (C - 일치, D - 불일치). 100 개 샘플 (불일치 판정된 것까지 모두 포함함) 의 IP-W 분석의 결과가 (B) 에 요약되어 있다. CEER™ 및 IPW 조정된 HER 상태 사이의 일치가 나타나 있다.
도 8 은 CEER™ 검정법을 사용하여 전장 및 절두된 p95HER2 발현을 확인하는 전략의 비제한적 예를 보여준다.
도 9 는 위암에서의 인산화된 마커의 프로파일링을 보여준다. (A) 명시된 신호 전달 단백질의 경로 프로파일링을 위한 대표적 면역-어레이 이미지가 제시되어 있다. 어레이 신호 강도 범위는 흑색/암청색 (저) 에서 적색/백색 (고/포화) 까지 이른다. (B) 10 ㎍ 용해물 농도에서 측정된 활성화된 (인산화된) 마커에 대한 CEER™ 검정법으로부터의 CU 값에 기초하는 434 개 샘플의 히트맵 및 계층적 군집화. 각각의 열은 마커를 나타내고, 각각의 행은 환자 샘플을 나타낸다. 색 스케일로 활성화의 상대적 수준이 나타나 있으며, 적색은 최고 수준의 활성화를 나타내고 녹색은 최저 수준의 활성화를 나타낸다. 각각의 마커 (열) 에 대한 CU 값이 십분위수에 의해 순위매겨져 있다. 0 과 0.1 사이의 지터 (Jitter) 가 각각의 바이오마커 CU 값에 첨가되어 동일한 크기의 빈 (bin) 을 생성했다. 행 및 열 계통수는 계층적 군집화 계산의 결과를 보여준다.
도 10 은 활성화된 RTK 프로파일링에 기초하는 위암에서의 무질환 생존기간 차이를 보여준다. (A & B) 종양 II+III 기의 위암 샘플에서의 치유적 수술 후 무질환 생존기간 차이. 분석은 전체 위암 샘플 집합 (A) 또는 오직 HER2(-) 위암 샘플 집합 (B) 을 0 RTK 활성화 vs ≥1 RTK 활성화 코호트 사이에 비교했다. II+III 기 위암 환자 모두에서 2 개의 코호트의 중앙 생존기간은 32.63 개월 (≥1 RTK 활성화) 및 76.53 개월 (0 RTK 활성화) 이고, HER2(-) II+III 기 위암 환자에서 30.10 개월 (≥1 RTK 활성화) 및 68.13 개월 (0 RTK 활성화) 이다. (C & D) HER2(-) (C) 또는 I 기, HER2(-) (D) 위암 샘플에서 c-MET(+) HER1(-) vs c-MET(+) HER1(+) 코호트를 비교하는 치유적 수술 후 무질환 생존기간 차이. HER2(-) 환자에서 2 개의 코호트의 중앙 생존기간은 46.17 개월 (c-MET(+) HER1(+)) 및 82.80 개월 (c-MET(+) HER1(-)) 이다. HER2(-) I 기 위암 환자에서 양쪽 코호트에 대한 중앙 생존기간은 확실하지 않다. 각각의 코호트의 샘플 수, p-값 및 위험 비율이 표시되어 있다.
도 11 은 c-MET(+) HER1(-) vs. c-MET(+) HER1(+) 위암 코호트 사이의 무질환 생존기간 차이를 보여준다. c-MET(+) HER1(-) vs c-MET(+) HER1(+) 코호트를 비교하는 모든 (HER2(+) 및 HER2(-)) 위암 샘플에서의 치유적 수술 후 무질환 생존기간 차이. 위암 환자에서 2 개의 코호트의 중앙 생존기간은 46.17 개월 (c-MET(+) HER1(+)) 및 82.80 개월 (c-MET(+) HER1(-)) 이다. 각각의 코호트의 샘플 수, p-값 및 위험 비율이 표시되어 있다.
도 12 는 위암 세포에서의 활성화된 HER1/HER2 및 MET 의 저해를 보여준다. 라파티닙/cMET 저해인자 치료 후 경로 단백질의 조정이 각각의 치료적 치료에 의한 경로 저해의 암 세포 성장 저해에 대한 표현형 효과와 함께 나타나 있다. HER1, HER2 및 c-MET 가 각각 적색, 황색 및 녹색 화살표로 표시되어 있다.
도 13 은 위암 환자로부터의 CTC 및 ATC 중 인산화된 마커의 프로파일링을 보여준다. (A) 위암 환자로부터 단리된 CTC 중 HER1 및 HER2 의 발현 및 활성화가 나타나 있다. CTC 용해물 중 포스포-HER1, 포스포-HER2, 총 HER1, 총 HER2 및 CK 가 CEER™ 을 사용하여 탐지되었다. (B) 위암 환자 005-110 로부터 수득된 복수액으로부터 단리된 종양 세포가 4 시간 동안 명시된 투여량으로 약물 (라파티닙 및 cMET 저해인자) 로 처리되었다. 처리 후 포스포-단백질의 조정이 CEER™ 에 의해 탐지된다. 약물 처리 후 pHER1, pHER2 및 p-cMET 의 수준의 명백한 감소가 용량 의존적 방식으로 관찰되었다. 표적-특이적 신호 감소가 관찰되었지만, 표적화되지 않은 RTK, IGF1R 의 활성화의 증가도 또한 관찰되었다. (C-E) 위암 환자로부터 수집된 복수액으로부터 단리된 종양 세포가 37℃ 에서 4 시간 동안 2 μM 저해인자 칵테일 (라파티닙 및 PHA-665,752) 또는 DMSO 의 존재 또는 부재 하에 성장 인자의 칵테일 (EGF, 헤레굴린, HGF 및 IGF) 로 처리되었다. 성장 인자/약물 처리의 완료시, 세포가 용해되고 CEER™ 을 사용하여 프로파일링되었다. 상대적 CU 는 기준선 (약물 처리 안하고 성장 인자 자극 안함) 에 대한 CU 의 비로서 정의되었다. 성장 인자 처리는 다중 신호 전달 단백질의 활성화를 유도했다. 약물 처리는 상응하는 표적 단백질의 활성화를 감소시켰다.
도 14 는 총 HER2 및 인산화된 HER2 에 대한 표준 곡선을 보여준다. BT474 로부터 제조된 계단 희석된 세포 용해물의 표준 곡선을 사용하여 각각의 샘플 중 HER2 발현 및 인산화의 정도를 정규화했다. 상대 형광 단위 (RFU) vs. 세포 용해물의 log 농도 로서 측정되고 표준 세포주에 참조된, log 신호 강도의 함수로서 각각의 곡선을 그렸다. 단일 PMT 설정, 그러나 다중 PMT 스캐닝에서 제시된 이미지는 정량에 대한 동적 범위를 확장시킨다.
도 15 는 표 2 이다. 이 표는 위암 (GCA) 및 유방암 (BCA) 채점 기준에 기초하는 HER2(+) 및 HER2(-) 위암 샘플 둘다의 HER2 유전자 증폭 상태 ('1' 은 유전자 증폭됨이고, '0' 은 유전자 증폭되지 않음이다) 및 HER2 IHC 점수 ('0', '1', '2', 또는 '3' 으로서 표시됨) 를 보여준다. 위암 샘플의 조직학적 아형이 음영으로 표시되어 있다: 장형 (옅은 회색), 미만형 (중간 회색), 및 혼합형 (짙은 회색). 표는 또한 각각의 샘플 중 p95HER2 발현 상태 ('1' 은 p95(+) 이고, '0' 은 p95(-) 이고, 'ND' 는 확인되지 않음이다) 및 HER1, HER2, HER3, c-MET, IGF1R 및 PI3K 신호전달 분자의 인산화 상태 ('1' 은 인산화됨이고, '0' 은 인산화되지 않음이다) 를 요약한다. 각각의 마커에 대한 각각의 CU 컷오프가 명시되어 있다.
도 16 은 표 3 이다. 이 표는 각각의 활성화된 HER 키나제 축 수용체 일원에 관한 샘플 수의 분포 및 다른 HER 일원과의 동시-활성화 패턴을 보여준다. 샘플의 HER2 상태 및 조직학적 아형이 명시되어 있다.
도 17 은 표 4 이다. 이 표는 활성화된 c-MET 수용체에 관한 샘플 수의 분포 및 다른 RTK 와의 동시-활성화 패턴을 보여준다. 샘플의 HER2 상태 및 조직학적 아형이 명시되어 있다.
도 18 은 표 5 이다. 이 표는 활성화된 IGF1 수용체에 관한 샘플 수의 분포 및 다른 RTK 와의 동시-활성화 패턴을 보여준다. 샘플의 HER2 상태 및 조직학적 아형이 명시되어 있다.
I. 서론
종양학 분야에서 분자 표적지향 요법 시대의 등장으로, 많은 종양학자들이 그렇지 않았다면 지지적 치료를 받았을 불응성, 전이성 암 환자에서 분자 표적지향제에 대한 예상 외의 극적 반응을 경험했다. 그러나, 임상에서는 그들의 표적 프로파일에 기초하여 선별된 환자라도 종종 표적화제에 반응하지 않거나 극적 초기 반응 후에 저항성을 발달시킨다. 표적지향제에 의한 치료 유익의 향상을 방해하는 주된 문제는 하기를 포함한다: (1) 환자의 아군에서 수반 및 중복 경로 활성화; (2) 경로 교차 대화를 통해 원래 표적화되었던 단백질(들)을 우회하는 대체 신호전달 사건이 활성화됨에 따른 저항성의 발달; (3) 항암 치료 과정 동안 암이 전이하고 진행함에 따른 분자 및 병리학적 특색의 변경; (4) 치료 동안 또는 후의 재-생검의 제한된 이용가능성; 및 (5) 잠재적 약물 저항 메카니즘을 확인하여 "진화하는" 질환을 다루는 표적지향제용 동반 진단제의 제한.
위암은 전세계적인 암 사망의 선두적 원인으로서, 연간 발생빈도는 18.9/100,000, 연간 사망률은 14.7/100,000 이며 (참고, 예를 들어, Cunningham et al., Ann. Oncol., 16 Suppl 1, i22-23 (2005)), 한국에서 가장 흔한 악성종양이다. 전이성 위암은 불량한 예후 때문에 의학 종양학자들에게 여전히 치료적 과제로 남아있다. 현재, 트라스투주맙은 무작위 제 III 상 시험에서 위암에 효과적인 것으로 입증된 유일한 활성 표적지향제이다 (참고, 예를 들어, Bang, Y. J. et al., Lancet, 376:687-697 (2010)). 위암에서 활성화되는 기타 알려진 경로 단백질은 인간 표피 성장 인자 수용체 (human epidermal growth factor receptor) (HER) 패밀리, 간엽 상피 전이 인자 (mesenchymal epithelial transition factor) 또는 간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor) (HGF) 수용체 (cMET), 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (phosphatidylinositol 3-kinase) (PI3K), 및 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (insulin-like growth factor 1 receptor) (IGF1R) 를 포함한다.
본 발명은 위암이 이러한 암 유형에서 활성인 핵심 성장 인자 수용체 신호전달 경로의 인산화 프로파일에 기초하여 구분될 수 있음을 입증한다. 특히, 본 발명은 이러한 암 유형에서 표적지향형 치료제의 선별 및 결과에 직접 영향을 미칠 신호전달 경로 활성화 프로파일에 기초하여 위암의 이질성의 수준을 식별한다. 특정 양상에서, 여러 단백질의 총 및 인산화된 형태를 특이적으로 분석하도록 다중화될 수 있는, 고도로 민감성인 신규한 면역검정법인 CEER™ 이 위암 임상 샘플에 사용되었다. 실시예 3 에 기재된 연구는 위암 환자의 40% 초과가 HER1, HER2, HER3, c-MET, PI3K, 및 IGF1R 분자 중에서 하나 이상의 활성화된 신호 전달 키나제를 가질 수 있음을 입증한다. 이러한 연구에서 분석된 RTK 중에서, HER 패밀리 일원이 가장 빈번히 활성화되는 티로신 키나제였으며, 위암의 28% 에서 HER3 이, 그 뒤를 이어 HER2 (21%) 및 HER1 (15.7%) 이 활성화된다. 또한, 실시예 3 에 기재된 연구는 HER2 양성 위암은 주로 활성화된 HER2 및 HER3 을 나타내지만, HER2 음성 암은 전형적으로 활성 HER1, HER3 및 c-MET 경로를 보유하고, HER2 활성화된 위암이 c-MET 활성화된 위암과 구별되는 아군임을 보여준다. 게다가, 실시예 3 에 기재된 연구는 다수의 위암 (HER2 양성의 75% 초과, HER2 음성의 ~85%) 이 단일 활성 RTK 를 갖기 보다는, 수반 활성화되는 RTK 의 네트워크에 의해 추진됨을 설명한다.
특히, 실시예 3 에 기재된 연구는 p-HER1:p-cMET 동시-발현 위암 샘플에서의 전체 신호전달 특징이, HER1 활성화가 부재하면서 p-cMET 를 발현하는 샘플과 상이함을 입증한다. p-HER1(-):p-cMET(+) 와 p-HER1(+):p-cMET(+) 샘플 집합 사이에 중앙 생존기간의 유의한 차이가 관찰되었다. 실제로, 이러한 연구는 HER2-음성 샘플 집합에서 cMET 및 HER1 의 동시활성화가 cMET 만 활성화되는 I 기 환자와 비교할 때 더 나쁜 무질환 생존기간을 나타냈음을 입증한다. 그와 같이, 이러한 연구는 cMET 및 HER1 (및 임의로 HER3) 의 동시활성화가 HER2-음성, 미만형, 위암과 밀접하게 연관되고, 그러한 위암 환자가 유의하게 더 불량한 생존률을 가짐을 입증한다. 따라서, 이러한 연구는 HER1 및 cMET 동시활성화된 암 세포에서 어느 하나의 표적에 대한 단일요법보다는 HER1 및 cMET 둘다의 조합 치료적 저해가 더욱 효과적인 항종양 전략임을 보여준다.
II. 정의
본원에서 사용되는 하기 용어들은 다르게 명시되지 않으면 그들에게 부여된 의미를 갖는다.
용어 "암" 은 이상 세포의 조절되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환 부류의 임의의 일원을 포함한다. 상기 용어는, 악성, 양성, 연조직 또는 고형 중 어느 것으로 특징지어지든, 모든 알려진 암 및 신생물 상태, 및 전이 전 및 후의 암을 포함하는 모든 시기 및 등급의 암을 포함한다. 상이한 유형의 암의 예는 소화 및 위장관 암 예컨대 위암 (gastric cancer) (예, 위암 (stomach cancer)), 대장직장암, 위장관 기질 종양 (GIST), 위장관 카르시노이드 종양, 대장암, 직장암, 항문암, 담도암, 소장암, 및 식도암; 유방암; 폐암 (예, 비-소세포 폐암); 담낭암; 간암; 췌장암; 맹장암; 전립선암, 난소암; 신장암 (예, 신세포 암종); 중추신경계의 암; 피부암; 림프종; 신경교종; 융모막암종; 두경부암; 골육종; 및 혈액암을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 사용되는, "종양" 은 하나 이상의 암 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 위암은 조직학적 아형 예컨대, 예를 들어, 장형, 미만형, 및/또는 혼합형에 해당한다.
용어 "분석물" 은 그것의 존재, 양 (발현 수준), 활성화 상태 또는 수준, 및/또는 정체가 확인될 임의의 관심의 분자, 전형적으로 거대분자 예컨대 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 분석물은 신호 전달 분자 예컨대, 예를 들어, HER (EGFR) 또는 c-Met 신호전달 경로의 구성요소이다.
용어 "신호 전달 분자" 또는 "신호 전달인자" 는 세포외 신호 또는 자극을, 전형적으로 세포 내부의 일련의 순차적 생화학 반응을 포함하는, 반응으로 변환시키는 과정을 수행하는 단백질 및 기타 분자를 포함한다. 신호 전달 분자의 예는 수용체 티로신 키나제 예컨대 EGFR (예, EGFR/HER1/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), VEGFR1/FLT1, VEGFR2/FLK1/KDR, VEGFR3/FLT4, FLT3/FLK2, PDGFR (예, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, INSR (인슐린 수용체), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (인슐린 수용체 관련 수용체), CSF-1R, FGFR 1-4, HGFR 1-2, CCK4, TRK A-C, c-MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, V-카드헤린, LTK (백혈구 티로신 키나제), ALK (역형성 림프종 키나제), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, 및 RTK 106; 수용체 티로신 키나제의 절두된 (truncated) 형태 예컨대 아미노-말단 세포외 도메인을 결여하는 절두된 HER2 수용체 (예, p95ErbB2 (p95m), p110, p95c, p95n 등); 수용체 티로신 키나제 이합체 (예, p95HER2/HER3, p95HER2/HER2, HER2/HER2, HER2/HER3, HER1/HER2, HER2/HER3, HER2/HER4 등); 비-수용체 티로신 키나제 예컨대 BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, 및 LIMK; 티로신 키나제 신호전달 캐스케이드 구성요소 예컨대 AKT (예, AKT1, AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PI3K (예, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85)), PDK1, PDK2, 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN), SGK3, 4E-BP1, P70S6K (예, p70 S6 키나제 스플라이스 변이체 알파 I), 단백질 티로신 포스파타제 (예, PTP1B, PTPN13, BDP1 등), RAF, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, p38, Shc (p66), Ras (예, K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Rac1, Cdc42, PLC, PKC, p53, 사이클린 D1, STAT1, STAT3, 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트 (PIP2), 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 (PIP3), mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, GSK-3β, RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67, 및 팍실린; 핵 호르몬 수용체 예컨대 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 안드로겐 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 비타민 A 수용체, 비타민 D 수용체, 레티노이드 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, 및 고아 수용체; 핵 수용체 공활성화인자 및 억제인자 예컨대 유방암-1 에서 증폭되는 것 (AIB1) 및 핵 수용체 공억제인자 1 (NCOR), 각각; 및 그들의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "HER 신호전달 경로의 구성요소" 는 HER 키나제 수용체의 상류 리간드, HER 키나제 수용체의 결합 파트너, 및/또는 HER 키나제 수용체를 통해 조정되는 하류 효과기 분자 중 임의의 하나 이상을 포함한다. HER 신호전달 경로 구성요소의 예는 헤레굴린, HER1/ErbB1, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4, AKT (예, AKT1, AKT2, AKT3 등), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PI3K (예, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85) 등), PDK1, PDK2, PTEN, SGK3, 4E-BP1, P70S6K (예, 스플라이스 변이체 알파 I), 단백질 티로신 포스파타제 (예, PTP1B, PTPN13, BDP1 등), HER 이합체 (예, HER1/HER1, HER1/p95HER2, HER1/HER2, HER1/HER3, HER1/HER4, HER2/HER2, HER2/p95HER2, HER2/HER3, HER2/HER4, HER3/HER3, HER3/p95HER2, HER3/HER4, HER4/HER4, HER4/p95HER2 등), GSK-3β, PIP2, PIP3, p27, 및 그들의 조합을 제한 없이 포함한다.
용어 "c-Met 신호전달 경로의 구성요소" 는 c-Met 의 상류 리간드, c-Met 의 결합 파트너, 및/또는 c-Met 을 통해 조정되는 하류 효과기 분자 중 임의의 하나 이상을 포함한다. c-Met 신호전달 경로 구성요소의 예는 간세포 성장 인자/산란 인자 (HGF/SF), Plexin B1, CD44v6, AKT (예, AKT1, AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), STAT (예, STAT1, STAT3), PI3K (예, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85)), GRB2, Shc (p66), Ras (예, K-Ras, N-Ras, H-Ras), GAB1, SHP2, SRC, GRB2, CRKL, PLCγ, PKC (예, PKCα, PKCβ, PKCδ), 팍실린, FAK, 아듀신, RB, RB1, PYK2, 및 그들의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "활성화 상태" 는 특정 신호 전달 분자 예컨대 HER3 또는 c-Met 신호전달 경로 구성요소가 활성화되는지 여부를 나타낸다. 유사하게, 용어 "활성화 수준" 은 특정 신호 전달 분자 예컨대 HER3 또는 c-Met 신호전달 경로 구성요소가 활성화되는 정도를 나타낸다. 활성화 상태는 전형적으로 하나 이상의 신호 전달 분자의 인산화, 유비퀴틴화, 및/또는 복합체화 상태에 해당한다. 활성화 상태 (괄호 안에 열거됨) 의 비제한적 예는 하기를 포함한다: HER1/EGFR (EGFRvIII, 인산화된 (p-) EGFR, EGFR:Shc, 유비퀴틴화된 (u-) EGFR, p-EGFRvIII); ErbB2 (p-ErbB2, p95HER2 (절두된 ErbB2), p-p95HER2, ErbB2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); c-MET (p-c-MET, c-Met:HGF 복합체); AKT1 (p-AKT1); AKT2 (p-AKT2); AKT3 (p-AKT3); PTEN (p-PTEN); P70S6K (p-P70S6K); MEK (p-MEK); ERK1 (p-ERK1); ERK2 (p-ERK2); PDK1 (p-PDK1); PDK2 (p-PDK2); SGK3 (p-SGK3); 4E-BP1 (p-4E-BP1); PIK3R1 (p-PIK3R1); c-KIT (p-c-KIT); ER (p-ER); IGF-1R (p-IGF-1R, IGF-1R:IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1R:PI3K); INSR (p-INSR); FLT3 (p-FLT3); HGFR1 (p-HGFR1); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRA (p-PDGFRA); PDGFRB (p-PDGFRB); VEGFR1 (p-VEGFR1, VEGFR1:PLCγ, VEGFR1:Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLCγ, VEGFR2:Src, VEGFR2:헤파린 설페이트, VEGFR2:VE-카드헤린); VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFR1); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); TIEl (p-TIEl); TIE2 (p-TIE2); EPHA (p-EPHA); EPHB (p-EPHB); GSK-3β (p-GSK-3β); NFKB (p-NFKB), IKB (p-IKB, p-P65:IKB); BAD (p-BAD, BAD:14-3-3); mTOR (p-mTOR); Rsk-1 (p-Rsk-1); Jnk (p-Jnk); P38 (p-P38); STAT1 (p-STAT1); STAT3 (p-STAT3); FAK (p-FAK); RB (p-RB); Ki67; p53 (p-p53); CREB (p-CREB); c-Jun (p-c-Jun); c-Src (p-c-Src); 팍실린 (p-팍실린); GRB2 (p-GRB2), Shc (p-Shc), Ras (p-Ras), GAB1 (p-GAB1), SHP2 (p-SHP2), GRB2 (p-GRB2), CRKL (p-CRKL), PLCγ (p-PLCγ), PKC (예, p-PKCα, p-PKCβ, p-PKCδ), 아듀신 (p-아듀신), RB1 (p-RB1), 및 PYK2 (p-PYK2).
본원에서 사용되는 용어 "샘플" 은 환자로부터 수득된 임의의 생물학적 시편을 포함한다. 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 적혈구, 전혈 세포 (예, 말초 혈액 단핵 세포), 도관 세척액, 복수, 흉막 삼출액, 유두 흡인물, 림프 (예, 림프절의 파종성 종양 세포), 골수 흡인물, 타액, 소변, 대변 (즉, 배설물), 가래, 기관지 세척액, 눈물, 미세 바늘 흡인물 (예를 들어 무작위 유륜주위 미세 바늘 흡인에 의해 수확된), 임의의 기타 체액, 조직 샘플 (예, 종양 조직) 예컨대 종양의 생검 (예를 들어 바늘 생검) 또는 림프절 (예, 전초 림프절 생검), 조직 샘플 (예를 들어 종양 조직) 예컨대 종양의 외과적 절제물, 및 이의 세포 추출물을 제한 없이 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 전혈 또는 그의 부분 구성요소 예컨대 혈장, 혈청, 또는 세포 펠렛이다. 다른 구현예에서, 샘플은 당업계에 알려진 임의의 기술을 사용하여 전혈 또는 그의 세포 분획으로부터 고형 종양의 순환 세포를 단리함으로써 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은, 예를 들어, 위암과 같은 고형 종양으로부터의, 포르말린 고정 파라핀 내입 (FEPE) 종양 조직 샘플이다. 특정 구현예에서, 샘플은 위암을 갖는 대상으로부터 수득된 동결된 조직으로부터 제조된 종양 용해물 또는 추출물이다.
"생검" 은 진단 또는 예후 평가를 위해 조직 샘플을 제거하는 과정, 및 조직 시편 그 자체를 언급한다. 당업계에 알려진 임의의 생검 기술이 본 발명의 방법 및 조성물에 적용될 수 있다. 적용되는 생검 기술은 일반적으로, 기타 인자들 중에서, 평가되는 조직 유형 및 종양의 크기 및 유형 (즉, 고형 또는 현탁형 (즉, 혈액 또는 복수) 에 의존할 것이다. 대표적인 생검 기술은 절제 생검 (excisional biopsy), 절개 생검 (incisional biopsy), 바늘 생검 [예를 들어, 중심 바늘 생검 (core needle biopsy), 미세 바늘 흡인 생검 (fine-needle aspiration biopsy) 등], 외과 생검, 및 골수 생검을 포함한다. 생검 기술은, 예를 들어, Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Chapter 70 및 Part V. 전체에서 논의되어 있다. 당업자는 생검 기술을 수행하여 소정의 조직 샘플에서 암 및/또는 전암 세포를 식별할 수 있음을 이해할 것이다.
용어 "대상", "환자", 또는 "개체" 는 전형적으로 인간을 포함하나, 예를 들어, 기타 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 양, 돼지 등과 같은 기타 동물을 또한 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "희석물 시리즈" 는 일련의 감소하는 농도의 특정 샘플 (예, 세포 용해물) 또는 시약 (예, 항체) 을 포함하는 것으로 의도된다. 희석물 시리즈는 전형적으로 측정된 양의 출발 농도의 샘플 또는 시약을 희석제 (예, 희석 완충제) 와 혼합하여 더 낮은 농도의 샘플 또는 시약을 제조하고, 이 과정을 충분한 회수로 반복하여 원하는 수의 계단 희석물을 수득하는 과정에 의해 생성된다. 샘플 또는 시약은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500, 또는 1000-배로 계단 희석되어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 개의 감소하는 농도의 샘플 또는 시약을 포함하는 희석물 시리즈를 생성할 수 있다. 예를 들어, 1 ㎎/㎖ 출발 농도에서 포획 항체 시약의 2-배 계단 희석물을 포함하는 희석물 시리즈는 일정량의 출발 농도의 포획 항체를 동일양의 희석 완충제와 혼합하여 0.5 ㎎/㎖ 농도의 포획 항체를 생성하고, 이 과정을 반복하여 0.25 ㎎/㎖, 0.125 ㎎/㎖, 0.0625 ㎎/㎖, 0.0325 ㎎/㎖ 등의 포획 항체 농축물을 수득함으로써 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "우수한 동적 범위" 는 1 개 만큼 적은 세포 중 또는 천 개 만큼 많은 세포 중 특정 분석물을 탐지하는 검정법의 능력을 나타낸다. 예를 들어, 본원에 기재된 면역검정법은 포획 항체 농축물의 희석물 시리즈를 사용하여 약 1-10,000 개의 세포 (예, 약 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500, 또는 10,000 개의 세포) 중 관심의 특정 신호 전달 분자를 탐지하기 때문에 우수한 동적 범위를 보유한다.
"어레이" 또는 "마이크로어레이" 는 고체 지지체 예컨대, 예를 들어, 유리 (예, 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드 (예, 자기 비드, 폴리스티렌 비드 등), 종이, 막 (예, 나일론, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 등), 섬유 다발, 또는 임의의 기타 적합한 기질에 고정되거나 구속된 포획 항체의 희석물 시리즈 및/또는 별도의 세트를 포함한다. 포획 항체는 일반적으로 공유적 또는 비공유적 상호작용 (예, 이온 결합, 소수성 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 쌍극자-쌍극자 결합) 을 통해 고체 지지체에 고정되거나 구속된다. 특정 경우에, 포획 항체는 고체 지지체에 결합된 포획제와 상호작용하는 포획 태그를 포함한다. 본원에 기재된 검정에 사용되는 어레이는 전형적으로 상이한 알려진/접근가능한 위치에서 고체 지지체의 표면에 커플링되는 복수의 상이한 포획 항체 및/또는 포획 항체 농축물을 포함한다.
용어 "포획 항체" 는 샘플 예컨대 세포 추출물 내의 하나 이상의 관심의 분석물에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 고정된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 특정 구현예에서, 포획 항체는 어레이 내의 고체 지지체 상에 구속된다. 고체 지지체 상에 임의의 다양한 신호 전달 분자를 고정시키기에 적합한 포획 항체는 Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO), 및 BD Biosciences (San Jose, CA) 로부터 입수가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "탐지 항체" 는 샘플 내의 하나 이상의 관심의 분석물에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 탐지가능한 표지를 포함하는 항체를 포함한다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 관심의 분석물에 특이적인 항체를 포함하며, 상기 항체는 탐지가능한 표지를 포함하는 또다른 종에 의해 결합될 수 있다. 탐지가능한 표지의 예는 비오틴/스트렙타비딘 표지, 핵산 (예, 올리고뉴클레오티드) 표지, 화학 반응성 표지, 형광 표지, 효소 표지, 방사선 표지, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 임의의 다양한 신호 전달 분자의 활성화 상태 및/또는 총량을 탐지하기에 적합한 탐지 항체는 Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO), 및 BD Biosciences (San Jose, CA) 로부터 입수가능하다. 비제한적인 예로서, 신호 전달 분자 예컨대 EGFR, c-KIT, c-Src, FLK-1, PDGFRA, PDGFRB, AKT, MAPK, PTEN, Raf, 및 MEK 의 다양한 인산화된 형태에 대한 포스포(phospho)-특이적 항체가 Santa Cruz Biotechnology 로부터 입수가능하다.
용어 "활성화 상태-의존적 항체" 는 샘플 내의 하나 이상의 관심의 분석물의 특정 활성화 상태에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 탐지 항체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 활성화 상태-의존적 항체는 하나 이상의 분석물 예컨대 하나 이상의 신호 전달 분자의 인산화, 유비퀴틴화 및/또는 복합체화 상태를 탐지한다. 일부 구현예에서, 수용체 티로신 키나제의 EGFR 패밀리의 일원의 인산화 및/또는 EGFR 패밀리 일원 사이의 이종이합체성 복합체의 형성이 활성화 상태-의존적 항체를 사용하여 탐지된다. 특정 구현예에서, 활성화 상태-의존적 항체는 하나 이상의 하기 신호 전달 분자 내의 하나 이상의 인산화 자리를 탐지하는데 유용하다 (인산화 자리는 인간 단백질 서열 내의 아미노산의 위치에 상응한다): EGFR/HER1/ErbB1 (예, 티로신 (Y) 1068); ErbB2/HER2 (예, Y1248); ErbB3/HER3 (예, Y1289); ErbB4/HER4 (예, Y1284); c-Met (예, Y1003, Y1230, Y1234, Y1235, 및/또는 Y1349); SGK3 (예, 트레오닌 (T) 256 및/또는 세린 (S) 422); 4E-BP1 (예, T70); ERK1 (예, T185, Y187, T202, 및/또는 Y204); ERK2 (예, T185, Y187, T202, 및/또는 Y204); MEK (예, S217 및/또는 S221); PIK3R1 (예, Y688); PDK1 (예, S241); P70S6K (예, T229, T389, 및/또는 S421); PTEN (예, S380); AKT1 (예, S473 및/또는 T308); AKT2 (예, S474 및/또는 T309); AKT3 (예, S472 및/또는 T305); GSK-3β (예, S9); NFKB (예, S536); IKB (예, S32); BAD (예, S112 및/또는 S136); mTOR (예, S2448); Rsk-1 (예, T357 및/또는 S363); Jnk (예, T183 및/또는 Y185); P38 (예, T180 및/또는 Y182); STAT3 (예, Y705 및/또는 S727); FAK (예, Y397, Y576, S722, Y861, 및/또는 S910); RB (예, S249, T252, S612, 및/또는 S780); RB1 (예, S780); 아듀신 (예, S662 및/또는 S724); PYK2 (예, Y402 및/또는 Y881); PKCα (예, S657); PKCα/β (예, T368 및/또는 T641); PKCδ (예, T505); p53 (예, S392 및/또는 S20); CREB (예, S133); c-Jun (예, S63); c-Src (예, Y416); 및 팍실린 (예, Y31 및/또는 Y118).
용어 "활성화 상태-비의존적 항체" 는 활성화 상태와 무관하게 샘플 내의 하나 이상의 관심의 분석물에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 탐지 항체를 포함한다. 예를 들어, 활성화 상태-비의존적 항체는 하나 이상의 분석물 예컨대 하나 이상의 신호 전달 분자의 인산화된 형태 및 인산화되지 않은 형태 둘다를 탐지할 수 있다.
용어 "인큐베이션" 은 "접촉" 및 "노출" 과 유의어로 사용되고, 다르게 명시되지 않으면 임의의 특정 시간 또는 온도 요건을 포함하지 않는다.
"수용체 티로신 키나아제 (Receptor Tyrosine Kinase)" 또는 "RTK" 는 막관통 도메인 및 티로신 키나아제 모티프에 의해 특징지어지는 56 개의 단백질의 패밀리를 포함한다. RTK 는 세포 신호전달에서 기능하고, 성장, 분화, 부착, 이주 및 세포자멸사를 조절하는 신호를 전달한다. 수용체 티로신 키나아제의 돌연변이성 활성화 및/또는 과발현은 세포를 형질전환시키고, 종종 암의 발달 및 증식에서 중요한 역할을 수행한다. RTK 는 다양한 분자 표적지향제 예컨대 트라스투주맙, 세툭시맙, 게피티닙, 에를로티닙, 수니티닙, 이마티닙, 닐로티닙 등의 표적이 된다. 하나의 잘 특정분석된 신호 전달 경로는 MAP 키나아제 경로이고, 이는 세포 내에서 세포 증식을 촉진하는 표피 성장 인자 (EGF) 로부터의 신호를 전달하는 역할을 한다.
용어 "무질환 생존기간" 은 특정 질환 (예, 암) 에 대한 치료 후 환자가 질환의 징후 없이 (예, 알려진 재발 없이) 생존하는 기간을 포함한다. 특정 구현예에서, 무질환 생존기간은, 통상적으로 1 또는 5 년의 단위로 측정되는, 특정 요법의 효능을 평가하는데 사용되는 임상 파라미터이다.
용어 "무진행 생존기간" 은 특정 질환 (예, 암) 에 대한 치료 후 또는 동안 환자가 질환의 부가적 증상 없이 질환을 갖고 살아가는 기간을 포함한다.
용어 "전체 생존률" 은 질환, 예컨대 암으로 진단되거나 그에 대해 치료된 후 한정된 시간 동안 살아 있는 환자를 기술하는 임상적 종점을 포함한다.
III. 구현예의 설명
본 발명은 종양 수술 후 초기 (예를 들어, I 또는 II 기 또는 시기 간 이행) 위암을 갖는 대상의 생존률을 예측하기 위한 검정법 및 방법을 제공한다. 특정 양상에서, 본 발명은 초기 위암을 갖는 대상에서 조합 요법에 대한 치료 효능 및/또는 반응을 예측하기 위한 검정법 및 방법을 제공한다. 본 발명은 위암에서 활성화되는 신호 전달 바이오마커에 맞춤인 조합 요법을 투여함으로써 초기 위암을 갖는 대상을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 초기 위암을 갖는 대상으로부터 수득된 암 세포 중 특정 조합의 신호 전달인자 분석물의 활성화 상태 또는 수준의 탐지에 의존한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 분석물에 대해 탐지된 활성화 상태 또는 수준을 고려하여 단일요법보다는 조합 요법으로부터 이익을 얻을 대상을 식별함으로써 초기 위암을 갖는 대상의 생존률 또는 예후를 예측하고 종양 수술 전 및 후 둘다의 치료 결정을 안내하는데 특히 유용하다.
특정 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 종양 수술 후 I 또는 II 기 위암을 갖는 대상의 생존률을 예측하는 방법을 제공한다:
(a) 대상으로부터 수득된 암 세포 중 cMET 및 HER1 을 포함하는 둘 이상의 분석물의 활성화의 존재 또는 수준을 확인하는 단계; 및
(b) 단계 (a) 에서 확인된 둘 이상의 분석물의 활성화의 존재 또는 수준에 기초하여 대상의 생존률을 예측하는 단계.
일부 구현예에서, 방법은 I 또는 II 기 위암을 갖는 대상의 무질환 생존기간 또는 무진행 생존기간을 예측한다. 특정 경우에, I 기 위암은 IA 기 또는 IB 기 위암이다. 특정 다른 경우에, II 기 위암은 IIA 기 또는 IIB 기 위암이다. 하나의 대안적 구현예에서, 대상은 0 기 위암을 갖는다. 또다른 대안적 구현예에서, 대상은 말기 (예를 들어, III 기 예컨대 IIIA, IIIB, 또는 IIIC 기, 또는 IV 기) 위암을 갖는다. 예를 들어, AJCC 위암 병기분류 시스템의 제 7 판의 설명에 대해 Washington, Ann. Surg. Oncol., 17:3077-9 (2010) 를 참고하며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 암 세포 중 cMET 및 HER1 이 동시활성화된다. 그러한 구현예에서, 대상은 HER1 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 (예를 들어, 더 불량한 예후) 을 가질 것으로 예측된다. 더 나쁜 생존률 결과의 비제한적 예는 더 짧은 수명, 더 짧은 암 재발 시간, 더 짧은 암 증상 발달 시간, 더 높은 재발 위험, 및 그들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, I 또는 II 기 위암은 조직학적 아형 예컨대, 예를 들어, 장형, 미만형, 또는 혼합형 위암에 해당한다. 특정 구현예에서, I 또는 II 기 위암은 미만형 위암이다. 다른 구현예에서, 미만형 위암에서 cMET 및 HER1 이 동시활성화된다. 그러한 구현예에서, 대상은 cMET 활성화가 존재하나 HER1 활성화가 부재하는 I 또는 II 기 위암 및/또는 미만형 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 (예를 들어, 더 불량한 예후) 을 가질 것으로 예측된다.
다른 구현예에서, 단계 (a) 는 암 세포 중 HER2 및/또는 HER3 을 포함하는 하나 이상의 부가적 분석물의 활성화의 존재 또는 수준을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 특정 경우에, 암 세포 중 cMET 및 HER1 은 동시활성화되지만 HER2 는 활성화되지 않는다. 그러한 경우에, 대상은 HER1 및/또는 HER2 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 (예를 들어, 더 불량한 예후) 을 가질 것으로 예측된다. 특정 다른 경우에, 암 세포 중 cMET, HER1, 및 HER3 은 동시활성화되지만 HER2 는 활성화되지 않는다. 그러한 경우에, 대상은 HER1, HER2, 및/또는 HER3 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 (예를 들어, 더 불량한 예후) 을 가질 것으로 예측된다.
일부 구현예에서, I 또는 II 기 위암을 갖는 대상에 대한 더 나쁜 생존률 결과는 대조군 대상 (예를 들어, cMET 활성화가 존재하나 HER1 활성화가 부재하는 I 또는 II 기 위암 대상) 에 비해 수 일, 주, 개월, 또는 년 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 일, 주, 개월, 또는 년) 더 짧은 수명, 무질환 생존기간, 또는 무진행 생존기간을 포함한다.
특정 구현예에서, 암 세포는 종양 조직 샘플 예컨대 일차 위 종양 샘플, 예를 들어, I 또는 II 기 위 종양으로부터 단리된다. 일부 경우에, 암 세포는 일차 종양 세포, 순환 종양 세포 (CTC), 복수 종양 세포 (ATC), 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 경우에, 세포 추출물은 단리된 암 세포로부터 생성된다.
특정 구현예에서, 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
(c) 단계 (a) 에서 확인된 적어도 cMET 및 HER1 의 활성화의 존재 또는 수준에 기초하여 cMET 저해인자를 단독으로 또는 cMET 저해인자를 HER1 과 조합하여 대상에게 투여하는 단계.
일부 구현예에서, 암 세포 중 cMET 및 HER1 이 동시활성화될 때, 및 임의로 암 세포 중 HER2 는 활성화되지 않고/거나 HER3 은 활성화될 때 cMET 저해인자는 HER1 저해인자와의 조합으로 투여된다. cMET 저해인자 및 HER1 저해인자의 비제한적 예가 본원에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, cMET 저해인자(들) 포레티닙 및/또는 PHA-665752 가 HER1 저해인자 라파티닙과의 조합으로 투여된다. 추가 구현예에서, 하나 이상의 부가적 항암 약물이 대상에게 투여된다. 적합한 부가적 항암 약물의 비제한적 예가 아래 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 단계 (a) 는 분석물 (예를 들어, 적어도 cMET 및 HER1 및 임의로 HER2 및/또는 HER3 뿐만 아니라 기타 신호 전달 바이오마커) 의 활성화의 존재 또는 수준을 CEER™ 로 확인하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 단계 (a) 는 하나 이상의 분석물 (예를 들어, 적어도 cMET 및 HER1 및 임의로 HER2 및/또는 HER3 뿐만 아니라 기타 신호 전달 바이오마커) 의 발현의 존재 또는 수준을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 그러한 분석물의 발현의 존재 또는 수준은 CEER™ 로 확인된다. 특정 구현예에서, 분석물의 발현 수준 및/또는 활성화 수준은 각각의 분석물에 대해 생성된 표준 곡선에 맞춰 보정된다.
특정 경우에, 본 발명의 방법은 단계 (b) 에서의 예측의 결과를 사용자 (예를 들어, 임상의 예컨대 종양학자 또는 일반의) 에게 판독가능한 형태로 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 단계 (b) 에서의 예측의 결과를 임상의, 예를 들어, 종양학자 또는 일반의에게 발송 또는 보고하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 다른 경우에, 방법은 단계 (b) 에서의 예측의 결과를 컴퓨터 데이타베이스 또는 기타 정보 저장에 적합한 기계 또는 장치 내에, 예를 들어, 실험실에서, 기록 또는 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, I 또는 II 기 위암을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다:
I 또는 II 기 위암에서 cMET 및 HER1 이 동시활성화되는 경우, cMET 저해인자 및 HER1 저해인자를 포함하는 조합 요법을 대상에게 투여하는 단계.
일부 구현예에서, 방법은 I 또는 II 기 위암을 갖는 대상의 예후를 개선한다 (예를 들어, 무질환 생존기간 또는 무진행 생존기간을 증가시킨다). 특정 경우에, I 기 위암은 IA 기 또는 IB 기 위암이다. 특정 다른 경우에, II 기 위암은 IIA 기 또는 IIB 기 위암이다. 하나의 대안적 구현예에서, 대상은 0 기 위암을 갖는다. 또다른 대안적 구현예에서, 대상은 말기 (예를 들어, III 기 예컨대 IIIA, IIIB, 또는 IIIC 기, 또는 IV 기) 위암을 갖는다. 예를 들어, AJCC 위암 병기분류 시스템의 제 7 판의 설명에 대해 Washington, Ann. Surg. Oncol., 17:3077-9 (2010) 를 참고하며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 방법은 I 또는 II 기 위암을 갖는 대상의 생존기간 (예를 들어, 무질환 생존기간 또는 무진행 생존기간) 을 조합 요법을 받지 않는 cMET 및 HER1 동시활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암을 갖는 대조군 대상에 비해 수 일, 주, 개월, 또는 년 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 일, 주, 개월, 또는 년) 증가시킨다.
다른 구현예에서, 대상은 (예를 들어, 조합 요법을 시작하기 전에) HER1 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 및/또는 더 불량한 예후를 갖는다. 더 나쁜 생존률 결과의 비제한적 예는 더 짧은 수명, 더 짧은 암 재발 시간, 더 짧은 암 증상 발달 시간, 더 높은 재발 위험, 및 그들의 조합을 포함한다.
추가 구현예에서, I 또는 II 기 위암에서 cMET 및 HER1 이 동시활성화되지만 HER2 는 활성화되지 않는다. 그러한 구현예에서, 대상은 (예를 들어, 조합 요법을 시작하기 전에) HER1 및/또는 HER2 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 및/또는 더 불량한 예후를 갖는다.
또다른 구현예에서, I 또는 II 기 위암에서 cMET, HER1, 및 HER3 이 동시활성화된다. 그러한 구현예에서, 대상은 (예를 들어, 조합 요법을 시작하기 전에) HER1, HER2, 및/또는 HER3 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 및/또는 더 불량한 예후를 갖는다.
일부 구현예에서, I 또는 II 기 위암을 갖는 대상에 대한 더 나쁜 생존률 결과는 대조군 대상 (예를 들어, cMET 활성화가 존재하나 HER1 활성화가 부재하는 I 또는 II 기 위암 대상) 에 비해 수 일, 주, 개월, 또는 년 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 일, 주, 개월, 또는 년) 더 짧은 수명, 무질환 생존기간, 또는 무진행 생존기간을 포함한다.
다른 구현예에서, 조합 요법은 대상에게 일차 요법으로서 (예를 들어, 위 종양의 크기를 수축시키는 수술 전 치료로서) 투여된다. 다른 구현예에서, 조합 요법은 대상에게 수술후 보조 요법으로서 (예를 들어, 종양 수술 후) 투여된다. 특정 구현예에서, 조합 요법은 수술 전에 일차 요법으로서 뿐만 아니라 수술 후에 보조 요법으로서 투여될 수 있다. 특정 경우에, 치료적 유효량의 cMET 저해인자 및 HER1 저해인자가 대상에게 투여된다.
특정 구현예에서, cMET 저해인자는 포레티닙 (GSK1363089/XL-880), PHA-665752, AMG102, MetMAb, ARQ197, JNJ-38877605, PF-2341066, PF-04217903, SGX523, XL184, MGCD265, MK-2461, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 다른 구현예에서, HER1 저해인자는 에를로티닙, 라파티닙, 게피티닙, BIBW-2992, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 조합 요법은 cMET 저해인자(들) 포레티닙 및/또는 PHA-665752 및 HER1 저해인자 라파티닙을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 부가적 항암 약물을 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 항암 약물은, 항-신호전달제 (즉, 세포증식억제 약물) 예컨대 모노클로날 항체 또는 티로신 키나제 저해인자; 항-증식제; 화학치료제 (즉, 세포독성 약물); 호르몬 치료제; 방사선치료제; 백신; 및/또는 이상 세포 예컨대 암 세포의 제어되지 않는 성장을 감소시키거나 차단하는 능력이 있는 임의의 기타 화합물을 제한 없이 포함하는, 암 세포 중 활성화된 신호 전달 경로 구성요소의 기능을 간섭하는 물질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 부가적 항암 약물은 pan-HER 저해인자, HER3 저해인자, HER1/2 저해인자, HER1/2/4 저해인자, IGF-1R 저해인자, MEK 저해인자, PI3K 저해인자, mTOR 저해인자, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 항-신호전달제의 예는 모노클로날 항체 예컨대 트라스투주맙 (Herceptin®), 페르투주맙 (2C4), 알렘투주맙 (Campath®), 베바시주맙 (Avastin®), 세툭시맙 (Erbitux®), 겜투주맙 (Mylotarg®), 파니투무맙 (Vectibix®), 리툭시맙 (Rituxan®), 및 토시투모맙 (BEXXAR®); 티로신 키나제 저해인자 예컨대 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 펠리티닙 (EKB-569), CP-654577, CP-724714, HKI-272, PKI-166, AEE788, BMS-599626, HKI-357, BIBW-2992, ARRY-334543, JNJ-26483327, 및 그들의 조합을 제한 없이 포함한다.
예시적 항-증식제는 mTOR 저해인자 예컨대 시롤리무스 (라파마이신), 템시롤리무스 (CCI-779), 에베롤리무스 (RAD001), BEZ-235, 및 XL765; Akt 저해인자 예컨대 1L6-히드록시메틸-키로-이노시톨-2-(R)-2-O-메틸-3-O-옥타데실-sn-글리세로카르보네이트, 9-메톡시-2-메틸엘립티시늄 아세테이트, 1,3-디히드로-1-(1-((4-(6-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-7-일)페닐)메틸)-4-피페리디닐)-2H-벤지미다졸-2-온, 10-(4'-(N-디에틸아미노)부틸)-2-클로로페녹사진, 3-포르밀크로몬 티오세미카르바존 (Cu(II)Cl2 복합체), API-2, 원종양유전자 TCL1 의 아미노산 10-24 에서 유래하는 15-mer 펩티드 (Hiromura et al., J. Biol. Chem., 279:53407-53418 (2004)), KP372-1, 및 Kozikowski et al., J. Am. Chem. Soc., 125:1144-1145 (2003) 및 Kau et al., Cancer Cell, 4:463-476 (2003) 에 기재된 화합물; PI3K 저해인자 예컨대 PX-866, 보르트만닌, LY 294002, 케르세틴, 테트로도톡신 시트레이트, 티오페라미드 말레에이트, GDC-0941 (957054-30-7), IC87114, PI-103, PIK93, BEZ-235 (NVP-BEZ235), TGX-115, ZSTK474, (-)-데구엘린, NU 7026, 미리세틴, 탄두티닙, GDC-0941 비스메실레이트, GSK690693, KU-55933, MK-2206, OSU-03012, 페리포신, 트리시리빈, XL-147, PIK75, TGX-221, NU 7441, PI 828, XL-765, 및 WHI-P 154; MEK 저해인자 예컨대 PD98059, ARRY-162, RDEA119, U0126, GDC-0973, PD184161, AZD6244, AZD8330, PD-0325901, 및 ARRY-142886; IGF-1R 저해인자 예컨대 BMS-536924; 및 그들의 조합을 포함한다.
pan-HER 저해인자의 비제한적 예는 PF-00299804, 네라티닙 (HKI-272), AC480 (BMS-599626), BMS-690154, PF-02341066, HM781-36B, CI-1033, BIBW-2992, 및 그들의 조합을 포함한다.
화학치료제의 비제한적 예는 백금-계 약물 (예를 들어, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 카르보플틴, 스피로플라틴, 이프로플라틴, 사트라플라틴 등), 알킬화제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 클로람부실, 부술판, 멜팔란, 메클로레타민, 우라무스틴, 티오테파, 니트로소우레아 등), 항대사물질 (예를 들어, 5-플루오로우라실, 5-플루오로시토신, 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 류코보린, 카페시타빈, 시타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 젬시타빈 (Gemzar®), 페메트렉세드 (ALIMTA®), 랄티트렉세드 등), 식물 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 포도필로톡신, 파클리탁셀 (Taxol®), 도세탁셀 (Taxotere®) 등), 토포아이소머레이스 저해인자 (예를 들어, 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포시드 (VP16), 에토포시드 포스페이트, 테니포시드 등), 항종양 항생제 (예를 들어, 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 미토산트론, 플리카마이신 등), 그의 제약적으로 수용가능한 염, 그의 입체이성질체, 그의 유도체, 그의 유사체, 및 그들의 조합을 포함한다.
호르몬 치료제의 예는 아로마타제 저해인자 (예를 들어, 아미노글루테티미드, 아나스트로졸 (Arimidex®), 레트로졸 (Femara®), 보로졸, 엑세메스탄 (Aromasin®), 4-안드로스텐-3,6,17-트리온 (6-OXO), 1,4,6-안드로스타트리엔-3,17-디온 (ATD), 포르메스탄 (Lentaron®) 등), 선별적 에스트로겐 수용체 조정인자 (예를 들어, 바제독시펜, 클로미펜, 풀베스트란트, 라소폭시펜, 라록시펜, 타목시펜, 토레미펜 등), 스테로이드 (예를 들어, 덱사메타손), 피나스테리드, 및 고나도트로핀-방출 호르몬 아고니스트 (GnRH) 예컨대 고세렐린, 그의 제약적으로 수용가능한 염, 그의 입체이성질체, 그의 유도체, 그의 유사체, 및 그들의 조합을 제한 없이 포함한다.
본 발명에서 유용한 암 백신의 비제한적 예는 Active Biotech 로부터의 ANYARA, Northwest Biotherapeutics 로부터의 DCVax-LB, IDM Pharma 로부터의 EP-2101, Pharmexa 로부터의 GV1001, Idera Pharmaceuticals 로부터의 IO-2055, Introgen Therapeutics 로부터의 INGN 225 및 Biomira/Merck 로부터의 Stimuvax 를 포함한다.
방사선치료제의 예는 종양 항원으로 지향되는 항체에 임의로 접합된 방사성핵종 예컨대 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 및 212Bi 를 포함하나, 그에 제한되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 부가적 항암 약물은 HER1/2 에 대한 라파티닙, HER1/2/4 에 대한 게피티닙, HER1/2 에 대한 BIBW-2992, IGF-1R 에 대한 BMS-536924, MEK 에 대한 PD-325901, PI3K 및 mTOR 에 대한 BEZ-235, 및 그들의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 대상으로부터 수득된 암 세포 중 분석물 예컨대 cMET 및 HER1 및 임의로 HER2 및/또는 HER3 (뿐만 아니라 기타 신호 전달 바이오마커) 의 활성화의 존재 또는 수준이 확인된다. 일부 경우에, 암 세포는 일차 종양 세포, 순환 종양 세포 (CTC), 복수 종양 세포 (ATC), 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 방법은, 예를 들어, I 또는 II 기 위암에서 cMET 및 HER1 이 동시활성화되는지 여부를 확인하기 위해, 조합 요법을 투여하기 전에 대상으로부터 수득된 암 세포 중 분석물 예컨대 cMET 및 HER1 및 임의로 HER2 및/또는 HER3 (뿐만 아니라 기타 신호 전달 바이오마커) 의 활성화의 존재 또는 수준을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 그러한 분석물 (예를 들어, 적어도 cMET 및 HER1, 임의로 HER2 및/또는 HER3) 의 활성화의 존재 또는 수준은 CEER™ 로 확인된다.
특정 구현예에서, 방법은, 예를 들어, I 또는 II 기 위암에서 cMET 및 HER1 이 동시발현되는지 여부를 확인하기 위해, 조합 요법을 투여하기 전에 대상으로부터 수득된 암 세포 중 분석물 예컨대 cMET 및 HER1 및 임의로 HER2 및/또는 HER3 (뿐만 아니라 기타 신호 전달 바이오마커) 의 발현의 존재 또는 수준을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 그러한 분석물 (예를 들어, 적어도 cMET 및 HER1, 임의로 HER2 및/또는 HER3) 의 발현의 존재 또는 수준은 CEER™ 로 확인된다. 특정 다른 구현예에서, 분석물의 발현 수준 및/또는 활성화 수준은 각각의 분석물에 대해 생성된 표준 곡선에 맞춰 보정된다.
일부 구현예에서, 관심의 특정 분석물의 발현 수준 및/또는 활성화 수준은, 예를 들어, CEER™ 과 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 분석물에 대한 신호 강도에 해당하는 상대 형광 단위 (RFU) 값으로서 표현된다. 다른 구현예에서, 관심의 특정 분석물의 발현 수준 및/또는 활성화 수준은 예를 들어, CEER™ 과 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 분석물에 대한 증가하는 신호 강도에 해당하는 "-", "±", "+", "++", "+++", 또는 "++++" 로서 표현된다. 일부 경우에, 예를 들어, CEER™ 과 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 관심의 특정 분석물의 발현 및/또는 활성화의 탐지불가능 또는 최소 탐지가능 수준은 "-" 또는 "±" 로서 표현될 수 있다. 다른 경우에, 예를 들어, CEER™ 과 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 관심의 특정 분석물의 발현 및/또는 활성화의 낮은 수준은 "+" 로서 표현될 수 있다. 또다른 경우에, 예를 들어, CEER™ 과 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 관심의 특정 분석물의 발현 및/또는 활성화의 중간 수준은 "++" 로서 표현될 수 있다. 추가의 경우에, 예를 들어, CEER™ 과 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 관심의 특정 분석물의 발현 및/또는 활성화의 높은 수준은 "+++" 로서 표현될 수 있다. 다른 경우에, 예를 들어, CEER™ 과 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 관심의 특정 분석물의 발현 및/또는 활성화의 매우 높은 수준은 "++++" 로서 표현될 수 있다.
다른 구현예에서, 관심의 특정 분석물의 발현 수준 및/또는 활성화 수준은, 예를 들어, CEER™ 과 같은 근접 검정법을 사용하여 측정된 RFU 값을 분석물에 대해 생성된 표준 곡선에 맞춰 보정 또는 정규화함으로써 정량된다. 특정 경우에, 산출된 단위 (computed units) (CU) 값이 표준 곡선에 기초하여 계산될 수 있다. 특정 다른 경우에, CU 값은 관심의 특정 분석물의 신호 강도에 대한 상기 설명에 따라 "-", "±", "+", "++", "+++", 또는 "++++" 로서 표현될 수 있다. 미국 출원 번호 13/365,638 의 실시예 3 (상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함됨) 은 세포 예컨대 암 세포 중 신호 전달 경로 단백질의 정량을 위한 데이타 분석의 비제한적 예를 제공한다.
특정 구현예에서, 관심의 특정 분석물에 대한 CU 값이 계산되고 컷오프 값과 비교되어, 세포 또는 샘플이 그 분석물에 대해 양성 또는 음성인지 여부를 결정할 수 있다. 특정 경우에, 관심의 분석물에 대한 컷오프 값은, CU 값으로 표현될 때, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 500000 CU, 또는 그 이상일 수 있다. 특정 구현예에서, 1 CU 는 약 1-2×106 RTK 및/또는 약 1-2×105 활성화된 (예를 들어, 인산화된) RTK 의 발현을 나타낸다 (참고, 하기 실시예 3).
특정 구현예에서, 컷오프 값 이상인 관심의 분석물에 대한 CU 값은 세포 또는 샘플 (예를 들어, 세포 추출물) 이 그 분석물에 대해 양성임을, 예를 들어, 세포 또는 샘플 중 분석물이 과발현됨 및/또는 활성화됨 (예를 들어, 인산화됨) 을 나타낸다. 비제한적 예로서, 약 500 CU 의 컷오프 값을 사용하여 p95HER2 양성에 대해 채점할 수 있다. 또다른 비제한적 예로서, 약 6 또는 7 (예를 들어, 6.7 CU) 의 컷오프 값을 사용하여 인산화된 HER1 (p-HER1) 의 존재에 대해 채점할 수 있다. 또다른 비제한적 예로서, 약 41 또는 42 (예를 들어, 41.6 CU) 의 컷오프 값을 사용하여 인산화된 HER2 (p-HER2) 의 존재에 대해 채점할 수 있다. 또다른 비제한적 예로서, 약 1124 또는 1125 (예를 들어, 1124.3 CU) 의 컷오프 값을 사용하여 인산화된 HER3 (p-HER3) 의 존재에 대해 채점할 수 있다. 또다른 비제한적 예로서, 약 6 또는 7 (예를 들어, 6.1 CU) 의 컷오프 값을 사용하여 인산화된 cMET (p-cMET) 의 존재에 대해 채점할 수 있다. 또다른 비제한적 예로서, 약 69 또는 70 (예를 들어, 69.2 CU) 의 컷오프 값을 사용하여 인산화된 IGF1R (p-IGF1R) 의 존재에 대해 채점할 수 있다. 또다른 비제한적 예로서, 약 175 또는 176 CU (예를 들어, 175.3 CU) 의 컷오프 값을 사용하여 인산화된 PI3K (p-PI3K) 의 존재에 대해 채점할 수 있다. 도 15 (표 2) 는 특정 샘플이 p95HER2 발현 및/또는 HER1, HER2, HER3, cMET, IGF1R 및/또는 PI3K 인산화에 대해 양성인지 여부를 결정하기 위한 본원에 기재된 예시적 컷오프 값의 사용을 보여준다.
특정 구현예에서, 컷오프 값은 분석되는 샘플의 특정 양에 상대적이고, 예를 들어, 특정 컷오프 값은 CEER™ 과 같은 근접 검정법에 의해 분석되는 샘플의 양 (예를 들어, CEER™ 에 의해 분석되는 조직의 적어도 약 1, 5, 10, 15, 20, 25 30, 35, 40, 45, 50, 100 ㎍, 또는 그 이상) 에 기초하여 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 약 500 CU 의 컷오프 값을 사용하여 특정 양 (예, 20 ㎍) 의 피분석 조직에 대한 p95HER2 양성에 대해 채점할 수 있다 (참고, 하기 실시예 3).
원위치 활성화 상태를 보존하기 위해, 신호 전달 단백질은 전형적으로는 세포가 단리된지 조금 후에, 바람직하게는 96, 72, 48, 24, 6, 또는 1 시간 내에, 더욱 바람직하게는 30, 15, 또는 5 분 내에 추출된다. 단리된 세포는 또한 통상적으로 약 1-30 분 동안 나노몰 ~ 마이크로몰 농도의 성장 인자와 함께 인큐베이션되어 신호 전달인자 활성화를 소생시키거나 자극할 수 있다 (참고, 예를 들어, Irish et al., Cell, 118:217-228 (2004)). 자극성 성장 인자는 표피 성장 인자 (EGF), 헤레굴린 (HRG), TGF-α, PIGF, 안지오포이에틴 (Ang), NRG1, PGF, TNF-α, VEGF, PDGF, IGF, FGF, HGF, 사이토카인 등을 포함한다. 개별 환자에 대한 잠재적 항암 요법을 평가하기 위해, 단리된 세포는 성장 인자 자극 전, 동안, 및/또는 후에 다양한 용량의 하나 이상의 항암 약물과 함께 인큐베이션될 수 있다. 성장 인자 자극은 수 분 또는 시간 (예, 약 1-5 분 ~ 약 1-6 시간) 동안 실시될 수 있다. 단리, 항암 약물에 의한 치료, 및/또는 성장 인자 자극 후, 당업계에 알려진 임의의 기술을 사용하여 세포가 용해되어 신호 전달 단백질이 추출된다. 바람직하게는, 세포 용해는 성장 인자 자극 후 약 1-360 분 사이에, 더욱 바람직하게는 2 개의 상이한 시간 간격으로 개시된다: (1) 성장 인자 자극 후 약 1-5 분에; 및 (2) 성장 인자 자극 후 약 30-180 분 사이에. 대안적으로, 용해물은 사용 전까지 -80℃ 에서 저장될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 암 세포 중 하나 이상의 (예, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55 가지, 또는 그 이상의) 부가적 분석물의 발현 수준 (예, 총량) 및/또는 활성화 수준 (예, 인산화 또는 복합체 형성의 수준) 을 확인하는 것을 추가로 포함한다.
샘플 예컨대 암 세포로부터의 세포 추출물 중 조사될 수 있는 부가적 분석물 예컨대 신호 전달 분자의 비제한적 예는 수용체 티로신 키나제, 비-수용체 티로신 키나제, 티로신 키나제 신호전달 캐스케이드 구성요소, 핵 호르몬 수용체, 핵 수용체 공활성화인자, 핵 수용체 억제인자, 및 그들의 조합을 제한 없이 포함한다. 특정 경우에, 샘플 예컨대 암 세포로부터의 세포 추출물 중 하기 부가적 분석물 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성화의 존재 또는 수준이 확인될 수 있다: p95HER2, HER4 (ErbB4), PI3K, SHC, Raf, SRC, MEK, NFkB-IkB, mTOR, PI3K (예, PIK3CA 및/또는 PIK3R1), VEGF, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, EPH-A, EPH-B, EPH-C, EPH-D, FGFR, c-KIT, FLT-3, TIE-1, TIE-2, c-FMS, PDGFRA, PDGFRB, Abl, FTL 3, RET, HGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, IGF-1R, ER, PR, NCOR, AIB1, AKT, ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PDK1, PDK2, PTEN, SGK3, 4E-BP1, P70S6K, 단백질 티로신 포스파타제 (예, PTP1B, PTPN13, BDP1 등), 수용체 이합체, GSK-3β, PIP2, PIP3, p27, 및 그들의 조합.
하나의 특정 구현예에서, 본 발명은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 가지, 또는 그 이상의 마커 예컨대 하기 분석물의 발현 수준 (예, 총량) 및/또는 활성화 수준 (예, 인산화 또는 복합체 형성의 수준) 을 확인하는 것을 포함한다: HER1, HER2, HER3, p95HER2, cMET, IGF-1R, cKIT, PI3K (예, PIK3CA 및/또는 PIK3R1), SHC, 및/또는 VEGFR (예, VEGFR1, 2, 및/또는 3).
특정 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (i) HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R, PI3K, 및/또는 SHC 중 적어도 하나 이상의 발현 수준을 확인하는 것 및/또는 (ii) HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R, PI3K, 및/또는 SHC 중 적어도 하나 이상의 활성화 수준을 확인하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성화 수준은 HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R, 및/또는 SHC 의 인산화 수준에 해당한다. 특정 다른 구현예에서, 활성화 수준은 PI3K 복합체의 수준에 해당한다. PI3K 복합체의 예는 이합체화된 수용체 티로신 키나제 쌍, PI3K p85 아단위 (예, PIK3R1), 및 PI3K p110 아단위 (예, α 또는 β 아단위 예컨대 PIK3CA 또는 PIK3CB) 를 포함하는 하나 이상의 복합체를 제한 없이 포함한다; 예를 들어, 2011 년 9 월 2 일에 제출된 미국 가 출원 번호 61/530,621 을 참고하며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 분석물의 발현 수준을 확인하는 것은 세포 추출물 중 하나 이상의 분석물 각각의 총량을 해당 분석물에 특이적인 하나 이상의 항체로 탐지하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 탐지되는 분석물의 활성화 상태와 관계 없이 분석물에 결합하며, 즉, 항체는 분석물의 비-활성화된 형태 및 활성화된 형태 둘다를 탐지한다.
총 발현 수준 및/또는 상태는 임의의 다양한 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플 예컨대 세포주 (예를 들어, 위암 세포주) 또는 종양 조직 (예를 들어, 위 종양 조직) 으로부터의 세포 추출물 중 하나 이상의 관심의 분석물 예컨대 신호 전달 분자의 총 발현 수준 및/또는 상태는 면역검정법 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 단일 탐지 검정법 또는 근접 이중 탐지 검정법 (예를 들어, 합동 효소 증강 반응성 면역검정법 (CEER™)) 으로 탐지된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 분석물의 발현 (예를 들어, 총) 수준을 확인하는 것은 하기 단계를 포함한다:
(i) 세포로부터 생성된 세포 추출물을 포획 항체 (예를 들어, 하나 이상의 분석물에 특이적인 포획 항체) 의 하나 또는 복수의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시켜 복수의 포획된 분석물을 형성하는 단계, 여기서 포획 항체는 고체 지지체 상에 구속되어 있음 (예를 들어, 세포 추출물에 존재하는 분석물을 분석물과 포획 항체를 포함하는 포획된 분석물의 복합체로 변환시키는 단계);
(ii) 복수의 포획된 분석물을 해당 분석물에 특이적인 하나 또는 복수의 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체 (예를 들어, 하나 이상의 분석물에 특이적인 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체) 를 포함하는 탐지 항체와 함께 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시켜 복수의 탐지가능한 포획된 분석물을 형성하는 단계 (예를 들어, 포획된 분석물의 복합체를 포획된 분석물과 탐지 항체를 포함하는 탐지가능한 포획된 분석물의 복합체로 변환시키는 단계),
여기서 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 표지되어 있고, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되어 있고, 촉진 모이어티는 산화제를 생성하며 그 산화제는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 채널링되어 그와 반응함;
(iii) 복수의 탐지가능한 포획된 분석물을 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시켜 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(iv) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 탐지하는 단계.
특정 다른 구현예에서, 절두된 수용체 (예를 들어, p95HER2) 인 하나 이상의 분석물의 발현 (예를 들어, 총) 수준을 확인하는 것은 하기 단계를 포함한다:
(i) 세포로부터 생성된 세포 추출물을 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 의 세포외 도메인 (ECD) 결합 영역에 특이적인 복수의 비드와 함께 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시키는 단계;
(ii) 세포 추출물로부터 복수의 비드를 제거함으로써, 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 를 제거하여 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 가 없는 세포 추출물을 형성하는 단계 (예를 들어, 세포 추출물을 특정 전장 수용체 또는 전장 수용체의 패밀리가 없는 세포 추출물로 변환시키는 단계);
(iii) 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 가 없는 세포 추출물을 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 의 세포내 도메인 (ICD) 결합 영역에 특이적인 하나 또는 복수의 포획 항체와 함께 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시켜 복수의 포획된 절두된 수용체를 형성하는 단계, 여기서 포획 항체는 고체 지지체 상에 구속되어 있음 (예를 들어, 전장 수용체-고갈된 세포 추출물에 존재하는 절두된 수용체를 절두된 수용체와 포획 항체의 복합체로 변환시키는 단계);
(iv) 복수의 포획된 절두된 수용체를 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 의 ICD 결합 영역에 특이적인 하나 또는 복수의 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체를 포함하는 탐지 항체와 함께 인큐베이션시켜 복수의 탐지가능한 포획된 절두된 수용체를 형성하는 단계 (예를 들어, 포획된 절두된 수용체의 복합체를 포획된 절두된 수용체와 탐지 항체를 포함하는 탐지가능한 포획된 절두된 수용체의 복합체로 변환시키는 단계),
여기서 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 표지되어 있고, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되어 있고, 촉진 모이어티는 산화제를 생성하며 그 산화제는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 채널링되어 그와 반응함;
(v) 복수의 탐지가능한 포획된 절두된 수용체를 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시켜 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(vi) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 탐지하는 단계.
제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 직접 표지되거나, 예를 들어, 제 1 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 올리고뉴클레오티드 및 촉진 모이어티에 접합된 상보적 올리고뉴클레오티드 사이의 혼성화를 통해, 촉진 모이어티로 간접 표지될 수 있다. 유사하게, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 직접 표지되거나, 예를 들어, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 결합 쌍의 제 1 일원 및 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 접합된 결합 쌍의 제 2 일원 사이의 결합을 통해, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 간접 표지될 수 있다. 특정 경우에, 결합 쌍의 제 1 일원은 비오틴이고, 결합 쌍의 제 2 일원은 아비딘 예컨대 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘이다.
일부 구현예에서, 촉진 모이어티는, 예를 들어, 글루코스 옥시다제일 수 있다. 특정 경우에, 예를 들어, PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 16-17 에 기재된 바와 같이, 글루코스 옥시다제 및 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자에 접합될 수 있으며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다. 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자는 전형적으로 분자량이 약 500kDa (예를 들어, 약 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 또는 750kDa) 이다. 다른 구현예에서, 산화제는, 예를 들어, 과산화수소 (H2O2) 일 수 있다. 또다른 구현예에서, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은, 예를 들어, 퍼옥시다제 예컨대 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 일 수 있다. 추가 구현예에서, 신호 증폭 쌍의 제 2 일원은, 예를 들어, 티라미드 시약 (예를 들어, 비오틴-티라미드) 일 수 있다. 바람직하게는, 비오틴-티라미드의 퍼옥시다제 산화에 의해 활성화된 티라미드를 생성하여 (예를 들어, 비오틴-티라미드를 활성화된 티라미드로 변환시켜) 증폭된 신호가 생성된다. 활성화된 티라미드는는 직접 탐지되거나, 예를 들어, 신호-탐지 시약의 첨가 후에, 간접 탐지될 수 있다. 신호-탐지 시약의 비제한적 예는 스트렙타비딘-표지된 형광단 및 스트렙타비딘-표지된 퍼옥시다제와 발색 시약 예컨대, 예를 들어, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 의 조합을 포함한다.
특정 경우에, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자에 접합될 수 있다. 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자는 전형적으로 분자량이 약 70kDa (예를 들어, 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100kDa) 이다.
절두된 수용체는 전형적으로 전장 수용체의 조각이고, 전장 수용체와 세포내 도메인 (ICD) 결합 영역을 공유한다. 특정 구현예에서, 전장 수용체는 세포외 도메인 (ECD) 결합 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인 (ICD) 결합 영역을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않으면서, 전장 수용체의 ECD 의 단백질가수분해 가공을 통해 또는 막관통 도메인 전에, 내부에, 또는 후에 위치하는 메티오닌 잔기로부터의 번역의 대안적 개시에 의해, 예를 들어, 단축된 ECD 를 갖는 절두된 수용체 또는 막-연합 또는 세포기질 ICD 조각을 포함하는 절두된 수용체를 생성함으로써 절두된 수용체를 생성할 수 있다.
특정 바람직한 구현예에서, 절두된 수용체는 p95HER2 이고, 상응하는 전장 수용체는 HER2 이다. 그러나, 당업자는 절두된 단백질을 탐지하기 위한 본원에 기재된 방법이 EGFR VIII 돌연변이체 (교모세포종, 대장직장 암 등에 연루됨), 기타 절두된 수용체 티로신 키나제, 카스파제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 상이한 단백질에 적용될 수 있음을 이해할 것이다. PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 12 (상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함됨) 는 우수한 동적 범위를 갖는 다중, 고처리량 (high-throughput), 근접 이중 탐지 마이크로어레이 ELISA 를 사용하여 세포 중 절두된 수용체 예컨대 p95HER2 를 탐지하기 위한 본 발명의 검정 방법의 예시적 구현예를 제공한다.
일부 구현예에서, ECD 결합 영역에 특이적인 복수의 비드는 스트렙타비딘-비오틴 쌍을 포함하며, 여기서 스트렙타비딘은 비드에 부착되어 있고, 비오틴은 항체에 부착되어 있다. 특정 경우에, 항체는 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 의 ECD 결합 영역에 특이적이다.
일부 구현예에서, 포획 항체의 각각의 희석물 시리즈는 일련의 감소하는 포획 항체 농축물을 포함한다. 특정 경우에, 포획 항체는 2-배 이상 (예를 들어, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 또는 1000-배) 계단 희석되어 집합 수 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 그 이상) 의 감소하는 포획 항체 농축물을 포함하는 희석물 시리즈를 생성하며, 이것이 어레이 위로 스포팅 (spot) 된다. 바람직하게는, 각각의 포획 항체 희석물의 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 복제물이 어레이 위로 스포팅된다.
다른 구현예에서, 고체 지지체는 유리 (예를 들어, 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막 (예를 들어, 나일론, 니트로셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오리드 (PVDF) 등), 섬유 다발, 또는 임의의 기타 적합한 기질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 포획 항체는 (예를 들어, 공유적 또는 비공유적 상호작용을 통해) 니트로셀룰로스 중합체 예컨대, 예를 들어, Whatman Inc. (Florham Park, NJ) 에서 상업적으로 입수가능한 FAST® 슬라이드로 코팅된 유리 슬라이드 상에 구속된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항체 어레이를 구축하기 위한 예시적 방법이, 예를 들어, PCT 공개 번호 WO2009/108637 에 기재되어 있으며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다.
추가 구현예에서, 하나 이상의 분석물의 활성화 수준을 탐지하는 것은 탐지될 각각의 분석물의 인산화된 형태에 특이적인 항체로 세포 추출물 중 하나 이상의 분석물의 인산화 수준을 탐지하는 것을 포함한다.
인산화 수준 및/또는 상태는 임의의 다양한 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 인산화된 형태를 특이적으로 인지하는 항체를 사용하는 면역검정법을 통해 인산화된 단백질이 탐지될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다 (참고, 예를 들어, Lin et al., Br. J. Cancer, 93:1372-1381 (2005)). 면역검정법은 일반적으로 면역블롯팅 (예를 들어, 웨스턴 블롯팅), RIA, 및 ELISA 를 포함한다. 더욱 구체적인 유형의 면역검정법은 항원 포획/항원 경쟁, 항체 포획/항원 경쟁, 2-항체 샌드위치, 항체 포획/항체 과잉, 및 항체 포획/항원 과잉을 포함한다. 항체 제조 방법은 본원에서 및 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 에 기재되어 있다. 포스포-특이적 항체는 새로 제조되거나 상업적 또는 비상업적 출처로부터 수득될 수 있다. 인산화 수준 및/또는 상태는 또한 [γ-32P]ATP 또는 [γ-33P]ATP 형태의 방사성 포스페이트로 세포를 대사적으로 표지하여 확인될 수 있다. 인산화된 단백질은 방사성으로 되고, 그에 따라 섬광 계수, 방사선촬영 등을 통해 추적 및 정량이 가능해진다 (참고, 예를 들어, Wang et al., J. Biol. Chem., 253:7605-7608 (1978)). 예를 들어, 대사적으로 표지된 단백질이 세포로부터 추출되고, 겔 전기영동에 의해 분리되고, 막으로 이동되고, 특정 분석물에 특이적인 항체로 프로빙 (probing) 되고, 자가방사선촬영에 적용되어 32P 또는 33P 가 탐지된다. 대안적으로, 막 이동 및 항체 프로빙 전에 겔이 자가방사선촬영에 적용될 수 있다.
특정 구현예에서, 샘플 예컨대 세포주 (예를 들어, 위암 세포주) 또는 종양 조직 (예를 들어, 위 종양 조직) 으로부터의 세포 추출물 중 하나 이상의 관심의 분석물의 활성화 (예를 들어, 인산화) 수준 및/또는 상태는 면역검정법 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 단일 탐지 검정법 또는 근접 이중 탐지 검정법 (예를 들어, 합동 효소 증강 반응성 면역검정법 (CEER™)) 으로 탐지된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 분석물의 활성화 (예를 들어, 인산화) 수준을 탐지하는 것은 하기 단계를 포함한다:
(i) 세포로부터 생성된 세포 추출물을 포획 항체 (예를 들어, 하나 이상의 분석물에 특이적인 포획 항체) 의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시켜 복수의 포획된 분석물을 형성하는 단계, 여기서 포획 항체는 고체 지지체 상에 구속되어 있음 (예를 들어, 세포 추출물에 존재하는 분석물을 분석물과 포획 항체를 포함하는 포획된 분석물의 복합체로 전환시키는 단계);
(ii) 복수의 포획된 분석물을 해당 분석물에 특이적인 활성화 상태-비의존적 항체 (예를 들어, 하나 이상의 분석물에 특이적인 활성화 상태-비의존적 항체) 및 해당 분석물에 특이적인 활성화 상태-의존적 항체 (예를 들어, 하나 이상의 분석물에 특이적인 활성화 상태-의존적 항체) 를 포함하는 탐지 항체와 함께 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시켜 복수의 탐지가능한 포획된 분석물을 형성하는 단계 (예를 들어, 포획된 분석물의 복합체를 포획된 분석물과 탐지 항체를 포함하는 탐지가능한 포획된 분석물의 복합체로 변환시키는 단계),
여기서 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 표지되어 있고, 활성화 상태-의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되어 있고, 촉진 모이어티는 산화제를 생성하며 그 산화제는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 채널링되어 그와 반응함;
(iii) 복수의 탐지가능한 포획된 분석물을 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시켜 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(iv) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 탐지하는 단계.
특정 다른 구현예에서, 절두된 수용체 (예를 들어, p95HER2) 인 하나 이상의 분석물의 활성화 (예를 들어, 인산화) 수준을 탐지하는 것은 하기 단계를 포함한다:
(i) 세포로부터 생성된 세포 추출물을 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 의 세포외 도메인 (ECD) 결합 영역에 특이적인 복수의 비드와 함께 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시키는 단계;
(ii) 세포 추출물로부터 복수의 비드를 제거함으로써, 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 를 제거하여 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 가 없는 세포 추출물을 형성하는 단계 (예를 들어, 세포 추출물을 특정 전장 수용체 또는 전장 수용체의 패밀리가 없는 세포 추출물로 변환시키는 단계);
(iii) 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 가 없는 세포 추출물을 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 의 세포내 도메인 (ICD) 결합 영역에 특이적인 복수의 포획 항체와 함께 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시켜 복수의 포획된 절두된 수용체를 형성하는 단계, 여기서 포획 항체는 고체 지지체 상에 구속되어 있음 (예를 들어, 전장 수용체-고갈된 세포 추출물에 존재하는 절두된 수용체를 절두된 수용체와 포획 항체의 복합체로 변환시키는 단계);
(iv) 복수의 포획된 절두된 수용체를 활성화 상태-비의존적 항체 및 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 의 ICD 결합 영역에 특이적인 활성화 상태-의존적 항체를 포함하는 탐지 항체와 함께 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시켜 복수의 탐지가능한 포획된 절두된 수용체를 형성하는 단계 (예를 들어, 포획된 절두된 수용체의 복합체를 포획된 절두된 수용체와 탐지 항체를 포함하는 탐지가능한 포획된 절두된 수용체의 복합체로 변환시키는 단계),
여기서 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 표지되어 있고, 활성화 상태-의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되어 있고, 촉진 모이어티는 산화제를 생성하며 그 산화제는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 채널링되어 그와 반응함;
(v) 복수의 탐지가능한 포획된 절두된 수용체를 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션 (예를 들어, 접촉) 시켜 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(vi) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 탐지하는 단계.
활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 직접 표지되거나, 예를 들어, 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 올리고뉴클레오티드 및 촉진 모이어티에 접합된 상보적 올리고뉴클레오티드 사이의 혼성화를 통해 촉진 모이어티로 간접 표지될 수 있다. 유사하게, 활성화 상태-의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 직접 표지되거나, 예를 들어, 활성화 상태-의존적 항체에 접합된 결합 쌍의 제 1 일원 및 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 접합된 결합 쌍의 제 2 일원 사이의 결합을 통해 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 간접 표지될 수 있다. 특정 경우에, 결합 쌍의 제 1 일원은 비오틴이고, 결합 쌍의 제 2 일원은 아비딘 예컨대 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘이다.
일부 구현예에서, 촉진 모이어티는, 예를 들어, 글루코스 옥시다제일 수 있다. 특정 경우에, 예를 들어, PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 16-17 에 기재된 바와 같이, 글루코스 옥시다제 및 활성화 상태-비의존적 항체는 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자에 접합될 수 있으며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다. 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자는 전형적으로 분자량이 약 500kDa (예를 들어, 약 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 또는 750kDa) 이다. 다른 구현예에서, 산화제는, 예를 들어, 과산화수소 (H2O2) 일 수 있다. 또다른 구현예에서, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은, 예를 들어, 퍼옥시다제 예컨대 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 일 수 있다. 추가 구현예에서, 신호 증폭 쌍의 제 2 일원은, 예를 들어, 티라미드 시약 (예를 들어, 비오틴-티라미드) 일 수 있다. 바람직하게는, 비오틴-티라미드의 퍼옥시다제 산화로 활성화된 티라미드를 생성하여 (예를 들어, 비오틴-티라미드를 활성화된 티라미드로 변환시켜) 증폭된 신호가 생성된다. 활성화된 티라미드는 직접 탐지되거나, 예를 들어, 신호-탐지 시약의 첨가 후에 간접 탐지될 수 있다. 신호-탐지 시약의 비제한적 예는 스트렙타비딘-표지된 형광단 및 스트렙타비딘-표지된 퍼옥시다제와 발색 시약 예컨대, 예를 들어, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 의 조합을 포함한다.
특정 경우에, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 및 활성화 상태-의존적 항체는 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자에 접합될 수 있다. 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자는 전형적으로 분자량이 약 70kDa (예를 들어, 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100kDa) 이다.
절두된 수용체는 전형적으로 전장 수용체의 조각이고, 전장 수용체와 세포내 도메인 (ICD) 결합 영역을 공유한다. 특정 구현예에서, 전장 수용체는 세포외 도메인 (ECD) 결합 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인 (ICD) 결합 영역을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않으면서, 전장 수용체의 ECD 의 단백질가수분해 가공을 통해 또는 막관통 도메인 전에, 내부에, 또는 후에 위치하는 메티오닌 잔기로부터의 번역의 대안적 개시에 의해, 예를 들어, 단축된 ECD 를 갖는 절두된 수용체 또는 막-연합 또는 세포기질 ICD 조각을 포함하는 절두된 수용체를 생성함으로써 절두된 수용체가 생성될 수 있다.
특정 바람직한 구현예에서, 절두된 수용체는 p95HER2 이고, 상응하는 전장 수용체는 HER2 이다. 그러나, 당업자는 절두된 단백질을 탐지하기 위한 본원에 기재된 방법이 EGFR VIII 돌연변이체 (교모세포종, 대장직장 암 등에 연루됨), 기타 절두된 수용체 티로신 키나제, 카스파제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 상이한 단백질에 적용될 수 있음을 이해할 것이다. PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 12 (상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함됨) 는 우수한 동적 범위를 갖는 다중, 고처리량, 근접 이중 탐지 마이크로어레이 ELISA 를 사용하여 세포 중 절두된 수용체 예컨대 p95HER2 를 탐지하기 위한 본 발명의 검정 방법의 예시적 구현예를 제공한다.
일부 구현예에서, ECD 결합 영역에 특이적인 복수의 비드는 스트렙타비딘-비오틴 쌍을 포함하며, 여기서 스트렙타비딘은 비드에 부착되어 있고, 비오틴은 항체에 부착되어 있다. 특정 경우에, 항체는 전장 수용체 (예를 들어, 전장 HER2) 의 ECD 결합 영역에 특이적이다.
일부 구현예에서, 포획 항체의 각각의 희석물 시리즈는 일련의 감소하는 포획 항체 농축물을 포함한다. 특정 경우에, 포획 항체는 2-배 이상 (예를 들어, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 또는 1000-배) 계단 희석되어 집합 수 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 그 이상) 의 감소하는 포획 항체 농축물을 포함하는 희석물 시리즈를 생성하며, 이것이 어레이 위로 스포팅된다. 바람직하게는, 각각의 포획 항체 희석물의 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6 복제물이 어레이 위로 스포팅된다.
다른 구현예에서, 고체 지지체는 유리 (예를 들어, 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막 (예를 들어, 나일론, 니트로셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오리드 (PVDF) 등), 섬유 다발, 또는 임의의 기타 적합한 기질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 포획 항체는 (예를 들어, 공유적 또는 비공유적 상호작용을 통해) 니트로셀룰로스 중합체 예컨대, 예를 들어, Whatman Inc. (Florham Park, NJ) 에서 상업적으로 입수가능한 FAST® 슬라이드로 코팅된 유리 슬라이드 상에 구속된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항체 어레이를 구축하기 위한 예시적 방법이, 예를 들어, PCT 공개 번호 WO2009/108637 에 기재되어 있으며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다.
IV. 단일 탐지 검정법
일부 구현예에서, 세포 예컨대 종양 세포의 세포 추출물 중 관심의 하나 이상의 분석물 (예를 들어, 하나 이상의 신호 전달 분자 예컨대 HER 및/또는 c-Met 신호전달 경로의 하나 이상의 구성요소) 의 발현 및/또는 활성화 수준 또는 상태를 탐지하기 위한 검정법은 우수한 동적 범위를 갖는 다중, 고처리량 2-항체 검정법이다. 비제한적 예로서, 검정법에서 사용되는 2 개의 항체는 하기를 포함할 수 있다: (1) 관심의 특정 분석물에 특이적인 포획 항체; 및 (2) 분석물의 활성화된 형태에 특이적인 탐지 항체 (즉, 활성화 상태-의존적 항체). 활성화 상태-의존적 항체는, 예를 들어, 분석물의 인산화, 유비퀴틴화, 및/또는 복합체화 상태를 탐지할 수 있다. 대안적으로, 탐지 항체는, 세포 추출물 중 분석물의 총량을 탐지하는, 활성화 상태-비의존적 항체를 포함한다. 활성화 상태-비의존적 항체는 일반적으로 분석물의 활성화된 및 비-활성화된 형태 둘다를 탐지할 수 있다.
하나의 특정 구현예에서, 관심의 분석물의 발현 또는 활성화 수준을 탐지하기 위한 2-항체 검정법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 복수의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션시켜 복수의 포획된 분석물을 형성하는 단계;
(ii) 복수의 포획된 분석물을 해당 분석물에 특이적인 탐지 항체와 함께 인큐베이션시켜 복수의 탐지가능한 포획된 분석물을 형성하는 단계, 여기서 탐지 항체는 분석물의 활성화 (예를 들어, 인산화) 수준을 탐지하기 위한 활성화 상태-의존적 항체 또는 분석물의 발현 수준 (예를 들어, 총량) 을 탐지하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체를 포함함;
(iii) 복수의 탐지가능한 포획된 분석물을 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원과 함께 인큐베이션시켜 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(iv) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 탐지하는 단계.
본원에 기재된 2-항체 검정법은 전형적으로 상이한 접근가능한 위치에서 고체 지지체의 표면에 커플링되어 있는 복수의 상이한 포획 항체를 다양한 포획 항체 농도로 포함하는 항체-기반 어레이이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 고체 지지체의 예는 위에 기재되어 있다.
포획 항체 및 탐지 항체는 바람직하게는 분석물 결합과 관련된 그들 사이의 경쟁을 최소화하도록 선별된다 (즉, 포획 및 탐지 항체 둘다가 그들의 상응하는 신호 전달 분자에 동시에 결합할 수 있다).
하나의 구현예에서, 탐지 항체는 결합 쌍의 제 1 일원 (예를 들어, 비오틴) 을 포함하고, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 결합 쌍의 제 2 일원 (예를 들어, 스트렙타비딘) 을 포함한다. 결합 쌍 일원은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 탐지 항체 또는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 직접 또는 간접 커플링될 수 있다. 특정 경우에, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 퍼옥시다제 (예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 카탈라제, 클로로퍼옥시다제, 시토크롬 c 퍼옥시다제, 호산구 퍼옥시다제, 글루타티온 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 미엘로퍼옥시다제, 갑상선 퍼옥시다제, 데이오디나제 등) 이고, 신호 증폭 쌍의 제 2 일원은 티라미드 시약 (예를 들어, 비오틴-티라미드) 이다. 이들 경우에, 과산화수소 (H2O2) 의 존재 하에 티라미드 시약의 퍼옥시다제 산화에 의해 활성화된 티라미드를 생성함으로써 증폭된 신호가 생성된다.
활성화된 티라미드는 직접 탐지되거나 신호-탐지 시약 예컨대, 예를 들어, 스트렙타비딘-표지된 형광단 또는 스트렙타비딘-표지된 퍼옥시다제 및 발색 시약의 조합의 첨가 후에 탐지된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 형광단의 예는 Alexa Fluor® 염료 (예를 들어, Alexa Fluor® 555), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon Green™; 로다민, 텍사스 레드, 테트라로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), CyDye™ 플루오르 (예를 들어, Cy2, Cy3, Cy5) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 스트렙타비딘 표지는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 형광단 또는 퍼옥시다제에 직접 또는 간접 커플링될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 발색 시약의 비제한적 예는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB), 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) (ABTS), 4-클로로-1-나프톨 (4CN), 및/또는 포르피리노겐을 포함한다.
본원에 기재된 2-항체 검정법을 실시하기 위한 예시적 프로토콜이 PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 3 에 제공되어 있으며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다.
2-항체 접근법의 또다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 절두된 수용체의 발현 또는 활성화 수준을 탐지하기 위한 방법을 제공한다:
(i) 세포 추출물을 전장 수용체의 세포외 도메인 (ECD) 결합 영역에 특이적인 복수의 비드와 함께 인큐베이션시키는 단계;
(ii) 세포 추출물로부터 복수의 비드를 제거함으로써, 전장 수용체를 제거하여 전장 수용체가 없는 세포 추출물을 형성하는 단계;
(iii) 전장 수용체가 없는 세포 추출물을 전장 수용체의 세포내 도메인 (ICD) 결합 영역에 특이적인 하나 또는 복수의 포획 항체의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션시켜 복수의 포획된 절두된 수용체를 형성하는 단계;
(iv) 복수의 포획된 절두된 수용체를 전장 수용체의 ICD 결합 영역에 특이적인탐지 항체와 함께 인큐베이션시켜 복수의 탐지가능한 포획된 절두된 수용체를 형성하는 단계, 여기서 탐지 항체는 절두된 수용체의 활성화 (예를 들어, 인산화) 수준을 탐지하기 위한 활성화 상태-의존적 항체 또는 절두된 수용체의 발현 수준 (예를 들어, 총량) 을 탐지하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체를 포함함;
(v) 복수의 탐지가능한 포획된 절두된 수용체를 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원과 함께 인큐베이션시켜 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(vi) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 탐지하는 단계.
특정 구현예에서, 절두된 수용체는 p95HER2 이고, 전장 수용체는 HER2 이다. 특정 다른 구현예에서, 세포외 도메인 (ECD) 결합 영역에 특이적인 복수의 비드는 스트렙타비딘-비오틴 쌍을 포함하며, 여기서 비오틴은 비드에 부착되어 있고, 비오틴은 항체에 부착되어 있다 (예를 들어, 여기서 항체는 전장 수용체의 ECD 결합 영역에 특이적이다).
PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 도 14A (상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함됨) 는 관심의 수용체의 세포외 도메인 (ECD) 으로 지향되는 항체로 코팅된 비드가 전장 수용체 (예를 들어, HER2) 에는 결합하지만, 절두된 수용체 (예를 들어, p95HER2) 에는 결합하지 않으므로 검정법으로부터 임의의 전장 수용체를 제거함을 보여준다. PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 도 14B 는 절두된 수용체 (예를 들어, p95HER2) 가, 일단 포획 항체에 결합된 후에, 전장 수용체 (예를 들어, HER2) 의 세포내 도메인 (ICD) 에 특이적인 탐지 항체에 의해 탐지될 수 있음을 보여준다. 탐지 항체는 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 에 직접 접합될 수 있다. 티라미드 신호 증폭 (TSA) 이 그 후 실시되어 탐지되는 신호를 생성할 수 있다. 절두된 수용체 (예를 들어, p95HER2) 의 발현 수준 또는 활성화 상태가 조사되어, 예를 들어, 그것의 총 농도 또는 그것의 인산화 상태, 유비퀴틴화 상태, 및/또는 복합체화 상태가 확인될 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 위에 기재된 2-항체 검정법을 실시하기 위한 키트를 제공한다: (a) 고체 지지체 상에 구속된 하나 또는 복수의 포획 항체의 희석물 시리즈; 및 (b) 하나 또는 복수의 탐지 항체 (예를 들어, 활성화 상태-비의존적 항체 및/또는 활성화 상태-의존적 항체). 일부 경우에, 키트는 키트를 사용하여 세포 예컨대 종양 세포의 하나 또는 복수의 신호 전달 분자의 발현 수준 및/또는 활성화 상태를 탐지하기 위한 지침을 추가로 함유할 수 있다. 키트는 본 발명의 구체적 방법을 실시하는 것과 관련하여 위에 기재된 부가적 시약 예컨대, 예를 들어, 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원, 티라미드 신호 증폭 시약, 세정 완충제 등을 임의로 또한 함유할 수 있다.
V. 근접 이중 탐지 검정법
일부 구현예에서, 세포 예컨대 종양 세포의 세포 추출물 중 하나 이상의 관심의 분석물 (예를 들어, 하나 이상의 신호 전달 분자 예컨대 HER 및/또는 c-Met 신호전달 경로의 하나 이상의 구성요소) 의 발현 및/또는 활성화 수준을 탐지하기 위한 검정법은 우수한 동적 범위를 갖는 다중, 고처리량 근접 (즉, 3-항체) 검정법이다. 비제한적 예로서, 근접 검정법에서 사용되는 3 개의 항체는 하기를 포함한다: (1) 관심의 특정 분석물에 특이적인 포획 항체; (2) 분석물의 활성화된 형태에 특이적인 탐지 항체 (즉, 활성화 상태-의존적 항체); 및 (3) 분석물의 총량을 탐지하는 탐지 항체 (즉, 활성화 상태-비의존적 항체). 활성화 상태-의존적 항체는, 예를 들어, 분석물의 인산화, 유비퀴틴화, 및/또는 복합체화 상태를 탐지할 수 있지만, 활성화 상태-비의존적 항체는 분석물의 총량 (즉, 활성화된 및 비-활성화된 형태 둘다) 을 탐지할 수 있다.
하나의 특정 구현예에서, 관심의 분석물의 활성화 수준 또는 상태를 탐지하기 위한 근접 검정법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 복수의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션시켜 복수의 포획된 분석물을 형성하는 단계;
(ii) 복수의 포획된 분석물을 하나 또는 복수의 활성화 상태-비의존적 항체 및 해당 분석물에 특이적인 하나 또는 복수의 활성화 상태-의존적 항체를 포함하는 탐지 항체와 함께 인큐베이션시켜 복수의 탐지가능한 포획된 분석물을 형성하는 단계,
여기서 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 표지되어 있고, 활성화 상태-의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되어 있고, 촉진 모이어티는 산화제를 생성하며 그 산화제는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 채널링되어 그와 반응함;
(iii) 복수의 탐지가능한 포획된 분석물을 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션시켜 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(iv) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 탐지하는 단계.
또다른 특정 구현예에서, 절두된 수용체인 관심의 분석물의 활성화 수준 또는 상태를 탐지하기 위한 근접 검정법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 전장 수용체의 세포외 도메인 (ECD) 결합 영역에 특이적인 복수의 비드와 함께 인큐베이션시키는 단계;
(ii) 세포 추출물로부터 복수의 비드를 제거함으로써, 전장 수용체를 제거하여 전장 수용체가 없는 세포 추출물을 형성하는 단계;
(iii) 전장 수용체가 없는 세포 추출물을 전장 수용체의 세포내 도메인 (ICD) 결합 영역에 특이적인 하나 또는 복수의 포획 항체와 함께 인큐베이션시켜 복수의 포획된 절두된 수용체를 형성하는 단계;
(iv) 복수의 포획된 절두된 수용체를 하나 또는 복수의 활성화 상태-비의존적 항체 및 전장 수용체의 ICD 결합 영역에 특이적인 하나 또는 복수의 활성화 상태-의존적 항체를 포함하는 탐지 항체와 함께 인큐베이션시켜 복수의 탐지가능한 포획된 절두된 수용체를 형성하는 단계,
여기서 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 표지되어 있고, 활성화 상태-의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되어 있고, 촉진 모이어티는 산화제를 생성하며 그 산화제는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 채널링되어 그와 반응함;
(v) 복수의 탐지가능한 포획된 절두된 수용체를 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션시켜 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(vi) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 탐지하는 단계.
특정 구현예에서, 절두된 수용체는 p95HER2 이고, 전장 수용체는 HER2 이다. 특정 다른 구현예에서, 세포외 도메인 (ECD) 결합 영역에 특이적인 복수의 비드는 스트렙타비딘-비오틴 쌍을 포함하며, 여기서 비오틴은 비드에 부착되어 있고, 비오틴은 항체에 부착되어 있다 (예를 들어, 여기서 항체는 전장 수용체의 ECD 결합 영역에 특이적이다).
대안적 구현예에서, 활성화 상태-의존적 항체는 촉진 모이어티로 표지될 수 있고, 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지될 수 있다.
또다른 비제한적 예로서, 근접 검정법에서 사용되는 3 개의 항체는 하기를 포함할 수 있다: (1) 관심의 특정 분석물에 특이적인 포획 항체; (2) 분석물의 총량을 탐지하는 제 1 탐지 항체 (즉, 제 1 활성화 상태-비의존적 항체); 및 (3) 분석물의 총량을 탐지하는 제 2 탐지 항체 (즉, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체). 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 분석물 상의 상이한 (예를 들어, 구별되는) 에피토프를 인지한다.
하나의 특정 구현예에서, 관심의 분석물의 발현 수준을 탐지하기 위한 근접 검정법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 복수의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션시켜 복수의 포획된 분석물을 형성하는 단계;
(ii) 복수의 포획된 분석물을 해당 분석물에 특이적인 하나 또는 복수의 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체를 포함하는 탐지 항체와 함께 인큐베이션시켜 복수의 탐지가능한 포획된 분석물을 형성하는 단계,
여기서 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 표지되어 있고, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되어 있고, 촉진 모이어티는 산화제를 생성하며 그 산화제는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 채널링되어 그와 반응함;
(iii) 복수의 탐지가능한 포획된 분석물을 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션시켜 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(iv) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 탐지하는 단계.
또다른 특정 구현예에서, 절두된 수용체인 관심의 분석물의 발현 수준을 탐지하기 위한 근접 검정법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 전장 수용체의 세포외 도메인 (ECD) 결합 영역에 특이적인 복수의 비드와 함께 인큐베이션시키는 단계;
(ii) 세포 추출물로부터 복수의 비드를 제거함으로써, 전장 수용체를 제거하여 전장 수용체가 없는 세포 추출물을 형성하는 단계;
(iii) 전장 수용체가 없는 세포 추출물을 전장 수용체의 세포내 도메인 (ICD) 결합 영역에 특이적인 하나 또는 복수의 포획 항체와 함께 인큐베이션시켜 복수의 포획된 절두된 수용체를 형성하는 단계;
(iv) 복수의 포획된 절두된 수용체를 전장 수용체의 ICD 결합 영역에 특이적인 하나 또는 복수의 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체를 포함하는 탐지 항체와 함께 인큐베이션시켜 복수의 탐지가능한 포획된 절두된 수용체를 형성하는 단계,
여기서 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 표지되어 있고, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되어 있고, 촉진 모이어티는 산화제를 생성하며 그 산화제는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 채널링되어 그와 반응함;
(v) 복수의 탐지가능한 포획된 절두된 수용체를 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션시켜 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(vi) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 탐지하는 단계.
특정 구현예에서, 절두된 수용체는 p95HER2 이고, 전장 수용체는 HER2 이다. 특정 다른 구현예에서, 세포외 도메인 (ECD) 결합 영역에 특이적인 복수의 비드는 스트렙타비딘-비오틴 쌍을 포함하며, 여기서 비오틴은 비드에 부착되어 있고, 비오틴은 항체에 부착되어 있다 (예를 들어, 여기서 항체는 전장 수용체의 ECD 결합 영역에 특이적이다).
대안적 구현예에서, 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지될 수 있고, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 표지될 수 있다.
본원에 기재된 근접 검정법은 전형적으로 상이한 접근가능한 위치에서 고체 지지체의 표면에 커플링되어 있는 하나 또는 복수의 상이한 포획 항체를 다양한 포획 항체 농도로 포함하는 항체-기반 어레이이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 고체 지지체의 예는 위에 기재되어 있다.
포획 항체, 활성화 상태-비의존적 항체, 및 활성화 상태-의존적 항체는 바람직하게는 분석물 결합과 관련된 그들 사이의 경쟁을 최소화하도록 선별된다 (즉, 모든 항체는 그들의 상응하는 신호 전달 분자에 동시에 결합할 수 있다).
일부 구현예에서, 하나 이상의 분석물의 활성화 수준을 탐지하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체 또는, 대안적으로, 하나 이상의 분석물의 발현 수준을 탐지하기 위한 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 탐지가능한 모이어티를 추가로 포함한다. 그러한 경우에, 탐지가능한 모이어티의 양은 세포 추출물 중 하나 이상의 분석물의 양과 상관관계가 있다. 탐지가능한 모이어티의 예는 형광 표지, 화학 반응성 표지, 효소 표지, 방사성 표지 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 탐지가능한 모이어티는 형광단 예컨대 Alexa Fluor® 염료 (예를 들어, Alexa Fluor® 647), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon Green™; 로다민, 텍사스 레드, 테트라로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), CyDye™ 플루오르 (예를 들어, Cy2, Cy3, Cy5) 등이다. 탐지가능한 모이어티는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 활성화 상태-비의존적 항체에 직접 또는 간접 커플링될 수 있다.
특정 경우에, 하나 이상의 분석물의 활성화 수준을 탐지하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체 또는, 대안적으로, 하나 이상의 분석물의 발현 수준을 탐지하기 위한 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 모이어티로 직접 표지된다. 촉진 모이어티는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 활성화 상태-비의존적 항체에 커플링될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 촉진 모이어티는 촉진 모이어티에 근접한 (즉, 공간적으로 가까운 또는 근처인) 또다른 분자로 채널링되어 (즉, 그것으로 지향되어) 그와 반응하는 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 산화제를 생성할 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 촉진 모이어티의 예는 효소 예컨대 글루코스 옥시다제 또는 전자 수용체로서 산소 분자 (O2) 를 수반하는 산화/환원 반응을 촉매작용하는 임의의 기타 효소, 및 감광제 예컨대 메틸렌 블루, 로즈 벤갈, 포르피린, 스쿠아레이트 염료, 프탈로시아닌 등을 제한 없이 포함한다. 산화제의 비제한적 예는 과산화수소 (H2O2), 일중항 산소, 및 산화/환원 반응에서 산소 원자를 주거나 전자를 얻는 임의의 기타 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 적합한 기질 (예를 들어, 글루코스, 빛 등) 의 존재 하에, 촉진 모이어티 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 감광제 등) 는 2 개의 모이어티가 서로 근접해 있을 때 신호 증폭 쌍의 제 1 일원 (예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 보호기로 보호된 합텐, 효소 저해인자로의 티오에테르 연결에 의해 불활성화되는 효소 등) 으로 채널링되어 그와 반응하는 산화제 (예를 들어, 과산화수소 (H2O2), 단일 산소 등) 를 생성한다.
특정 다른 경우에, 하나 이상의 분석물의 활성화 수준을 탐지하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체 또는, 대안적으로, 하나 이상의 분석물의 발현 수준을 탐지하기 위한 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 올리고뉴클레오티드 링커 및 촉진 모이어티에 접합된 상보적 올리고뉴클레오티드 링커 사이의 혼성화를 통해 촉진 모이어티로 간접 표지된다. 올리고뉴클레오티드 링커는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 촉진 모이어티 또는 활성화 상태-비의존적 항체에 커플링될 수 있다. 일부 구현예에서, 촉진 모이어티에 접합된 올리고뉴클레오티드 링커는 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 올리고뉴클레오티드 링커와 100% 상보성을 갖는다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 링커 쌍은, 예를 들어, 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화시, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 부조화 영역을 포함한다. 당업자는 상이한 분석물에 특이적인 활성화 상태-비의존적 항체가 동일한 올리고뉴클레오티드 링커에 또는 상이한 올리고뉴클레오티드 링커에 접합될 수 있음을 이해할 것이다.
촉진 모이어티 또는 활성화 상태-비의존적 항체에 접합되는 올리고뉴클레오티드 링커의 길이는 다양할 수 있다. 일반적으로, 링커 서열은 길이가 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 또는 100 뉴클레오티드일 수 있다. 전형적으로, 커플링 동안 무작위 핵산 서열이 생성된다. 비제한적 예로서, 올리고뉴클레오티드 링커의 라이브러리는 하기 3 개의 구별되는 인접 도메인을 갖도록 디자인된다: 스페이서 도메인; 서명 도메인; 및 접합 도메인. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 링커는 그것이 접합되는 촉진 모이어티 또는 활성화 상태-비의존적 항체의 기능을 파괴하지 않으면서 효율적인 커플링을 하기 위해 디자인된다.
올리고뉴클레오티드 링커 서열은 다양한 검정 조건 하에 임의의 2차 구조 형성을 방지 또는 최소화하도록 디자인될 수 있다. 용융 온도가 전형적으로 링커 내부의 각각의 분절에 대해 조심스럽게 모니터링되어 전체 검정 절차에서 그들의 참여를 허용한다. 일반적으로, 링커 서열의 분절의 용융 온도 범위는 1-10℃ 이다. 규정된 이온 농도 하의 용융 온도, 2차 구조, 및 헤어핀 구조를 확인하기 위한 컴퓨터 알고리즘 (예를 들어, OLIGO 6.0) 을 사용하여 링커 내부의 3 개의 상이한 도메인 각각을 분석할 수 있다. 전체적인 조합된 서열이 또한 그들의 구조적 특징 및 다른 접합된 올리고뉴클레오티드 링커 서열과의 공통성, 예를 들어, 그들이 엄격한 혼성화 조건 하에 상보적 올리고뉴클레오티드 링커에 혼성화할지 여부에 대해 분석된다.
올리고뉴클레오티드 링커의 스페이서 영역은 올리고뉴클레오티드 교차연결 자리로부터 접합 도메인의 적절한 분리를 제공한다. 접합 도메인은 핵산 혼성화를 통해 상보적 올리고뉴클레오티드 링커 서열로 표지된 분자를 접합 도메인에 연결하는 기능을 한다. 핵산-매개 혼성화는 항체-분석물 (즉, 항원) 복합체 형성 전에 또는 후에 실시되어, 더욱 유연한 검정 포맷을 제공할 수 있다. 많은 직접적 항체 접합 방법과는 달리, 비교적 작은 올리고뉴클레오티드를 항체 또는 다른 분자에 연결시키는 것은 항체의 그의 표적 분석물을 향한 특정 친화도에 또는 접합된 분자의 기능에 가장 작은 영향을 미친다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 링커의 서명 서열 도메인은 복합 다중 단백질 검정법에서 사용될 수 있다. 다중 항체는 상이한 서명 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 링커와 접합될 수 있다. 다중 면역검정법에서, 적당한 탐침으로 표지된 리포터 올리고뉴클레오티드 서열이 사용되어 다중 검정 포맷으로 항체 및 그들의 항원 사이의 교차반응성을 탐지할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 링커는 여러 상이한 방법을 사용하여 항체 또는 기타 분자에 접합될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 링커는 5' 또는 3' 말단에 티올 기를 갖도록 합성될 수 있다. 티올 기는 환원제 (예를 들어, TCEP-HCl) 를 사용하여 탈보호될 수 있고, 결과로서 얻어지는 링커는 탈염 스핀 칼럼 (spin column) 을 사용하여 정제될 수 있다. 결과로서 얻어지는 탈보호된 올리고뉴클레오티드 링커는 이질이관능성 (heterobifunctional) 가교제 예컨대 SMCC 를 사용하여 항체 또는 다른 유형의 단백질의 일차 아민에 접합될 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 상의 5'-포스페이트 기가 수용성 카르보디이미드 EDC 로 처리되어 포스페이트 에스테르를 형성한 후, 아민-함유 분자에 커플링될 수 있다. 특정 경우에, 3'-리보스 잔기 상의 디올이 알데히드 기로 산화된 후, 환원성 아미노화를 사용하여 항체 또는 다른 유형의 단백질의 아민 기에 접합될 수 있다. 특정 다른 경우에, 올리고뉴클레오티드 링커는 3' 또는 5' 말단에 비오틴 수식을 갖도록 합성되고 스트렙타비딘-표지된 분자에 접합될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 링커는 당업계에 알려진 임의의 다양한 기술, 예컨대 Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845 (1987); Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); 및 Wincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997) 에 기재된 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 합성은 통상적인 핵산 보호 및 커플링 기, 예컨대 5'-말단에 디메톡시트리틸 및 3'-말단에 포스포라미다이트를 사용한다. 올리고뉴클레오티드 합성, 핵산 탈보호 방법, 및 핵산 정제 방법에 적합한 시약은 당업자에게 알려져 있다.
특정 경우에, 하나 이상의 분석물의 활성화 수준을 탐지하기 위한 활성화 상태-의존적 항체 또는, 대안적으로, 하나 이상의 분석물의 발현 수준을 탐지하기 위한 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 직접 표지된다. 신호 증폭 쌍 일원은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 활성화 수준을 탐지하는 활성화 상태-의존적 항체 또는 발현 수준을 탐지하는 제 2 활성화 상태-비의존적 항체에 커플링될 수 있다. 특정 다른 경우에, 활성화 상태-의존적 항체 또는 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 활성화 상태-의존적 항체 또는 제 2 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 결합 쌍의 제 1 일원 및 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 접합된 결합 쌍의 제 2 일원 사이의 결합을 통해 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 간접 표지된다. 결합 쌍 일원 (예를 들어, 비오틴/스트렙타비딘) 은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 신호 증폭 쌍 일원에 또는 활성화 상태-의존적 항체 또는 제 2 활성화 상태-비의존적 항체에 커플링될 수 있다. 신호 증폭 쌍 일원의 예는 퍼옥시다제 예컨대 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 카탈라제, 클로로퍼옥시다제, 시토크롬 c 퍼옥시다제, 호산구 퍼옥시다제, 글루타티온 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 미엘로퍼옥시다제, 갑상선 퍼옥시다제, 데이오디나제 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 신호 증폭 쌍 일원의 다른 예는 보호기로 보호된 합텐 및 효소 저해인자로의 티오에테르 연결에 의해 불활성화된 효소를 포함한다.
근접 채널링 (channeling) 의 하나의 예에서, 촉진 모이어티는 글루코스 옥시다제 (GO) 이고, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 이다. GO 가 기질 예컨대 글루코스와 접촉될 때, 그것은 산화제 (즉, 과산화수소 (H2O2)) 를 생성한다. HRP 가 GO 에 채널링 근접해 있는 경우, GO 에 의해 생성된 H2O2 는 HRP 로 채널링되고 그와 복합체화되어 HRP-H2O2 복합체를 형성하고, 이 복합체는, 신호 증폭 쌍의 제 2 일원 (예를 들어, 화학발광 기질 예컨대 루미놀 또는 이소루미놀 또는 형광생성 기질 예컨대 티라미드 (예를 들어, 비오틴-티라미드), 호모바닐린산, 또는 4-히드록시페닐 아세트산) 의 존재 하에, 증폭된 신호를 생성한다. 근접 검정법에서 GO 및 HRP 를 사용하는 방법이, 예를 들어, Langry et al., U.S. Dept. of Energy Report No. UCRL-ID-136797 (1999) 에 기재되어 있다. 비오틴-티라미드가 신호 증폭 쌍의 제 2 일원으로서 사용될 때, HRP-H2O2 복합체는 티라미드를 산화시켜 반응성 티라미드 라디칼을 생성하고, 그 라디칼은 근처의 친핵 잔기에 공유 결합한다. 활성화된 티라미드는 직접 탐지되거나 신호-탐지 시약 예컨대, 예를 들어, 스트렙타비딘-표지된 형광단 또는 스트렙타비딘-표지된 퍼옥시다제 및 발색 시약의 조합의 첨가 후에 탐지된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 형광단의 예는 Alexa Fluor® 염료 (예를 들어, Alexa Fluor® 555), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon Green™; 로다민, 텍사스 레드, 테트라로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), CyDye™ 플루오르 (예를 들어, Cy2, Cy3, Cy5) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 스트렙타비딘 표지는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 형광단 또는 퍼옥시다제에 직접 또는 간접 커플링될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 발색 시약의 비제한적 예는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB), 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) (ABTS), 4-클로로-1-나프톨 (4CN), 및/또는 포르피리노겐을 포함한다.
근접 채널링의 또다른 예에서, 촉진 모이어티는 감광제이고, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 특정 결합 파트너 (예를 들어, 리간드, 항체 등) 에 대한 합텐의 결합을 방지하는 보호기로 보호되어 있는 다중 합텐으로 표지된 대형 분자이다. 예를 들어, 신호 증폭 쌍 일원은 보호된 비오틴, 쿠마린, 및/또는 플루오레세인 분자로 표지된 덱스트란 분자일 수 있다. 적합한 보호기는 페녹시-, 아날리노-, 올레핀-, 티오에테르-, 및 셀레노에테르-보호기를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 근접 검정법에서 사용하기에 적합한 부가적 감광제 및 보호된 합텐 분자가 미국 특허 제 5,807,675 호에 기재되어 있다. 감광제가 빛으로 여기될 때, 그것은 산화제 (즉, 일중항 산소) 를 생성한다. 합텐 분자가 감광제에 채널링 근접해 있는 경우, 감광제에 의해 생성된 일중항 산소는 합텐의 보호기 상의 티오에테르로 채널링되고 그와 반응하여 카르보닐 기 (케톤 또는 알데히드) 및 술핀산을 산출하여, 합텐으로부터 보호기를 방출한다. 보호되지 않은 합텐은 그 후 신호 증폭 쌍의 제 2 일원 (예를 들어, 탐지가능한 신호를 생성할 수 있는 특이적 결합 파트너) 에 특이적으로 결합하는데 이용가능하다. 예를 들어, 합텐이 비오틴일 때, 특이적 결합 파트너는 효소-표지된 스트렙타비딘일 수 있다. 예시적 효소는 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, HRP 등을 포함한다. 세정하여 결합되지 않은 시약을 제거한 후, 효소의 탐지가능한 (예를 들어, 형광, 화학발광, 발색 등) 기질을 첨가하여 탐지가능한 신호가 생성되고, 당업계에 알려진 적합한 방법 및 장비를 사용하여 탐지될 수 있다. 대안적으로, 위에 기재된 바와 같이, 탐지가능한 신호가 티라미드 신호 증폭을 사용하여 증폭되고, 활성화된 티라미드가 직접 탐지되거나 신호-탐지 시약의 첨가 후에 탐지될 수 있다.
근접 채널링의 또다른 예에서, 촉진 모이어티는 감광제이고, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 효소-저해인자 복합체이다. 효소 및 저해인자 (예를 들어, 포스폰산-표지된 덱스트란) 는 절단가능한 링커 (예를 들어, 티오에테르) 에 의해 함께 연결된다. 감광제가 빛으로 여기될 때, 그것은 산화제 (즉, 일중항 산소) 를 생성한다. 효소-저해인자 복합체가 감광제에 채널링 근접해 있는 경우, 감광제에 의해 생성된 일중항 산소는 절단가능한 링커로 채널링되고 그와 반응하여, 효소로부터 저해인자를 방출함으로써, 효소를 활성화시킨다. 효소 기질이 첨가되어 탐지가능한 신호를 생성하거나, 또는 대안적으로, 증폭 시약이 첨가되어 증폭된 신호를 생성한다.
근접 채널링의 추가의 예에서, 촉진 모이어티는 HRP 이고, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 상기 보호된 합텐 또는 효소-저해인자 복합체이고, 보호기는 p-알콕시 페놀을 포함한다. 페닐렌디아민 및 H2O2 의 첨가는 반응성 페닐렌 디이민을 생성하고, 이는 보호된 합텐 또는 효소-저해인자 복합체로 채널링되고 p-알콕시 페놀 보호기와 반응하여 노출된 합텐 또는 반응성 효소를 산출한다. 상기와 같이 증폭된 신호가 생성되고 탐지된다 (참고, 예를 들어, 미국 특허 제 5,532,138 호 및 제 5,445,944 호).
본원에 기재된 근접 검정법을 실시하기 위한 예시적 프로토콜이 PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 4 에 제공되어 있으며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 상기 근접 검정법을 실시하기 위한 키트를 제공한다: (a) 고체 지지체 상에 구속된 하나 또는 복수의 포획 항체의 희석물 시리즈; 및 (b) 하나 또는 복수의 탐지 항체 (예를 들어, 활성화 수준을 탐지하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체 및 활성화 상태-의존적 항체의 조합 및/또는 발현 수준을 탐지하기 위한 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체의 조합). 일부 경우에, 키트는 세포 예컨대 종양 세포의 하나 또는 복수의 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 상태를 탐지하기 위한 키트 사용 방법에 대한 지침을 추가로 함유할 수 있다. 키트는 본 발명의 구체적 방법의 실시와 관련하여 위에 기재된 임의의 부가적 시약 예컨대, 예를 들어, 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원, 티라미드 신호 증폭 시약, 촉진 모이어티에 대한 기질, 세정 완충제 등을 또한 함유할 수 있다.
VI. 항체의 생산
본 발명의 면역검정법에 따라 종양 세포 중 신호 전달 분자의 발현 및 활성화의 수준을 분석하기 위한 아직 상업적으로 입수가능하지 않은 항체의 생산 및 선별은 여러 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나의 방식은 당업계에 알려진 단백질 발현 및 정제 방법을 사용하여 관심의 폴리펩티드 (즉, 항원) 를 발현시키고/거나 정제하는 것이지만, 또다른 방식은 당업계에 알려진 고체상 펩티드 합성 방법을 사용하여 관심의 폴리펩티드를 합성하는 것이다. 참고, 예를 들어, Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol., Vol. 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields, ed., Meth. Enzymol., Vol. 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull., 38:1192-99 (1990); Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1:255-60, (1995); 및 Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull., 44:1326-31 (1996). 정제된 또는 합성된 폴리펩티드는 그 후, 예를 들어, 마우스 또는 토끼 내로 주입되어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체가 생산될 수 있다. 당업자는, 예를 들어, Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988) 에 기재된 바와 같은, 많은 절차가 항체의 생산에 이용가능하다는 것을 인지할 것이다. 당업자는 또한 항체를 모방하는 (예를 들어, 항체의 기능적 결합 영역을 보유하는) 결합 조각 또는 Fab 조각이 유전 정보로부터 다양한 절차에 의해 제조될 수 있음을 이해할 것이다. 참고, 예를 들어, Antibody Engineering: A Practical Approach, Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, Oxford (1995); 및 Huse et al., J. Immunol., 149:3914-3920 (1992).
당업자는 항체 또는 결합 조각을 생산하고 다양한 관심의 폴리펩티드에 대한 친화도 및 특이성을 스크리닝하고 선별함에 있어서 많은 접근법이 취해질 수 있으나, 이러한 접근법들이 본 발명의 범위를 바꾸지 않음을 인지할 것이다.
폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체, 그의 조각, 및 항체 정제 방법의 더욱 상세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2010/132723 에서 찾을 수 있으며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다.
당업자는 항체와 유사한 기능을 갖는 임의의 결합 분자, 예를 들어, 샘플 중 하나 이상의 관심의 분석물에 특이적인 결합 분자 또는 결합 파트너도 또한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 적합한 항체-유사 분자의 예는 도메인 항체, 유니바디 (unibodies), 나노바디 (nanobodies), 샤크 (shark) 항원 반응성 단백질, 아비머, 아드넥틴 (adnectin), 안티캄 (anticalm), 친화도 리간드, 파일로머 (phylomer), 앱타머, 아피바디 (affibodies), 트리넥틴 (trinectin) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
VII. 투여 방법
본 발명의 방법에 따르면, 본원에 기재된 항암 약물은 당업계에 알려진 임의의 편리한 수단에 의해 대상에게 투여된다. 본 발명의 방법은 위 종양을 갖는 대상에서 항암 약물 또는 항암 약물의 조합의 치료 효능을 예측하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 항암 약물 또는 항암 약물의 조합에 의한 치료에 대한 위 종양의 반응을 예측하는데 사용될 수 있다. 발명의 방법은 또한 위 종양의 치료에 적합한 항암 약물 또는 항암 약물의 조합을 선별 또는 식별하는데 사용될 수 있다. 발명의 방법은 또한 cMET 및 HER1 저해인자의 조합 요법을 대상에게 투여함으로써 I 또는 II 기 위암을 갖는 대상을 치료하는데 사용될 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 하나 이상의 항암 약물이 단독으로, 또는 종래의 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 면역요법, 및/또는 수술법과 조합된 치료적 접근법의 일부로서 투여될 수 있음을 인지할 것이다.
특정 구현예에서, 항암 약물은 항-신호전달제 (즉, 세포증식억제 약물) 예컨대 모노클로날 항체 또는 티로신 키나제 저해인자; 항-증식제; 화학치료제 (즉, 세포독성 약물); 호르몬 치료제; 방사선치료제; 백신; 및/또는 이상 세포 예컨대 암 세포의 제어되지 않는 성장을 감소시키거나 차단하는 능력이 있는 임의의 기타 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 하나 이상의 화학치료제와 조합된 하나 이상의 항-신호전달제, 항-증식제, 및/또는 호르몬 치료제로 처리된다. 예시적 모노클로날 항체, 티로신 키나제 저해인자, 항-증식제, 화학치료제, 호르몬 치료제, 방사선치료제, 및 백신이 위에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항암 약물은 면역자극제 (예를 들어, 바실러스 칼메테 구에린 (BCG), 레바미솔, 인터류킨-2, 알파-인터페론 등), 면역독소 (예를 들어, 항-CD33 모노클로날 항체-칼리케아마이신 접합체, 항-CD22 모노클로날 항체-슈도모나스 외독소 접합체 등), 및 방사선면역요법 (예를 들어, 111In, 90Y, 또는 131I 에 접합된 항-CD20 모노클로날 항체 등) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 종래의 면역치료제와 동시-투여될 수 있다.
항암 약물은 필요에 따라 적합한 약제학적 부형제와 함께 투여될 수 있고, 임의의 승인된 투여 방식을 통해 운반될 수 있다. 따라서, 투여는, 예를 들어, 경구, 협측 (buccal), 설하, 잇몸 (gingival), 입천장 (palatal), 정맥내, 국소, 피하, 경피 (transcutaneous), 경피 (transdermal), 근육내, 관절내, 비경구, 소동맥내, 진피내, 심실내, 두개내, 복막내, 방광내, 경막내, 병변내, 비강내, 직장, 질내, 또는 흡입 투여일 수 있다. "동시-투여" 는 항암 약물이 제 2 약물 (예를 들어, 또다른 항암 약물, 항암 약물 요법과 연관된 부작용을 감소시키는데 유용한 약물, 방사선치료제, 호르몬 치료제, 면역치료제 등) 의 투여와 동일한 시간에, 그 직전에, 또는 그 직후에 투여되는 것을 의미한다.
항암 약물의 치료적 유효량이 반복적으로, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 회 또는 그 이상 투여될 수 있거나, 그 용량이 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여량은 고체, 반고체, 동결건조된 분말, 또는 액체 투여 형태 예컨대 정제, 알약, 펠렛, 캡슐, 분말, 용액, 현탁제, 에멀전, 좌제, 체류 관장제 (retention enemas), 크림, 연고, 로션, 겔, 에어로졸, 포말 등의 형태를 가질 수 있으며, 바람직하게는, 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태이다.
본원에서 사용되는 용어 "단위 투여 형태" 는 인간 대상 및 다른 포유동물에 대한 단일 투여물로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 포함하며, 각각의 단위는 적합한 약제학적 부형제 (예를 들어, 앰플) 와 연합하여, 요망되는 개시, 내성, 및/또는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정의 양의 항암 약물을 함유한다. 또한, 더욱 농축된 투여 형태가 제조될 수 있고, 그로부터 그 후 더욱 희석된 단위 투여 형태가 생산될 수 있다. 따라서 더욱 농축된 투여 형태는 실질적으로, 예를 들어, 항암 약물의 양의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 배, 또는 그 이상을 함유할 것이다.
그러한 투여 형태를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990) 참조). 투여 형태는 전형적으로 종래의 약제학적 담체 또는 부형제를 포함하고, 다른 의약제, 담체, 아주반트, 희석제, 조직 투과 증강제, 가용화제 등을 부가적으로 포함할 수 있다. 적절한 부형제는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 특정 투여 형태 및 투여 경로에 맞추어질 수 있다 (예를 들어, 상기 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES 참조).
적합한 부형제의 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 식염수, 시럽, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 및 폴리아크릴산 예컨대 카르보폴, 예를 들어, 카르보폴 941, 카르보폴 980, 카르보폴 981 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 투여 형태는 윤활제 예컨대 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네알 오일; 습윤제; 에멀젼화제; 현탁제; 보존제 예컨대 메틸-, 에틸-, 및 프로필-히드록시-벤조에이트 (즉, 파라벤); pH 조정제 예컨대 무기 및 유기산 및 염기; 감미제; 및 착향제를 부가적으로 포함할 수 있다. 투여 형태는 생분해성 중합체 비드, 덱스트란, 및 시클로덱스트린 포함 복합체를 또한 포함할 수 있다.
경구 투여의 경우, 치료적 유효량은 정제, 캡슐, 에멀젼, 현탁액, 용액, 시럽, 스프레이, 로젠지, 분말, 및 지속-방출 제형의 형태일 수 있다. 경구 투여에 적합한 부형제는 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈컴, 셀룰로스, 글루코스, 젤라틴, 수크로스, 마그네슘 카르보네이트 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 유효량은 알약, 정제, 또는 캡슐의 형태를 취하고, 따라서 투여 형태는, 항암 약물과 함께, 하기 중 임의를 함유할 수 있다: 희석제 예컨대 락토스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 등; 붕해제 예컨대 전분 또는 이의 유도체; 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트 등; 및 결합제 예컨대 전분, 아카시아 검, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 셀룰로스 및 이의 유도체. 항암 약물은 또한, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 담체 중에 배치된 좌제로 제형화될 수 있다.
액체 투여 형태는 예를 들어, 경구, 국소, 또는 정맥내 투여를 위한 용액 또는 현탁액을 형성하기 위해, 예를 들어, 식염수 (예를 들어, 0.9% w/v 나트륨 클로라이드), 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 담체 중에 항암 약물 및 임으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 아주반트를 용해 또는 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 항암 약물은 또한 체류 관장제로 제형화될 수 있다.
국소 투여의 경우, 치료 유효량은 에멀젼, 로션, 겔, 포말, 크림, 젤리, 용액, 현탁액, 연고, 및 경피 패치의 형태일 수 있다. 흡입에 의한 투여의 경우, 항암 약물은 네뷸라이저를 통해 건조 분말 또는 액체 형태로 전달될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 치료 유효 용량은 멸균 주사가능 용액 및 멸균 포장된 분말 형태일 수 있다. 바람직하게는, 주사가능 용액은 약 4.5 내지 약 7.5 의 pH 로 제형화된다.
치료 유효량은 또한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 그러한 투여 형태는 투여 전 재구성을 위한 완충액, 예를 들어, 바이카보네이트를 포함할 수 있거나, 또는 완충액이, 예를 들어, 물로 재구성하기 위한 동결건조된 투여 형태에 포함될 수 있다. 동결건조된 투여 형태는 적합한 혈관수축제, 예를 들어, 에피네프린을 추가로 포함할 수 있다. 동결건조된 투여 형태는, 재구성된 투여 형태가 즉시 대상에게 투여될 수 있도록, 임의로 재구성용 완충제와 조합하여 포장된, 주사기 중에 제공될 수 있다.
대상은 또한 특정 치료 섭생법의 효능을 평가하기 위해 주기적 시간 간격으로 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 특정 신호 전달 분자의 활성화 상태가 본원에 기재된 하나 이상의 항암 약물에 의한 처리의 치료 효과에 따라 변화할 수 있다. 대상은 개별화된 접근법에서 반응을 평가하고 특정 약물 또는 치료의 효과를 이해하기 위해 모니터링될 수 있다. 부가적으로, 처음에는 특정 항암 약물 또는 항암 약물의 조합에 반응하는 대상이 그 약물 또는 약물 조합에 불응성으로 변할 수 있으며, 이는 그 대상이 후천적 약물 저항성을 발달시켰음을 시사한다. 그 대상은 그의 현재의 요법을 중단하고 본 발명의 방법에 따라 대안적 치료를 처방받을 수 있다.
VIII. 실시예
하기 실시예는 청구된 발명을 설명을 하기 위해 제공되나, 그것을 제한하지는 않는다. 2010 년 7 월 15 일에 제출된 PCT 공개 번호 WO 2011/008990 (PCT/US2010/042182), 및 2012 년 1 월 19 일에 제출된 미국 특허 출원 번호 13/354,257 의 실시예가 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
실시예 1. 위암 환자에서 다중 신호 경로 단백질의 기능적 프로파일링.
요약
위절제술은 위암 (GCA) 환자에서 유일한 치유적 치료법이지만, 치유적 수술 후 40 ~ 60% 의 높은 재발율은 여전히 불량한 전체 생존률의 원인이다. 생존률을 추가로 개선하기 위해, 보조 화학방사선 요법 후 생존률 또는 재발에 대한 신뢰할 수 있는 분자 진단 마커를 식별할 필요가 절실하며, 이는 환자-맞춤 치료 전략의 개발로 발전될 것이다. 따라서, 우리는 다중 면역-마이크로어레이 플랫폼을 사용하는 신호 전달 경로 단백질의 기능적 프로파일링을 위한 다중 면역검정법 플랫폼을 개발했다. 여기에서 우리는 GCA 에서의 HER1, HER2, HER3, cMET, PI3K, 및 IGF1R 의 기능적 프로파일링을 보고한다.
서론
전이성 위암은 불량한 예후 때문에 의학 종양학자들에게 여전히 치료적 과제로 남아 있다. HER2 증폭 및/또는 과발현이 많은 위암 사례에서 존재한다. 위암에 대한 신규한 치료 표적의 탐색에서, 트라스투주맙은 HER2(+) 전이성 GCA 환자에서 생존률 유익을 나타냈다. 그러나, HER2 (+) 환자는 일차 또는 후천적 저항성으로 인해 종종 트라스투주맙에 반응하지 않는다. 우리의 연구에서, 저해인자 또는 물질의 조합의 합리적 선별을 위한 표적화가능 경로 단백질의 출현율을 조사하기 위해 우리는 신호 전달 경로 내의 단백질의 발현/활성화 수준을 분석했다. 여기에서 우리는 GCA 에서 HER2 표적지향제를 포함시키는 장래의 임상 시험에 대한 기초작업을 하기 위해 HER2, p95-HER2 및, HER2 및 기타 평행 경로에 대한 전사활성 잠재성을 갖는 기타 경로 단백질의 발현/활성화-프로파일링을 보고한다.
방법
합동 효소 증강 반응성-면역검정법 ( C ollaborative E nzyme E nhanced R eactive-immunoassay) (CEER™): 조직-용해물 중 존재하는 표적 단백질이 니트로셀룰로스 표면에 프린팅된 특이적 포획 항체에 결합되고, 결합되지 않은 비-표적 단백질이 슬라이드로부터 제거된다. 글루코스 옥시다제 (GO) 와 접합된 포획된 표적-단백질 상의 대체 (alternate) 에피토프에 대한 탐지자 항체 중 하나와, HRP 와 접합된 표적-단백질 상의 인산화된 자리 또는 또다른 비-중복 에피토프에 특이적인 다른 탐지자 항체 사이의 효소적 상호작용이 신호 생성/증폭을 초래한다 (참고, 도 1).
슬라이드 프링팅 : 각각의 특정 표적 단백질에 대한 포획 항체가 연속 희석물로 3 반복 프린팅된다. 각각의 슬라이드는 각각의 슬라이드 실행 (run) 에 대한 샘플의 정확한 정량을 위한 표준 곡선 생성을 위한 세포주 대조군을 함유한다.
임상 샘플 : 위치확인된, 조직학적으로 확인된 GCA 환자로부터 급속 냉동된 위암 조직을 얻었다 (Samsung Medical Center). 급속 냉동된 조직 샘플을 100 ㎕ 의 용해 완충액 중에 용해하고, 결과로서 얻어진 용해물을 후속 분석 전에 -80℃ 에서 저장했다.
결과
IHC 에 의해 이러한 코호트 내의 환자의 7% 가 높은 수준의 HER2 (31/447) 를 나타냈지만, CEER™ 검정법에 의해 환자의 대략 12% 가 유의한 수준의 HER2 의 발현을 보였다. 도 2 에서 나타나는 바와 같이 GCA 환자의 5.6% (25/447) 에서 절두된 HER2 (또는 p95HER2) 가 탐지되었다. 환자의 대략 40% 에서 다양한 수준의 HER3 발현이 발견되었다.
더 낮은 HER2 발현이 존재하는 샘플에서 더 높은 수준의 HER1 이 발견되었다. HER3-P 수준은 HER3-T 및 PI3K 활성화와 높은 수준의 상관관계를 보였다. 이러한 코호트에서 IGF1R 의 발현은 대부분의 샘플에서 비교적 더 낮았다. 더 높은 HER2 발현이 존재하는 샘플에서 p95HER2 수준이 현저했으나, p95HER2 활성화의 증거는 더 넓은 분포를 가졌다. cMET 활성화가 존재하는 환자에 대해 종종 HER1 의 동시-활성화가 관찰되었다 (참고, 도 3).
결론
재발성 또는 전이성 GCA 의 치료법이 바이오마커의 질환-특이적 기능적 프로파일링에 기초하여 최적화되어, 환자-맞춤 치료 전략을 초래할 수 있다. 아-GCA 에서 HER1 및 cMET 의 조합된 표적화는 동시-활성화 패턴을 갖는 환자에게 유익할 수 있다. CEER™ 은 제한된 양의 조직으로도 수행될 수 있으므로, 치료 섭생법의 과정 동안 전달 경로 단백질의 변경의 발생빈도는 임상의가 더 나은 치료 전략을 고안하는 것을 안내하고 진화형 또는 조합형/순차배열형 표적화 요법의 임상적 개발을 지지할 수 있다.
실시예 2. 위암 세포주의 패널에서 경로 단백질의 포괄적 프로파일링.
요약
암 관리에서 분자 표적지향 요법의 등장으로, 표적지향형 약물에 대한 경로 단백질의 프로파일링이 매우 중요하다. 그러나, 표적 섭생법에서 반응을 예측하는 것이 어려운 원인 중 하나는 아마도 종양의 신호 전달 경로 내의 단백질의 비정상적 변화에 대한 제한된 지식의 결과일 것이다. 경로 단백질의 비정상적 활성화가 종양 세포에서 신생물 표현형을 야기하는 메카니즘 및 표적지향형 간섭이 어떻게 임상 반응을 초래하는지에 대한 깊은 수준의 이해는 임상의 및 약물 개발자들의 공통적 목표일 것이다. 여기에서 우리는 포괄적 돌연변이 프로파일을 경로 단백질 발현 및/또는 활성화 (HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF1T, cKIT, Shc, PI3K, AKT, ERK, Src, FAK, PTEN 및 기타 신호 단백질) 및 표적지향형 약물 치료에 반응하는 그들의 조정과 함께 보고한다. GCA 의 서브클래스에서 다양한 저해인자에 대한 저항성의 메카니즘을 이용하여 표적지향형 약물 선별, 조합, 및/또는 순차배열로 합리적 치료 옵션을 디자인할 수 있다.
서론
종양 샘플의 전임상 세포 반응 프로파일링은 신규한 암 치료제의 개발에 있어서 초석이 되었다. 따라서, 우리는 합동 효소 증강 반응성-면역검정법 (CEER™) 다중 단백질 마이크로어레이 시스템을 적용하여, 유전적 변경에 대해 잘 특성분석된 30 개의 GCA 세포주 내의 신호 전달 단백질을 기능적으로 프로파일링했다. 이들 세포주에서 유전적 및 기능적 경로 특성분석의 조합은 GCA 의 다양한 구별되는 하위 분류를 허용했고, 임상 연구 및 약물 개발을 위한 로드맵을 제공할 수 있다.
방법
CEER™: 조직-용해물 중 존재하는 표적 단백질이 니트로셀룰로스 표면에 프린팅된 특이적 포획 항체에 결합되고, 결합되지 않은 비-표적 단백질이 슬라이드로부터 제거된다. 글루코스 옥시다제 (GO) 와 접합된 포획된 표적-단백질 상의 대체 에피토프에 대한 탐지자 항체 중 하나와, HRP 와 접합된 표적-단백질 상의 인산화된 자리 또는 또다른 비-중복 에피토프에 특이적인 다른 탐지자 항체 사이의 효소적 상호작용이 신호 생성/증폭을 초래한다 (참고, 도 1).
다중 약물 효과 분석: ~ 1×104 세포를 24-웰 플레이트에 플레이팅하고 적당한 성장 배지에서 성장시켰다. 라파티닙, cMET 저해인자 또는 이들 물질 둘다 (조합) 를 1 μM 농도로 4 시간 동안 첨가하고, 후속 경로 프로파일링을 위해 용해시켰다.
결과
도 4A 는 30 개의 GCA 세포주의 포괄적 발현/활성화 프로파일을 나타낸다. 도 4B 는 SNU5 세포주 경로 프로파일에 대한 예시적 면역어레이 이미지를 제공한다. 도면 4C-G 는 세포주 SNU5 (C), SNU484 (D), SNU1 (E), MKN45 (F), 및 KATOIII (G) 에 대한 기준선 경로 프로파일의 요약 및 약물 치료 후 그들의 조정을 제공한다. 활성화의 정도가 상이한 강도의 하이라이트로 구별된다.
결론
재발성 또는 전이성 GCA 의 치료법이 바이오마커의 질환-특이적 기능적 프로파일링에 기초하여 최적화되어, 환자-맞춤 치료 전략을 초래할 수 있다. 또한, 치료 동안 전달 경로 단백질의 변경의 발생빈도는 제한된 양의 종양 샘플 (예를 들어, FNA, CTC 등) 을 요구하는 CEER™ 플랫폼에 의해 용이하게 확인되어 임상의가 적절한 물질들을 조합하거나 순차배열하는 것을 더 양호하게 안내할 수 있다.
실시예 3. 티로신 인산화 프로파일링은 위암에서 수반 활성화되는 경로를 식별한다.
이 실시예에 제시된 연구는 위암이 이러한 암 유형에서 활성인 핵심성장 인자 수용체 신호전달 경로의 인산화 프로파일에 기초하여 구분될 수 있음을 설명한다.
요약
현재, 트라스투주맙은 전이성 위암의 ~20% 에서 유익한 유일하게 알려진 표적지향 요법이다. 이들 이질성 암에서 활성화된 RTK 에 대한 이해의 증가는 표적지향형 치료제 개발을 상당히 진전시킬 수 있다; 그러나, 그것은 임상 시편 중 인산화 네트워크를 조사하지 못하는 우리의 무능력에 의해 방해된다. 신규한 면역검정법, CEER™ 을 이용하여 우리는 진행암에서 절두된 HER2 변이체의 존재를 최초로 입증했다. 우리는 또한 재발성 위암의 무질환 생존 시간에 영향을 미치는 수반 활성화된 RTK 의 존재를 입증한다. 활성화된 RTK 의 계층적 군집화는 위암에서 활성화된 HER1:c-MET, HER2:HER3 및 IGF1R-PI3K 를 발현하는 샘플의 동시-군집화를 밝힌다. 세포 및 일차 종양 세포의 시험관내 연구는 차등 조절된 RTK 패턴이 치료적 표적화를 안내할 수 있음을 입증한다. 전체적으로, 우리의 연구는 위암에서 약물 개발 및 치료 모니터링에 큰 영향을 미친다.
중요성
HER2(+) 암의 아집합을 제외하면, 효과적 치료 접근법을 안내하는 분자 마커의 결여로 인해 대부분의 진행 위암에 대해 세계적으로 받아들여지는 치료 합의가 없다. 여기에서, 신규한 임상 진단 검정법을 사용하여, 우리는 434 개의 진행 단계 위암 샘플, 희귀 CTC 및 복수-유래 종양 세포에서 수반 활성화된 RTK 가 위암의 별개의 아집합을 구별하는 증거를 제시한다. 차등적 RTK 활성화 패턴은 수술후 무질환 생존기간과 상관관계를 갖는다. 위암 아형의 고유의 분자 동인에 대한 우리의 이해의 개선, 신규한 예후 마커, 치료 패러다임의 식별의 보조, 및 약물 투여 후 치료 반응 또는 질환 진행의 종적 모니터링을 포함하는, 임상 조직에 대한 직접적 표적지향형 인산화 분석의 결과는 중요하다.
서론
종양학 분야에서 분자 표적지향 요법 시대의 등장으로, 많은 종양학자들이 그렇지 않았다면 지지적 치료를 받았을 불응성, 전이성 암 환자에서 분자 표적지향제에 대한 예상 외의 극적 반응을 경험했다. 그러나, 표적지향형 치료제에 대한 환자 선별 기준은 현재 불완전하다. 그들의 표적 프로파일에 기초하여 선별된 환자라도 종종 표적화제에 반응하지 않거나 극적 초기 반응 후에 저항성을 발달시킨다. 표적지향제에 의한 치료 유익의 향상을 방해하는 주된 문제는 다음과 같다: (1) 환자의 아군에서 수반 및 중복 경로 활성화; (2) 경로 교차 대화를 통해 원래 표적화되었던 단백질(들)을 우회하는 대체 신호전달 사건이 활성화됨에 따른 저항성의 발달; (3) 항암 치료 과정 동안 암이 전이하고 진행함에 따른 분자 및 병리학적 특색의 변경; (4) 치료 동안 또는 후의 재-생검의 제한된 이용가능성; 및 (5) 잠재적 약물 저항 메카니즘을 확인하여 "진화하는" 질환을 다루는 표적지향형 약물용 동반 진단제의 제한.
인간 키놈 (kinome) 의 티로신 키나제 보체의 대략 절반이 인간 암에 연루되고, 암 치료를 위한 표적 뿐만 아니라 환자 선별을 위한 바이오마커를 제공한다 (Blume-Jensen and Hunter, 2001; Hochgrafe et al., 2010). 더욱이, 이전 연구들은 여러 암의 아집합 예컨대 다형성 교모세포종 (Stommel et al., 2007), 유방암 (Hochgrafe et al., 2010; Liu et al., 2011; Xu et al., 2011), 폐암 (Engelman and Janne, 2008; Engelman and Settleman, 2008), 두경부암 (Xu et al., 2011) 및 위암 (Liu et al., 2011) 에서 수용체 티로신 키나제 (RTK) 의 동시활성화를 밝혔다. 우리는 일단 표적 단백질이 마이크로어레이 상에 포획된 후 2 개의 탐지자 효소-접합된-항체의 동시-국소화를 요구하는 고유의 면역-복합체의 형성을 이용하는 근접-기반 면역검정법인, 합동 효소 증강 반응성-면역검정법 (도 5 에 제시된 바와 같은 CEER™) 을 개발했다. 이러한 검정 포맷은 우리가 RTK 및 하류 경로 단백질 발현 및 활성화를 단일 세포 수준까지 매우 민감한 방식으로 프로파일링할 수 있게 하고 (약 100 젭토몰의 민감도), 따라서 수반 경로 활성화 (또는 활성화 잠재성) 가 존재하는 중복 경로의 다중 분석에 적합하다.
위암은 전세계적인 암 사망의 선두적 원인으로서, 연간 발생빈도는 18.9/100,000, 연간 사망률은 14.7/100,000 이며 (Cunningham et al., 2005), 한국에서 가장 흔한 악성종양이다 (Bae and Park, 2002). 전이성 위암은 불량한 예후 때문에 의학 종양학자들에게 여전히 치료적 과제로 남아 있다. 현재, 트라스투주맙은 무작위 제 III 상 시험에서 위암에 효과적인 것으로 입증된 유일한 활성 표적지향제이다 (Bang, Y. J. et al., 2010). 위암에서 활성화되는 기타 알려진 경로 단백질은 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER) 패밀리, 간엽 상피 전이 인자 또는 간세포 성장 인자 (HGF) 수용체 (cMET), 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K), 및 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R) 를 포함한다. 따라서, 우리는 다중 CEER™ 플랫폼을 이용하여 434 개의 신선 동결 위암 조직 중 활성화된 RTK 의 수준을 확인했고, 위암 환자를 잠재적 아군 (HER1, HER2, HER2 의 절두된 변이체, p95HER2, HER3, cMET, PI3K, 및 IGF1R) 내로 분류하려고 시도했다. 그들의 경로 단백질 활성화 패턴에 기초하여, 우리는 종양의 아군에서 다중 신호 단백질 활성화를 관찰했고, 우리는 중복 경로 활성화 입력이 잔류 하류 신호전달을 초래하여, 단일 RTK 를 표적으로 삼는 단일요법의 항종양 효능을 제한한다는 가설을 세웠다. 우리는 cMET 및 HER 동시-활성화된 위암 세포주에서 HER1/2 저해인자 + cMET 저해인자의 항종양 효과를 조사하는 원리 증명 실험을 수행했다. 마지막으로, 우리는 임상의가 순환 종양 세포 및 복막액 (복수) 으로부터 단리된 악성 세포를 사용하여 치료 동안 RTK 활성화 프로파일의 기준선 및 진화적 변화를 모니터링할 수 있게 해주는 매우 강력한 도구를 개발했다. 종합하면, 우리의 연구는 위암 인간 조직 중 수반 RTK 활성화에 대한 증거를 제공하고, 치료 및 경과 동안 암이 진화함에 따른 RTK 활성화를 모니터링하는 임상 도구를 확립했다.
결과
환자 특성
분석에 포함된 434 명의 환자들의 특성이 표 1 에 제공되어 있다. 모든 환자가 위절제술과 D2 림프절 절제술을 받았다. 434 명의 환자 중, 242 (55.8%) 명의 환자가 부분 위절제술과 D2 림프절 절제술을 받았다. AJCC 2002 병기분류 시스템에 따르면, 86 명의 환자의 병기는 I 기, 116 명의 환자의 병기는 II 기, 126 명의 환자의 병기는 III 기, 106 명의 환자의 병기는 IV 기였다 (35 명의 환자는 전이성 M1 을 가졌다). 분석 시점에, 226 명의 환자가 사망했고, 237 명의 환자가 재발했다고 기록되었다. 병리의 경우, 70 명의 환자가 인환 세포 암종을 가졌다. 5-년 전체 생존률은 52.4% 였고, 5-년 무질환 생존률은 50.0% 였다. 모든 일차 위암 조직을 수술시 획득하여, 장래의 분자 분석을 위해 즉시 급속동결시켰다.
표 1: 위암 임상 샘플 집합의 환자 특성.
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위암은 HER2 및 그것의 절두된 변이체, p95HER2 를 발현함
화학요법과 조합된, HER2 표적화 항체인, 트라스투주맙의 우수한 효능은 위암에서 분자 표적지향 요법의 길을 열었다. 그러나, 면역조직화학 및 형광 원위치 혼성화에 의해 선별된 모든 HER2 발현 위암 환자가 이러한 치료에 반응하는 것은 아니며, 이는 예측성이 더 큰 바이오마커에 대한 필요를 강조한다. 우리는 434 명의 환자로부터 수득된 위암 시편에서 그것의 활성화된 상태를 포함하는 HER2 상태의 심층 분석을 수행했다.
우리의 위암 샘플 코호트의 HER2 상태를 IHC 점수가 2+ 인 그들 조직에 대한 표준 IHC HercepTest 에 뒤이은 FISH 분석에 의해 확인했다. 우리의 연구에서, FISH 에 의해 확인되는 HER2 유전자 증폭에 더하여 HER2 양성 (HER2(+)) 샘플은 HER2-IHC 점수가 3+ 또는 2+ 인 샘플로서 정의된다. HER2 음성 (HER2(-)) 샘플은 HER2 유전자 증폭이 없는 2+ HER2-IHC 점수를 갖는 시편 또는 1+/0 HER2-IHC 점수를 갖는 샘플을 포함한다. 위암에 특이적인 이들 정의에 기초하여 (Hofmann et al., 2008), 우리의 환자 코호트에서 434 명 중 50 명 (11.5%) 의 환자가 면역조직화학 및/또는 FISH 에 의해 HER2(+) 인 것으로 확인되었다 (표 2). 우리의 보고와 일치하게 (Grabsch et al., 2010; Hofmann et al., 2008; Tanner et al., 2005), HER2 발현은 로렌 (Lauren) 히스토타입에 따라 달랐으며, 미만형 또는 혼합형 위암에 비해 장형 암에서 더 많은 수의 HER2(+) 샘플 (50 중 36 (72%)) 이 관찰되었다. HER2 양성 환자 집단보다 명백히 더 낮은 수준에서이긴 하지만 대다수의 HER2 음성 샘플이 여전히 총 HER2 를 발현한다는 점에 유의하는 것이 중요하다 (도 6A). HER2(+) 위암 샘플이 유방암 HER2-IHC 에 특이적인 IHC 가이드라인을 사용하여 HER2 발현에 대해 재분석되었을 때, 78% (39/50) 가 여전히 3+ 또는 2+ 였지만, 나머지 22% (11/50) 는 1+ 로 채점되었다 (표 2).
면역조직화학 및 FISH 기술은 HER2 의 활성화된 상태에 대한 판독값을 제공하지 않고 낮은 HER2 발현을 놓칠 수 있으므로, 우리는 다음으로 이러한 환자 샘플 집합에서 면역-마이크로어레이 기반 CEER™ 검정법을 사용하여 총 및 인산화된 HER2 단백질의 발현 수준을 분석했다 (Kim et al., 2011) (도 5). 우리는 이전에 CEER™ 검정법에서 수득된 RFU 값을, HER2 발현 및 활성화가 알려진 세포주 대조군에 기초하는 표준 기능적 단위인, 산출된 단위 (CU) 로 변환시키기 위한 알고리즘을 개발했다 (Kim et al., 2011). 예상된 바와 같이, CEER™ 에 의해 HER2(-) 종양보다 IHC/FISH HER2(+) 종양에서 실질적으로 더 높은 HER2 발현 수준이 관찰되었으며, 이는 도 6A 에 나타나 있다 (평균 값 77.9 CU vs. 4.3 CU, p-값 8.18E-10). 더욱이, CEER™ 은, HER2 세포 분포 패턴의 초점성 또는 "무리성" 으로 인해 위암에서 빈번히 보고되어 온 특질인 (Hofmann et al., 2008), HER2(+) 종양 집단 내 HER2 발현의 유의한 수준의 이질성을 밝혔다. 이는 또한 HER2 에 대한 IHC 및 FISH 판독값 사이에 오직 중간 정도의 일치성 (ToGA 시험, 87.5%) 를 초래하여,위암용 HER2 진단법을 개발함에 있어서 복잡성을 야기한다. 우리의 분석에서, IHC/FISH HER2(+) 암의 64% (32/50) 가 또한 CEER™ 에 의해 HER2 발현을 보였다. 흥미롭게도, HER2(-) 암의 ~20% 가 또한 CEER™ 에 의해 HER2 발현에 대해 양성이었다. 특히, 우리는이전에 293 명의 유방암 환자에서 IHC 및 CEER™ 을 통해 HER2 발현을 비교했으며, 초기에 83% 일치성을 보였으나 (도 7), HER2 웨스턴 블롯 (WB)-기반 발현에 의한 IHC 판독값 조정 후, 비교는 CEER™ 및 WB-조정된 IHC 사이에 96% 일치성을 밝혔다 (Kim et al., 2011).
우리는 위암에서 대체 HER2 변이체의 존재를 탐구했다. HER2 과발현 유방암의 70-80% 에서 트라스투주맙 저항성에 관한 중요한 메카니즘 중 하나는, 세포외 트라스투주맙-결합 도메인을 결여하는 (Scaltriti et al., 2007), HER2 수용체의 절두된 형태인, p95HER2 의 축적이다. 우리는 위암에서 총 p95HER2 를 특이적으로 분석하는 고도로 민감성인 특이적 CEER™-기반 검정법을 개발했다. 이는 전장 HER2 의 면역-자기 고갈 후 절두된 HER2 변이체가 풍부해진 종양 조직 용해물 중에서 3중 항체 매개성 면역-미세검정법 플랫폼을 사용함으로써 달성되었다 (도 8). 총 p95HER2 검정법 판독값은 BT474 유방암 세포주로부터의 대조군 세포 용해물을 사용하여 생성된 표준 곡선으로부터 생성된 신호에 상대적인 것이었다. CEER™-기반 p95HER2 검정법 플랫폼을 사용하여, 위암에서 최초로 전장 HER2 에 더하여 HER2 의 절두된 형태가 특이적으로 탐지되었다. CEER™ 에 의해 탐지되는 유의한 전장 HER2 발현을 나타냈던 HER2(+) 군 (31 개 샘플) 및 HER2(-) 군 (27 개 샘플) 으로부터의 종양 샘플의 아집합에서 p95HER2 발현이 분석되었다. HER2(-) 군 중 하나의 샘플이 기술적 문제로 인해 정확히 분석될 수 없었다. 우리의 위암 환자 코호트에서 p95HER2 의 발생빈도는 HER2(+) 시편에서 대략 77% (31 개 중 24 개) 였다. 전장 HER2 발현과 유사하게, 절두된 HER2 발현의 대다수 (HER2(+) 에서 발현된 p95HER2 의 79%) 가 장형 위암에서 관찰되었다. 또한 IHC/FISH 에 의해 HER2(-) 였으나 유의한 CEER™-기반 HER2 발현을 보였던 종양의 적은 백분율 (2.6% 또는 10/384 전체) 에서도 p95HER2 발현이 탐지되었다. 이들은 p95HER2 에 대해 분석되었던 HER2(-) 샘플의 아집합의 ~37% (10/27) 를 차지했다. 그러나, HER2(+) 위암 샘플 중 p95HER2 의 평균 발현은 HER2(-) 샘플 중 관찰된 것보다 유의하게 더 높았다 (HER2(+) 에서 5083.6 CU vs HER2(-) 에서 437.0 CU, p-값=1.27e-05). 분석된 조직 20 ㎍ 당 500 CU 의 컷오프 값을 사용하여 p95HER2 양성에 대해 채점했다 (도 6B 에 나타냄). 종합하면, 우리의 데이타는 전장 및 절두된 HER2 발현 둘다의 포괄적 분석이 위암에서 HER2 표적화 전략의 추가의 발달을 위한 값에 가치를 제공함을 시사한다.
위암에서 경로 활성화 프로파일의 이질성: 동시활성화된 신호전달 경로
위암에서 HER2 및 그것의 절두된 동형의 존재를 확인하여, 우리는 약물 표적인 여러 신호전달 분자의 총 및 인산화된 (활성화된) 형태의 존재를 탐구했다. 이들은 HER 키나제 축의 RTK 일원 (HER1, HER2 및 HER3), c-MET, IGF1R 및 PI3K 을 포함했다. 다중 CEER™ 경로-어레이의 대표적 이미지가 도 9A 에 나타나 있다. 우리의 연구 패널에서, 202 명의 환자 (46.5%) 로부터의 종양은 우리의 연구 패널에서 시험된 RTK 의 활성화가 탐지가능하지 않았다. 반대로, 나머지 환자에 대한 경로 활성화 패턴은, 경로 군집화 분석에서 묘사된 바와 같이 (도 9B), 다중 RTK 예컨대 HER2/HER3, HER1/2/3, HER1/3/c-MET 또는 HER3/c-MET 의 수반 활성화를 나타내는 일부 위암에서는 크게 달랐지만, 다른 것들은 오직 단일 단백질 상에서만 인산화되었다. 모든 분석된 샘플의 종양 함량은 그들의 조직학적 검사에 기초하여 70% 이상이었다. 그러나, pan-사이토케라틴 발현은 명백히 가변적이며, 이는 위암의 상피 함량의 이질성을 시사한다. 이러한 프로파일링에 기초하여, 우리는 434 개의 위암 샘플 코호트를 그들의 RTK 활성화 서명 및 HER2 상태에 따라 분류했다.
위암에서 HER 축 (표 3): 우리가 분석한 모든 RTK 중에서, 우리는 우리의 데이타 집합 내 위암 샘플의 41% 에서 HER 축의 하나 이상의 수용체 일원이 활성화되었음을 발견했다. 대략 HER2(+) 암의 66% 및 HER2(-) 암의 ~38% 가 HER 키나제 수용체 일원의 활성화를 나타냈다. 게다가, 활성화된 HER 키나제 수용체가 존재하는 샘플의 ~36% 는 c-MET 또는 IGF1R 경로의 수반 활성화를 나타내지 않았다. HER2 및 HER3 는, HER2(-) 암에서는 각각 ~22% 및 ~24% 샘플에서 활성화되었던 것과 비교되게, HER2(+) 위암 환자에서는 더 높은 백분율 (50% 및 36%) 로 인산화되었다. 인산화된 HER1 은 HER2 양성 암에 대한 그러한 선호도를 갖는 것으로 보이지 않았고, HER2 양성 및 음성 위암 둘다에서 동등하게 활성화되었다 (HER2(+) 에서 26% 및 HER2(-) 에서 25%). 조직학적으로, 대다수의 HER2 양성, 장형 위암이 활성화된 HER2 (22/36 또는 ~61%) 에 뒤이어 HER3 (13/36 또는 ~36%) 을 발현했으며, 전체적으로 장형 위암의 36% 가 활성화된 HER2 경로를 발현했다. 일반적으로, HER2 활성화는 미만형 암 (19.1%) 에 비해 장형 (35.7%) 및 혼합형 암 (33.3%) 에서 더욱 집중되었다. 대조적으로, 활성화된 HER1 은 주로 장형 (24.7%) 및 미만형 (25.8%) 위암에서 관찰되었다. 활성화된 HER3 은 모든 3 가지 위암 히스토타입 중에서 동등하게 발현되었다.
HER 키나제 축의 신호전달 기능은 활성화된 수용체 이합체화에 의존적이므로, 우리는 다양한 쌍의 활성화된 HER 일원을 검토했다. HER2 와 HER3 의 동시-활성화가 HER2 양성 암에서 선호되었으며 (13/50 또는 26%), 7/13 HER2:HER3 활성화된 샘플에서 HER1 동시-활성화가 부재했다. 다른 한편으로는, HER2 음성 위암은 임의의 특정 HER 키나제 이합체 쌍에 대한 선호도를 보이지 않았으며, 모든 3 가지 가능한 활성화된 이합체 쌍 (HER1:HER2, HER1:HER3 및 HER2:HER3) 이 각각 HER2(-) 샘플의 ~15% 에서 발현되었다. HER1/2/3 수용체의 삼중 활성화가 위암의 11.5% 에서 관찰되었으며, HER2(+) 및 HER2(-) 암 사이에 유사한 분포가 존재했다.
우리는 또한 샘플 중 p95HER2 발현과 관련하여 활성화된 HER 축 수용체 일원의 상태를 검토했다. p95HER2(+), HER2(+) 위암은 활성화된 HER1 (p95HER2(+),HER2(+) 의 5/24 또는 ~21% 에서 발현됨) 또는 활성화된 HER3 (p95HER2(+),HER2(+) 의 9/24 또는 ~37% 에서 발현됨) 에 비해 활성화된 전장 HER2 (p95HER2(+), HER2(+) 의 16/24 또는 ~67% 에서 발현됨) 에 대한 선호도를 가졌다. 그러나, p95HER2(+), HER2(-) 위암은 그러한 선호도를 갖지 않았으며 p95HER2(+), HER2(-) 샘플의 50% (5/10) 가 모든 3 가지 HER 키나제 축 수용체 일원의 활성화를 보였다.
c-MET 활성화된 위암 (표 4): HER1 과 유사하게, c-MET 의 인산화는 HER2(+) (22%) 및 HER2(-) (25%) 위암 사이에서 동등하게 분포되었다. 게다가, 로렌 히스토타입에 기초하는 활성화된 c-MET 분포는 장형 (31.2%) 및 미만형 (24.4%) 위암에서 유사했다. 혼합형 위암 중 어느 것도 우리의 샘플 집합에서 활성화된 c-MET 의 존재를 보이지 않았다.
대다수의 c-MET 활성화된 위암 샘플 (~71% 또는 77/108) 이 HER 키나제 수용체 일원의 수반 활성화를 보였다. 그러므로, 우리는 위암에서 c-MET 경로와 교차대화하는 바람직한 HER 축 수용체를 추가로 연구했다. 활성화된 c-MET 및 p95HER2 발현이 각각 5/24 및 1/10 p95HER2 발현, HER2(+) 및 HER2(-) 샘플에서 동시-존재했다. 전체, c-MET 는 HER2 (10.1%) 또는 HER3 (9.7%) 에 비해 HER1 (66/434 또는 15.2% 에서) 와 함께 우선적으로 동시-활성화되었다. 동일한 경향이 HER2(-) 위암에서 관찰되었으며, 이 경우 암의 15.4% 가 c-MET-HER1 동시-활성화를 나타냈다. 사실, c-MET-HER1 동시-활성화가 존재하는 위암의 13/66 은 HER2 또는 HER3 의 동시-활성화를 나타내지 않았다. 이들 관찰은 위암에서 c-MET 및 HER1 신호전달 경로 사이의 가능한 교차대화를 시사한다. 동일한 샘플에서 HER1 및/또는 HER2 가 또한 인산화되지 않는 한, c-MET 활성화는 절대로 HER3 활성화와 동시-존재하지 않는다. 위암 샘플의 대략 7% 가 모든 3 가지 HER 축 수용체 일원과 c-MET 의 동시-활성화를 나타냈다.
IGF1R 활성화된 위암 (표 5): HER3 활성화와 유사하게, IGF1 수용체에 의해 추진되는 신호전달 경로는 HER2(-) 암 (24.5%) 에 비해 더 높은 백분율의 HER2(+) 암 (30%) 에서 활성이었다. 게다가, 인산화된 HER3 에 대해 관찰되는 바와 같이, 활성화된 IGF1R 은 3 가지 조직학적 위암 아형 중에서 동등하게 분포되었다; 즉, 장형 암의 26%, 미만형 위암의 24% 및 혼합형 위암의 28%. 이러한 분포는 우리로 하여금 우리의 샘플 집합에서 IGF1R-HER3 동시-활성화가 존재했는지 여부를 조사하게 했다. IGF1R 는 실제로 특히 HER2(+) 암에서 포스포-HER3 와 함께 최대로 동시-활성화되었으며, 22% 또는 11/50 HER2(+) 샘플이 IGF1R-HER3 동시-활성화를 보였다. 그러나, HER2(-) 암에서는, IGF1R 과 HER3 의 동시-활성화의 백분율 (51/384 샘플 또는 13.8% 에서) 은 IGF1R 과 HER1 의 동시-활성화 (53/384 샘플 또는 13.3% 에서) 와 유사했다. IGF1R:HER2 동시-활성화 (45/384 샘플 또는 11.7% 에서) 가 바짝 뒤따랐다. 전체적으로, 34/434 위암 샘플이 HER 키나제 축의 모든 일원과 IGF1R 의 동시-활성화를 나타냈으며, 그 중 28 개의 샘플이 c-MET 동시-활성화를 또한 나타냈다. 그러나, c-MET 는 HER 키나제 수용체 일원 동시-활성화의 부재시 IGF1R 과 드물게 동시-활성화되었다. 게다가, c-MET:IGF1R 동시-활성화는 주로 HER2(-) 위암에서 관찰되었다. 적은 수의 p95HER2(+) 샘플이 IGF1R 활성화를 나타냈다 (7/24 HER2(+) 샘플 및 3/10 HER2(-) 샘플).
이러한 연구에서 평가된 마커 6 개의 십분위수-기반 활성화 프로파일에 기초하여 위암 샘플이 히트맵 내로 군집화되었다. 군집화 분석을 수행하여 앞서 언급된 위암에서의 RTK 활성화 상관관계 패턴을 확인했다 (도 9B). 분석은 c-MET:pHER1, pHER2:pHER3 및 IGF1R:PI3K 활성화 패턴이 우리의 샘플 집합에서 구별되는 아집합을 형성하는 c-MET-pHER1 군집과 밀접하게 상관관계를 가짐을 입증했다. 이는 우리가 이전에 관찰했던 RTK 동시-활성화 패턴과 일치했다. 이들 분석된 RTK 예컨대 PI3K 의 하류에 상주하는 신호전달 경로의 추가의 분석은 선별되지 않은 위암 집단에서, PI3K 활성이 IGF1R 동시-활성화 (77/108 샘플 또는 71.3%) 에 뒤이어 HER3 동시-활성화 (71/108 샘플 또는 65.7%) 와 함께 최대로 관찰되었음을 밝혔다. 이는 군집화 분석 및 보고된 연구와 일치하여, CEER™ 검정법의 타당성을 추가로 강화시킨다.
요약하면, 인산화된 HER 키나제 축 수용체 일원, c-MET 및 IGF1R 에 대한 우리의 포괄적 분석은, 위암이 분석된 RTK 의 활성에 관해 유의하게 이질성이고, 실제로 그들의 RTK 활성화 프로파일에 기초하여 구별되는 서브클래스 내로 분류될 수 있음을 밝혔다. 더욱이, 위암에서 수반 신호전달 경로는 임의의 하나의 신호보다 고도로 우세했다. 그러한 분자 분류는 위암 아형에 대한 진단적 및 치료적 연구를 안내하는 것을 도울 수 있다.
CEER™-기반 경로 활성화 프로파일에 기초하는 샘플 분류는 수술후 무질환 생존과 상관관계를 가짐
우리는 위암의 임상 예후에 대한 CEER™-기반 인산화 프로파일링의 영향을 조사했다. 환자를 수술 시점에 수득된 그들의 종양 샘플의 신호전달 경로 활성화 프로파일에 기초하여 그룹 내로 분류한 후, 치유적 수술 후 무질환 환자 생존률을 분석했다. 처음에, 우리는 HER2(+) 종양을 갖는 환자와 HER2(-) 종양을 갖는 환자 사이에 무질환 생존기간 차이를 분석했다. HER2(+) 종양은 대부분이 항-HER2 요법에 명백히 반응하는 장형 히스토타입이었다. 그러므로, 우리는 HER2(+) 종양의 재발 횟수가 HER2(-) 위암의 재발 횟수와 다른지 여부를 조사했다. 그러나, 샘플이 그들의 종양 시기에 대해 조정된 후에도 그러한 차이가 관찰되지 않았다. 직관적으로 예상되는 바와 같이, 위암 환자의 중앙 무질환 생존 기간은, HER2(+) 및 HER2(-) 종양 둘다에서, 종양 시기가 I 기에서 IV 기로 증가함에 따라 점진적으로 감소했다.
오직 HER2(+) 및 HER2(-) 위암 둘다의 아집합만이 우리의 연구에서 분석된 RTK 의 활성화를 보였으므로, 우리는 활성화된 RTK 가 이들 종양의 진행에 영향을 미칠 수 있다고 추론했다. 그러므로, 우리는 CEER™ 검정법에 의해 확인되는 RTK 활성화가 부재하는 환자와 1≥ RTK 활성화가 존재하는 환자 사이의 생존률 차이를 분석했다. 종양 시기가 또한 고려되기 전까지는 두 그룹 사이에 생존률의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. I 기 질환을 갖는 GCA 환자는 전형적으로 치유적 외과 절제술로부터 극도의 유익을 보이지만 IV 기 질환을 갖는 환자는 완화적 치료 옵션에 제한되므로, 우리는 RTK 활성화의 정도가 II 및 III 기 질환을 갖는 환자의 임상 결과에 임의의 영향을 갖는지 여부를 조사하려고 시도했다. 일단 샘플이 그들의 종양 시기에 기초하여 분류되면, 1≥ RTK 활성화가 존재하는 II 및 III 기 환자가 분석된 RTK 중 어느 것도 활성화되지 않았던 경우보다 더 나쁜 무진행 생존기간을 보였음이 명백했다. 종양 II+III 기 및 1≥ RTK 활성화가 존재하는 환자의 중앙 생존기간은 0 RTK 활성화가 존재하는 환자보다 유의하게 더 낮았다 (도 10A; 종양 II+III 기: 1≥ RTK 활성화의 경우 32.63 개월 vs 0 RTK 활성화의 경우 76.53 개월 (p=0.0318, 위험 비율=0.69)). 중앙 생존기간의 유의한 차이가 HER2(-) 유일 샘플에서도 유지되었다 (도 10B; 종양 II+III 기: 1≥ RTK 활성화의 경우 30.10 개월 vs 0 RTK 활성화의 경우 68.13 개월 (p=0.0190, 위험 비율=0.64)). 이들 데이타는 이러한 연구에서 분석된 RTK 가, 다양한 조합으로, 위암의 무질환 생존기간에 영향을 미침을 명백히 시사한다. 이러한 분석으로부터의 중요한 관찰은 치유적 수술 후 환자의 무질환 생존기간에 기여하는 것이 단순히 RTK 의 발현 상태가 아니고 RTK 의 활성화된 상태라는 점이다. 도 9A 로부터 명백한 바와 같이, 다수의 위암 샘플이 다양한 RTK 를 높은 수준으로 발현하지만, 대부분의 샘플에서 오직 RTK 의 아집합만 인산화되거나 어느 것도 인산화되지 않는다. 생존률 분석을 위해, 오직 유의한 RTK 활성화가 존재하는 샘플만 분석했다.
무진행 생존기간에 대한 개별 RTK 의 기여를 탐구하려는 노력으로, 우리는 HER1 및 c-MET 활성화된 위암 샘플에 집중했다. 이들 RTK 에 초점을 맞추는 이유는 여러 가지이다. c-MET 는 상당한 수의 위암에서 유전자 증폭된다; 그러나, 단일 물질 항-MET 저해인자는 이들 암에서 임상 유익을 입증하는데 실패했다 (Jhawer et al., 2008). 다른 연구들은 위암의 전임상 모델에서 c-MET 및 HER1 조합 요법의 우수한 효능을 보고했다 (Corso et al., 2010). 위암 임상 시편의 우리 자신의 CEER™-기반 분석에서, 우리는 그러한 샘플의 동시-군집화 (co-clustering) 를 포함하여 c-MET 및 HER1 의 동시-활성화를 관찰했다. 이는 p-HER1:p-cMET 동시-발현 위암 샘플에서의 전체적 신호전달 특성이 활성화된 HER1 이 부재하면서 p-cMET 를 발현하는 샘플과 명백히 상이할 수 있음을 시사한다. 우리는 p-HER1(-):p-cMET(+) 및 p-HER1(+):p-cMET(+) 샘플 집합에서 무진행 생존기간을 비교했다. 전체 위암 샘플 집합에서 이들 코호트의 중앙 생존기간에 유의한 차이가 존재했다 (도 11; p-HER1(+):p-cMET(+) 의 경우 46.17 개월 vs p-HER1(-):p-cMET(+) 의 경우 82.80 개월 (p=0.0184, 위험 비율=0.51). 유사한 결과가 HER2(-) 유일 샘플에서 관찰되었다 (도 10C). 그 후, 종양 시기-조정된 HER2(-) 샘플 집합에서 p-HER1(-):p-cMET(+) 및 p-HER1(+):p-cMET(+) 코호트를 분석했다. I 기 위암은 상이한 RTK 활성화 상태가 존재하는 환자에 대한 수술후 무질환 생존기간에서 유의한 차이를 보였지만, p-cMET(+) I 기 위암은 HER1 동시활성화된 아형에서 유의한 차이를 나타냈다. cMET 및 HER1 의 동시-활성화는 cMET 활성화만 존재하는 I 기 환자와 비교할 때 더 나쁜 무질환 생존기간을 보였다 (도 10D). 우리의 데이타는 p-HER1(+):p-cMET(+) 위암 샘플이 더 불량한 예후를 갖고, 신호전달 경로 특성을 시기-특이적 방식으로 확인하여 그러한 환자를 위한 치료 옵션을 결정하는 것이 가치 있음을 강하게 시사한다. I 기 질환을 갖는 위암 환자는 경로 활성화 상태에 기초하여 추가로 특성분석되어, 수술 후 더욱 적극적인 보조 치료에 대한 후보를 식별할 필요가 있다.
치료적 표적화는 위암 모델 시스템에서의 RTK 프로파일에 기초하여 안내될 수 있음
CEER™ 검정법을 사용하여, 우리는 16 개 초과의 위암 세포주를 그들의 RTK 활성화 프로파일에 기초하여 분류했고, 데이타는 위암 조직에서 관찰된 것과 일치했다 (Hoe et al., 2011). 몇몇 그러한 모델에 대한 데이타가 제시되어 있다. MET-증폭된 위암 세포인, SNU5 및 SNU484 는 주목할 만한 수준의 HER1 및 c-MET 단백질을 동시-발현하는 것으로 식별되었다. 그러나, 인산화 프로파일링은 이들 세포 내에서 pMET 에 더하여 pHER1 및 pHER2 의 발현도 입증했으며, 이는 이전에 위암 임상 시편의 아집합에서 관찰된 바와 같다. HER2 증폭된 위암 세포로서 잘 알려져 있는, NCI-87 (N87) 세포는 분석된 포스포-RTK 패널 내에서 오직 pHER2 의 발현을 나타냈다. 도 12 에 나타난 바와 같이 FGFR2-증폭된 KATO III 세포는 낮은 수준의 pHER1, pHER2, pHER3 및 pMET 단백질을 보였다.
이질적 RTK 활성화 패턴이 위암 모델 시스템에 존재하고 위암 환자의 아집합에도 존재한다는 관찰에 기초하여, 우리는 이러한 정보를 이용하여 장래에 위암의 치료 결정을 지도할 수 있다는 가설을 세웠다. 그러므로, 우리는 이중-HER1/2 티로신 키나제 저해인자 (TKI), 라파티닙, 및 MET 저해인자, PHA-665,752 및 포레티닙을 사용하여 "개념 증명" 실험을 수행했다. 도 12 에 나타나는 바와 같이, 라파티닙은 NCI-87 세포에서 총 HER2 수준을 변화시키기 않으면서 HER2 활성화를 폐지했으나, MET-증폭된 SNU5 또는 SNU484 세포에서는 그럴 수 없었다. 다른 한편으로는, MET 저해인자는 SNU5 및 SNU484 세포에서 pMET 를 폐지했다. 흥미롭게도, MET 저해가 존재하는 MET-증폭된 세포에서 pHER1 및 pHER2 도 또한 부분적으로 차단되었으나, 유의한 MET 활성을 전혀 나타내지 않는 NCI-87 세포에서는 그렇지 않았다. 이는 MET-증폭된 위암에서 MET 및 HER-키나제 신호전달 경로가 연결되어 있을 수 있음을 시사했다. 게다가, MET-증폭된 SNU5 및 SNU484 세포에서 4 시간 동안의 라파티닙 및 포레티닙에 의한 조합 치료는, 하류 신호전달 효과기인 PI3K 및 Shc 의 활성을 포함하여, HER 키나제 및 MET 키나제 활성을 완전히 차단했다. 이는 그러한 위암에서 조합 치료 접근법이 더욱 유익할 수 있음을 시사한다.
암 세포 성장 저해에 대한 경로 저해의 표현형 효과를 조사하기 위해, 우리는 각각의 치료적 치료법을 사용하여 세포독성 검정을 수행했다. RTK 프로파일링 데이타와 일치하게, c-MET 증폭된 SNU5 세포에서 라파티닙에 대한 IC50 은 > 1.0 μM/L 였지만, PHA665,752 에 대한 IC50 은 0.058 μM/L 로 2 배 더 낮았다. 그러나, 라파티닙 + PHA665,752 조합에 대한 IC50 은 0.018 μM/L 로 훨씬 더 낮았으며, 이는 조합 치료에 의한 HER 키나제 및 MET 신호전달 경로의 최대 차단과 일치했다 (p= 0.01). 이들 실험은 이러한 부류의 위암에서 단일 작용제 요법이 아니라 HER 및 MET 키나제의 조합된 저해가 더욱 유익할 수 있음을 시사한다. 이와 대조적으로, 표적지향형 치료제의 존재시 신호전달 경로의 불완전 저해를 보였던, KATO III 세포는 단일 또는 조합 약물 치료 둘다에 의해 최소 세포 성장 저해 (IC50 > 1.0 μM/L) 를 보였다. 종합하면, 전임상 모델에서의 이들 연구는 CEER™ 플랫폼이 위암에서 다중 RTK 활성화의 상태를 동시에 조사할 수 있고, 그 후 이것을 사용하여 치료 결과를 선별하고 모니터링할 수 있음을 명백히 입증한다.
위암 환자에서 RTK 프로파일을 연구함에 있어서 CTC 및 ATC 의 유용성의 조사
위암 전임상 모델에서 입증된 바와 같이, CEER™ 기술에 의해 확인되는 RTK 활성화의 패턴을 사용하여 치료 결정을 안내하고 치료 반응을 모니터링할 수 있다. 그러나, 분자 변경을 모니터링하는 추적 (follow-up) 종양 생검이 임상에서 언제나 이용가능한 것은 아니다. 그러므로, 우리는 더욱 용이하게 입수가능한 순환 종양 세포 (CTC) 및 복수 종양 세포 (ATC) 를 사용하는 RTK 평가 플랫폼을 설치하려고 시도했다. 환자 1 명 당 CTC 의 수는 CEER™ 검정법에 의해 밝혀진 CK 의 다양한 수준으로 보여지는 바와 같이 광범위하게 다르며, 그러한 환자 4 명으로부터의 결과가 도 13A 에 제시되어 있다. 오직 HER1 및 HER2 발현 및 활성화만 제시되어 있지만, 우리는 전이성 위암 환자로부터 단리된 CTC 에서 다른 RTK 활성화의 이질적 패턴을 관찰했다. 또한, 우리는 위암에서 비침윤성 암 세포의 또다른 공급원인 복수액으로부터 악성 세포를 성공적으로 단리했다. 복수액의 배액 100 ㎖ 에서, 혈액 7.5 ㎖ 중 CTC 의 전형적 수율보다 몇 배 더 많은 수의 종양 세포가 발견되었다 (> 1 × 103 ~ 1 × 104). 위암 CTC 에서 밝혀진 바와 같은 이질적 RTK 활성화 패턴이 위암 환자로부터 단리된 ATC 에서도 발견되었다.
다음으로, 우리는 이들 종양 세포 (CTC 및 ATC) 에서 신호전달 경로가 리간드 및/또는 약물 교란 (perturbation) 에 반응성일지 여부를 확인했다. 이는 비침습 암의 지표일 수 있는 CTC/ATC 에서의 신호전달 경로의 기능성 및 약물 반응성에 관해 귀중한 정보를 잠재적으로 제공할 수 있을 것이다. 라파티닙 및 c-MET 저해인자의 조합에 의한 치료 후, 위암 환자로부터 단리된 CTC 에서 인산화된 HER1, HER2 및 c-MET 의 용량 의존적 저해가 나타났다. 대표적 예가 도 13B 에 제시되어 있다. CTC 의 이러한 특정 집합에서, 저해인자 치료 후 우리는 또한 IGF1R 의 수반 활성화도 관찰했다. 이러한 현상의 정확한 메카니즘 및 이것이 위암에서도 발생하는지 여부는 현 시점에서 알려져 있지 않다. 그 후, EpCAM-양성 ATC 를 4 시간 동안 37℃ 에서 라파티닙 및 PHA-665,752 칵테일의 존재 또는 부재 하에 성장 인자 (EGF, HRG, HGF 및 IGF1) 의 칵테일로 처리했다. 플랫폼을 여러 상이한 ATC 단리물에 대해 시험했다. 구별되는 활성화된 경로를 나타냈던 3 명의 상이한 위암 환자로부터 단리된 ATC 의 대표적 예가 제시되어 있다 (도 13C-E). 유의한 수준의 p-HER1, p-HER2 뿐만 아니라 p-cMET 가 ATC 의 모든 3 개의 집합에서 관찰되었으며, 이는 라파티닙 및 PHA-665,752 의 조합이 이들 특정 환자에게 유익할 수 있음을 시사한다. 실제로 표적지향형 치료제의 이러한 조합은 비록 다양한 정도로이기는 하나 이들 3 가지 표적의 인산화를 감소시킬 수 있었다. 이러한 약물 조합이 실제로 그러한 환자에게 임상 유익을 초래할지 여부는 지켜봐야 한다. 그러나, ATC 중 다른 활성화된 RTK 의 프로파일링은 일부 샘플에서 저해인자 칵테일로 효율적으로 저해될 수 없었던 HER3 및 IGF1R 가 또한 다양한 수준으로 활성화되었음을 시사했다. 이들 활성화된 RTK 가 시험된 치료법의 결과에 영향을 미칠 수 있을 것이다. 사실, 1 명의 환자 (005-116) 가 저해인자 치료에 의해 p-IGF1R 의 증가를 보였다. 유사하게, 활성화된 RTK 의 하류에 있는 신호전달 분자 (PI3K, SHC, Erk 및 AKT) 의 분석은 리간드 및 약물 치료 후 그들의 활성화 및 저해 프로파일의 면에서 이질성을 밝혔다. 우리의 데이타는 위암 환자에서 치료적 치료 전에 및 후에 신호전달 경로의 평가를 위한 비-침습적 플랫폼을 명백히 입증한다.
검토
이러한 연구에서, 우리는 위암이 이러한 암 유형에서 활성인 핵심 성장 인자 수용체 신호전달 경로의 인산화 프로파일에 기초하여 구분될 수 있다는 증거를 제공한다. 위암은 재발 및 화학요법에 대한 반응의 면에서 예후가 광범위한 극도의 이질성 질환이다. 이질성은 병리조직학적 (Lauren, 1965), 해부학적 (Blot et al., 1991; Crew and Neugut, 2006) 및 역학적 (Carneiro et al., 2004; Correa et al., 1990; Uemura et al., 2001; You et al., 1993) 구분을 포함하여 여러 수준에서 인식된다. 최근에 위암을 그것의 유전자 발현 서명에 기초하여 추가로 분류하려는 노력이 시작되었다 (Ooi et al., 2009; Shah et al., 2011; Tay et al., 2003). 우리의 연구는 이러한 암 유형에서 표적지향형 치료제의 선별 및 결과에 직접 영향을 미치는 신호전달 경로 활성화 프로파일에 기초하여 위암에서 또다른 수준의 이질성을 식별한다.
제한된 양의 임상 조직에 작용함에도 불구하고 다중 RTK 의 활성화 패턴을 채점하고 구별하기에 충분히 민감성인 용이하게 사용가능한 임상 검정법의 결여로 인해 임상 샘플의 표적지향 인산화 분석이 방해되었다. 이러한 연구에서, 우리는, 여러 단백질의 총 및 인산화된 형태를 특이적으로 분석하도록 다중화될 수 있는, 고도로 민감성인 신규한 면역검정법인 CEER™ 을 급속 냉동된 위암 임상 샘플에 직접 사용했다. 우리는 위암 환자의 ~53% 가 HER1, HER2, HER3, c-MET 및 IGF1R 분자 중에서 하나 이상의 활성화된 RTK 를 가짐을 입증했다. 이러한 연구에서 분석된 RTK 중에서, HER 패밀리 일원이 가장 빈번히 활성화된 티로신 키나제였다. HER 패밀리 일원의 발현은 이전에 위암에서의 종양 진행 및 불량한 예후와 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다 (Allgayer et al., 2000; Garcia et al., 2003; Hayashi et al., 2008); 그러나, 우리의 연구는 그들의 활성화 프로파일의 첫번째 입증이다. 활성화된 HER 키나제 일원이 존재하는 여러 위암은 다른 분석된 RTK 패밀리 일원의 활성화를 나타내지 않았지만, c-MET 활성화된 암은 거의 항상 HER 및/또는 IGF1R 의 동시-활성화를 나타냈다. 군집화 분석은 HER2 활성화된 위암이 HER3 활성화된 위암과 같은 그룹이고, c-MET 활성화된 위암이 HER1 활성화된 위암과 같은 그룹이고, IGF1R 활성화된 위암이 PI3K 활성화된 위암과 가장 가까웠음을 밝혔다. RTK 인산화 프로파일은 종양의 로렌 히스토타입 및 HER2 상태에 기초하여 분류되었다. 유전자 발현 프로파일의 차이에 기초하여, 최근의 연구 (Shah et al., 2011) 는 위암을 "근위 비-미만형", "미만형", 및 "원위 비-미만형" 으로 분류했으며, 이들 구분이 현재 위암의 임상 관리에 상당한 영향을 미칠 수 있다고 시사했다. 그들의 활성 키나제 프로파일에 기초하여 이들 위암 아형의 구별되는 생명작용에 대한 새로운 통찰을 제공하는 것 외에도, 위암의 조직병리와 일치하는 특이적 RTK 활성화 패턴의 확인은 이제 이용가능한 약물 후보의 가설-구동 치료 시험을 허용할 수 있다.
우리의 분석으로부터 현저한 관찰은 상당한 수의 위암 (HER2 양성의 48% 및 HER2 음성의 ~32%) 이 단일 활성 RTK 를 갖지 않고, 오히려 수반 활성화된 RTK 의 네트워크에 의해 추진된다는 점이다. 이러한 발견은 위암이 개별 표적지향 치료제에 저항성을 나타낼 수 있고, 위암의 그러한 아집합에서 표적지향제의 조합이 더욱 효과적일 수 있음을 시사하므로 약물 개발에 큰 영향을 미친다. 실제로, 선별되지 않은 위암 환자에서의 포레티닙 (XL-880) 단일요법의 제 II 상 시험은 목적 반응을 입증하는데 실패했고 (Jhawer et al., 2008), 트라스투주맙 활성은 오직 HER2(+) 위암 환자의 아집합에서만 관찰된다. 우리가 아는 바, 우리의 연구는 위암 임상 샘플 중 다중 RTK 경로 활성화의 첫번째 입증이다. 이전에 교모세포종 (Stommel et al., 2007) 및 유방암 (Hochgrafe et al., 2010) 에서 유사한 관찰이 보고되었으며, 그들의 RTK 활성화 프로파일에 의해 안내되는 조합 치료가 단일 작용제 치료보다 우수했다. 우리는 HER2 음성 위암에서 cMET/HER1 인산화가 밀접하게 연관되고, 그러한 위암 환자가 유의하게 더 불량한 생존률을 가짐을 확인했다. c-MET 및 HER1 축 사이의 교차 대화가 위암 및 폐 암 세포주에서 보고되었다 (Engelman et al., 2007; Liu et al., 2011). 최근의 연구는 위암에서 HER 키나제 신호전달이 cMET 저해에 대한 저항성을 촉진하고, 2 개의 신호전달 패밀리의 동시 차단이 더욱 유익할 수 있다고 보고한다 (Corso et al., 2010; Liu et al., 2011). 우리의 결과는 HER1 및 cMET 의 조합 치료적 저해가 어느 하나의 표적에 대한 단일요법보다 HER1/MET 동시활성화된 세포에서 더욱 효과적인 항종양 활성을 가짐을 입증한다.
HER2 단백질을 과발현하는 유방암에서 트라스투주맙 활성이 보인다. 이러한 발견은 현재 위암에까지 확장되었고, 트라스투주맙은 HER2(+) 진행 위암의 치료에 대해 FDA 승인되었다 (Bang et al., 2010). 사실, 트라스투주맙은 위암에서 생존률 유익을 나타내는 유일한 표적지향 요법이다. 그러나, 최근의 ToGA 시험 결과로부터, 트라스투주맙 + 표준 화학요법이 HER2(+) 위암에서 47% 의 전체 반응률을 초래하므로 트라스투주맙이 모든 HER2(+) 위암 환자에게 유익한 것은 아니라는 것이 명백하다. 우리의 현재의 CEER™-기반 분석은 이러한 비-반응에 대한 이유를 적어도 4 개 제공하고, 그들의 활성 상태를 포함하는 다중 마커의 채점이 표적지향형 치료제에 대한 반응을 예측함에 있어서 더욱 유익할 수 있음을 시사한다. 트라스투주맙 비-반응에 대한 하나의 가능성은 CEER™ 검정법에 의해 입증되는 바와 같은 위암에서의 HER2 발현의 고도의 이질성이며, 이는 효율적인 HER2 진단법을 개발함에 있어서 복잡성의 원인이 된다. 유방암 가이드라인과 구별되는 위암에 관한 IHC/FISH-HER2 채점 기준이 규정되었지만, 그들은 여전히 모든 위암에서의 이질적인 HER2 상태를 효율적으로 포착할 수 없고, 항-HER2 반응자를 정확히 예측하기에 충분하지 않을 수 있다. 둘째로, CEER™ 분석에 의해 밝혀진 바와 같이 HER2(+) 위암의 오직 50% 만이 인산화된 HER2 를 발현한다. 활성 HER2 경로의 부재는 HER2 신호전달이 모든 HER2(+) 위암에서 종양 생존률에 유의하게 기여하는 것은 아닐 수 있음을 시사한다; 그러므로, 그것의 트라스투주맙에 의한 저해는 측정가능한 종양 저해를 초래하지 않을 것이다. 셋째로, 우리가 각각 HER2(+) 위암의 26%, 36%, 22% 및 30% 에서 활성임을 입증한 HER1, HER3, c-MET 및 IGF1R 에 의해 추진되는 것과 같은 신호전달 경로는 트라스투주맙에 대한 저항성을 촉진하는 대체 종양 생존 신호를 제공할 수 있다. 유방암에서 HER2:HER3 이종이합체가 트라스투주맙에 의해 효율적으로 차단될 수 없고 (Agus et al., 2002; Cho et al., 2003; Ghosh et al., 2011), IGF1R 신호전달이 트라스투주맙 저항성을 촉진한다고 알려져 있다 (Huang et al., 2010; Nahta et al., 2005). 더욱이, 위암 이종이식 모델에서의 최근의 전임상 증거 (Yamashita-Kashima et al., 2011) 는 HER2(+) 모델에서 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합 치료가 부분적으로 HER2:HER3 이종이합체 신호전달의 효율적 저해로 인해 트라스투주맙 단독보다 우수함을 입증한다. 마지막으로, 근접-기반 CEER™면역검정법을 사용하는 우리의 연구는 HER2(+) 위암의 46% 에서 HER2 의 절두된 카르복시-말단 조각인 p95HER2 의 존재를 입증하며, 이는 또한 위암에서의 트라스투주맙 저항성의 원인일 수 있다. 유방암에서 p95HER2 는 더 나쁜 예후 (Saez et al., 2006) 및 더 높은 전이 성향 (Molina et al., 2002) 에 더하여, 트라스투주맙-인지 세포외 에피토프의 결여로 인해 헤르셉틴 치료에 대한 저항성을 촉진한다 (Scaltriti et al., 2007). 그러나, 파라핀 포매 시편 중 p95HER2 의 면역조직화학적 탐지와 연관된 기술적 곤란성으로 인해, p95HER2 발현의 대규모 임상 확인은 여전히 부족하다. 2 개의 그룹이 p95HER2 에 대한 모노클로날 항체를 생성했지만, 아직 임상적으로 확인되지 않았으며 (Parra-Palau et al., 2010; Sperinde et al., 2010), GeparQuattro 연구로부터의 최근의 상충되는 발견들은 p95HER2 의 수준과 트라스투주맙 저항성의 상관관계를 밝히는데 실패했다 (Loibl et al., 2011). 우리가 CEER™ 검정법을 사용하여 급속 냉동된 위암 임상 시편에서 p95HER2 를 탐지하는데 성공했음에 주목해야 한다. 위암에서 p95HER2 발생의 빈도 (HER2(+) 의 77%) 는 유방암에서 보고된 빈도 (HER2(+) 의 ~30%) 보다 높다. 전장 HER2 또는 절두된 p95HER2 중 하나를 발현하는 위암 세포에서 트라스투주맙 대 라파티닙의 효능이 시험될 수 있으며, 여러 연구는 p95HER2(+) 암에서 항-HER2 TKI, 라파티닙의 사용을 시사한다 (Arribas et al., 2011; Saez et al., 2006). 부가적으로, p95HER2 발현은 위암 환자에서의 제 II 상 신보조 라파티닙 + 화학요법 시험에서 확인될 수 있다. HER2 음성 위암은 우리의 연구에서 분석된 전체 위암 집단에서 더 큰 비율 (~88%) 을 형성하나, 이러한 집단에 대한 승인된 표적지향 요법은 없다. CEER™ 검정법에 기초하면, 이들 암의 일부는 HER2 단백질을 여전히 발현하나, HER2(+) 집단과 비교할 때 유의하게 더 낮은 수준으로 발현한다. 사실, 우리는 유의한 수준의 인산화된 HER2 이 존재하는 84 개의 샘플을 탐지했으며, 이는 이들 암이 활성 HER2 수용체 신호전달을 이용하여 종양 성장을 촉진할 수 있고, 따라서 다양한 HER2 표적화제에 대한 잠재적 반응자일 수 있음을 시사한다. HER2(-) 상태를 갖는 유방암 환자의 일부에서 트라스투주맙이 유익할 수 있음이 밝혀졌으며, 이는 IHC 에 의해 확인되었다 (Paik et al., 2008). 활성 HER2 신호전달에 더하여, 우리는 HER2(-) 위암에서 HER2(-) 종양 성장을 추진하는데 또한 기여할 수 있는 활성화된 HER1, HER3, c-MET 및 IGF1R 가 존재하는 환자의 여러 아군을 식별했다. 우리의 연구에서 발견된 pHER1, pHER2 및 pHER3 을 발현하는 샘플의 비율이 유방암에서 보고된 것과 유사하다는 것은 주목할 만하다 (Frogne et al., 2009). HER3 단백질 과발현이 위암에서 불량한 예후와 상관관계를 갖는 것으로 밝혀졌고 (Begnami et al., 2011; Hayashi et al., 2008), 잠재적 치료적 표적으로서 제안되었다. 우리의 분석에서, HER2(-) 위암의 대략 24% 가 활성 HER3 신호전달을 발현했으며, 이들 암의 상당한 비율이 인산화된 HER2 및 HER1 을 동시-발현했다. 이는 HER3 신호전달이 위암에서 유의한 역할을 수행할 수 있음을 시사한다.할지에 대해, 할 것인지 말 것인지를 두고
분자 표적지향제에 관한 수년의 경험 후에, 우리는 이제 전이성 암이 치료 동안 저항성 경로가 출현하는 진화하는 질환임을 인지한다. 종양학자는 후속 치료를 계획하기 위한 재생검의 필요성과 재생검의 임상 실행가능성 사이에서 딜레마에 빠질 것이다. 따라서, 우리는 CTC 및 체액 (예를 들어, 복수) 으로부터 단리된 악성 세포를 사용하는 RTK 활성화 프로파일링 플랫폼을 개발했다. 우리는 CEER™ 검정법이 CTC 를 프로파일링하기에 충분히 민감성임을 입증했다. CTC 로, 우리는 치료 동안 및 진행시 표적화된-RTK 상태를 종적으로 모니터링할 수 있다. 모든 전이성 암 환자가 분석에 이용가능한 CTC 를 갖는 것은 아니라는 사실을 고려하여, 우리는 또한 위암 환자로부터의 체액 예컨대 악성 복수로부터 악성 세포를 단리했고, 이들 세포에서 RTK 활성화가 프로파일링될 수 있음을 성공적으로 밝혔다. 이는 위암 환자에서 포스포-RTK 검정법의 적용가능성 및 임상 실행가능성의 범위를 분명히 확장할 것이다. 증거-기반 표적지향형 치료제를 적용하고 약물 저항성을 극복하는 전략을 개발하기 위해 환자에서 특정 경로 단백질을 표적화하는 물질의 효과를 시험하는 강력한 대리 시스템 (surrogate system) 으로서, 우리는 악성 복수로부터 암 세포를 단리하고, 성장 인자를 사용하여 경로를 활성화시킨 후, 생체 외에서 종양 세포를 TKI 로 처리했다.
우리는 이제 개인화된 암 의약 및 바이오마커 주도 임상 연구의 시대로 신속하게 접근하고 있다. 다중 RTK 동시-활성화를 입증하는 우리의 발견은 위암에 있어서 단일요법의 낮은 반응률에 관한 타당한 설명을 제공한다. 장래에, 우리는 위암 환자의 아집합에서 다중 신호전달 경로를 이용하는 선봉적 조합 표적지향 치료를 고려할 수 있다. CTC 및/또는 체액을 이용하는 모니터링 도구를 이용하여, 우리는 질환 진행후 필요한 후속 처리를 신속히 찾아내어 대체 신호전달 경로를 표적화할 수 있다.
실험 절차
환자 코호트 및 조직 시편 입수
모든 화자가 치유적 의도로 위절제술과 근치 림프절 절제술을 받아왔다. 외과적으로 절제된 일차 위 종양으로부터 수집된 447 개의 신선한 동결 조직이 최종 분석에 이용가능했다. 모든 신선한 동결 조직을 수술실에서 외과의가 수집했고 (30 분 내에), 즉시 액체 질소 중에서 급속 냉동시키고, -80℃ 냉동고에서 다음 사용 전까지 저장했다.
병리학자가 종양 시편을 종양 면적 > 70% 의 존재에 대해 확인했다. 분석을 위해, 미리 차갑게 한 면도날을 사용하여 동결 조직의 작은 조각 (10 ㎛ 절편 X 3) 을 준비한 후, 100 ㎕ 의 용해 완충액 중에 용해시켰다. 결과로서 얻어지는 용해물을 후속 분석 전에 -80 ℃ 에서 저장했다.
조직병리 검토 및 HER2 상태 확인
모든 입수가능한 H&E-염색된 슬라이드를 2 명의 병리학자가 중심적으로 검토했다. 모든 종양 시편은 외과적으로 절제된 일차 위 종양으로부터였다. HER2 상태를 면역조직화학 (IHC) 에 의해 확인했다. IHC 분석을 HercepTest™ (Dako, Glostrup, Denmark) 을 사용하여 수행했다. 위암에 관한 HER2 채점에 대한 합의 집단 권고 (consensus panel recommendation) (Hofmann et al., 2008; Ruschoff et al., 2010) 에 따라, HER2 단백질 발현 수준을 0 내지 3+ 로 채점했다. FISH 를 위해, PathVysion HER2 DNA 탐침 키트 (Abbott, Des Plaines, IL) 를 사용했다. Ariol 이미지 분석 시스템을 사용하여 혼성화 신호를 계수했다 (Genetix, San Jose, USA). 40 개의 비침윤성 종양 세포를 계수했다. 이미지 분석에 의한 HER2/CEP17 의 비가 1.8 ~ 2.2 인 모든 샘플을 60 개 초과의 비-중복 세포를 계수함으로써 수동으로 채점했다. 2.2 초과, 1.8 ~ 2.2, 또는 1.8 미만의 비를 각각 증폭에 관해 양성, 불분명, 또는 음성으로 분류했다. 염색체 17 다염색체성을 세포 1 개 당 평균 6 카피 초과의 CEP17 신호로서 정의했다. 447 개의 시편 중에서, 434 개의 시편이 최종 분석에 포함되었다.
합동 효소 증강 반응성-면역검정법 (CEER™)
면역-마이크로어레이 슬라이드를 TBST (50 mM Tris/ 150 mM NaCl/ 0.1% Tween-20, pH 7.2-7.4) 로 2 회 헹구고, 80 ㎕ Whatman 차단 완충액으로 1 시간 동안 실온에서 차단한 후, TBST 로 2 회 세정했다. 80 ㎕ 희석 완충액 (2% BSA/ 0.1% TritonX-100/ TBS, pH 7.2-7.4) 중에 계단 희석된 용해물 대조군을 슬라이드 상의 지정된 서브어레이에 첨가한 후, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 슬라이드를 4 회 (각각 3 분) 세정하고, 탐지자 Ab 를 80 ㎕ 의 반응 완충액 중에 첨가하고, 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 슬라이드를 TBST 로 세정하여 결합되지 않은 탐지자 Ab 를 제거한 후, 에탄올 용액 중 400 ㎍/㎖ (Perkin-Elmer Life Science) 로부터 제조된 80 ㎕ 의 비오틴-티라미드 용액 (50 mM 글루코스/PBS 중 5 ㎍/㎖) 을 첨가하고 15 분 동안 어둠 속에서 인큐베이션했다. 글루코스-옥시다제 (GO)/HRP-매개성 티라미드 신호 증폭 과정을, TBST 로 4 회, 각각 3 분 간 세정하여 종료시켰다. 2% BSA/ 0.1% Triton/TBS 중 0.5 ㎍/㎖ 의 스트렙타비딘 (SA)-Alexa647 (Invitrogen) 과 40 분 동안 인큐베이션시켜 비오틴-티라미드의 국소 침적을 탐지했다. 인큐베이션의 완료 후, 슬라이드를 TBST 로 4 회 세정하고, 건조시키고, 마이크로어레이 스캐너를 통한 영상화 전까지 어둠 속에서 보관했다.
절두된 HER2 농축
도 8 에 제시된 바와 같이 HER2 의 세포외 도메인 (ECD) 에 특이적인 자기 구슬 커플링된 항체를 사용하여 용해물로부터 전장 p185-ERBB2 수용체를 제거했다. 결과로서 얻어지는 p185-HER2 고갈된 용해물은, ECD 를 결여하는 절두된 HER2 (t-HER2) 수용체 단백질을 함유했으며, 이를 t-HER2 발현 및 인산화의 후속 정량에 사용했다.
CEER™ 데이타 분석
효과적인 동적 범위를 증가시키는 4 개의 광전자증배관 (PMT) 게인 설정 (gain setting) 에서 슬라이드를 스캔했다. 배경 보정된 신호 강도를 3 회 프린팅된 스팟에 대해 평균을 냈다. 스팟 발자국에 대한 제한, 스팟 복제물에 대한 변동계수, 및 전체 패드 배경을 포함하는, 여러 기준을 사용하여 데이타를 추가 분석을 위해 필터링했다. 각각의 검정법을 위해, 잘 특성분석된 신호 전달 단백질을 함유하는 세포주로부터 제조된 계단 희석된 대조군 세포 용해물로부터 표준 곡선을 생성했다. 데이타를 포획-항체 농도 및 PMT 의 함수로서 유도된 5-매개변수 등식으로 근사 (fit) 시켰다. 각각의 마커에 대한 표준 곡선을 상대 형광 단위 (RFU) 로서 측정된 log 신호 강도 vs. 세포 용해물의 log 농도의 함수로서 근사시키고, 표준 세포주를 참조했다. 예를 들어, BT474 로부터 제조된 계단 희석된 세포 용해물의 표준 곡선을 사용하여 각각의 샘플 중 HER2 발현 및 인산화도를 정규화했다 (도 14). 따라서, 1 CU 의 HER2 발현이 존재하는 샘플의 RFU 값은 1 표준 참조 BT474 세포의 RFU 값과 동등하다. 참조 세포는 세포 1 개 당 1~2×106 HER1 또는 HER2 수용체와 대략 10% 의 인산화된 수용체를 가지므로, 1 CU 는 1~2×106 RTK 또는 1~2×105 인산화된 RTK 를 나타낸다 (Kim et al., 2011). CU 에 의한 탐지 (LOD) 값의 한계는 HER2 의 발현 및 활성화 둘다에 대해 1 CU 미만으로 확인되었다. 각각의 희석 및 게인으로부터의 개별 예측의 평균을 내어 단일, 최종 예측을 수득했다.
CEER™ 마커 확인 및 히트맵 군집화
임상 현장에서 사용하기 위한 바이오마커 데이타의 평가에 있어서 통계적 도전 중에 최적 진단 컷오프 수준 (optimum diagnostic cutoff level) 을 확인하는 것이 있다. 참조 범위 값의 부재시, 주어진 바이오마커에 대한 양성은 이러한 연구의 환자 집단에서 개별 바이오마커에 대한 삼사분위수 초과로서 정의되었다. 주어진 바이오마커에 대한 CEER™ 검정법으로부터의 CU 값에 기초하여 환지의 순위를 매겼다. 삼사분위수 컷오프를 초과하는 환자를 상승된 바이오마커 수준 및 그러므로 잠재적으로 활성화되는 신호 경로를 갖는 최고 위험에 처한 것으로 간주했다. 후속 생존률 분석을 실시하여 이들 컷오프의 서술적 특성에 접근했다.
종양 샘플의 바이오마커 프로파일을 히트맵으로 나타냈다. 각각의 셀을 그 마커의 활성화의 십분위수 순위에 기초하여 채색했다. 각각의 마커를 구별되는 색조로 표시된, 십분위수로 순위를 매겼으며, 척도는 색상을 표시한다. 행 (환자) 및 열 (마커) 군집화 둘다가 제시되었다. 통계 환경 R: A Language and Environment for Statistical Computing (http://www.r-project.org/) 의 gplots 라이브러리에서 입수가능한 히트맵.2 함수로 호출되는, R 에서의 hclust 함수를 사용하여 가장 밀접한 상관관계를 갖는 관찰들을 순차적으로 그룹화함으로써, 완전 연결 알고리즘을 사용하여 계층적 군집 (또는 계통수) 을 수득했다. 마커의 아군은 군집화에 의해 정의되고, 환자에 대한 마커 프로파일의 비교를 허용한다.
다중-마이크로어레이 프린팅
포획 항체를 비-접촉 프린터 (Nanoplotter, GeSiM) 를 사용하여 니트로셀룰로스-코팅된 유리 슬라이드 (ONCYTE®, Grace Bio-Labs) 위에 프린팅했다. 스팟 직경은 대략 175 ㎛ 였고, 슬라이드를 건조실 내에서 4 ℃ 에서 보관했다. 대략 500 pL 의 포획 Ab 를 3 반복 및 계단 희석 농도 1 ㎎/㎖, 0.5 ㎎/㎖, 및 0.25 ㎎/㎖ 로 프린팅했다. 정제된 마우스-IgG 가 음성 대조군으로서의 역할을 했다. 면역-어레이 슬라이드 배열이 도 5 에 제시되어 있다.
항체 접합 및 정제
표적 특이적-Ab (인간 신호 전달 단백질 상의 상이한 에피토프에 대한 마우스 모노클로날) 및 상응하는 탐지자 효소 글루코스 옥시다제 (GO) 또는 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 를 2-관능성 가교제, 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC) 로 활성화시키고, 커플링시켜 항체-효소 접합체를 만들었다 (Gibson et al., 1964; Klapper and Hackett, 1963). 접합체를 HPLC 로 정제했다. 정제된 접합체 중 Ab 활성을 경쟁 ELISA 에 의해 측정하고, 접합 후 효소 활성을 탐지자 효소에 특이적인 기능 검정법에 의해 탐지했다.
세포 배양 및 시약
인간 위암 세포주를 한국 세포주 은행 (KCLB, 서울, 한국) 으로부터 구입했다. 모든 세포주를 10% 열-불활성화된 소태아혈청, 항생제/항진균제를 보충한 RPMI-1640 배지 (PAA Laboratories GmbH, Austria) 에서 성장시켰다. 세포를 37℃ 에서 5% CO2 에서 인큐베이션했고, 배지를 1 주일에 2 번 교환했다. 융합 (confluence) 후, 세포를 시험 종료시까지 새로운 플라스크 내로 다시 나누었다.
ErbB-RTK 발현의 정도가 다양한 CEER™ 검정법 대조군 세포주, MDA-MB-468, T47D, HCC827 및 BT474 세포 (Dragowska et al., 2004; Filmus et al., 1987; Imai et al., 1982) 를 ATCC 로부터 입수하고, 37℃ 에서 5% CO2 에서 성장시켰다: MDA-MB-468 (둘베코 최소 필수 배지, DMEM, 10% FBS), BT474 (DMEM, 10% FBS), 및 HCC827 및 T47D (RPMI 1640, 10% FBS, 0.2 U/㎖ 소 인슐린). 세포를 계수하고, 성장 인자 자극 전에 1×PBS 세정했다. 무혈청 성장 배지에서 5 또는 15 분 동안 MDA-MB-468 세포를 100 nM 표피 성장 인자 (EGF) 또는 전환 성장 인자 a (TGFa) 로 자극하고, T47D 세포를 20 nM 헤레굴린 β (HRGβ) 또는 100 ng/㎖ 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF1) 로 자극했다. 자극된 세포를 1×PBS 로 세정한 후, 용해시키고 (용해 완충액: 50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Trition X-100 및 2 mM Na3VO4), 후속 검정을 위해 상청액을 취하기 전에 얼음 위에서 30 분 동안 유지하거나, -80℃ 에서 유지했다.
약물 처리
세포를 2×105 세포/6-웰 플레이트 위에 파종하고, 24 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하고, 1 μM/㎖ 의 라파티닙, 포레티닙 또는 조합으로 4 시간 동안 37 ℃ 에서 처리했다. 세포를 약물 처리 후 수집하고, 원심분리에 의해 펠렛화했다. 단백질 분석을 위해, 단백질 추출에 앞서 세포 펠렛을 -80℃ 에서 저장했다.
세포 성장-저해 검정법
세포 성장 저해를 CellTiter 96 Aqueous One Solution 검정법 (Promega) 을 제조사의 프로토콜에 따라 이용하여 확인했다. 간략히, 세포 (100 uL/웰 중 3×103) 를 96-웰 플레이트 위에 파종하고, 24 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하고, 약물 (라파티닙 또는 포레티닙 또는 조합) 로 3 일 동안 37 ℃ 에서 처리했다. 약물 처리 후, MTS 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 인큐베이션을 4 시간 동안 37 ℃에서 계속했다. 각각의 웰의 흡광도 값 (OD) 을 마이크로플레이트 판독시 세트로 490 ㎚ 에서 측정했다. 모든 실험을 3 반복으로 실시했다.
참고문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
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실시예 4. 위암 요법에 대한 개인환된 마우스 모델.
이 실시예는 특정 종양 예컨대 위 종양과 싸우기 위해 환자에게 투여될 수 있는 가장 효과적인 항암 약물 또는 항암 약물의 조합 (예를 들어, 칵테일) 을 의사가 식별하는 것을 돕는 마우스 모델 ("아바타") 을 기술한다.
"아바타" 는 인간 종양으로부터의 조직이 이식되어 1 명의 환자의 암의 개인화된 모델을 생성하는 마우스 또는 기타 동물을 포함한다. 이러한 접근법의 한 실시예에서, 환자의 위 종양 (예를 들어, I 또는 II 기 위암 예컨대 미만형 위암) 이 하나 이상의 분석물 예컨대 cMET 및 HER1, 및 임의로 HER2 및/또는 HER3 뿐만 아니라 기타 신호 전달 경로 구성요소의 발현 및/또는 활성화의 존재 또는 수준에 대해 분석된다. 그 후 환자의 종양의 조각을 면역결핍 마우스에게 이종이식하여 특정 위암의 개인화된 마우스 모델을 생성한다. 그 후 항암 약물 또는 항암 약물의 조합 (예를 들어, 칵테일) 에 대한 이종이식 종양의 반응이 시험될 수 있다. 예를 들어, 환자의 위 종양에서 cMET 및 HER1 이 둘다 활성화되는 경우 (예를 들어, CEER™ 기술에 의해 측정됨), 아바타에 존재하는 이종이식 종양에 대해 cMET 저해인자 및 HER1 저해인자의 조합을 시험하여 이것이 그 환자의 암에 효과적인 치료인지 여부를 확인할 수 있다. 이종이식 종양이 저해인자 칵테일에 반응하는 경우 (예를 들어, 종양이 수축하는 경우), 그러한 특정 조합 요법이 환자에게 투여될 수 있다.
이 명세서에서 언급된 모든 출판물 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 출판물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함된다고 표시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 상술된 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명 및 실시예를 이용하여 다소 상세히 기술되었지만, 본 발명의 교시에 비추어 첨부된 청구항의 목적 또는 범위에서 벗어나지 않으면서 특정 변화 및 수정이 그에 가해질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (26)

  1. 하기 단계를 포함하는, 종양 수술 후 I 또는 II 기 위암을 갖는 대상의 생존률을 예측하는 방법:
    (a) 대상으로부터 수득된 암 세포 중 cMET 및 HER1 을 포함하는 둘 이상의 분석물의 활성화의 존재 또는 수준을 확인하는 단계; 및
    (b) 단계 (a) 에서 확인된 둘 이상의 분석물의 활성화의 존재 또는 수준에 기초하여 대상의 생존률을 예측하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 대상의 무질환 생존기간 또는 무진행 생존기간을 예측하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 암 세포 중 cMET 및 HER1 이 동시활성화되는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 대상이 HER1 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률을 가질 것으로 예측되는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 위암이 미만형 위암인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 가 암 세포 중 HER2 및/또는 HER3 을 포함하는 하나 이상의 부가적 분석물의 활성화의 존재 또는 수준을 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 암 세포 중 cMET 및 HER1 은 동시활성화되지만 HER2 는 활성화되지 않는 방법
  8. 제 7 항에 있어서, 대상이 HER1 및/또는 HER2 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률을 가질 것으로 예측되는 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 암 세포 중 cMET, HER1, 및 HER3 은 동시활성화되지만 HER2 는 활성화되지 않는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 대상이 HER1, HER2, 및/또는 HER3 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률을 가질 것으로 예측되는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (c) 단계 (a) 에서 확인된 적어도 cMET 및 HER1 의 활성화의 존재 또는 수준에 기초하여 cMET 저해인자를 단독으로 또는 cMET 저해인자를 HER1 과 조합하여 대상에게 투여하는 단계.
  12. 제 11 항에 있어서, 암 세포 중 cMET 및 HER1 이 동시활성화되고, 임의로 암 세포 중 HER2 는 활성화되지 않고/거나 HER3 는 활성화될 때 cMET 저해인자가 HER1 저해인자와의 조합으로 투여되는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 가 분석물의 활성화의 존재 또는 수준을 합동 효소 증강 반응성 면역검정법 (CEER™) 으로 확인하는 것을 포함하는 방법.
  14. 하기 단계를 포함하는, I 또는 II 기 위암을 갖는 대상을 치료하는 방법:
    I 또는 II 기 위암에서 cMET 및 HER1 이 동시활성화되는 경우, cMET 저해인자 및 HER1 저해인자를 포함하는 조합 요법을 대상에게 투여하는 단계.
  15. 제 14 항에 있어서, 대상이 HER1 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 및/또는 더 불량한 예후를 갖는 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 조합 요법이 대상에게 일차 요법으로서 투여되는 방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 조합 요법이 대상에게 종양 수술 후 보조 요법으로서 투여되는 방법.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, I 또는 II 기 위암에서 HER2 가 활성화되지 않는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 대상이 HER1 및/또는 HER2 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 및/또는 더 불량한 예후를 갖는 방법.
  20. 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, I 또는 II 기 위암에서 HER3 이 활성화되는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 대상이 HER1, HER2, 및/또는 HER3 활성화가 부재하면서 cMET 활성화가 존재하는 I 또는 II 기 위암 대상에 비해 더 나쁜 생존률 및/또는 더 불량한 예후를 갖는 방법.
  22. 제 14 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, cMET 저해인자가 AMG102, MetMAb, ARQ197, JNJ-38877605, PF-2341066, PF-04217903, SGX523, GSK1363089/XL880, XL184, MGCD265, MK-2461, PHA-665752, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  23. 제 14 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, HER1 저해인자가 에를로티닙, 라파티닙, 게피티닙, BIBW-2992, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제 14 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상으로부터 수득된 암 세포 중 cMET 및 HER1 의 활성화의 존재 또는 수준이 확인되는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 암 세포가 일차 종양 세포, 순환 종양 세포 (CTC), 복수 종양 세포 (ATC), 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, cMET 및 HER1 의 활성화의 존재 또는 수준이 합동 효소 증강 반응성 면역검정법 (CEER™) 으로 확인되는 방법.
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