ES2639650T3 - Métodos para predecir y mejorar la supervivencia de pacientes con cáncer gástrico - Google Patents

Métodos para predecir y mejorar la supervivencia de pacientes con cáncer gástrico Download PDF

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Abstract

Un método in vitro para predecir la supervivencia de un sujeto que tiene cáncer gástrico en estadio I después de la cirugía del tumor, comprendiendo el método: (a) determinar la presencia de activación o el nivel de activación de al menos dos analitos que comprenden cMET y HER1 en una célula cancerosa obtenida del sujeto, en donde cMET y HER1 están coactivados en la célula cancerosa; y (b) predecir la supervivencia del sujeto basándose en la presencia de activación o el nivel de activación de dichos al menos dos analitos determinados en la etapa (a), en donde se predice que el sujeto tiene peor supervivencia que los sujetos con cáncer gástrico en estadio I con activación de cMET en ausencia de activación de HER1.

Description

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DESCRIPCION
Metodos para predecir y mejorar la supervivencia de pacientes con cancer gastrico Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas Antecedentes de la invencion
Una amplia diversidad de malignidades humanas presenta una estimulacion sostenida, sobreexpresion o mutacion de c-Met, incluyendo carcinomas de mama, hfgado, pulmon, ovario, rinon, estomago (gastrico) y tiroides. En particular, se han identificado positivamente mutaciones de activacion en c-Met en pacientes con una forma hereditaria particular de cancer renal papilar, lo cual implica directamente a cMet en la tumorigenesis humana. La senalizacion aberrante de la ruta de senalizacion de cMet debido a la desregulacion del receptor c-Met o la sobreexpresion de su ligando, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), se ha asociado con un fenotipo agresivo. Los abundantes indicios de que la senalizacion de c-Met esta implicada en la progresion y extension de varios canceres y una mejor comprension de su papel en la enfermedad han generado un interes considerable en c- Met y HGF como dianas principales en el desarrollo de farmacos para el cancer.
Este interes ha llevado al desarrollo de una diversidad de antagonistas de la ruta de c-Met con posibles aplicaciones clfnicas. Los tres enfoques principales del desarrollo de farmacos anticancerosos con selectividad de ruta han incluido el antagonismo de la interaccion ligando/receptor, la inhibicion de la actividad catalftica de tiroxina quinasas y el bloqueo de la interaccion receptor/efector.
Bachleitner-Hofmann et al:. Proc. Am.Cancer Res. Ann. Meeting, vol. 49, abril 2008, pagina 1186, describe que la estimulacion de EGFR o HER-3 con EGF o HRG es un mecanismo mediante el cual las celulas tumorales con MET amplificado pueden rescatarse de los efectos inhibidores del crecimiento de la inhibicion de MET. La inhibicion combinada de la senalizacion de MET, EGFR y HER-3 impide dicho rescate de celulas tumorales, lo que hace que sea un enfoque prometedor para tumores con MET amplificado que coexpresan EGFR y/o HER-3.
Bachleitner-Hofmann et al.. Clin Cancer Res; 17(1); 122-33 proporciona indicios de la eficacia de la inhibicion de HSP-90 en celulas cancerosas con MET amplificado, particularmente cuando ha aparecido resistencia al inhibidor de la quinasa de MET. MUKOHARA T. ET AL.. EUR. J. CANCER, vol. 8, n.° 7, #109, noviembre 2010 (2010-11-01), paginas 42, XP027497797 desvela que Foretinib (GSK1363089) inhibe el crecimiento de lfneas celulares de cancer gastrico mediante el bloqueo de redes de tirosina quinasas entre receptores.
TABERNERO J. ET AL.. EUR. J. CANCER, vol. 7, n.° 2, #305, septiembre 2009 (2009-09-01), pagina 74, XP026689064 desvela la integracion de terapias dirigidas y la determinacion de la supervivencia global de pacientes con cancer gastrico positivo para Her2 despues de una terapia combinada.
c-Met es el receptor de la superficie celular del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), tambien conocido como factor de dispersion. HGF es una glicoprotefna de multiples dominios que esta muy relacionada con miembros de la familia de la serina proteasa de plasminogeno. Se secreta como un polipeptido inactivo monocatenario por celulas mesenquimaticas y se escinde por varias proteasas dando su heterodfmero activo.
La union de HGF induce la homodimerizacion del receptor c-Met y la fosforilacion de dos restos de tirosina (Y1234 e Y1235) dentro del sitio catalftico, regulando la actividad quinasa. La cola carboxi-terminal incluye las tirosinas Y1349 e Y1356 que, cuando se forforilan, sirven como sitios de acoplamiento para protefnas adaptadoras intracelulares, llevando a la senalizacion aguas abajo. El receptor c-Met se expresa en las celulas epiteliales de muchos organos durante la embriogenesis y en el estado adulto, entre los que se incluyen el hfgado, pancreas, prostata, rinon, musculo y medula osea.
Un cancer de interes mediado por c-Met es el cancer gastrico. El cancer gastrico es la causa principal de muerte por cancer a nivel mundial con una incidencia de 18,9/100.000 al ano. Se ha estimado una incidencia de cancer gastrico de 934.000 casos, produciendose un 56 % de los nuevos casos en el Este asiatico. El cancer gastrico representa un 20,8 % de todos los canceres en Corea, de acuerdo con los datos del Registro Central de Tumores para 2002. Aunque la gastrectomfa es el unico tratamiento curativo para los pacientes con cancer gastrico, la alta tasa de recurrencia que varfa del 40 al 60 % despues de una cirugfa curativa aun supone una baja supervivencia global.
Actualmente estan bajo investigacion clfnica los resultados clfnicos preliminares de varios antagonistas de c-Met. Estos agentes, incluyendo anticuerpos monoclonales, disruptores de las interacciones ligando/receptor e inhibidores de tirosina quinasa de molecula pequena, han sido alentadores. Tambien se estan investigando en el ambito clfnico varias terapias multidirigidas y han demostrado ser prometedoras, particularmente con respecto a la inhibicion de la tirosina quinasa. En vista del papel que juega c-Met en una diversidad de canceres, existe la necesidad de una seleccion y de estrategias de terapias apropiadas para un individuo. Esto se aplica especialmente en el caso de los canceres gastricos mediados c-Met. La presente invencion satisface estas y otras necesidades.
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Breve sumario de la invencion
La presente invencion proporciona ensayos y metodos para predecir la supervivencia de un sujeto que tiene un cancer gastrico en estadio temprano (por ejemplo, estadio I o II o transicion entre estos estadios) despues de una cirugfa tumoral. En ciertos aspectos, la presente invencion proporciona ensayos y metodos para predecir la eficacia terapeutica y/o respuesta a la terapia combinada en un sujeto que tiene un cancer gastrico en estadio temprano.
En un aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para predecir la supervivencia de un sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I despues de una cirugfa tumoral, comprendiendo el metodo:
(a) determinar la presencia de activacion o el nivel de activacion de al menos dos analitos que comprenden cMET y HER1 en una celula cancerosa obtenida del sujeto, en donde cMET y HER1 estan coactivados en la celula cancerosa; y
(b) predecir la supervivencia del sujeto basandose en la presencia de activacion o el nivel de activacion de dichos al menos dos analitos determinados en la etapa (a), en donde se predice que el sujeto tiene una peor supervivencia que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1.
En realizaciones particulares, los metodos de la presente invencion se basan en la deteccion del estado o nivel de activacion de una combinacion especffica de analitos transductores de senales en una celula cancerosa obtenida de un sujeto que tiene un cancer gastrico en estadio temprano. De esta manera, los metodos descritos en el presente documento son particularmente utiles para predecir la supervivencia o pronostico de un sujeto que tiene un cancer gastrico en estadio temprano y para guiar decisiones de tratamiento tanto antes como despues de la cirugfa del tumor al identificar a los sujetos que se beneficiarfan de la terapia combinada en lugar de la monoterapia en vista del estado o el nivel de activacion detectado de los analitos.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a que el metodo predice la supervivencia sin enfermedad o la supervivencia sin progresion del sujeto. El cancer gastrico puede ser un cancer gastrico de tipo difuso.
En una realizacion, la presente invencion se refiere al metodo descrito en [0008a] en donde la etapa (a) comprende, ademas, determinar la presencia o el nivel de activacion de al menos un analito adicional que comprende hER2 y/o HER3 en la celula cancerosa.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a dicho metodo de [0008b] en donde HER2 no esta activado en la celula cancerosa, en donde opcionalmente se predice que el sujeto tiene peor supervivencia que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1 y/o HER2. En otra realizacion, la presente invencion se refiere a dicho metodo de [0008b] en donde cMET, hER1 y HER3 estan coactivados pero HER2 no esta activado en la celula cancerosa, en donde opcionalmente se predice que el sujeto tiene peor supervivencia que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1, HER2 y/o HER3.
En una realizacion, el metodo es como se describe en [0008a-0008c], en donde la etapa (a) comprende determinar la presencia o el nivel de activacion de los analitos con un inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (CEER™, por sus siglas en ingles).
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende un inhibidor de cMET y un inhibidor de HER1 para uso en el tratamiento de cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde cMET y HER1 estan coactivados en el cancer gastrico en estadio I, y en donde el sujeto tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMet en ausencia de activacion de HER1.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a la composicion descrita en [0008d] para uso en el tratamiento de un cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde la composicion se va a administrar al sujeto como terapia primaria. En otra realizacion, la presente invencion se refiere a la composicion descrita en [0008d] para uso en el tratamiento de un cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde la composicion se va a administrar como una composicion adyuvante despues de la cirugfa tumoral.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a la composicion descrita en [0008d] para uso en el tratamiento de un cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde HER2 no esta activado en el cancer gastrico en estadio I, en donde opcionalmente el sujeto tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMet en ausencia de activacion de HER1 y/o HER2.
En otra realizacion, la presente invencion se refiere a la composicion descrita en [0008d] para uso en el tratamiento de un cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde HER3 esta activado en el cancer gastrico en estadio I, en donde opcionalmente el sujeto tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1, HER2 y/o HER3.
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En una realizacion, la presente invencion se refiere a la composicion descrita en [0008d] para uso en el tratamiento de un cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde el inhibidor de cMET se selecciona del grupo que consiste en AMG102, MetMAb, ARQ197, JNJ-38877605, PF-2341066, PF-04217903, SGX523, GSK1363089/XL880, XL184, MGCD265, MK-2461, PHA-665752 y combinaciones de los mismos, o en donde el inhibidor de HER1 se selecciona del grupo que consiste en erlotinib, lapatinib, gefitinib, BIBW-2992 y combinaciones de los mismos.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a la composicion descrita en [0008d] para uso en el tratamiento de un cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde la presencia de activacion o el nivel de activacion de cMET y HER1 se determina en una celula cancerosa obtenida del sujeto, en donde la celula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en una celula tumoral primaria, una celula tumoral circulante (CTC), una celula tumoral ascftica (CTA) y combinaciones de las mismas.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a la composicion descrita en [0008g] para uso en el tratamiento de un cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde la presencia de activacion o el nivel de activacion de cMET y HER1 se determinan con un inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (CEER™).
El estudio expuesto mas adelante en el Ejemplo 3 describe el uso de la plataforma CEER™ multiplexada para determinar los niveles de RTK activadas en tejidos de cancer gastrico ultracongelados y la categorizacion de pacientes con cancer gastrico en posibles subgrupos (por ejemplo, HER1, HER2, variantes truncadas de HER2, p95HER2, HER3, cMET, PI3K e IGF1R). Basandose en sus patrones de activacion de protefnas de las rutas, se observo la activacion de multiples protefnas senal en un subgrupo de tumores, y las entradas de activacion de ruta redundantes llevaron a una senalizacion residual aguas abajo, limitandose de esta manera la eficacia antitumoral de la monoterapia dirigida contra una sola RTK. Se determino el efecto antitumoral de un inhibidor de HER1/2 en combinacion con un inhibidor de cMET en lfneas celulares de cancer gastrico con cMET y HER coactivados. Se desarrollo una herramienta potente que permite a los medicos supervisar las alteraciones iniciales y posteriores en el perfil de activacion de RTK durante el tratamiento usando celulas tumorales circulantes y celulas malignas aisladas de lfquido peritoneal (ascitis). Considerado en conjunto, este estudio proporciona indicios de la activacion concomitante de RTK en tejidos humanos de cancer gastrico y establece una herramienta clfnica para supervisar la activacion de RTK segun evoluciona el cancer durante el tratamiento y la progresion.
En algunas realizaciones, el metodo predice la supervivencia sin enfermedad o la supervivencia sin progresion de un sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I o II. En ciertos casos, el cancer gastrico en estadio I es un cancer gastrico en estadio IA o estadio IB. En ciertos otros casos, el cancer gastrico en estadio II es un cancer gastrico en estadio IIA o estadio IIB.
En realizaciones particulares, cMET y HER1 estan coactivados en la celula cancerosa. En dichas realizaciones, se predice que el sujeto tiene una peor supervivencia (por ejemplo, un peor pronostico) en comparacion con los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMET en ausencia de activacion de hER1.
En algunas realizaciones, el cancer gastrico en estadio I o II corresponde a un subtipo histologico tal como, por ejemplo, un cancer gastrico de tipo intestinal, de tipo difuso o de tipo mixto. En realizaciones particulares, el cancer gastrico en estadio I o II es un cancer gastrico de tipo difuso.
En otras realizaciones, la etapa (a) comprende ademas determinar la presencia o el nivel de activacion de al menos un analito adicional que comprende HER2 y/o HER3 en la celula cancerosa. En ciertos casos, cMET y HER1 estan coactivados, pero HER2 no esta activado en la celula cancerosa. En estos casos, se predice que el sujeto tiene peor supervivencia (por ejemplo, peor pronostico) que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1 y/o HER2. En ciertos otros casos, cMET, HER1 y HER3 estan coactivados, pero HER2 no esta activado en la celula cancerosa. En estos casos, se predice que el sujeto tiene peor supervivencia (por ejemplo, peor pronostico) que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1, HER2 y/o HER3.
En algunas realizaciones, se administra un inhibidor de cMET en combinacion con un inhibidor de HER1 cuando cMET y HER1 estan coactivados en la celula cancerosa y, opcionalmente, cuando HER2 no esta activado y/o HER3 esta activado en la celula cancerosa.
Los niveles totales de expresion y activacion (por ejemplo, fosforilacion) y/o el estado de las moleculas de transduccion de senales pueden determinarse usando cualquiera de una diversidad de tecnicas. En ciertas realizaciones, el nivel de expresion y/o activacion (por ejemplo, fosforilacion) y/o el estado de las moleculas de transduccion de senales en muestras tales como extractos celulares de celulas cancerosas, se detecta con un inmunoensayo tal como un solo ensayo de deteccion o un ensayo de deteccion doble de proximidad (por ejemplo, un inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (CEER™)) como se describe en el presente documento.
En realizaciones particulares, la etapa (a) comprende determinar la presencia o el nivel de activacion de los analitos (por ejemplo, al menos cMET y HER1 y, opcionalmente, HER2 y/o HER3) con CEER™.
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La tecnologfa CEER™ se describe en el presente documento y en los siguientes documentos de patente: Publicaciones de Patente PCT N.° WO 2008/036802, WO 2009/012140, WO 2009/108637, WO 2010/132723, WO 2011/008990, WO 2011/050069 y WO 2012/088337.
En algunas realizaciones, el metodo mejora el pronostico (por ejemplo, aumenta la supervivencia sin enfermedad o la supervivencia sin progresion) de un sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I o II. En ciertos casos, el cancer gastrico en estadio I es un cancer gastrico en estadio IA o estadio IB. En ciertos otros casos, el cancer gastrico en estadio II es un cancer gastrico en estadio IIA o estadio IIB.
En otras realizaciones, el sujeto (por ejemplo, antes de empezar la terapia combinada) tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMet en ausencia de activacion de HER1.
En otras realizaciones, cMET y HER1 estan coactivados, pero HER2 no esta activado en el cancer gastrico en estadio I o II. En dichas realizaciones, el sujeto (por ejemplo, antes de empezar la terapia combinada) tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMet en ausencia de activacion de HER1 y/o HER2.
En otras realizaciones adicionales, cMET, HER1 y HER3 estan coactivados en el cancer gastrico en estadio I o II. En dichas realizaciones, el sujeto (por ejemplo, antes de empezar la terapia combinada) tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1, HER2 y/o HER3.
En algunas realizaciones, la terapia combinada se administra al sujeto como una terapia primaria (por ejemplo, como un tratamiento preoperatorio para reducir el tamano de un tumor gastrico). En otras realizaciones, la terapia combinada se administra al sujeto como una terapia adyuvante posoperatoria (por ejemplo, despues de la cirugfa del tumor). En realizaciones particulares, la terapia combinada puede administrarse tanto antes de la operacion como una terapia primaria como despues de la operacion como una terapia adyuvante.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de cMET se selecciona del grupo que consiste en foretinib (GSK1363089/XL- 880), PHA-665752, AMG102, MetMAb, ARQ197, JNJ-38877605, PF-2341066, PF-04217903, SGX523, XL184, MGCD265, MK-2461 y combinaciones de los mismos. En otras ciertas realizaciones, el inhibidor de HER1 se selecciona del grupo que consiste en erlotinib, lapatinib, gefitinib, BIBW-2992 y combinaciones de los mismos. En realizaciones particulares, la terapia combinada comprende el o los inhibidores de cMET foretinib y/o PHA-665752 y el inhibidor de HER1 lapatinib.
En realizaciones particulares, se determina la presencia o el nivel de activacion de analitos tales como cMET y HER1 y, opcionalmente, HER2 y/o HER3 (asf como otros biomarcadores de transduccion de senales) en una celula cancerosa obtenida del sujeto. En algunos casos, la celula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en una celula tumoral primaria, una celula tumoral circulante (CTC), una celula tumoral ascftica (CTA) y combinaciones de las mismas.
En ciertas realizaciones, el metodo comprende ademas determinar la presencia o el nivel de activacion de analitos tales como cMET y HER1 y, opcionalmente, HER2 y/o HER3 (asf como otros biomarcadores de transduccion de senales) en una celula cancerosa obtenida del sujeto antes de la administracion de la terapia combinada, por ejemplo, para determinar si cMET y HER1 estan coactivados en el cancer gastrico en estadio I o II. En realizaciones particulares, la presencia o el nivel de activacion de dichos analitos se determina con CEER™.
Otros objetos, caracterfsticas y ventajas de la presente invencion seran evidentes para un experto en la materia tras la siguiente descripcion detallada y las figuras.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra una realizacion del formato de ensayo de proximidad de la presente invencion (por ejemplo, el inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (Collaborative Enzyme Enhanced Reactive Immunoassay (CEER™)), que es particularmente util para determinar los niveles de analito activado (por ejemplo, fosforilado) y total en una muestra biologica.
La Figura 2 muestra la expresion de RTK por CEER™ (parte superior) e IHC (inmunohistoqufmica) (parte inferior izquierda). Los niveles de protefnas de senal en cada paciente se clasificaron en el orden de "HER2, PI3K, hER3, cMET, HER1, IGF1R" antes de generar el diagrama. Tambien se muestra la presencia de p95HER2 en pacientes con GCA (parte inferior izquierda) y sus niveles de cada HER2 con un subtipo de IHC (parte inferior derecha).
La Figura 3 muestra un fndice de correlacion de coactivacion ejemplar generado por Escalamiento Multidimensional (A) y patron (B).
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Las Figuras 4A-G muestran los resultados del perfilado exhaustivo de protefnas de ruta en un panel de lineas de celulas de cancer gastrico descritas en el Ejemplo 2.
La Figura 5 muestra un esquema ejemplar que ilustra el principio del ensayo CEER™ y la distribucion de la matriz.
La Figura 6 muestra la expresion de HER2 y p95HER2 en canceres gastricos. (A) distribucion de UC para la expresion de HER2 en muestras de pacientes en 0,25 pg de lisado. El eje x representa el estado segun IHC/FISH (inmunohistoqufmica/hibridacion fluorescente in situ) y el eje y representa los valores de UC del ensayo CEER™ determinados a partir de una curva patron de BT474. Se ilustra la separacion entre los dos grupos con una mediana de 0 para la poblacion negativa segun IHC/FISH (384 de 434) en comparacion con una mediana de 11 para la poblacion positiva segun IHC/FISH (50 de 434). No se muestra una muestra saturada, que esta por encima del lfmite de cuantificacion. Las cajas representan el rango intercuartflico, con el percentil 75 en la parte superior y el percentil 25 en la parte inferior. La lfnea en la mitad de la caja representa la mediana. Se extienden bigotes hacia el valor maximo y mfnimo dentro de 1,5 veces el rango intercuartflico. El valor de P <0,001 se determino por la prueba de rangos con signos de Wilcoxon. (B) Distribucion UC para p95HER2 en una subserie de muestras de tumor (58 de 434) en 20 pg de lisado. El eje x representa el estado segun IHC y el eje y representa los valores de UC del ensayo CEER™ para p95. Se retiro HER2 de longitud completa por inmunoeliminacion antes del ensayo. Los puntos de datos estan coloreados basandose en el estado de HER2 por IHC y FISH. Como se muestra, un punto de datos con un valor de 2 segun IHC se considero positivo por el analisis FISH. En el grafico inferior, se muestran los valores de UC para las muestras con IHC de 3. De las 34 muestras consideradas positivas para p95 por CEER™, 24 (71 %) eran HER2(+) por IHC/FISH.
La Figura 7 muestra una comparacion de la expresion de HER2 en canceres de mama a traves de IHC y CEER™. En (A) se muestra la distribucion de la expresion de HER2 basada en CEER™ en cada subgrupo de IHC en cancer de mama. Hubo un 17 % (38/227) de llamadas discordantes entre el estado de HER2 por IHC y CEER™ (C -concordancia, D -discordancia). El resultado del analisis IP-W de 100 muestras (incluyendo todas las que tuvieron llamadas discordantes) se resume en (B). Se muestra la concordancia entre el estado de HER ajustado por CEER™ e IPW.
La Figura 8 muestra un ejemplo no limitante de una estrategia para determinar la expresion de p95HER2 de longitud completa y truncado usando el ensayo CEER™.
La Figura 9 muestra el perfilado de marcadores fosforilados en canceres gastricos. (A) Se muestran imagenes de inmunomatrices representativas para el perfilado de las rutas de las protefnas de transduccion de senales indicadas. La intensidad de las senales de la matriz varfa de color negro/azul oscuro (baja) a color rojo/blanco (alta/saturacion). (B) Mapa de calor y agrupamiento jerarquico de las 434 muestras, basados en los valores de UC del ensayo CEER™ para marcadores activados (fosforilados), medidos a una concentracion de lisado de 10 pg. Cada columna representa un marcador y cada fila representa una muestra de paciente. Los niveles relativos de activacion se representan con una escala de colores en la que el rojo representa el maximo nivel de activacion y el verde representa el mfnimo nivel. Los valores de UC para cada marcador (columna) se clasificaron por deciles. Se anadio una variabilidad temporal (jitter) entre 0 y 0,1 a cada valor de UC de biomarcador para crear particiones con las mismas dimensiones. El dendograma de filas y columnas muestra el resultado del calculo de agrupamiento jerarquico.
La Figura 10 muestra las diferencias de supervivencia sin enfermedad en canceres gastricos basadas en el perfil de RTK activadas. (A & B) Diferencias de supervivencia sin enfermedad despues de una cirugfa curativa en muestras de cancer gastrico de los estadios tumorales II+III. El analisis comparo el conjunto de todas las muestras de cancer gastrico (A) o solo el conjunto de muestras de cancer gastrico HER2(-) (B) entre cohortes con activacion de RTK 0 frente a activacion de RTK >1. La mediana de supervivencia de las dos cohortes en todos los pacientes con cancer gastrico en estadio II+III es de 32,63 meses (activacion de RTK >1) y de 76,53 meses (activacion de RTK 0), y en pacientes con cancer gastrico en estadio II+III HER2(-) es de 30,10 meses (activacion de RTK >1) y de 68,13 meses (activacion de RTK 0). (C & D) Diferencias de supervivencia sin enfermedad despues de una cirugfa curativa que compara cohortes c-MET(+) HER1(-) frente a c-MET(+) HER1(+) en muestras de cancer gastrico HER2(-) (C) o de Estadio I, HER2(-) (D). La mediana de supervivencia de las dos cohortes en pacientes HER2(-) es de 46,17 meses (c-MET(+) hER1(+)) y de 82,80 meses (c-MET(+) HER1(-)). La mediana de los tiempos de supervivencia en los pacientes con cancer gastrico en estadio I HER2(-) no esta definida para ninguna de las cohortes. Se indican los numeros de muestra en cada cohorte, los valores de p y los cocientes de riesgo.
La Figura 11 muestra las diferencias de supervivencia sin enfermedad entre cohortes de cancer gastrico c- MET(+) HER1(-) frente a c-MET(+) HER1(+). Diferencias de supervivencia sin enfermedad despues de una cirugfa curativa en todas las muestras de cancer gastrico (HER2(+) y HER2(-)) que comparan las cohortes c- MET(+) HER1(-) frente a c-MET(+) HER1(+). La mediana de supervivencia de las dos cohortes en pacientes con cancer gastrico es de 46,17 meses (c-mEt(+) HER1(+)) y de 82,80 meses (c-MET(+) HER1(-)). Se indican los
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numeros de muestra en cada cohorte, los valores de p y los cocientes de riesgo.
La Figura 12 muestra la inhibicion de HER1/HER2 y MET activados en celulas de cancer gastrico. Se muestran modulaciones de protefnas de la ruta despues de tratamientos con lapatinib/inhibidor de cMET junto con el efecto fenotfpico de la inhibicion de la ruta sobre la inhibicion del crecimiento de celulas cancerosas con los tratamientos terapeuticos respectivos. HER1, HER2 y c-MET se indican por flechas de color rojo, amarillo y verde respectivamente.
La Figura 13 muestra el perfilado de marcadores fosforilados en CTC y ATC de pacientes con cancer gastrico. (A) Se muestra la expresion y activacion de HER1 y HER2 en CTC aisladas de pacientes con cancer gastrico. Se detectaron fosfo-HER1, fosfo-HER2, HER1 total, HER2 total y CK en al lisado de CTC usando CEER™. (B) Se trataron con farmacos (Lapatinib e inhibidores de cMET) celulas tumorales aisladas de lfquido ascftico obtenido a partir del paciente con cancer gastrico 005-110 a la dosificacion indicada durante 4 horas. Las modulaciones en las fosfoprotefnas despues del tratamiento se detectan por CEER™. Se observo una clara reduccion en los niveles de pHER1, pHER2 y p-cMET tras el tratamiento con farmaco de una manera dependiente de la dosis. Aunque se observo una reduccion de la senal especffica de la diana, tambien se observo una mayor activacion de una RTK no establecida como diana, IGF1R. (C-E) Se trataron celulas tumorales aisladas de lfquido ascftico recogido de pacientes con cancer gastrico, con un coctel de factores de crecimiento (EGF, Heregulina, HGF e IGF) con o sin una concentracion 2 pM de coctel inhibidor (lapatinib y PHA-665.752) o DMSO durante 4 horas a 37 °C. Despues de finalizar el tratamiento con factor de crecimiento/farmaco, las celulas se lisaron y se perfilaron usando CEER™. El valor relativo de UC se definio como la relacion de UC con respecto al valor basal (sin tratamiento con farmaco y sin estimulacion con factor de crecimiento). El tratamiento con factor de crecimiento indujo la activacion de multiples protefnas de transduccion de senales. El tratamiento con farmacos redujo la activacion de las protefnas diana correspondientes.
La Figura 14 muestra una curva patron para HER2 total y HER2 fosforilado. Se uso una curva patron de lisados celulares diluidos en serie preparados a partir de BT474 para normalizar la expresion de HER2 y el grado de fosforilacion en cada muestra. Cada curva se represento en funcion del logaritmo de la intensidad de la senal, medida como unidades relativas de fluorescencia (RFU), frente a la concentracion logarftmica de lisados celulares y con respecto a las lfneas celulares patron. La imagen se muestra con un solo PMT, pero la exploracion con multiples PMT amplfa el rango dinamico para la cuantificacion.
La Figura 15 es la Tabla 2. Esta tabla muestra el estado de amplificacion del gen de HER2 (“1” es el gen amplificado y “0” es el gen no amplificado) y las puntuaciones IHC de HER2 (representadas como “0”, “1”, “2” o “3”) de muestras de cancer gastrico HER2(+) y HER2(-) basadas en criterios de puntuacion de cancer gastrico (GCA) y de cancer de mama (BCA). Los subtipos histologicos de las muestras de cancer gastrico estan sombreados: tipo intestinal (gris claro), tipo difuso (gris medio) y tipo mixto (gris oscuro). La tabla tambien resume el estado de expresion de p95HER2 (“1” es p95(+), “0” es p95(-), “ND” es no determinado) y el estado de fosforilacion (“1” es fosforilado y “0” es no fosforilado) de las moleculas de senalizacion HER1, HER2, HER3, c- MET, IGF1R y PI3K en cada muestra. Se indican los lfmites de UC respectivos para cada marcador.
La Figura 16 es la Tabla 3. Esta tabla muestra la distribucion de numeros de muestra con respecto a cada miembro receptor de eje de la HER quinasa activada y sus coactivaciones con otros miembros de HER. Se indica el estado HER2 y el subtipo histologico de las muestras.
La Figura 17 es la Tabla 4. Esta tabla muestra la distribucion de numeros de muestra con respecto al receptor c- MET activado y sus patrones de coactivacion con otras RTK. Se indica el estado HER2 y el subtipo histologico de las muestras.
La Figura 18 es la Tabla 5. Esta tabla muestra la distribucion de numeros de muestra con respecto al receptor de IGF1 activado y sus patrones de coactivacion con otras RTK. Se indica el estado HER2 y el subtipo histologico de las muestras.
Descripcion detallada de la invencion
I. Introduccion
Con la llegada de la era de la terapia dirigida molecularmente en el campo de la oncologfa, muchos oncologos han experimentado una respuesta espectacular inesperada a agentes dirigidos molecularmente en pacientes con cancer metastasico refractario que, de otra forma, estarfan con cuidados paliativos. En el ambito clfnico, sin embargo, incluso los pacientes seleccionados basandose en su perfil de dianas, con frecuencia no responden a los agentes dirigidos o desarrollan resistencia despues de tener una respuesta inicial espectacular. Los puntos principales que obstaculizan la mejora del efecto terapeutico beneficioso con los agentes dirigidos incluyen: (1) la activacion de rutas concomitantes y redundantes en subgrupos de pacientes; (2) el desarrollo de resistencia por la activacion de acontecimientos de senalizacion alternativos que desvfan la protefna o protefnas dirigidas originalmente por medio de comunicacion entre rutas; (3) una alteracion de caracterfsticas moleculares y patologicas a medida que
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metastatiza y progresa el cancer durante el transcurso del tratamiento anticanceroso; (4) la posibilidad limitada de repetir las biopsias durante o despues de los tratamientos; y (5) la limitacion de diagnosticos complementarios para agentes dirigidos con el fin de identificar posibles mecanismos de resistencia a farmacos para tratar la enfermedad "en desarrollo".
El cancer gastrico es la causa principal de muerte por cancer a nivel mundial, con una incidencia de 18,9/100.000 al ano y una tasa de mortalidad de 14,7/100.000 al ano (vease, por ejemplo, Cunningham et al., Ann. Oncol., 16 Suppl
I, i22-23 (2005)) y es la malignidad mas comun en Corea. El cancer gastrico metastasico sigue siendo un desaffo terapeutico para los oncologos debido a su mal pronostico. Actualmente, el trastuzumab es el unico agente dirigido activo que ha resultado ser eficaz para el cancer gastrico en un ensayo aleatorizado de fase III (vease, por ejemplo, Bang, Y. J. et al., Lancet, 376:687-697 (2010)). Otras protefnas conocidas de rutas activadas en el cancer gastrico incluyen la familia del receptor del factor de crecimiento epidermico humano (HER), el receptor del factor de transicion epitelial mesenquimatico o del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (receptor cMET), la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo 1 (IGF1R).
La presente invencion demuestra que los canceres gastricos pueden segregarse basandose en los perfiles de fosforilacion de rutas de senalizacion de receptores de factores de crecimiento clave que estan activas en este tipo de cancer. En particular, la presente invencion identifica un nivel de heterogeneidad en canceres gastricos basado en perfiles de activacion de rutas de senalizacion que afectaran directamente a la seleccion y resultado de los agentes terapeuticos dirigidos en este tipo de cancer. En aspectos particulares, se ha usado un inmunoensayo nuevo y muy sensible, CEER™, en muestras clfnicas de cancer gastrico, que puede multiplexarse para analizar especfficamente las formas totales y fosforiladas de varias protefnas. El estudio descrito en el Ejemplo 3 demuestra que >40 % de los pacientes con cancer gastrico tienen al menos una quinasa de transduccion de senales activada entre las moleculas HER1, HER2, HER3, c-MET, PI3K e IGF1R. Entre las RTK analizadas en este estudio, los miembros de la familia HER fueron las tirosina quinasas activadas con mas frecuencia, estando HER3 activado en el 28 % de los canceres gastricos, seguido de HER2 (21 %) y de HER1 (15,7 %). Ademas, el estudio descrito en el Ejemplo 3 muestra que los canceres gastricos positivos para HER2 presentan principalmente HER2 y HER3 activados, mientras que los canceres negativos para HER2 tfpicamente tienen activas las rutas de HER1, hER3 y c- MET, y que los canceres gastricos con HER2 activado son un subgrupo distinto de los canceres gastricos con c- MET activado. Ademas, el estudio descrito en el Ejemplo 3 ilustra que la mayorfa de los canceres gastricos (>75 % de canceres gastricos positivos para HER2 y ~85 % de canceres gastricos negativos para HER2) no tienen ninguna RTK activa individual, sino que mas bien se dirigen por redes de RTK activadas concomitantemente.
En particular, el estudio descrito en el Ejemplo 3 demuestra que las caracterfsticas de senalizacion globales en muestras de cancer gastrico que coexpresan p-HER1:p-cMET son diferentes de las de las muestras que expresan p- cMET sin HER1 activado. Se observo una diferencia significativa en la mediana de los tiempos de supervivencia para conjuntos de muestras p-HER1(-):p-cMET(+) frente a p-HER1(+):p-cMET(+). De hecho, este estudio demuestra que la coactivacion de cMET y HER1 mostro peor supervivencia sin enfermedad en comparacion con los pacientes en estadio I con activacion de cMET solo, en un conjunto de muestras negativas para HER2. Como tal, este estudio demuestra que la coactivacion de cMET y HER1 (y opcionalmente HER3) esta muy asociada con canceres gastricos de tipo difuso negativos para HER2, y que estos pacientes con cancer gastrico tienen una supervivencia significativamente peor. De esta manera, este estudio ilustra que la inhibicion terapeutica combinatoria tanto de HER1 como de cMET es una estrategia antitumoral mas eficaz en celulas cancerosas con HER1 y cMET coactivados que la monoterapia contra cualquier diana sola.
II. Definiciones
Como se usan en el presente documento, los siguientes terminos tienen los significados que se les atribuye a menos que se especifique otra cosa.
El termino "cancer" pretende incluir cualquier miembro de una clase de enfermedades caracterizadas por el crecimiento incontrolado de celulas aberrantes. El termino incluye todos los canceres y afecciones neoplasicas conocidas, ya esten caracterizadas como malignas, benignas, de tejidos blandos o solidas, y canceres de todos los estadios y grados incluyendo canceres pre- y post-metastasicos. Los ejemplos de diferentes tipos de cancer incluyen, pero sin limitacion, canceres digestivos y gastrointestinales tales como cancer gastrico (por ejemplo, cancer de estomago), cancer colorrectal, tumores del estroma gastrointestinal (GIST), tumores carcinoides gastrointestinales, cancer de colon, cancer rectal, cancer anal, cancer de conducto biliar, cancer de intestino delgado y cancer esofagico; cancer de mama; cancer de pulmon (por ejemplo, cancer de pulmon no microcftico); cancer de la vesfcula biliar; cancer de hfgado; cancer pancreatico; cancer de apendice; cancer de prostata, cancer de ovario; cancer renal (por ejemplo, carcinoma de celulas renales); cancer del sistema nervioso central; cancer de piel; linfomas; gliomas; coriocarcinomas; canceres de cabeza y cuello; sarcomas osteogenicos; y canceres sangufneos. Como se usa en el presente documento, un "tumor" comprende una o mas celulas cancerosas. En ciertas realizaciones, el cancer gastrico corresponde a un subtipo histologico tal como, por ejemplo, un tipo intestinal, tipo difuso y/o tipo mixto.
El termino "analito" incluye cualquier molecula de interes, tfpicamente una macromolecula tal como un polipeptido, del que se determina la presencia, cantidad (nivel de expresion), estado o nivel de activacion y/o identidad. En
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ciertas realizaciones, el analito es una molecula de transduccion de senales tal como, por ejemplo, un componente de una ruta de senalizacion de HER (EGFR) o c-Met.
La expresion "molecula de transduccion de senales" o "transductor de senales" incluye protefnas u otras moleculas que realizan el proceso mediante el cual una celula convierte una senal o estfmulo extracelular en una respuesta, que implica tfpicamente secuencias ordenadas de reacciones bioqufmicas en el interior de la celula. Los ejemplos de moleculas de transduccion de senales incluyen, pero sin limitacion, tirosina quinasas receptoras tales como EGFR (por ejemplo, EGFR/HER1/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), VEGFR1/FLT1, VEGFR2/FLK1/KDR, VEGFR3/FLT4, FLT3/FLK2, PDGFR (por ejemplo, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, INSR (receptor de la insulina), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (receptor relacionado con el receptor de la insulina), CSF-1R, FGFR 14, HGFR 1-2, CCK4, TRK A-C, c-MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 12, RET, c-ROS, cadherina-V, LTK (tirosina quinasa de leucocito), ALK (quinasa del linfoma anaplasico), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3 y RTK 106; formas truncadas de tirosina quinasas receptoras tales como receptores de HER2 truncados con dominios extracelulares amino-terminales ausentes (por ejemplo, p95ErbB2 (p95m), p110, p95c, p95n, etc.); dfmeros de tirosinas quinasas receptoras (por ejemplo, p95HER2/HER3, p95HER2/HER2, HER2/HER2, HER2/HER3, HER1/HER2, HER2/HER3, HER2/HER4, etc.); tirosina quinasas no receptoras tales como BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack y LIMK; componentes de la cascada de senalizacion de tirosina quinasas tales como AKT (por ejemplo, AKT1, AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PI3K (por ejemplo, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85)), PDK1, PDK2, homologo de fosfatasa y tensina (PTEN), SGK3, 4E-BP1, P70S6K (por ejemplo, variante alfa I de corte y empalme de la quinasa p70 S6), protefna tirosina fosfatasas (por ejemplo, PTP1B, PTPN13, BDP1, etc.), RAF, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, p38, Shc (p66), Ras (por ejemplo, K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Rac1, Cdc42, PLC, PKC, p53, ciclina D1, STAT1, StAt3, fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2), fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3), mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, GSK- 3p, RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67 y paxilina; receptores de hormonas nucleares tales como el receptor de estrogenos (ER), receptor de progesterona (PR), receptor de androgenos, receptor de glucocorticoides, receptor de mineralocorticoides, receptor de vitamina A, receptor de vitamina D, receptor retinoide, receptor de hormonas tiroideas y receptores huerfanos; coactivadores y represores de receptores nucleares tales como los amplificados en el cancer de mama-1 (AIB 1) y correpresor 1 de receptor nuclear (NCOR), respectivamente; y combinaciones de los mismos.
La expresion "componente de una ruta de senalizacion de HER” incluye uno cualquiera o mas de un ligando aguas arriba de un receptor quinasa HER, companero de union de un receptor quinasa HER y/o molecula efectora aguas abajo que se modula a traves de un receptor quinasa HER. Los ejemplos de los componentes de la ruta de senalizacion de HER incluyen, sin limitacion, heregulina, HER1/ErbB1, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4, AKT (por ejemplo, AKT1, AKT2, AKT3, etc.), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PI3K (por ejemplo, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85), etc.), PDK1, PDK2, PTEN, SGK3, 4E-BP1, P70S6K (por ejemplo, variante alfa I de corte y empalme), protefna tirosina fosfatasas (por ejemplo, PTP1B, PTPN13, BDP1, etc.), dfmeros de HER (por ejemplo, HER1/HER1, HER1/p95HER2, HER1/HER2, HER1/HER3, HER1/HER4, HER2/HER2, HER2/p95HER2, HER2/HER3, HER2/HER4, HER3/HER3, HER3/p95HER2, HER3/HER4, HER4/HER4, HER4/p95HER2, etc.), GSK- 3p, PIP2, PIP3, p27 y combinaciones de los mismos.
La expresion “componente de una ruta de senalizacion de c-Met” incluye uno cualquiera o mas de un ligando aguas arriba de c-Met, companero de union de c-Met y/o una molecula efectora aguas abajo que se modula a traves de c- Met. Los ejemplos de componentes de la ruta de senalizacion de c-Met incluyen, pero sin limitacion, factor de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersion (HGF/SF), Plexina B1, CD44v6, AkT (por ejemplo, AKT1, AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), STAT (por ejemplo, STAT1, STAT3), PI3K (por ejemplo, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85)), GRB2, Shc (p66), Ras (por ejemplo, K-Ras, N-Ras, H-Ras), GAB1, SHP2, SRC, GRB2, CRKL, PLCy, PKC (por ejemplo, PKCa, PKCp, PKC6), paxilina, FAK, aducina, RB, RB1, PYK2 y combinaciones de los mismos.
La expresion "estado de activacion" se refiere a si una molecula de transduccion de senales particular, tal como un componente de la ruta de senalizacion de HER o c-Met, esta activada. De forma similar, la expresion "nivel de activacion" se refiere a la medida en la que esta activada una molecula de transduccion de senales particular, tal como un componente de la ruta de senalizacion de HER o c-Met. El estado de activacion tfpicamente corresponde al estado de fosforilacion, ubiquitinacion y/o complejacion de una o mas moleculas de transduccion de senales. Los ejemplos no limitantes de estados de activacion (indicados entre parentesis) incluyen: HER1/EGFR (EGFRvIII, EGFR fosforilado (p-), EGFR:Shc, EGFR ubiquitinado (u-), p-EGFRvIII); ErbB2 (p-ErbB2, p95HER2 (ErbB2 truncado), p-p95HER2, ErbB2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); c-MET (p-c-MET, complejo c-Met:HGF); AKT1 (p-AKT1); AKT2 (p-AKT2); AKT3 (p-AKT3); PTEN (p-PTEN); P70S6K (p-P70S6K); MEK (p-MEK); ERK1 (p-ERK1); ERK2 (p-ERK2); PDK1 (p-PDK1); PDK2 (p-PDK2); SGK3 (p-SGK3); 4E-BP1 (p-4E-BP1); PIK3R1 (p-PIK3R1); c-KIT (p-c-KIT); ER (p-ER); IGF-1R (p-IGF-1R, IGF-1R:IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1 R:PI3K); INSR (p-INSR); FLT3 (p- FLT3); HGFR1 (p-HGFR1); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRA (p-PDGFRA); PDGFRB (p-PDGFRB); VEGFR1 (p-VEGFR1, VEGFR1:PLCy, VEGFR1:Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLCy, VEGFR2:Src, VEGFR2: heparan sulfato, VEGFR2:VE-cadherina); VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFR1); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p- FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); TIE1 (p-TIEl); TIE2 (p-TIE2); EPHA (p-EPHA); EPHB (p-EPHB); GSK-3p (p-GSK-3p);
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NFKB (p-NFKB), IKB (p-IKB, p-P65:IKB); BAD (p-BAD, BAD:14-3-3); mTOR (p-mTOR); Rsk-1 (p-Rsk-1); Jnk (p-Jnk); P38 (p-P38); STAT1 (p-STAT1); STAT3 (p-STAT3); FAK (p-FAK); RB (p-RB); Ki67; p53 (p-p53); CREB (p-CREB); c- Jun (p-c-Jun); c-Src (p-c-Src); paxilina (p-paxilina); GRB2 (p-GRB2), Shc (p-Shc), Ras (p-Ras), GAb1 (p-GAB1), SHP2 (p-SHP2), GRB2 (p-GRB2), CRKL (p-CRKL), PLCy (p-PLCy), PKC (por ejemplo, p-PKCa, p-PKCp, p-PKC8), aducina (p-aducina), RB1 (p-RB1) y PYK2 (p-PYK2).
El termino "muestra", como se usa en el presente documento, incluye cualquier especimen biologico obtenido de un paciente. Las muestras incluyen, sin limitacion, sangre entera, plasma, suero, globulos rojos, globulos blancos (por ejemplo, celulas mononucleares de sangre periferica), fluido de lavado ductal, lfquido ascftico, lfquido de derrame pleural, aspirado de pezon, linfa (por ejemplo, celulas tumorales diseminadas de los ganglios linfaticos), aspirado de medula osea, saliva, orina, deposiciones (es decir, heces), esputo, fluido de lavado bronquial, lagrimas, aspirado de aguja fina (por ejemplo, recogido por aspiracion con aguja fina periareolar aleatoria), cualquier otro fluido corporal, una muestra de tejido (por ejemplo, tejido tumoral), tal como una biopsia de un tumor (por ejemplo, biopsia con aguja) o un ganglio linfatico (por ejemplo, biopsia de ganglio linfatico centinela), una muestra de tejido (por ejemplo, tejido tumoral), tal como una reseccion quirurgica de un tumor, y extractos celulares de los mismos. En algunas realizaciones, la muestra es sangre entera o un componente fraccional de la misma tal como plasma, suero o un sedimento celular. En otras realizaciones, la muestra se obtiene aislando celulas circulantes de un tumor solido de sangre entera o una fraccion celular de la misma, usando cualquier tecnica conocida en este campo. En otras realizaciones adicionales, la muestra es una muestra de tejido tumoral incluido en parafina y fijado con formalina (FFPE), por ejemplo, de un tumor solido tal como un cancer gastrico. En realizaciones particulares, la muestra es un lisado de tumor o un extracto preparado a partir de tejido congelado obtenido de un sujeto que tiene cancer gastrico.
Una "biopsia" se refiere al proceso de retirar una muestra de tejido para una evaluacion de diagnostico o pronostico, y al propio especimen de tejido. A los metodos y composiciones de la presente invencion se les pueden aplicar cualquier tecnica de biopsia conocida en este campo. La tecnica de biopsia aplicada generalmente dependera del tipo de tejido a evaluar y del tamano y tipo de tumor (es decir, solido o suspendido (es decir, sangre o lfquido ascftico)), entre otros factores. Las tecnicas de biopsia representativas incluyen biopsia escisional, biopsia incisional, biopsias de aguja (por ejemplo, biopsia con aguja gruesa, biopsia de aspiracion con aguja fina, etc.), biopsia quirurgica y biopsia de medula osea. Se analizan tecnicas de biopsia, por ejemplo, en Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16a ed., 2005, Capftulo 70, y a lo largo de la Parte V. Un experto en la materia apreciara que pueden realizarse tecnicas de biopsia para identificar celulas cancerosas y/o precancerosas en una muestra de tejido dada.
El termino "sujeto" o "paciente" o "individuo" tfpicamente incluye seres humanos, pero tambien puede incluir otros animales tales como, por ejemplo, otros primates, roedores, caninos, felinos, equinos, ovinos, porcinos y similares.
Como se usa en el presente documento, la expresion "serie de dilucion" pretende incluir una serie de concentraciones decrecientes de una muestra particular (por ejemplo, lisado celular) o reactivo (por ejemplo, anticuerpo). Una serie de dilucion tfpicamente se produce por un proceso de mezcla de una cantidad medida de una concentracion de partida de una muestra o reactivo con un diluyente (por ejemplo, tampon de dilucion) para crear una menor concentracion de la muestra o reactivo, y repitiendo el proceso las veces suficientes para obtener el numero deseado de diluciones seriadas. La muestra o reactivo puede diluirse en serie al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500 o 1.000 veces para producir una serie de dilucion que comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 concentraciones decrecientes de la muestra o reactivo. Por ejemplo, una serie de dilucion que comprende una dilucion seriada de 2 veces de un reactivo de anticuerpo de captura a una concentracion de partida de 1 mg/ml puede producirse mezclando una cantidad de la concentracion de partida del anticuerpo de captura con una cantidad igual de un tampon de dilucion para crear una concentracion de 0,5 mg/ml del anticuerpo de captura, y repitiendo el proceso para obtener concentraciones de anticuerpo de captura de 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,0325 mg/ml, etc.
La expresion "rango dinamico superior", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un ensayo de detectar un analito especffico en tan solo una celula o en tantas como miles de celulas. Por ejemplo, los inmunoensayos descritos en el presente documento poseen un rango dinamico superior porque ventajosamente detectan una molecula de transduccion de senales particular de interes en aproximadamente de 1-10.000 celulas (por ejemplo, aproximadamente 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1.000, 2.500, 5.000, 7.500, 10.000 celulas) usando una serie de dilucion de concentraciones de anticuerpo de captura.
Una "matriz" o "micromatriz" comprende un conjunto y/o series de dilucion distintas de anticuerpos de captura inmovilizados o contenidos en un soporte solido tal como, por ejemplo, vidrio (por ejemplo, un portaobjetos), plastico, microtarjetas, agujas, filtros, perlas (por ejemplo, perlas magneticas, perlas de poliestireno, etc.), papel, membrana (por ejemplo, nailon, nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno, (PVDF), etc.), haces de fibras o cualquier otro sustrato adecuado. Los anticuerpos de captura generalmente se inmovilizan o se mantienen en el soporte solido a traves de interacciones covalentes o no covalentes (por ejemplo, enlaces ionicos, interacciones hidrofobas, enlaces de hidrogeno, fuerzas de Van der Waals, enlaces dipolo-dipolo). En ciertos casos, los anticuerpos de captura comprenden etiquetas de captura que interaccionan con agentes de captura unidos al soporte solido. Las matrices
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usadas en los ensayos descritos en el presente documento tfpicamente comprenden una pluralidad de anticuerpos de captura y/o concentraciones de anticuerpo de captura diferentes que se acoplan a la superficie de un soporte solido en diferentes localizaciones conocidas/direccionables.
La expresion "anticuerpo de captura" pretende incluir un anticuerpo inmovilizado que es especffico para (es decir, se une, se une por o forma un complejo con) uno o mas analitos de interes en una muestra, tal como un extracto celular. En realizaciones particulares, el anticuerpo de captura esta contenido en un soporte solido en una matriz. En Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO) y BD Biosciences (San Jose, CA) estan disponibles anticuerpos de captura adecuados para inmovilizar cualquiera de una diversidad de moleculas de transduccion de senales en un soporte solido.
La expresion “anticuerpo de deteccion”, como se usa en el presente documento, incluye un anticuerpo que comprende un marcador detectable que es especffico para (es decir, se une, se une por o forma un complejo con) uno o mas analitos de interes en una muestra. La expresion tambien incluye un anticuerpo que es especffico para uno o mas analitos de interes, en donde el anticuerpo puede unirse a otra especie que comprende un marcador detectable. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen, pero sin limitacion, marcadores de biotina/estreptavidina, marcadores de acido nucleico (por ejemplo, oligonucleotido), marcadores reactivos qufmicamente, marcadores fluorescentes, marcadores enzimaticos, marcadores radiactivos, y combinaciones de los mismos. En Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO) y BD Biosciences (San Jose, CA) estan disponibles anticuerpos de deteccion adecuados para detectar el estado de activacion y/o la cantidad total de cualquiera de una diversidad de moleculas de transduccion de senales. Como ejemplo no limitante, en Santa Cruz Biotechnology estan disponibles anticuerpos fosfoespecfficos contra diversas formas fosforiladas de moleculas de transduccion de senales tales como EGFR, c-KIT, c-Src, FLK-1, PDGFRA, PDGFRB, AKT, MAPK, PTEN, Raf y MEK.
La expresion "anticuerpo dependiente del estado de activacion" incluye un anticuerpo de deteccion que es especffico para (es decir, se une, se une por o forma un complejo con) un estado de activacion particular de uno o mas analitos de interes en una muestra. En realizaciones preferidas, el anticuerpo dependiente del estado de activacion detecta la fosforilacion, ubiquitinacion y/o estado de complejacion de uno o mas analitos tales como una o mas moleculas de transduccion de senales. En algunas realizaciones, la fosforilacion de miembros de la familia EGFR de tirosina quinasas receptoras y/o la formacion de complejos heterodimericos entre miembros de la familia EGFR se detecta usando anticuerpos dependientes del estado de activacion. En realizaciones particulares, los anticuerpos dependientes del estado de activacion son utiles para detectar uno o mas sitios de fosforilacion en una o mas de las siguientes moleculas de transduccion de senales (los sitios de fosforilacion corresponden a la posicion del aminoacido en la secuencia de la protefna humana): EGFR/HER1/ErbB1 (por ejemplo, tirosina (Y) 1068); ErbB2/HER2 (por ejemplo, Y1248); ErbB3/HER3 (por ejemplo, Y1289); ErbB4/HER4 (por ejemplo, Y1284); c-Met (por ejemplo, Y1003, Y1230, Y1234, Y1235 y/o Y1349); SGK3 (por ejemplo, treonina (T) 256 y/o serina (S) 422); 4E- BP1 (por ejemplo, T70); ERK1 (por ejemplo, T185, Y187, T202 y/o Y204); ERK2 (por ejemplo, T185, Y187, T202 y/o Y204); MEK (por ejemplo, S217 y/o S221); PIK3R1 (por ejemplo, Y688); PDK1 (por ejemplo, S241); P70S6K (por ejemplo, T229, T389 y/o S421); PTEN (por ejemplo, S380); AKT1 (por ejemplo, s473 y/o t308); AKT2 (por ejemplo, S474 y/o T309); AKt3 (por ejemplo, S472 y/o T305); GSK-3p (por ejemplo, S9); NFKB (por ejemplo, S536); iKb (por ejemplo, S32); BAD (por ejemplo, S112 y/o S136); mTOR (por ejemplo, S2448); Rsk-1 (por ejemplo, T357 y/o S363); Jnk (por ejemplo, T183 y/o Y185); P38 (por ejemplo, T180 y/o Y182); STAT3 (por ejemplo, y705 y/o S727); FAK (por ejemplo, Y397, Y576, S722, Y861 y/o S910); RB (por ejemplo, S249, T252, S612 y/o S780); RB1 (por ejemplo, S780); aducina (por ejemplo, S662 y/o S724); PyK2 (por ejemplo, Y402 y/o Y881); PKCa (por ejemplo, S657); PKCa/p (por ejemplo, T368 y/o T641); PKC6 (por ejemplo, T505); p53 (por ejemplo, S392 y/o S20); CREB (por ejemplo, S133); c-Jun (por ejemplo, S63); c-Src (por ejemplo, Y416); y paxilina (por ejemplo, Y31 y/o Y118).
La expresion “anticuerpo independiente del estado de activacion” incluye un anticuerpo de deteccion que es especffico para (es decir, se une, se une por o forma un complejo con) uno o mas analitos de interes en una muestra independientemente de su estado de activacion. Por ejemplo, el anticuerpo independiente del estado de activacion puede detectar formas tanto fosforiladas como no fosforiladas de uno o mas analitos tales como una o mas moleculas de transduccion de senales.
El termino “incubacion” se usa como sinonimo de “contacto” y “exposicion” y no implica ningun requisito especffico de tiempo o temperatura a menos que se indique otra cosa.
"Tirosina quinasas receptoras" o "RTK" incluye una familia de cincuenta y seis (56) protefnas caracterizadas por un dominio transmembrana y un motivo tirosina quinasa. Las RTK funcionan en la senalizacion celular y transmiten senales que regulan el crecimiento, la diferenciacion, la adhesion, la migracion y la apoptosis. La activacion mutacional y/o la sobreexpresion de tirosina quinasas receptoras transforma las celulas y con frecuencia juega un papel crucial en el desarrollo y propagacion de canceres. Las RTK se han convertido en dianas de diversos agentes dirigidos molecularmente tales como trastuzumab, cetuximab, gefitinib, erlotinib, sunitinib, imatinib, nilotinib y similares. Una ruta de transduccion de senales bien caracterizada es la ruta de la MAP quinasa, que es responsable
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de la transduccion de la senal procedente del factor de crecimiento epidermico (EGF) para la promocion de la proliferacion celular en celulas.
La expresion "supervivencia sin enfermedad" incluye el periodo de tiempo despues del tratamiento para una enfermedad especffica (por ejemplo, cancer) durante el cual un paciente sobrevive sin signos de la enfermedad (por ejemplo, sin recurrencia conocida). En ciertas realizaciones, la supervivencia sin enfermedad es un parametro clfnico usado para evaluar la eficacia de una terapia particular, que normalmente se mide en unidades de 1 o 5 anos.
La expresion “supervivencia sin progresion” incluye el periodo del tiempo durante y despues del tratamiento para una enfermedad especffica (por ejemplo, cancer) que un paciente vive con la enfermedad sin sfntomas adicionales de la enfermedad.
La expresion "supervivencia global" incluye el criterio de valoracion clfnico que describe pacientes que estan vivos durante un periodo de tiempo definido despues de que se les haya diagnosticado o tratado para una enfermedad, tal como cancer.
III. Descripcion de las realizaciones
La presente invencion proporciona ensayos y metodos para predecir la supervivencia de un sujeto que tiene un cancer gastrico en estadio temprano (por ejemplo, estadio I o II o transicion entre estos estadios) despues de la cirugfa del tumor. En ciertos aspectos, la invencion proporciona ensayos y metodos para predecir la eficacia terapeutica y/o la respuesta a la terapia combinada en un sujeto que tiene un cancer gastrico en estadio temprano. La presente invencion proporciona ademas metodos para tratar a un sujeto que tiene un cancer gastrico en estadio temprano mediante la administracion de una terapia combinada adaptada a los biomarcadores de transduccion de senales que estan activados en el cancer gastrico. En realizaciones particulares, los metodos de la presente invencion se basan en la deteccion del estado de activacion o el nivel de una combinacion especffica de analitos transductores de senales en una celula cancerosa obtenida de un sujeto que tiene un cancer gastrico en estadio temprano. De esta manera, los metodos descritos en el presente documento son particularmente utiles para predecir la supervivencia o pronostico de un sujeto que tiene un cancer gastrico en estadio temprano y para guiar las decisiones de tratamiento tanto antes de la cirugfa del tumor como despues de la cirugfa del tumor mediante la identificacion de los sujetos que se beneficiarfan de la terapia combinada en contraposicion a la monoterapia, en vista del estado o nivel de activacion detectado para los analitos.
En ciertos aspectos, la presente invencion proporciona un metodo para predecir la supervivencia de un sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I o II despues de una cirugfa tumoral, comprendiendo el metodo:
(a) determinar la presencia o el nivel de activacion de al menos dos analitos que comprenden cMET y HER1 en una celula cancerosa obtenida del sujeto; y
(b) predecir la supervivencia del sujeto basandose en la presencia o nivel de activacion de dichos al menos dos analitos determinados en la etapa (a).
En algunas realizaciones, el metodo predice la supervivencia sin enfermedad o la supervivencia sin progresion de un sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I o II. En ciertos casos, el cancer gastrico en estadio I es cancer gastrico en estadio IA o estadio IB. En ciertos otros casos, el cancer gastrico en estadio II es un cancer gastrico en estadio IIA o estadio IIB. En una realizacion alternativa, el sujeto tiene un cancer gastrico en estadio 0. En otra realizacion alternativa, el sujeto tiene un cancer gastrico en estadio tardfo (por ejemplo, estadio III, tal como estadio IIIA, IIIB o IIIC, o estadio IV). Vease, por ejemplo, en Washington, Ann. Surg. Oncol., 17:3077-9 (2010) una descripcion de la 7a Edicion del sistema de estadificacion de canceres gastricos AJCC.
En realizaciones particulares, cMET y HER1 estan coactivados en la celula cancerosa. En estas realizaciones, se predice que el sujeto tiene una peor supervivencia (por ejemplo, peor pronostico) que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1. Los ejemplos no limitantes de resultados de peor supervivencia incluyen una duracion de la vida mas corta, un periodo de tiempo mas corto para la recurrencia del cancer, un periodo de tiempo mas corto para desarrollar sfntomas de cancer, un mayor riesgo de recafda y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el cancer gastrico en estadio I o II corresponde a un subtipo histologico tal como, por ejemplo, un cancer gastrico de tipo intestinal, de tipo difuso o de tipo mixto. En realizaciones particulares, el cancer gastrico en estadio I o II es un cancer gastrico de tipo difuso. En otras realizaciones, cMET y HER1 estan coactivados en el cancer gastrico de tipo difuso. En estas realizaciones, se predice que el sujeto tiene peor supervivencia (por ejemplo, peor pronostico) que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMET pero sin activacion de HER1 y/o un cancer gastrico de tipo difuso.
En otras realizaciones, la etapa (a) comprende ademas determinar la presencia o el nivel de activacion de al menos un analito adicional que comprende HER2 y/o HER3 en la celula cancerosa. En ciertos casos, cMET y HER1 estan coactivados pero HER2 no esta activado en la celula cancerosa. En estos casos, se predice que el sujeto tiene peor
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supervivencia (por ejemplo, peor pronostico) que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1 y/o HER2. En ciertos otros casos, cMET, HER1 y HER3 estan coactivados pero HER2 no esta activado en la celula cancerosa. En estos casos, se predice que el sujeto tiene peor supervivencia (por ejemplo, peor pronostico) que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1, HER2 y/o HER3.
En algunas realizaciones, un peor resultado de supervivencia para el sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I o II incluye una duracion de la vida, supervivencia sin enfermedad o supervivencia sin progresion que es mas corta en dfas, semanas, meses o anos (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 dfas, semanas, meses o anos) que la de un sujeto de control (por ejemplo, un sujeto con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMET pero sin activacion de HER1).
En ciertas realizaciones, la celula cancerosa se afsla de una muestra de tejido tumoral, tal como una muestra de tumor gastrico primario, por ejemplo, un tumor gastrico en estadio I o II. En algunos casos, la celula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en una celula tumoral primaria, una celula tumoral circulante (CTC), una celula tumoral ascftica (CTA) y combinaciones de las mismas. En casos particulares, se produce un extracto celular a partir de la celula cancerosa aislada.
En ciertas realizaciones, el metodo comprende ademas:
(c) administrar un inhibidor de cMET solo o un inhibidor de cMET en combinacion con un inhibidor de HER1 al sujeto basandose en la presencia o nivel de activacion de dicho al menos cMET y HER1 determinado en la etapa (a).
En algunas realizaciones, se administra un inhibidor de cMET en combinacion con un inhibidor de HER1 cuando cMET y HER1 estan coactivados en la celula cancerosa y, opcionalmente, cuando HER2 no esta activado y/o HER3 esta activado en la celula cancerosa. En el presente documento se describen ejemplos no limitantes de inhibidores de cMET e inhibidores de HER1. En realizaciones particulares, el inhibidor o inhibidores de cMET foretinib y/o PHA- 665752 se administran en combinacion con el inhibidor de HER1 lapatinib. En otras realizaciones, al sujeto se le administran uno o mas farmacos anticancerosos adicionales. Mas adelante se describen ejemplos no limitantes de farmacos anticancerosos adicionales adecuados.
En realizaciones particulares, la etapa (a) comprende determinar la presencia o el nivel de activacion de los analitos (por ejemplo, al menos cMET y HER1 y, opcionalmente, HER2 y/o HER3, asf como de otros biomarcadores de transduccion de senales) con CEER™. En otras realizaciones, la etapa (a) comprende ademas determinar la presencia o el nivel de expresion de uno o mas analitos (por ejemplo, al menos cMET y HER1 y, opcionalmente, HER2 y/o HER3, asf como de otros biomarcadores de transduccion de senales). En realizaciones particulares, la presencia o nivel de expresion de dichos analitos se determina con CEER™. En ciertas realizaciones, el nivel de expresion y/o el nivel de activacion de los analitos se calibra frente a una curva patron generada para cada uno de los analitos.
En ciertos casos, los metodos de la presente invencion pueden comprender ademas la etapa de proporcionar el resultado de la prediccion de la etapa (b) a un usuario (por ejemplo, a un medico, tal como un oncologo o un medico general) en un formato legible. En algunos casos, el metodo puede comprender ademas enviar o presentar el resultado de la prediccion de la etapa (b) a un medico, por ejemplo, un oncologo o un medico general. En otros casos, el metodo puede comprender ademas registrar o almacenar el resultado de la prediccion en la etapa (b) en una base de datos informatica u otra maquina o dispositivo adecuado para almacenar informacion, por ejemplo, en un laboratorio.
En otros aspectos, la presente invencion proporciona un metodo para tratar a un sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I o II, comprendiendo el metodo:
administrar una terapia combinada que comprende un inhibidor de cMET y un inhibidor de HER1 al sujeto, en donde cMET y HER1 estan coactivados en el cancer gastrico en estadio I o II.
En algunas realizaciones, el metodo mejora el pronostico (por ejemplo, aumenta la supervivencia sin enfermedad o la supervivencia sin progresion) de un sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I o II. En ciertos casos, el cancer gastrico en estadio I es un cancer gastrico en estadio IA o estadio IB. In en ciertos otros casos, el cancer gastrico en estadio II es un cancer gastrico en estadio IIA o estadio IIB. En una realizacion alternativa, el sujeto tiene un cancer gastrico en estadio 0. En otra realizacion alternativa, el sujeto tiene un cancer gastrico en estadio tardfo (por ejemplo, estadio III, tal como estadio IIIA, IIIB o IIIC, o estadio IV). Vease, por ejemplo, en Washington, Ann. Surg. Oncol., 17:3077-9 (2010) una descripcion de la 7a Edicion del sistema de estadificacion de canceres gastricos AJCC.
En ciertas realizaciones, el metodo aumenta la supervivencia (por ejemplo, aumenta la supervivencia sin enfermedad o la supervivencia sin progresion) del sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I o II en dfas, semanas, meses o anos (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25,
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30, 35, 40, 45 o 50 dfas, semanas, meses o anos) en comparacion con un sujeto de control que tiene cancer gastrico en estadio I o II con coactivacion de cMET y HER1 que no recibe la terapia combinada.
En otras realizaciones, el sujeto (por ejemplo, antes de iniciar la terapia combinada) tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMet en ausencia de activacion de HERl. Los ejemplos no limitantes de peores resultados de supervivencia incluyen una duracion de la vida mas corta, un tiempo mas corto hasta la recurrencia del cancer, un tiempo mas corto hasta el desarrollo de sfntomas de cancer, un mayor riesgo de recafdas y combinaciones de los mismos.
En realizaciones adicionales, cMET y HER1 estan coactivados pero HER2 no esta activado en el cancer gastrico en estadio I o II. En dichas realizaciones, el sujeto (por ejemplo, antes de iniciar la terapia combinada) tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMet en ausencia de activacion de HER1 y/o HER2.
En otras realizaciones, cMET, HER1 y HER3 estan coactivados en el cancer gastrico en estadio I o II. En estas realizaciones, el sujeto (por ejemplo, antes de iniciar la terapia combinada) tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1, HER2 y/o HER3.
En algunas realizaciones, un peor resultado de supervivencia para el sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I o II incluye una duracion de la vida, supervivencia sin enfermedad o supervivencia sin progresion que es mas corta en dfas, semanas, meses o anos (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 dfas, semanas, meses o anos) en comparacion con un sujeto de control (por ejemplo, un sujeto con cancer gastrico en estadio I o II con activacion de cMET pero sin activacion de HER1).
En otras realizaciones, la terapia combinada se administra al sujeto como una terapia primaria (por ejemplo, como un tratamiento preoperatorio para reducir el tamano de un tumor gastrico). En otras realizaciones, la terapia combinada se administra al sujeto como una terapia adyuvante posoperatoria (por ejemplo, despues de la cirugfa del tumor). En realizaciones particulares, la terapia combinada puede administrarse tanto antes de la operacion como una terapia primaria como despues de la operacion como una terapia adyuvante. En ciertos casos, al sujeto se le administran cantidades terapeuticamente eficaces de un inhibidor de cMET y un inhibidor de HER1.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de cMET se selecciona del grupo que consiste en foretinib (GSK1363089/XL- 880), PHA-665752, AMG102, MetMab™, ARQ197, JNJ-38877605, PF-2341066, PF-04217903, SGX523, XL184, MGCD265, MK-2461 y combinaciones de los mismos. En ciertas otras realizaciones, el inhibidor de HER1 se selecciona del grupo que consiste en erlotinib, lapatinib, gefitinib, BIBW-2992 y combinaciones de los mismos. En realizaciones particulares, la terapia combinada comprende el o los inhibidores de cMET foretinib y/o PHA-665752 y el inhibidor de HER1 lapatinib.
En otras realizaciones, los metodos de la presente invencion comprenden ademas la administracion de uno o mas farmacos anticancerosos adicionales al sujeto. En realizaciones particulares, el farmaco anticanceroso comprende un agente que interfiere con la funcion de componentes de la ruta de transduccion de senales activada en las celulas cancerosas, que incluye, pero sin limitacion, agentes antisenalizacion (por ejemplo, un farmaco citostatico) tales como un anticuerpo monoclonal o un inhibidor de tirosina quinasa; agentes antiproliferativos; agentes quimioterapeuticos (es decir, farmacos citotoxicos); agentes terapeuticos hormonales; agentes radioterapeuticos; vacunas; y/o cualquier otro compuesto con capacidad de reducir o anular el crecimiento incontrolado de celulas aberrantes tales como celulas cancerosas. En realizaciones preferidas, uno o mas de los farmacos anticancerosos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en pan-inhibidores de HER, inhibidores de HER3, inhibidores de HER1/2, inhibidores de HER1/2/4, inhibidores de IGF-1R, inhibidores de MEK, inhibidores de PI3K, inhibidores de mTOR y combinaciones de los mismos.
Los ejemplos de agentes antisenalizacion adecuados para uso en la presente invencion incluyen, sin limitacion, anticuerpos monoclonales tales como trastuzumab (Herceptin®), pertuzumab (2C4), alemtuzumab (Campath®), bevacizumab (Avastin®), cetuximab (Erbitux®), gemtuzumab (Mylotarg®), panitumumab (Vectibix™), rituximab (Rituxan®) y tositumomab (BEXXAR®); inhibidores de tirosina quinasa tales como gefitinib (Iressa®), sunitinib (Sutent®), erlotinib (Tarceva®), lapatinib (GW-572016; Tykerb®), canertinib (CI 1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/zK222584), sorafenib (BAY 43-9006; Nexavar®), mesilato de imatinib (Gleevec®), leflunomida (SU101), vandetanib (ZACTIMA™; ZD6474), pelitinib (EKB-569), CP-654577, CP-724714, HKI-272, PKI-166, AEE788, BMS-599626, HKI-357, BIBW-2992, ARRY-334543, JNJ-26483327 y combinaciones de los mismos.
Los agentes antiproliferativos ejemplares incluyen inhibidores de mTOR tales como sirolimus (rapamicina), temsirolimus (CCI-779), everolimus (RAD001), bEz-235 y XL765; inhibidores de AKT tales como 1L6-hidroximetil- quiro-inositol-2-(R)-2-O-metil-3-O-octadecil-sn-glicerocarbonato, acetato de 9-metoxi-2-metilelipticinio, 1,3-dihidro-1- (1-((4-(6-fenil-1H-imidazo[4,5-g]quinoxalin-7-yl)fenil)metil)-4-piperidinil)-2H-bencidimazol-2-ona,10-(4'-(N-dietilamino) butil)-2-clorofenoxacina, 3-formilcromona tiosemicarbazona (complejo Cu(II)Cl2), API-2, un peptido de 15 unidades derivado de los aminoacidos 10-24 del proto-oncogen TCL1 (Hiromura et al., J. Biol. Chem., 279:53407-53418
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(2004), KP372-1, y los compuestos descritos en Kozikowski et al., J. Am. Chem. Soc., 125:1144-1145 (2003) y Kau et al., Cancer Cell, 4:463-476 (2003); inhibidores de PI3K tales como PX-866, wortmanina, LY 294002, quercetina, citrato de tetrodotoxina, maleato de tioperamida, GDC-0941 (957054-30-7), IC87114, PI-103, PIK93, BEZ-235 (NVP- BEZ235), TGX-115, ZSTK474, (-)-deguelina, NU 7026, miricetina, tandutinib, bismesilato de GDC-0941, GSK690693, KU-55933, MK-2206, OSU-03012, perifosina, triciribina, XL-147, PIK75, TGX-221, NU 7441, PI 828, XL-765 y WHI-P 154; inhibidores de MEK tales como PD98059, ARRY-162, RDEA119, U0126, GDC-0973, PD184161, AZD6244, AZD8330, PD-0325901 y ARRY-142886; inhibidores de IGF-1R tales como BMS-536924; y combinaciones de los mismos.
Los ejemplos no limitantes de pan-inhibidores de HER incluyen PF-00299804, neratinib (HKI-272), AC480 (BMS- 599626), BMS-690154, PF-02341066, HM781-36B, CI-1033, BIBW-2992 y combinaciones de los mismos.
Los ejemplos no limitantes de agentes quimioterapeuticos incluyen farmacos basados en platino (por ejemplo, oxaliplatino, cisplatino, carboplatino, espiroplatino, iproplatino, satraplatino, etc.), agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucilo, busulfan, melfalan, mecloretamina, uramustina, tiotepa, nitrosoureas, etc.), anti-metabolitos (por ejemplo, 5-fluorouracilo, 5-fluorocitosina, azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, leucovorina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina (Gemzar®), pemetrexed (ALIMTA®), raltitrexed, etc.), alcaloides de plantas (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, podofilotoxina, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), etc.), inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, irinotecan, topotecan, amsacrina, etoposido (VP16), etoposido fosfato, teniposido, etc.), antibioticos antitumorales (por ejemplo, doxorubicina, adriamicina, daunorubicina, epirubicina, actinomicina, bleomicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, etc.), sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, estereoisomeros de los mismos, derivativos de los mismos, analogos de los mismos y combinaciones de los mismos.
Los ejemplos de agentes terapeuticos hormonales incluyen, sin limitacion, inhibidores de aromatasa (por ejemplo, aminoglutetimida, anastrozol (Arimidax®), letrozol (Femara®), vorozol, exemestano (Aromasin®), 4-androsteno- 3,6,17-triona (6-OXO), 1,4,6-androstatrien-3,17-diona (ATD), formestano (Lentaron®), etc.), moduladores selectivos de receptores de estrogenos (por ejemplo, bazedoxifeno, clomifeno, fulvestrant, lasofoxifeno, raloxifeno, tamoxifeno, toremifeno, etc.), esteroides (por ejemplo, dexametasona), finasterida y agonistas de la hormona de liberacion de gonadotropina (GnRH) tales como goserelina, sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, estereoisomeros de los mismos, derivados de los mismos, analogos de los mismos y combinaciones de los mismos.
Los ejemplos no limitantes de vacunas para cancer utiles en la presente invencion incluyen ANYARA de Active Biotech, DCVax-LB de Northwest Biotherapeutics, EP-2101 de iDm Pharma, GV1001 de Pharmexa, IO-2055 de Idera Pharmaceuticals, INGN 225 de Introgen Therapeutics y Stimuvax de Biomira/Merck.
Los ejemplos de agentes radioterapeuticos incluyen,
89Sr, 8fV, 87Y, 90Y, ™5Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm,
pero sin limitacion, radionuclidos tales como 47Sc, 64Cu, 67Cu, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi, opcionalmente
conjugados con anticuerpos dirigidos contra antfgenos tumorales.
En ciertas realizaciones, uno o mas farmacos anticancerosos adicionales incluyen lapatinib para HER1/2, gefitinib para HER1/2/4, BIBW-2992 para HER1/2, BMS-536924 para IGF-1R, PD-325901 para MEK, BEZ-235 para PI3K y mTOR, y combinaciones de los mismos.
En realizaciones particulares, la presencia o nivel de activacion de analitos tales como cMET y HER1 y, opcionalmente, HER2 y/o HER3 (asf como otros biomarcadores de transduccion de senales) se determina en una celula cancerosa obtenida del sujeto. En algunos casos, la celula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en una celula tumoral primaria, una celula tumoral circulante (CTC), una celula tumoral ascftica (CTA), y combinaciones de las mismas.
En ciertas realizaciones, el metodo comprende ademas determinar la presencia o el nivel de activacion de analitos tales como cMET y HER1 y, opcionalmente, HER2 y/o HER3 (asf como otros biomarcadores de transduccion de senales) en una celula cancerosa obtenida del sujeto antes de la administracion de la terapia combinada, por ejemplo, para determinar si cMET y HER1 estan coactivados en el cancer gastrico en estadio I o II. En realizaciones particulares, la presencia o el nivel de activacion de dichos analitos (por ejemplo, al menos cMET y HER1, opcionalmente HER2 y/o HER3) se determina con CEER™.
En ciertas realizaciones, el metodo comprende ademas determinar la presencia o el nivel de expresion de analitos tales como cMET y HER1 y, opcionalmente, HER2 y/o HER3 (asf como otros biomarcadores de transduccion de senales) en una celula cancerosa obtenida del sujeto antes de la administracion de la terapia combinada, por ejemplo, para determinar si cMET y HER1 estan coexpresados en el cancer gastrico en estadio I o II. En realizaciones particulares, la presencia o el nivel de expresion de dichos analitos (por ejemplo, al menos cMET y HER1, opcionalmente HER2 y/o HER3) se determina con CEER™. En ciertas otras realizaciones, el nivel de expresion y/o el nivel de activacion de los analitos se calibra frente a una curva patron generada por cada uno de los analitos.
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En algunas realizaciones, el nivel de expresion y/o el nivel de activacion de un analito particular de interes se expresa como un valor de unidad de fluorescencia relativa (RFU) que corresponde a la intensidad de la senal para el analito, que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER™. En otras realizaciones, el nivel de expresion y/o el nivel de activacion de un analito particular de interes se expresa como "-", "±","+", "++", "+++", o "++++" que corresponde al aumento de la intensidad de senal para el analito, que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER™. En algunos casos, un nivel de expresion y/o activacion indetectable o mfnimamente detectable de un analito particular de interes que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER™, puede expresarse como "-" o "±". En otros casos, un nivel de expresion y/o activacion bajo de un analito particular de interes que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER™, puede expresarse como "+". En otros casos adicionales, un nivel moderado de expresion y/o activacion de un analito particular de interes que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER™, puede expresarse como "++". En otros casos, un alto nivel de expresion y/o activacion de un analito particular de interes que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER™, puede expresarse como "+++". En otros casos, un nivel muy alto de expresion y/o activacion de un analito particular de interes que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER™, puede expresarse como "++++".
En otras realizaciones, el nivel de expresion y/o el nivel de activacion de un analito particular de interes se cuantifica calibrando o normalizando el valor de RFU determinado usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER™, frente a una curva patron generada para el analito. En ciertos casos, puede calcularse un valor de unidades calculadas (UC) basandose en la curva patron. En ciertos otros casos, el valor de UC puede expresarse como "-", "±", "+", "++", "+++" o "++++" de acuerdo con la descripcion anterior para la intensidad de la senal de un analito particular de interes. El Ejemplo 3 del documento US 20120231965 proporciona un ejemplo no limitante de analisis de datos para la cuantificacion de protefnas de rutas de transduccion de senales en celulas tales como celulas cancerosas.
En realizaciones particulares, el valor de UC para un analito particular de interes puede calcularse y compararse con un valor lfmite para determinar si una celula o muestra es positiva o negativa para ese analito. En ciertos casos, el valor lfmite para un analito de interes, cuando se expresa como un valor de UC, puede ser al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.000, 8.500, 9.000, 9.500, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000, 100.000, 500.000 o mas UC. En realizaciones particulares, 1 UC representa la expresion de aproximadamente 1-2 x106 RTK y/o aproximadamente 1- 2x105 RTK activadas (por ejemplo, fosforiladas) (vease el Ejemplo 3 mostrado mas adelante).
En realizaciones particulares, un valor de UC para un analito de interes que es igual o mayor que el valor lfmite indica que una celula o muestra (por ejemplo, extracto celular) es positivo para ese analito, por ejemplo, el analito esta sobreexpresado y/o activado (por ejemplo, fosforilado) en la celula o muestra. Como ejemplo no imitante, puede usarse un valor lfmite de aproximadamente 500 UC para evaluar la positividad para p95HER2. Como otro ejemplo no limitante, puede usarse un valor lfmite de aproximadamente 6 o 7 (por ejemplo 6,7 UC) para evaluar la presencia de HER1 fosforilado (p-HER1). Como otro ejemplo no limitante, puede usarse un valor lfmite de aproximadamente 41 o 42 (por ejemplo, 41,6 UC) para evaluar la presencia de HER2 fosforilado (p-HER2). Como otro ejemplo no limitante, puede usarse un valor lfmite de aproximadamente 1124 o 1125 (por ejemplo, 1124,3 UC) para evaluar la presencia de HER3 fosforilado (p-HER3). Como otro ejemplo no limitante, puede usarse un valor lfmite de aproximadamente 6 o 7 (por ejemplo, 6,1 UC) para evaluar la presencia de cMET fosforilado (p-cMET). Como otro ejemplo no limitante, puede usarse un valor lfmite de aproximadamente 69 o 70 (por ejemplo 69,2 UC) para evaluar la presencia de IGF1R fosforilado (p-IGF1R). Como otro ejemplo no limitante, puede usarse un valor lfmite de aproximadamente 175 o 176 UC (por ejemplo 175,3 UC) para evaluar la presencia de PI3K fosforilado (p-PI3K). La Figura 15 (Tabla 2) muestra el uso de los valores lfmite ejemplares descritos en el presente documento para determinar si una muestra particular es positiva para la expresion de p95HER2 y/o la fosforilacion de HER1, HER2, HER3, cMET, IGF1R y/o PI3K.
En ciertas realizaciones, el valor lfmite es relativo a una cantidad especffica de muestra analizada, por ejemplo, pueden determinarse valores lfmite particulares basandose en la cantidad de muestra analizada por un ensayo de proximidad tal como CEER™ (por ejemplo, al menos aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25 30, 35, 40, 45, 50, 100 o mas pg de tejido analizado por CEER™). Como ejemplo no limitante, puede usarse un valor lfmite de aproximadamente 500 UC para evaluar la positividad para p95HER2 por una cantidad especffica (por ejemplo 20 pg) de tejido analizado (vease el Ejemplo 3 mostrado mas adelante).
Para conservar los estados de activacion in situ, tfpicamente se extraen protefnas de transduccion de senales poco despues de que las celulas se hayan aislado, preferentemente antes de que hayan transcurrido 96, 72, 48, 24, 6 o 1 h, mas preferentemente antes de que hayan transcurrido 30, 15 o 5 minutos. Las celulas aisladas tambien pueden incubarse con factores de crecimiento normalmente a concentraciones de nanomolares a micromolares durante aproximadamente 1-30 minutos para resucitar o estimular la activacion del transductor de senales (vease, por ejemplo, Irish et al., Cell, 118:217-228 (2004)). Los factores de crecimiento estimuladores incluyen factor de
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crecimiento epidermico (EGF), heregulina (HRG), TGF-a, PIGF, angiopoyetina (Ang), NRG1, PGF, TNF-a, VEGF, PDGF, IGF, FGF, HGF, citocinas y similares. Para evaluar las posibles terapias anticancerosas para un paciente individual, las celulas aisladas pueden incubarse con uno o mas farmacos anticancerosos de dosis variables antes, durante y/o despues de la estimulacion del factor de crecimiento. La estimulacion del factor de crecimiento puede realizarse durante unos pocos minutos u horas (por ejemplo, de aproximadamente 1-5 minutos a aproximadamente 1-6 horas). Despues del aislamiento, el tratamiento con el farmaco anticanceroso y/o la estimulacion del factor de crecimiento, las celulas se lisan para extraer las protefnas de transduccion de senales usando cualquier tecnica conocida en este campo. Preferentemente, la lisis celular se inicia entre aproximadamente 1-360 minutos despues de la estimulacion del factor de crecimiento y, mas preferentemente, a dos intervalos de tiempo diferentes: (1) aproximadamente 1-5 minutos despues de la estimulacion del factor de crecimiento; y (2) entre aproximadamente 30 y 180 minutos despues de la estimulacion del factor de crecimiento. Como alternativa, el lisado puede conservarse a -80 °C hasta el uso.
En ciertas realizaciones, la presente invencion comprende ademas determinar el nivel de expresion (por ejemplo, cantidad total) y/o el nivel de activacion (por ejemplo, nivel de fosforilacion o formacion de complejos) de uno o mas (por ejemplo, al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o mas) analitos adicionales en una celula cancerosa.
Los ejemplos no limitantes de analitos adicionales tales como moleculas de transduccion de senales que pueden buscarse en una muestra tal como un extracto celular de una celula cancerosa incluyen, sin limitacion, tirosina quinasas receptoras, tirosina quinasas no receptoras, componentes de la cascada de senalizacion de tirosina quinasas, receptores de hormonas nucleares, coactivadores de receptores nucleares, represores de receptores nucleares y combinaciones de los mismos. En ciertos casos, en una muestra, tal como un extracto celular de una celula cancerosa, puede determinarse la presencia o el nivel de expresion y/o activacion de uno o mas de los siguientes analitos adicionales: p95HER2, HER4 (ErbB4), PI3K, SHC, Raf, SRC, MEK, NFkB-IkB, mTOR, PI3K (por ejemplo, PIK3CA y/o PIK3R1), VEGF, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, EPH-A, EPH-B, EPH-C, EPH-D, FGFR, c-KIT, FLT-3, TIE-1, TIE-2, c-FMS, PDGFRA, PDGFRB, Abl, FTL 3, RET, HGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, IGF- 1R, ER, PR, NCOR, AIB1, AKT, ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PDK1, PDK2, PTEN, SGK3, 4E-BP1, P70S6K, protefna tirosina fosfatasas (por ejemplo, PTP1B, PTPN13, BDP1, etc.), dfmeros de receptores, GSK-3p, PIP2, PIP3, p27 y combinaciones de los mismos.
En una realizacion particular, la presente invencion comprende determinar el nivel de expresion (por ejemplo, cantidad total) y/o el nivel de activacion (por ejemplo, nivel de fosforilacion o formacion de complejos) de al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o mas marcadores, tales como los siguientes analitos: HER1, HER2, HER3, p95HER2, cMET, IGF-1R, cKIT, PI3K (por ejemplo, PIK3CA y/o PIK3R1), SHC y/o VEGFR (por ejemplo, VEGFR1, 2 y/o 3).
En ciertas realizaciones preferidas, la presente invencion comprende (i) determinar el nivel de expresion de al menos uno o mas de HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R, PI3K y/o SHC y/o (ii) determinar el nivel de activacion de al menos uno o mas de HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R, PI3K y/o SHC. En algunas realizaciones, el nivel de activacion corresponde a un nivel de fosforilacion de HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R y/o SHC. En ciertas otras realizaciones, el nivel de activacion corresponde a un nivel de un complejo de PI3K. Los ejemplos de complejos de PI3K incluyen, sin limitacion, uno o mas complejos que comprenden un par dimerizado de tirosina quinasa receptora, una subunidad de p85 de PI3K (por ejemplo, PIK3R1) y una subunidad p110 de PI3K (por ejemplo, una subunidad a o p tal como PIK3Ca o PIK3CB); vease, por ejemplo, el documento US2015-0017659.
En algunas realizaciones, la determinacion del nivel de expresion de dichos uno o mas analitos comprende detectar la cantidad total de cada uno de dichos uno o mas analitos en el extracto celular con uno o mas anticuerpos especfficos para el analito correspondiente. En realizaciones particulares, los anticuerpos se unen al analito independientemente del estado de activacion del analito a detectar, es decir, los anticuerpos detectan tanto la forma no activada como la forma activada del analito.
El nivel y/o estado de expresion total puede determinarse usando cualquiera de una diversidad de tecnicas. En ciertas realizaciones, el nivel y/o estado de expresion total de uno o mas analitos de interes tales como moleculas de transduccion de senales en una muestra tal como un extracto celular de una lfnea celular (por ejemplo, lfnea celular de cancer gastrico) o tejido tumoral (por ejemplo, tejido de tumor gastrico) se detecta con un inmunoensayo tal como un solo ensayo de deteccion o un ensayo de deteccion doble de proximidad (por ejemplo, un inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (CEER™)) como se describe en el presente documento.
En ciertas realizaciones, la determinacion de los niveles de expresion (por ejemplo, totales) de uno o mas analitos comprende:
(i) incubar (por ejemplo, poner en contacto) un extracto celular producido a partir de una celula con una o una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura (por ejemplo, anticuerpos de captura especfficos para uno o mas analitos) para formar una pluralidad de analitos capturados, en donde los anticuerpos de captura estan contenidos en un soporte solido (por ejemplo, para transformar los analitos presentes en el extracto celular
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en complejos de analitos capturados que comprenden los analitos y anticuerpos de captura);
(ii) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden uno o una pluralidad de primeros y segundos anticuerpos independientes del estado de activacion especfficos para los analitos correspondientes (por ejemplo, primeros y segundos anticuerpos independientes del estado de activacion especfficos para dichos uno o mas analitos) para formar una pluralidad de analitos capturados detectables (por ejemplo, para transformar los complejos de analitos capturados en complejos de analitos capturados detectables que comprenden los analitos capturados y anticuerpos de deteccion),
en donde los primeros anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un resto facilitador, los segundos anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un primer miembro de un par de amplificacion de senales, y el resto facilitador genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificacion de senales;
(iii) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificacion de senales para generar una senal amplificada; y
(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales.
En ciertas otras realizaciones, la determinacion de los niveles de expresion (por ejemplo, totales) de uno o mas analitos que son receptores truncados (por ejemplo, p95HER2) comprende:
(i) incubar (por ejemplo, poner en contacto) un extracto celular producido a partir de una celula con una pluralidad de perlas especfficas para una region de union al dominio extracelular (DEC) de un receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa);
(ii) retirar la pluralidad de perlas del extracto celular, retirando de esta manera el receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa) para formar un extracto celular que carece del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa) (por ejemplo, para transformar el extracto celular en un extracto celular que carece de un receptor de longitud completa especffico o familia de receptores de longitud completa especffica);
(iii) incubar (por ejemplo, poner en contacto) el extracto celular que carece del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa) con uno o una pluralidad de anticuerpos de captura especfficos para una region de union al dominio intracelular (DIC) del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa) para formar una pluralidad de receptores truncados capturados, en donde los anticuerpos de captura estan contenidos en un soporte solido (por ejemplo, para transformar los receptores truncados presentes en un extracto celular del que se ha eliminado el receptor de longitud completa en complejos de receptores truncados y anticuerpos de captura);
(iv) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden uno o una pluralidad de primeros y segundos anticuerpos independientes del estado de activacion especfficos para una region de union a DIC del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa) para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables (por ejemplo, para transformar los complejos de receptores truncados capturados en complejos de receptores truncados capturados detectables que comprenden los receptores truncados capturados y anticuerpos de deteccion),
en donde los primeros anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un resto facilitador, los segundos anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un primer miembro de un par de amplificacion de senales, y el resto facilitador genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificacion de senales;
(v) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificacion de senales para generar una senal amplificada; y
(vi) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales.
Los primeros anticuerpos independientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con el resto facilitador o marcarse indirectamente con el resto facilitador, por ejemplo, a traves de la hibridacion entre un oligonucleotido conjugado con los primeros anticuerpos independientes del estado de activacion y un oligonucleotido complementario conjugado con el resto facilitador. De forma similar, los segundos anticuerpos independientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con el primer miembro del par de amplificacion de senales o marcarse indirectamente con el primer miembro del par de amplificacion de senales, por ejemplo, a traves de la union entre un primer miembro de un par de union conjugado con los segundos anticuerpos independientes del estado de activacion y un segundo miembro del par de union conjugado con el primer miembro del par de amplificacion de senales. En ciertos casos, el primer miembro del par de union es biotina y el segundo miembro del par de union es una avidina, tal como estreptavidina o neutravidina.
En algunas realizaciones, el resto facilitador puede ser, por ejemplo, glucosa oxidasa. En ciertos casos, la glucosa oxidasa y los primeros anticuerpos independientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada con sulfhidrilo como se describe, por ejemplo, en los Ejemplos 16-17 de la Publicacion PCT N.° WO2009/108637. La molecula de dextrano activada con sulfhidrilo tfpicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 500 kDa (por ejemplo, aproximadamente 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750
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kDa). En otras realizaciones, el agente oxidante puede ser, por ejemplo, peroxido de hidrogeno (H2O2). En otras realizaciones adicionales, el primer miembro del par de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, una peroxidasa tal como peroxidasa de rabano picante (HRP). En otras realizaciones, el segundo miembro del par de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, un reactivo de tiramida (por ejemplo, biotin-tiramida). Preferentemente, la senal amplificada se genera por oxidacion por peroxidasa de biotin-tiramida para producir una tiramida activada (por ejemplo, para transformar la biotin-tiramida en una tiramida activada). La tiramida activada puede detectarse directamente o puede detectarse indirectamente, por ejemplo, tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales. Los ejemplos no limitantes de reactivos de deteccion de senales incluyen fluoroforos marcados con estreptavidina y combinaciones de peroxidasas marcadas con estreptavidina y reactivos cromogenicos tales como, por ejemplo, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB).
En ciertos casos, la peroxidasa de rabano picante y los segundos anticuerpos independientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada por sulfhidrilo. La molecula de dextrano activada por sulfhidrilo tfpicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 70 kDa (por ejemplo, aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 kDa).
El receptor truncado tfpicamente es un fragmento del receptor de longitud completa y comparte una region de union al dominio intracelular (DIC) con el receptor de longitud completa. En ciertas realizaciones, el receptor de longitud completa comprende una region de union al dominio extracelular (DEC), un dominio transmembrana y una region de union al dominio intracelular (DIC). Sin limitarse por ninguna teorfa particular, el receptor truncado puede producirse a traves del procesamiento proteolftico del DEC del receptor de longitud completa o mediante la iniciacion alternativa de la traduccion a partir de restos de metionina que estan localizados antes, dentro o despues del dominio transmembrana, por ejemplo, para crear un receptor truncado con un DEC acortado o un receptor truncado que comprende un fragmento de DIC asociado a la membrana o citosolico.
En ciertas realizaciones preferidas, el receptor truncado es p95HER2 y el receptor de longitud completa correspondiente es HER2. Sin embargo, un experto en la materia apreciara que los metodos descritos en el presente documento para detectar protefnas truncadas pueden aplicarse a varias protefnas diferentes entre las que se incluyen, pero sin limitacion, el mutante EGFR VIII (implicado en glioblastoma, cancer colorrectal, etc.), otras tirosina quinasas receptoras truncadas, caspasas y similares. El Ejemplo 12 de la Publicacion PCT N.° WO2009/108637 proporciona una realizacion ejemplar de los metodos de ensayo de la presente invencion para detectar receptores truncados tales como p95HER2 en celulas usando un ELISA de micromatriz de deteccion doble por proximidad, de alto rendimiento, multiplex, que tiene un rango dinamico superior.
En algunas realizaciones, la pluralidad de perlas especfficas para una region de union a DEC comprende un par de estreptavidina-biotina, en donde la estreptavidina esta unida a la perla y la biotina esta unida a un anticuerpo. En ciertos casos, el anticuerpo es especffico para la region de union a DEC del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa).
En algunas realizaciones, cada serie de dilucion de anticuerpos de captura comprende una serie de concentraciones decrecientes de anticuerpo de captura. En ciertos casos, los anticuerpos de captura se diluyen en serie al menos 2 veces (por ejemplo, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500 o 1.000 veces) para producir una serie de dilucion que comprende un numero establecido (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o mas) de concentraciones decrecientes de anticuerpo de captura que se han aplicado en una matriz. Preferentemente, se aplican en la matriz al menos 2, 3, 4, 5 o 6 replicas de cada dilucion de anticuerpo de captura.
En otras realizaciones, el soporte solido comprende vidrio (por ejemplo, un portaobjetos), plastico, microtarjetas, agujas, filtros, perlas, papel, membrana (por ejemplo, nailon, nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVDF), etc.), haces de fibras o cualquier otro sustrato adecuado. En una realizacion preferida, los anticuerpos de captura se mantienen (por ejemplo, a traves de interacciones covalentes o no covalentes) sobre portaobjetos revestidos con un polfmero de nitrocelulosa tales como, por ejemplo, FAST® Slides, que estan disponibles en el mercado en Whatman Inc. (Florham Park, NJ). Se describen metodos ejemplares para construir matrices de anticuerpos adecuadas para uso en la invencion, por ejemplo, en la Publicacion PCT N.° WO2009/108637.
En realizaciones adicionales, la determinacion de los niveles de activacion de uno o mas analitos comprende la deteccion de un nivel de fosforilacion de dichos uno o mas analitos en el extracto con anticuerpos especfficos para la forma fosforilada de cada uno de los analitos a detectar.
Los niveles y/o el estado de fosforilacion pueden determinarse usando cualquiera de una diversidad de tecnicas. Por ejemplo, es bien sabido en la tecnica que pueden detectarse protefnas fosforiladas mediante inmunoensayos usando anticuerpos que reconocen especfficamente la forma fosforilada de la protefna (vease, por ejemplo, Lin et al., Br. J. Cancer, 93:1372-1381 (2005)). Los inmunoensayos generalmente incluyen inmunotransferencia (por ejemplo, transferencia de Western), RIA y ELISA. Otros tipos mas especfficos de inmunoensayos incluyen captura de antfgeno/competicion de antfgeno, captura de anticuerpo/competicion de antfgeno, sandwiches de dos anticuerpos, captura de anticuerpo/exceso de anticuerpo y captura de anticuerpo/exceso de antfgeno. Se describen metodos para fabricar anticuerpos en el presente documento y en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,
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1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA. Los anticuerpos fosfoespecfficos pueden fabricarse de novo u obtenerse a partir de fuentes comerciales o no comerciales. Los niveles y/o estados de fosforilacion tambien pueden determinarse mediante el marcaje metabolico de celulas con fosfato radiactivo en forma de [y-32P]ATP o [y-33P]ATP. Las protefnas fosforiladas se vuelven radiactivas y, por lo tanto, rastreables y cuantificables mediante recuento de centelleo, radiograffa y similares (vease, por ejemplo, Wang et al., J. Biol. Chem., 253:7605-7608 (1978)). Por ejemplo, pueden extraerse protefnas marcadas metabolicamente a partir de celulas, separarse por electroforesis en gel, transferirse a una membrana, sondarse con un anticuerpo especffico para un analito particular y someterse a autorradiograffa para detectar 32P o 33P. Como alternativa, el gel puede someterse a autorradiograffa antes de la transferencia a la membrana y sondeo con anticuerpo.
En realizaciones particulares, el nivel y/o estado de activacion (por ejemplo fosforilacion) de uno o mas analitos de interes en una muestra tal como un extracto celular de una lfnea celular (por ejemplo, lfnea celular de cancer gastrico) o tejido tumoral (por ejemplo, tejido de tumor gastrico) se detecta con un inmunoensayo tal como un ensayo de deteccion simple o un ensayo de deteccion doble de proximidad (por ejemplo, un inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (CEER™)) como se describe en el presente documento.
En ciertas realizaciones, la determinacion del nivel de activacion (por ejemplo, fosforilacion) de uno o mas analitos comprende:
(i) incubar (por ejemplo, poner en contacto) un extracto celular producido a partir de una celula con una serie de dilucion de anticuerpos de captura (por ejemplo, anticuerpos de captura especfficos para uno o mas analitos) para formar una pluralidad de analitos capturados, en donde los anticuerpos de captura estan contenidos en un soporte solido (por ejemplo, para transformar los analitos presentes en el extracto celular en complejos de analitos capturados que comprenden los analitos y anticuerpos de captura);
(ii) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden anticuerpos independientes del estado de activacion especfficos para los analitos correspondientes (por ejemplo, anticuerpos independientes del estado de activacion especfficos para dichos uno o mas analitos) y anticuerpos dependientes del estado de activacion especfficos para los analitos correspondientes (por ejemplo, anticuerpos dependientes del estado de activacion especfficos para dichos uno o mas analitos) para formar una pluralidad de analitos capturados detectables (por ejemplo, para transformar los complejos de analitos capturados en complejos de analitos capturados detectables que comprenden los analitos capturados y anticuerpos de deteccion),
en donde los anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un resto facilitador, los anticuerpos dependientes del estado de activacion estan marcados con un primer miembro de un par de amplificacion de senales, y el resto facilitador genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificacion de senales;
(iii) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificacion de senales para generar una senal amplificada; y
(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales.
En ciertas otras realizaciones, la determinacion del nivel de activacion (por ejemplo, fosforilacion) de uno o mas analitos que son receptores truncados (por ejemplo, p95HER2) comprende:
(i) incubar (por ejemplo, poner en contacto) un extracto celular producido a partir de una celula con una pluralidad de perlas especfficas para una region de union al dominio extracelular (DEC) de un receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa);
(ii) retirar la pluralidad de perlas del extracto celular, retirando de esta manera el receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa) para formar un extracto celular que carece del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa) (por ejemplo, para transformar el extracto celular en un extracto celular que carece de un receptor de longitud completa especffico o familia de receptores de longitud completa especffica);
(iii) incubar (por ejemplo, poner en contacto) el extracto celular que carece del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa) con una pluralidad de anticuerpos de captura especfficos para una region de union al dominio intracelular (DIC) del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa) para formar una pluralidad de receptores truncados capturados, en donde los anticuerpos de captura estan contenidos en un soporte solido (por ejemplo, para transformar los receptores truncados presentes en un extracto celular del que se ha eliminado el receptor de longitud completa en complejos de receptores truncados y anticuerpos de captura);
(iv) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden anticuerpos independientes del estado de activacion y anticuerpos dependientes del estado de activacion especfficos para una region de union a DIC del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa) para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables (por ejemplo, para transformar los complejos de receptores truncados capturados en complejos de receptores truncados capturados detectables que comprenden los receptores truncados capturados y anticuerpos de deteccion),
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en donde los anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un resto facilitador, los anticuerpos dependientes del estado de activacion estan marcados con un primer miembro de un par de amplificacion de senales, y el resto facilitador genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificacion de senales;
(v) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificacion de senales para generar una senal amplificada; y
(vi) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales.
Los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con el resto facilitador o pueden marcarse indirectamente con el resto facilitador, por ejemplo, mediante hibridacion entre un oligonucleotido conjugado con los anticuerpos independientes del estado de activacion y un oligonucleotido complementario conjugado con el resto facilitador. De forma similar, los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con el primer miembro del par de amplificacion de senales o pueden marcarse indirectamente con el primer miembro del par de amplificacion de senales, por ejemplo, mediante union entre un primer miembro de un par de union conjugado con los anticuerpos dependientes del estado de activacion y un segundo miembro del par de union conjugado con el primer miembro del par de amplificacion de senales. En ciertos casos, el primer miembro del par de union es biotina y el segundo miembro del par de union es una avidina, tal como estreptavidina o neutravidina.
En algunas realizaciones, el resto facilitador puede ser, por ejemplo, glucosa oxidasa. En ciertos casos, la glucosa oxidasa y los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada con sulfhidrilo como se describe, por ejemplo, en los Ejemplos 16-17 de la Publicacion PCT N.° WO2009/108637. La molecula de dextrano activada con sulfhidrilo tfpicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 500 kDa (por ejemplo, aproximadamente 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 kDa). En otras realizaciones, el agente oxidante puede ser, por ejemplo, peroxido de hidrogeno (H2O2). En otras realizaciones adicionales, el primer miembro del par de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, una peroxidasa tal como peroxidasa de rabano picante (HRP). En otras realizaciones, el segundo miembro del par de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, un reactivo de tiramida (por ejemplo, biotin-tiramida). Preferentemente, la senal amplificada se genera por oxidacion por peroxidasa de biotin-tiramida para producir una tiramida activada (por ejemplo, para transformar la biotin-tiramida en una tiramida activada). La tiramida activada puede detectarse directamente o puede detectarse indirectamente, por ejemplo, tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales. Los ejemplos no limitantes de reactivos de deteccion de senales incluyen fluoroforos marcados con estreptavidina y combinaciones de peroxidasas marcadas con estreptavidina y reactivos cromogenicos tales como, por ejemplo, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB).
En ciertos casos, la peroxidasa de rabano picante y los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada por sulfhidrilo. La molecula de dextrano activada por sulfhidrilo tfpicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 70 kDa (por ejemplo, aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 kDa).
El receptor truncado tfpicamente es un fragmento del receptor de longitud completa y comparte una region de union al dominio intracelular (DIC) con el receptor de longitud completa. En ciertas realizaciones, el receptor de longitud completa comprende una region de union al dominio extracelular (DEC), un dominio transmembrana y una region de union al dominio intracelular (DIC). Sin limitarse por ninguna teorfa particular, el receptor truncado puede producirse por el procesamiento proteolftico del DEC del receptor de longitud completa o por la iniciacion alternativa de la traduccion a partir de restos de metionina que estan localizados antes, dentro o despues del dominio transmembrana, por ejemplo, para crear un receptor truncado con un DEC acortado o un receptor truncado que comprende un fragmento de DIC asociado a la membrana o citosolico.
En ciertas realizaciones preferidas, el receptor truncado es p95HER2 y el receptor de longitud completa correspondiente es HER2. Sin embargo, un experto en la materia apreciara que los metodos descritos en el presente documento para detectar protefnas truncadas pueden aplicarse a varias protefnas diferentes incluyendo, pero sin limitacion, el mutante EGFR VIII (implicado en glioblastoma, cancer colorrectal, etc.), otras tirosina quinasas receptoras truncadas, caspasas y similares. El Ejemplo 12 de la Publicacion PCT N.° WO2009/108637 proporciona una realizacion ejemplar de los metodos de ensayo de la presente invencion para detectar receptores truncados tales como p95HER2 en celulas usando un ELISA de micromatriz de deteccion doble por proximidad, de alto rendimiento, multiplex, que tiene un rango dinamico superior.
En algunas realizaciones, la pluralidad de perlas especfficas para una region de union a DEC comprende un par de estreptavidina-biotina, en donde la estreptavidina esta unida a la perla y la biotina esta unida a un anticuerpo. En ciertos casos, el anticuerpo es especffico para la region de union a DEC del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2 de longitud completa).
En algunas realizaciones, cada serie de dilucion de anticuerpos de captura comprende una serie de concentraciones decrecientes de anticuerpo de captura. En ciertos casos, los anticuerpos de captura se diluyen en serie al menos 2
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veces (por ejemplo, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500 o 1.000 veces) para producir una serie de dilucion que comprende un numero establecido (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o mas) de concentraciones decrecientes de anticuerpo de captura que se han aplicado en una matriz. Preferentemente, se aplican en la matriz al menos 2, 3, 4, 5 o 6 replicas de cada dilucion de anticuerpo de captura.
En otras realizaciones, el soporte solido comprende vidrio (por ejemplo, un portaobjetos), plastico, microtarjetas, agujas, filtros, perlas, papel, membrana (por ejemplo, nailon, nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVDF), etc.), haces de fibras o cualquier otro sustrato adecuado. En una realizacion preferida, los anticuerpos de captura se mantienen (por ejemplo, a traves de interacciones covalentes o no covalentes) sobre portaobjetos revestidos con un polfmero de nitrocelulosa tales como, por ejemplo, FAST® Slides, que estan disponibles en el mercado en Whatman Inc. (Florham Park, NJ). Se describen metodos ejemplares para construir matrices de anticuerpos adecuadas para uso en la invencion, por ejemplo, en la Publicacion PCT N.° WO2009/108637.
IV. Ensayos de deteccion sencillos
En algunas realizaciones, el ensayo para detectar la expresion y/o el nivel o estado de activacion de uno o mas analitos (por ejemplo, una o mas moleculas de transduccion de senales tales como uno mas componentes de las rutas de senalizacion de HER y/o c-Met) de interes en un extracto celular de celulas, tales como celulas tumorales, es un ensayo de dos anticuerpos de alto rendimiento, multiplex, que tiene un rango dinamico superior. Como ejemplo no limitante, los dos anticuerpos usados en el ensayo pueden comprender: (1) un anticuerpo de captura especffico para un analito particular de interes; y (2) un anticuerpo de deteccion especffico para una forma activada del analito (es decir, anticuerpo dependiente del estado de activacion). El anticuerpo dependiente del estado de activacion es capaz de detectar, por ejemplo, el estado de fosforilacion, ubiquitinacion y/o complejacion del analito. Como alternativa, el anticuerpo de deteccion comprende un anticuerpo independiente del estado de activacion, que detecta la cantidad total del analito en el extracto celular. El anticuerpo independiente del estado de activacion generalmente es capaz de detectar las formas tanto activada como no activada del analito.
En una realizacion particular, el ensayo de dos anticuerpos para detectar el nivel de expresion o activacion de un analito de interes comprende:
(i) incubar el extracto celular con una o una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados;
(ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de deteccion especfficos para los analitos correspondientes para formar una pluralidad de analitos capturados detectables, en donde los anticuerpos de deteccion comprenden anticuerpos dependientes del estado de activacion para detectar el nivel de activacion (por ejemplo, fosforilacion) del analito o anticuerpos independientes del estado de activacion para detectar el nivel de expresion (por ejemplo, cantidad total) del analito;
(iii) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con un primer y segundo miembros de un par de amplificacion de senales para generar una senal amplificada; y
(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales.
Los ensayos de dos anticuerpos descritos en el presente documento tfpicamente son matrices basadas en anticuerpos que comprenden una pluralidad de anticuerpos de captura diferentes en un intervalo de concentraciones de anticuerpos de captura que estan acoplados a la superficie de un soporte solido en diferentes localizaciones direccionables. Anteriormente se han descrito ejemplos de soportes solidos adecuados para uso en la presente invencion.
Los anticuerpos de captura y los anticuerpos de deteccion preferentemente se seleccionan para minimizar la competicion entre ellos con respecto a la union al analito (es decir, tanto los anticuerpos de captura como los anticuerpos de deteccion pueden unirse simultaneamente a sus moleculas de transduccion de senales correspondientes).
En una realizacion, los anticuerpos de deteccion comprenden un primer miembro de un par de union (por ejemplo, biotina) y el primer miembro del par de amplificacion de senales comprende un segundo miembro del par de union (por ejemplo, estreptavidina). Los miembros del par de union pueden acoplarse directa o indirectamente a los anticuerpos de deteccion o al primer miembro del par de amplificacion de senales usando metodos bien conocidos en la tecnica. En ciertos casos, el primer miembro del par de amplificacion de senales es una peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante (HRP), catalasa, cloroperoxidasa, citocromo c peroxidasa, eosinofilo peroxidasa, glutation peroxidasa, lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, peroxidasa de tiroides, desyodinasa, etc.) y el segundo miembro del par de amplificacion de senales es un reactivo de tiramida (por ejemplo, biotin-tiramida). En estos casos, la senal amplificada se genera por oxidacion con peroxidasa del reactivo de tiramida para producir una tiramida activada en presencia de peroxido de hidrogeno (H2O2).
La tiramida activada se detecta directamente o se detecta tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales tal como, por ejemplo, un fluoroforo marcado con estreptavidina o una combinacion de una peroxidasa marcada con estreptavidina y un reactivo cromogenico. Los ejemplos de fluoroforos adecuados para uso en la presente invencion
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incluyen, pero sin limitacion, un colorante Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa Fluor® 555), fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna (FITC), Oregon Green™; rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodamina (TRITC), un fluor CyDye™ (por ejemplo, Cy2, Cy3, Cy5) y similares. El marcador de estreptavidina puede acoplarse directa o indirectamente al fluoroforo o a la peroxidasa usando metodos bien conocidos en la tecnica. Los ejemplos no limitantes de reactivos cromogenicos adecuados para uso en la presente invencion incluyen 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (TMB), 3,3'-diaminobenzidina (DAB), 2,2'-azino-bis(acido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfonico) (ABTS), 4-cloro-1-naftol (4Cn) y/o porfirinogeno.
En el Ejemplo 3 de la Publicacion PCT N.° WO2009/108637 se proporciona un protocolo ejemplar para realizar los ensayos de dos anticuerpos descritos en el presente documento.
En otra realizacion de un enfoque de dos anticuerpos, la presente invencion proporciona un metodo para detectar el nivel de expresion o activacion de un receptor truncado, comprendiendo el metodo:
(i) incubar el extracto celular con una pluralidad de perlas especfficas para una region de union al dominio extracelular (DEC) de un receptor de longitud completa;
(ii) retirar la pluralidad de perlas del extracto celular, retirando de esta manera el receptor de longitud completa para formar un extracto celular que carece del receptor de longitud completa;
(iii) incubar el extracto celular que carece del receptor de longitud completa con una serie de dilucion de uno o una pluralidad de anticuerpos de captura especfficos para una region de union al dominio intracelular (DIC) del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados;
(iv) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de deteccion especfficos para una region de union a DIC del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables, en donde los anticuerpos de deteccion comprenden anticuerpos dependientes del estado de activacion para detectar el nivel de activacion (por ejemplo, fosforilacion) del receptor truncado o anticuerpos independientes del estado de activacion para detectar el nivel de expresion (por ejemplo, cantidad total) del receptor truncado;
(v) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un primer y segundo miembros de un par de amplificacion de senales para generar una senal amplificada; y
(vi) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales.
En ciertas realizaciones, el receptor truncado es p95HER2 y el receptor de longitud completa es HER2. En ciertas otras realizaciones, la pluralidad de perlas especfficas para una region de union al dominio extracelular (DEC) comprende un par de estreptavidina-biotina, en donde la biotina esta unida a la perla y la biotina esta unida a un anticuerpo (por ejemplo, en donde el anticuerpo es especffico para la region de union a DEC del receptor de longitud completa).
La Figura 14A de la Publicacion PCT N.° WO2009/108637 muestra que perlas revestidas con un anticuerpo dirigido al dominio extracelular (DEC) de un receptor de interes se une al receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2), pero no al receptor truncado (por ejemplo, p95HER2) para retirar todo el receptor de longitud completa del ensayo. La Figura 14B de la Publicacion pCt N.° WO2009/108637 muestra que el receptor truncado (por ejemplo, p95HER2), una vez unido a un anticuerpo de captura, puede detectarse por un anticuerpo de deteccion que es especffico para el dominio intracelular (DIC) del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2). El anticuerpo de deteccion puede conjugarse directamente con peroxidasa de rabano picante (HRp). Despues puede realizarse la amplificacion de la senal de tiramida (TSA) para generar una senal a detectar. El nivel de expresion o el estado de activacion del receptor truncado (por ejemplo, p95HER2) puede buscarse para determinar, por ejemplo, su concentracion total o su estado de fosforilacion, estado de ubiquitinacion y/o estado de complejacion.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona kits para realizar los ensayos de dos anticuerpos descritos anteriormente, que comprenden: (a) una serie de dilucion de uno o una pluralidad de anticuerpos de captura contenidos en un soporte solido; y (b) uno o una pluralidad de anticuerpos de deteccion (por ejemplo, anticuerpos independientes del estado de activacion y/o anticuerpos dependientes del estado de activacion). En algunos casos, los kits pueden contener ademas instrucciones para los metodos de uso del kit para detectar los niveles de expresion y/o estados de activacion de una o una pluralidad de moleculas de transduccion de senales de celulas tales como celulas tumorales. Los kits tambien pueden contener cualquiera de los reactivos adicionales descritos anteriormente con respecto a la realizacion de los metodos especfficos de la presente invencion tales como, por ejemplo, el primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales, reactivos de amplificacion de senales de tiramida, tampones de lavado, etc.
V. Ensayos de deteccion doble de proximidad
En algunas realizaciones, el ensayo para detectar el nivel de expresion y/o activacion de uno o mas analitos (por ejemplo, una o mas moleculas de transduccion de senales tales como uno o mas componentes de la ruta de senalizacion de HER y/o c-Met) de interes en un extracto celular de celulas, tales como celulas tumorales, es un ensayo de proximidad de alto rendimiento, multiplex (es decir, de tres anticuerpos) que tiene un rango dinamico
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superior. Como ejemplo no limitante, los tres anticuerpos usados en el ensayo de proximidad pueden comprender: (1) un anticuerpo de captura espedfico para un analito particular de interes; (2) un anticuerpo de deteccion espedfico para una forma activada del analito (es decir, anticuerpo dependiente del estado de activacion); y (3) un anticuerpo de deteccion que detecta la cantidad total del analito (es decir, anticuerpo independiente del estado de activacion). El anticuerpo dependiente del estado de activacion es capaz de detectar, por ejemplo, el estado de fosforilacion, ubiquitinacion y/o complejacion del analito, mientras que el anticuerpo independiente del estado de activacion es capaz de detectar la cantidad total (es decir, tanto la forma activada como la forma no activada) del analito.
En una realizacion particular, el ensayo de proximidad para detectar el nivel o estado de activacion de un analito de interes comprende:
(i) incubar el extracto celular con una o una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados;
(ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden uno o una pluralidad de anticuerpos independientes del estado de activacion y uno o una pluralidad de anticuerpos dependientes del estado de activacion espedficos para los analitos correspondientes para formar una pluralidad de analitos capturados detectables,
en donde los anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un resto facilitador, los anticuerpos dependientes del estado de activacion estan marcados con un primer miembro de un par de amplificacion de senales y el resto facilitador genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificacion de senales;
(iii) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificacion de senales para generar una senal amplificada; y
(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales.
En otra realizacion particular, el ensayo de proximidad para detectar el nivel o estado de activacion de un analito de interes que es un receptor truncado comprende:
(i) incubar el extracto celular con una pluralidad de perlas espedficas para una region de union al dominio extracelular (DEC) de un receptor de longitud completa;
(ii) retirar la pluralidad de perlas del extracto celular, retirando de esta manera el receptor de longitud completa para formar un extracto celular que carece del receptor de longitud completa;
(iii) incubar el extracto celular que carece del receptor de longitud completa con uno o una pluralidad de anticuerpos de captura espedficos para una region de union al dominio intracelular (DIC) del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados;
(iv) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden uno o una pluralidad de anticuerpos independientes del estado de activacion y uno o una pluralidad de anticuerpos dependientes del estado de activacion espedficos para una region de union a DIC del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables, en donde los anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un resto facilitador, los anticuerpos dependientes del estado de activacion estan marcados con un primer miembro de un par de amplificacion de senales y el resto facilitador genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificacion de senales;
(v) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificacion de senales para generar una senal amplificada; y
(vi) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales.
En ciertas realizaciones, el receptor truncado es p95HER2 y el receptor de longitud completa es HER2. En ciertas otras realizaciones, la pluralidad de perlas espedficas para una region de union al dominio extracelular (DEC) comprende un par de estreptavidina-biotina, en donde la biotina esta unida a la perla y la biotina esta unida a un anticuerpo (por ejemplo, en donde el anticuerpo es espedfico para la region de union a DEC del receptor de longitud completa).
En realizaciones alternativas, los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden marcarse con un resto facilitador y los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden marcarse con un primer miembro de un par de amplificacion de senales.
Como otro ejemplo no limitante, los tres anticuerpos usados en el ensayo de proximidad pueden comprender: (1) un anticuerpo de captura espedfico para un analito particular de interes; (2) un primer anticuerpo de deteccion que detecta la cantidad total del analito (es decir, un primer anticuerpo independiente del estado de activacion); y (3) un segundo anticuerpo de deteccion que detecta la cantidad total del analito (es decir, un segundo anticuerpo independiente del estado de activacion). En realizaciones preferidas, el primer y segundo anticuerpos independientes del estado de activacion reconocen epttopos diferentes (por ejemplo, distintos) sobre el analito.
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En una realizacion particular, el ensayo de proximidad para detectar el nivel de expresion de un analito de interes comprende:
(i) incubar el extracto celular con una o una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados;
(ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden uno o una pluralidad de primeros y segundos anticuerpos independientes del estado de activacion especfficos para los analitos correspondientes para formar una pluralidad de analitos capturados detectables,
en donde los primeros anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un resto facilitador, los segundos anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un primer miembro de un par de amplificacion de senales, y el resto facilitador genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificacion de senales;
(iii) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificacion de senales para generar una senal amplificada; y
(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales.
En otra realizacion particular, el ensayo de proximidad para detectar el nivel de expresion de un analito de interes que es un receptor truncado comprende:
(i) incubar el extracto celular con una pluralidad de perlas especfficas para una region de union al dominio extracelular (DEC) de un receptor de longitud completa;
(ii) retirar la pluralidad de perlas del extracto celular, retirando de esta manera el receptor de longitud completa para formar un extracto celular que carece del receptor de longitud completa;
(iii) incubar el extracto celular que carece del receptor de longitud completa con uno o una pluralidad de anticuerpos de captura especfficos para una region de union al dominio intracelular (DIC) del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados;
(iv) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden uno o una pluralidad de primeros y segundos anticuerpos independientes del estado de activacion especfficos para una region de union a DIC del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables,
en donde los primeros anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un resto facilitador, los segundos anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con un primer miembro de un par de amplificacion de senales, y el resto facilitador genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificacion de senales;
(v) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificacion de senales para generar una senal amplificada; y
(vi) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales.
En ciertas realizaciones, el receptor truncado es p95HER2 y el receptor de longitud completa es HER2. En ciertas otras realizaciones, la pluralidad de perlas especfficas para una region de union al dominio extracelular (DEC) comprende un par de estreptavidina-biotina, en donde la estreptavidina esta unida a la perla y la biotina esta unida a un anticuerpo (por ejemplo, en donde el anticuerpo es especffico para la region de union a DEC del receptor de longitud completa).
En realizaciones alternativas, los primeros anticuerpos independientes del estado de activacion pueden marcarse con un primer miembro de un par de amplificacion de senales y los segundos anticuerpos independientes del estado de activacion pueden marcarse con un resto facilitador.
Los ensayos de proximidad descritos en el presente documento tfpicamente son matrices basadas en anticuerpos que comprenden uno o una pluralidad de anticuerpos de captura diferentes a un intervalo de concentraciones de anticuerpos de captura, que estan acoplados a la superficie de un soporte solido en diferentes localizaciones direccionables. Anteriormente se han descrito ejemplos de soportes solidos adecuados para uso en la presente invencion.
Los anticuerpos de captura, anticuerpos independientes del estado de activacion y anticuerpos dependientes del estado de activacion preferentemente se seleccionan para minimizar la competicion entre ellos con respecto a la union al analito (es decir, todos los anticuerpos pueden unirse simultaneamente a sus moleculas de transduccion de senales correspondientes).
En algunas realizaciones, los anticuerpos independientes del estado de activacion para detectar los niveles de activacion de uno o mas de los analitos o, como alternativa, los primeros anticuerpos independientes del estado de activacion para detectar los niveles de expresion de uno o mas de los analitos, comprenden ademas un resto detectable. En estos casos, la cantidad del resto detectable esta correlacionada con la cantidad de uno o mas de los
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analitos en el extracto celular. Los ejemplos de restos detectables incluyen, pero sin limitacion, marcadores fluorescentes, marcadores reactivos qufmicamente, marcadores enzimaticos, marcadores radiactivos y similares. Preferentemente, el resto detectable es un fluoroforo tal como un colorante Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa Fluor® 647), fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna (FITC), Oregon Green™; rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodamina (TRITC), un fluor CyDye™ (por ejemplo, Cy2, Cy3, Cy5), y similares. El resto detectable puede acoplarse directa o indirectamente a los anticuerpos independientes del estado de activacion usando metodos bien conocidos en la tecnica.
En ciertos casos, los anticuerpos independientes del estado de activacion para detectar niveles de activacion de uno o mas de los analitos o, como alternativa, los primeros anticuerpos independientes del estado de activacion para detectar niveles de expresion de uno o mas de los analitos se marcan directamente con el resto facilitador. El resto facilitador puede acoplarse a los anticuerpos independientes del estado de activacion usando metodos bien conocidos en la tecnica. Un resto facilitador adecuado para uso en la presente invencion incluye cualquier molecula capaz de generar un agente oxidante que se canaliza hacia (es decir, se dirige a) y reacciona con (es decir, se une, se une por o forma un complejo con) otra molecula proxima (es decir, cercana o proxima espacialmente) al resto facilitador. Los ejemplos de restos facilitadores incluyen, sin limitacion, enzimas tales como glucosa oxidasa o cualquier otra enzima que cataliza una reaccion de oxidacion/reduccion en la que esta implicada oxfgeno molecular (O2) como aceptor de electrones, y fotosensibilizadores tales como azul de metileno, rosa de bengala, porfirinas, tintes de escuarato, ftalocianinas y similares. Los ejemplos no limitantes de agentes oxidantes incluyen peroxido de hidrogeno (H2O2), un oxfgeno singlete y cualquier otro compuesto que transfiera atomos de oxfgeno o capte electrones en una reaccion de oxidacion/reduccion. Preferentemente, en presencia de un sustrato adecuado (por ejemplo, glucosa, luz, etc.), el resto facilitador (por ejemplo, glucosa oxidasa, fotosensibilizador, etc.) genera un agente oxidante (por ejemplo, peroxido de hidrogeno (H2O2), oxfgeno singlete, etc.) que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificacion de senales (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante (HRP), hapteno protegido por un grupo protector, una enzima inactivada por un enlace tioeter con un inhibidor enzimatico, etc.) cuando los dos restos estan proximos entre sf.
En ciertos otros casos, los anticuerpos independientes del estado de activacion para detectar los niveles de activacion de uno o mas de los analitos o, como alternativa, los primeros anticuerpos independientes del estado de activacion para detectar los niveles de expresion de uno o mas de los analitos, se marcan indirectamente con el resto facilitador mediante hibridacion entre un enlazador oligonucleotfdico conjugado con los anticuerpos independientes del estado de activacion y un enlazador oligonucleotfdico complementario conjugado con el resto facilitador. Los enlazadores oligonucleotfdicos pueden acoplarse al resto facilitador o a los anticuerpos independientes del estado de activacion usando metodos bien conocidos en la tecnica. En algunas realizaciones, el enlazador oligonucleotfdico conjugado con el resto facilitador tiene un 100 % de complementariedad con el enlazador oligonucleotfdico conjugado con los anticuerpos independientes del estado de activacion. En otras realizaciones, el par de enlazadores oligonucleotfdicos comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas regiones de desacoplamiento, por ejemplo, tras la hibridacion en condiciones de hibridacion rigurosas. Un experto en la materia apreciara que los anticuerpos independientes del estado de activacion especfficos para diferentes analitos pueden conjugarse con el mismo enlazador oligonucleotfdico o con diferentes enlazadores oligonucleotfdicos.
La longitud de los enlazadores oligonucleotfdicos que se conjugan con el resto facilitador o con los anticuerpos independientes del estado de activacion puede variar. En general, la secuencia enlazadora puede ser de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o 100 nucleotidos de longitud. Tfpicamente, se generan secuencias de acido nucleico aleatorias para el acoplamiento. Como ejemplo no limitante, puede disenarse una biblioteca de enlazadores oligonucleotfdicos de manera que tenga tres dominios contiguos distintos: un dominio espaciador; dominio distintivo; y dominio de conjugacion. Preferentemente, los enlazadores oligonucleotfdicos se disenan disenados para un acoplamiento eficaz sin destruir la funcion del resto facilitador o de los anticuerpos independientes del estado de activacion a los que se conjugan.
Las secuencias enlazadoras oligonucleotfdicas pueden disenarse para prevenir o minimizar la formacion de cualquier estructura secundaria en una diversidad de condiciones de ensayo. Tfpicamente, se controlan cuidadosamente las temperaturas de fusion para cada segmento dentro del enlazador para permitir su participacion en los procedimientos de ensayo generales. Generalmente, el intervalo de temperaturas de fusion del segmento de la secuencia enlazadora esta entre 1 y 10 °C. Pueden usarse algoritmos informaticos (por ejemplo, OLIGO 6.0) para determinar la temperatura de fusion, la estructura secundaria y la estructura de horquilla en concentraciones ionicas definidas para analizar cada uno de los tres dominios diferentes dentro de cada enlazador. Las secuencias combinadas globales tambien pueden analizarse con respecto a su caracterizacion estructural y su comparabilidad con otras secuencias enlazadoras oligonucleotfdicas conjugadas, por ejemplo, para determinar si hibridaran en condiciones de hibridacion rigurosas con un enlazador oligonucleotfdico complementario.
La region espaciadora del enlazador oligonucleotfdico proporciona una separacion adecuada entre el dominio de conjugacion y el sitio de reticulacion del oligonucleotido. El dominio de conjugacion funciona uniendo moleculas marcadas con una secuencia enlazadora oligonucleotfdica complementaria al dominio de conjugacion a traves de hibridacion de acidos nucleicos. La hibridacion mediada por acidos nucleicos puede realizarse antes o despues de la formacion del complejo anticuerpo-analito (es decir, antfgeno), proporcionandose asf un formato de ensayo mas
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flexible. A diferencia de muchos metodos de conjugacion directa de anticuerpos, la union de oligonucleotidos relativamente pequenos a anticuerpos u otras moleculas tiene un impacto mfnimo sobre la afinidad especffica de los anticuerpos por su analito diana o sobre la funcion de las moleculas conjugadas.
En algunas realizaciones, el dominio de la secuencia distintiva del enlazador oligonucleotfdico puede usarse en ensayos de protefnas multiplexados complejos. Multiples anticuerpos pueden conjugarse con enlazadores oligonucleotfdicos con diferentes secuencias distintivas. En inmunoensayos multiplex, pueden usarse secuencias oligonucleotfdicas indicadoras marcadas con sondas apropiadas para detectar la reactividad cruzada entre anticuerpos y sus antfgenos en el formato de ensayo multiplex.
Los enlazadores oligonucleotfdicos pueden conjugarse con anticuerpos u otras moleculas usando varios metodos diferentes. Por ejemplo, pueden sintetizarse enlazadores oligonucleotfdicos con un grupo tiol en el extremo 5' o 3'. El grupo tiol puede desprotegerse usando agentes reductores (por ejemplo, TCEP-HCI) y los enlazadores resultantes pueden purificarse usando una columna de centrifugacion de desalinizacion. Los enlazadores oligonucleotfdicos desprotegidos resultantes pueden conjugarse con las aminas primarias de anticuerpos u otros tipos de protefnas usando agentes de reticulacion heterobifuncionales tales como SMCC. Como alternativa, pueden tratarse grupos 5' fosfato presentes en los oligonucleotidos con EDC carbodiimida soluble en agua para formar esteres de fosfato y, posteriormente, acoplarse a moleculas que contienen amina. En ciertos casos, el diol en el resto de ribosa 3' puede oxidarse para dar grupos aldehfdo y despues conjugarse con los grupos amina de anticuerpos u otros tipos de protefnas usando aminacion reductora. En ciertos otros casos, el enlazador oligonucleotfdico puede sintetizarse con una modificacion con biotina en el extremo 3' o 5' y conjugarse con moleculas marcadas con estreptavidina.
Los enlazadores oligonucleotfdicos pueden sintetizarse usando cualquiera de una diversidad de tecnicas conocidas en este campo, tales como las descritas en Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109: 7845 (1987); Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18: 5433 (1990); Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23: 2677-2684 (1995); y Wincott et al., Methods Mol. Bio., 74: 59 (1997). En general, la sfntesis de oligonucleotidos hace uso de grupos de acoplamiento y protectores de acido nucleico comunes, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y fosforamiditas en el extremo 3'. Los expertos en la materia conocen reactivos adecuados para la sfntesis de oligonucleotidos, metodos para la desproteccion de acidos nucleicos y metodos para la purificacion de acidos nucleicos.
En ciertos casos, los anticuerpos dependientes del estado de activacion para detectar los niveles de activacion de uno o mas de los analitos o, como alternativa, los segundos anticuerpos independientes del estado de activacion para detectar niveles de expresion de uno o mas de los analitos, se marcan directamente con el primer miembro del par de amplificacion de senales. El miembro del par de amplificacion de senales puede acoplarse a anticuerpos dependientes del estado de activacion para detectar niveles de activacion o a segundos anticuerpos independientes del estado de activacion para detectar niveles de expresion, usando metodos bien conocidos en la tecnica. En ciertos otros casos, los anticuerpos dependientes del estado de activacion o los segundos anticuerpos independientes del estado de activacion se marcan indirectamente con el primer miembro del par de amplificacion de senales a traves de la union entre un primer miembro de un par de union conjugado con los anticuerpos dependientes del estado de activacion o los segundos anticuerpos independientes del estado de activacion y un segundo miembro del par de union conjugado con el primer miembro del par de amplificacion de senales. Los miembros del par de union (por ejemplo, biotina/estreptavidina) pueden acoplarse al miembro del par de amplificacion de senales o a los anticuerpos dependientes del estado de activacion o segundos anticuerpos independientes del estado de activacion usando metodos bien conocidos en la tecnica. Los ejemplos de miembros del par de amplificacion de senales incluyen, pero sin limitacion, peroxidasas tales como peroxidasa de rabano picante (HPR), catalasa, cloroperoxidasa, citocromo c peroxidasa, eosinofilo peroxidasa, glutation peroxidasa, lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, peroxidasa de tiroides, desyodinasa y similares. Otros ejemplos de miembros del par de amplificacion de senales incluyen haptenos protegidos por un grupo protector y enzimas inactivadas por un enlace tioeter con un inhibidor enzimatico.
En un ejemplo de canalizacion de proximidad, el resto facilitador es glucosa oxidasa (GO) y el primer miembro del par de amplificacion de senales es peroxidasa de rabano picante (HRP). Cuando la GO entra en contacto con un sustrato, tal como glucosa, genera un agente oxidante (es decir, peroxido de hidrogeno (H2O2)). Si la HRP esta dentro de la proximidad de canalizacion hacia la GO, el H2O2 generado por la GO se canaliza hacia y forma un complejo con la HRP para formar un complejo HRP-H2O2 que, en presencia del segundo miembro del par de amplificacion de senales (por ejemplo, un sustrato quimioluminiscente tal como luminol o isoluminol, o un sustrato fluorogenico tal como tiramida (por ejemplo, biotin-tiramida), acido homovanflico o acido 4-hidroxifenil acetico) genera una senal amplificada. Se describen metodos para usar GO y HRP en un ensayo de proximidad, por ejemplo, en Langry et al., U.S. Dept. of Energy Report N.° UCRL-ID-136797 (1999). Cuando se usa biotin-tiramida como segundo miembro del par de amplificacion de senales, el complejo HRP-H2O2 oxida la tiramida generandose un radical tiramida reactivo que une covalentemente restos nucleofilos cercanos. La tiramida activada se detecta directamente o se detecta tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales tal como, por ejemplo, un fluoroforo marcado con estreptavidina o una combinacion de una peroxidasa marcada con estreptavidina y un reactivo cromogenico. Los ejemplos de fluoroforos adecuados para uso en la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, un colorante Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa Fluor® 555), fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna (FITC), Oregon Green™; rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodamina (TRITC), un fluor CyDye™ (por ejemplo, Cy2, Cy3,
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Cy5) y similares. El marcador de estreptavidina puede acoplarse directa o indirectamente al fluoroforo o a la peroxidasa usando metodos bien conocidos en la tecnica. Los ejemplos no limitantes de reactivos cromogenicos adecuados para uso en la presente invencion incluyen 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), 3,3'-diaminobenzidina (DAB), 2,2'-azino-bis(acido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfonico) (ABTS), 4-cloro-1-naftol (4CN) y/o porfirinogeno.
En otro ejemplo de canalizacion de proximidad, el resto facilitador es un fotosensibilizador y el primer miembro del par de amplificacion de senales es una molecula grande marcada con multiples haptenos que estan protegidos con grupos protectores que impiden la union de los haptenos a un companero de union especffico (por ejemplo, ligando, anticuerpo, etc.). Por ejemplo, el miembro del par de amplificacion de senales puede ser una molecula de dextrano marcada con moleculas de fluorescefna, cumarina y/o biotina protegida. Los grupos protectores adecuados incluyen, pero sin limitacion, grupos protectores de fenoxi, anilino, olefina, tioeter y selenoeter. En la Patente de Estados Unidos N.° 5.807.675 se describen fotosensibilizadores adicionales y moleculas de hapteno protegidas adecuadas para uso en los ensayos de proximidad de la presente invencion. Cuando el fotosensibilizador se excita con luz, genera un agente oxidante (es decir, oxfgeno singlete). Si las moleculas de hapteno estan dentro de la proximidad de canalizacion al fotosensibilizador, el oxfgeno singlete generado por el fotosensibilizador se canaliza hacia y reacciona con tioeteres presentes en los grupos protectores de los haptenos para producir grupos carbonilo (cetonas o aldehfdos) y acido sulffnico, liberandose los grupos protectores de los haptenos. Los haptenos desprotegidos entonces estan disponibles para unirse especfficamente al segundo miembro del par de amplificacion de senales (por ejemplo, un companero de union especffico que puede generar una senal detectable). Por ejemplo, cuando el hapteno es biotina, el companero de union especffico puede ser una estreptavidina marcada con enzima. Las enzimas ejemplares incluyen fosfatasa alcalina, P-galactosidasa, HRP, etc. Despues de lavar para retirar los reactivos que no se han unido, la senal detectable puede generarse anadiendo un sustrato detectable (por ejemplo, fluorescente, quimioluminiscente, cromogenico, etc.) de la enzima y detectarse usando metodos adecuados y la instrumentacion conocida en la tecnica. Como alternativa, la senal detectable puede amplificarse usando amplificacion de senales con tiramida y la tiramida activada puede detectarse directamente o detectarse tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales como se ha descrito anteriormente.
En otro ejemplo de canalizacion de proximidad, el resto facilitador es un fotosensibilizador y el primer miembro del par de amplificacion de senales es un complejo de enzima-inhibidor. La enzima y el inhibidor (por ejemplo, dextrano marcado con acido fosfonico) se unen entre sf por un enlazador escindible (por ejemplo, tioeter). Cuando el fotosensibilizador se excita con luz, genera un agente oxidante (es decir, oxfgeno singlete). Si el complejo enzima- inhibidor esta dentro de la proximidad de canalizacion hacia el fotosensibilizador, el oxfgeno singlete generado por el fotosensibilizador se canaliza hacia y reacciona con el enlazador escindible, liberandose el inhibidor de la enzima, activandose de esta manera la enzima. Se anade un sustrato enzimatico para generar una senal detectable o, como alternativa, se anade un reactivo de amplificacion para generar una senal amplificada.
En un ejemplo adicional de canalizacion de proximidad, el resto facilitador es HRP, el primer miembro del par de amplificacion de senales es un hapteno protegido o un complejo de enzima-inhibidor como se ha descrito anteriormente, y los grupos protectores comprenden p-alcoxi fenol. La adicion de fenilendiamina y H2O2 genera una fenilendiimina reactiva que se canaliza hacia el hapteno protegido o el complejo de enzima-inhibidor y reacciona con grupos protectores de p-alcoxi fenol para producir haptenos expuestos o una enzima reactiva. La senal amplificada se genera y se detecta como se ha descrito anteriormente (veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.532.138 y 5.445.994).
En el Ejemplo 4 de la Publicacion PCT N.° WO2009/108637 se proporciona un protocolo ejemplar para realizar los ensayos de proximidad descritos en el presente documento.
En otra realizacion, la presente inversion proporciona kits para realizar los ensayos de proximidad descritos anteriormente que comprenden: (a) una serie de dilucion de uno o una pluralidad de anticuerpos de captura contenidos en un soporte solido; y (b) uno o una pluralidad de anticuerpos de deteccion (por ejemplo, una combinacion de anticuerpos independientes del estado de activacion y anticuerpos dependientes del estado de activacion para detectar niveles de activacion y/o una combinacion de primeros y segundos anticuerpos independientes del estado de activacion para detectar niveles de expresion). En algunos casos, los kits pueden contener ademas instrucciones de metodos para usar el kit para detectar el estado de expresion y/o activacion de una o una pluralidad de moleculas de transduccion de senales de celulas tales como celulas tumorales. Los kits tambien pueden contener cualquiera de los reactivos adicionales descritos anteriormente con respecto a la realizacion de los metodos especfficos de la presente invencion tales como, por ejemplo, primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales, reactivos de amplificacion de senales de tiramida, sustratos para el resto facilitador, tampones de lavado, etc.
VI. Produccion de anticuerpos
La generacion y seleccion de anticuerpos no disponibles en el mercado para analizar los niveles de expresion y activacion de moleculas de transduccion de senales en celulas tumorales de acuerdo con los inmunoensayos de la presente invencion pueden realizarse de varias formas. Por ejemplo, una forma es expresar y/o purificar un polipeptido de interes (es decir, antfgeno) usando metodos de expresion y purificacion de protefnas conocidos en la tecnica, mientras que otra forma es sintetizar el polipeptido de interes usando metodos de sfntesis de peptidos en
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fase solida conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol., Vol. 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields, ed., Meth. Enzymol., Vol. 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull., 38: 1192-99 (1990); Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1: 255-60, (1995); y Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull., 44:1326-31 (1996). El polipeptido purificado o sintetizado despues puede inyectarse, por ejemplo, en ratones o conejos, para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. Un experto en la materia reconocera que se dispone de muchos procedimientos para la produccion de anticuerpos, por ejemplo, como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988). Un experto en la materia tambien apreciara que tambien pueden prepararse fragmentos de union o fragmentos Fab que imitan (por ejemplo, retienen las regiones de union funcionales de) anticuerpos a partir de la informacion genetica por diversos procedimientos. Vease, por ejemplo, Antibody Engineering: A Practical Approach, Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, Oxford (1995); y Huse et al.,
J. Immunol., 149:3914-3920 (1992).
Los expertos en la materia reconoceran que pueden realizarse muchas estrategias para producir anticuerpos o fragmentos de union y se pueden cribar y seleccionar con respecto a la afinidad y especificidad los diversos polipeptidos de interes, pero estos enfoques no cambian el alcance de la presente invencion.
En la publicacion PCT N.° WO 2010/132723 se encuentra una descripcion mas detallada de anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos biespecfficos, fragmentos de los mismos y metodos para purificar anticuerpos.
Un experto en la materia apreciara que tambien puede usarse en los metodos de la presente invencion cualquier molecula de union que tenga una funcion similar a un anticuerpo, por ejemplo, una molecula de union o un companero de union que sea especffico para uno o mas analitos de interes en una muestra. Los ejemplos de moleculas de tipo anticuerpo adecuadas incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos de dominio, unicuerpos, nanocuerpos, protefnas reactivas con antfgeno de tiburon, avfmeros, adnectinas, anticuerpos anti-calm, ligandos de afinidad, filomeros, aptameros, aficuerpos, trinectinas y similares.
VII. Metodos de administracion
De acuerdo con los metodos de la presente invencion, los farmacos anticancerosos descritos en el presente documento se administran a un sujeto por cualquier medio conveniente conocido en la tecnica. Los metodos de la presente invencion pueden usarse para predecir la eficacia terapeutica de un farmaco anticanceroso o una combinacion de farmacos anticancerosos en un sujeto que tiene un tumor gastrico. Los metodos de la presente invencion tambien pueden usarse para predecir la respuesta de un tumor gastrico al tratamiento con un farmaco anticanceroso o una combinacion de farmacos anticancerosos. Los metodos de la invencion tambien pueden usarse para seleccionar o identificar un farmaco anticanceroso adecuado o una combinacion de farmacos anticancerosos para el tratamiento de un tumor gastrico. Los metodos de la invencion tambien pueden usarse para tratar a un sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I o II mediante la administracion de una terapia combinada de inhibidores de cMET y HER1 al sujeto. Un experto en la materia apreciara que uno o mas farmacos anticancerosos descritos en el presente documento pueden administrarse solos o como parte de un enfoque terapeutico combinado con quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia y/o cirugfa convencionales.
En ciertas realizaciones, el farmaco anticanceroso comprende un agente antisenalizacion (es decir, un farmaco citostatico) tal como un anticuerpo monoclonal o un inhibidor de tirosina quinasa; un agente antiproliferativo; un agente quimioterapeutico (es decir, un farmaco citotoxico); un agente terapeutico hormonal; un agente radioterapeutico; una vacuna; y/o cualquier otro compuesto con la capacidad de reducir o anular el crecimiento incontrolado de celulas aberrantes tales como celulas cancerosas. En algunas realizaciones, el sujeto se trata con uno o mas agentes antisenalizacion, agentes antiproliferativos y/o agentes terapeuticos hormonales en combinacion con al menos un agente quimioterapeutico. Anteriormente se han descrito ejemplos de anticuerpos monoclonales, inhibidores de tirosina quinasa, agentes antiproliferativos, agentes quimioterapeuticos, agentes terapeuticos hormonales, agentes radioterapeuticos y vacunas.
En algunas realizaciones, los farmacos anticancerosos descritos en el presente documento pueden coadministrarse con agentes inmunoterapeuticos convencionales entre los que se incluyen, pero sin limitacion, inmunoestimuladores (por ejemplo, Bacillus Calmette-Guerin (BCG), levamisol, interleucina-2, interferon alfa, etc.), inmunotoxinas (por ejemplo, conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CD33-calicheamicina, conjugado de anticuerpo monoclonal anti- CD22-exotoxina de pseudomonas, etc.) y radioinmunoterapia (por ejemplo, anticuerpo monoclonal anti-CD20 conjugado con 111In, 9 Y o 131I, etc.).
Los farmacos anticancerosos pueden administrarse con un excipiente farmaceutico adecuado cuando sea necesario y esto puede hacerse por cualquiera de los modos de administracion aceptados. De esta manera, la administracion puede ser, por ejemplo, oral, bucal, sublingual, gingival, palatal, intravenosa, topica, subcutanea, transcutanea, transdermica, intramuscular, intraarticular, parenteral, intra-arteriolar, intradermica, intraventricular, intracraneal, intraperitoneal, intravesical, intratecal, intralesional, intranasal, rectal, vaginal o por inhalacion. Por “co-administrar” se entiende que un farmaco anticanceroso se administra al mismo tiempo, justo antes de o justo despues de la
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administracion de un segundo farmaco (por ejemplo, otro farmaco anticanceroso, un farmaco util para reducir los efectos secundarios asociados con una terapia con farmaco anticanceroso, un agente radioterapeutico, un agente terapeutico hormonal, un agente inmunoterapeutico, etc.).
Una cantidad terapeuticamente eficaz de un farmaco anticanceroso puede administrarse repetidamente, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o mas veces, o la dosis puede administrarse por infusion continua. La dosis puede tomar la forma de formas farmaceuticas solidas, semisolidas, de polvo liofilizado o lfquidas, tales como, por ejemplo, comprimidos, pfldoras, granulos, capsulas, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retencion, cremas, pomadas, lociones, geles, aerosoles, espumas o similares, p refe rente me nte en formas farmaceuticas unitarias adecuadas para la administracion sencilla de dosificaciones precisas.
Como se usa en el presente documento, la expresion “forma farmaceutica unitaria” se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mamfferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un farmaco anticanceroso calculada para producir el inicio, la tolerancia y/o los efectos terapeuticos deseados, junto con un excipiente farmaceutico adecuado (por ejemplo, una ampolla). Ademas, pueden prepararse formas farmaceuticas mas concentradas, a partir de las cuales despues pueden producirse las formas farmaceuticas unitarias mas diluidas. De esta manera, las formas farmaceuticas mas concentradas contendran sustancialmente mas que, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas veces la cantidad del farmaco anticanceroso.
Los expertos en la materia conocen metodos para preparar dichas formas farmaceuticas (vease, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)). Las formas farmaceuticas tfpicamente incluyen un vehfculo o excipiente farmaceutico convencional y ademas pueden incluir otros agentes medicinales, vehfculos, adyuvantes, diluyentes, potenciadores de la infiltracion en tejidos, solubilizantes y similares. Los excipientes apropiados pueden adaptarse a la forma farmaceutica y via de administracion particular por metodos bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra).
Los ejemplos de excipientes adecuados incluyen, pero sin limitacion, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arabiga, fosfato calcico, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato calcico, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, solucion salina, jarabe, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y acidos poliacrflicos tales como Carbopoles, por ejemplo, Carbopol 941, Carbopol 980, Carbopol 981, etc. Las formas farmaceuticas pueden incluir ademas agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes; agentes de suspension; agentes conservantes tales como metil-, etil-, y propil-hidroxi-benzoatos (es decir, los parabenos); agentes para ajustar el pH tales como acidos y bases inorganicas y organicas; agentes edulcorantes; y agentes saporfferos. Las formas farmaceuticas tambien pueden comprender perlas polimericas biodegradables, dextrano y complejos de inclusion de ciclodextrina.
Para la administracion oral, la dosis terapeuticamente eficaz puede estar en forma de comprimidos, capsulas, emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes, pulverizaciones, grageas, polvos y formulaciones de liberacion sostenida. Los excipientes adecuados para administracion oral incluyen calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.
En algunas realizaciones, la dosis terapeuticamente eficaz toma la forma de una pfldora, comprimido o capsula, y de esta manera, la forma farmaceutica puede contener, junto con un farmaco anticanceroso, cualquiera de los siguientes: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicalcico y similares; un disgregante tal como almidon o derivados del mismo; un lubricante tal como estearato de magnesio y similares; y un aglutinante tal como almidon, goma arabiga, polivinilpirrolidona, gelatina, celulosa y derivados de los mismos. Un farmaco anticanceroso tambien puede formularse en un supositorio dispuesto, por ejemplo, en un vehfculo de polietilenglicol (PEG).
Las formas farmaceuticas lfquidas pueden prepararse disolviendo o dispersando un farmaco anticanceroso y opcionalmente uno o mas adyuvantes farmaceuticamente aceptables en un vehfculo tal como, por ejemplo, solucion salina acuosa (por ejemplo, cloruro sodico al 0,9 % p/v), dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar una solucion o suspension, por ejemplo, para administracion oral, topica o intravenosa. Un farmaco anticanceroso tambien puede formularse en un enema de retencion.
Para la administracion topica, la dosis terapeuticamente eficaz puede estar en forma de emulsiones, lociones, geles, espumas, cremas, gelatinas, soluciones, suspensiones, pomadas y parches transdermicos. Para la administracion por inhalacion, un farmaco anticanceroso puede administrarse como un polvo seco o en forma lfquida a traves de un nebulizador. Para la administracion parenteral, la dosis terapeuticamente eficaz puede estar forma de soluciones inyectables esteriles y polvos envasados esteriles. Preferentemente, las soluciones inyectables se formulan a un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5.
La dosis terapeuticamente eficaz tambien puede proporcionarse en una forma liofilizada. Dichas formas farmaceuticas pueden incluir un tampon, por ejemplo, bicarbonato, para reconstituirse antes de la administracion, o
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el tampon puede incluirse en la forma farmaceutica liofilizada para la reconstitucion, por ejemplo, con agua. La forma farmaceutica liofilizada puede comprender ademas un vasoconstrictor adecuado, por ejemplo, epinefrina. La forma farmaceutica liofilizada puede proporcionarse en una jeringa, opcionalmente empaquetada junto con el tampon para la reconstitucion, de tal forma que la forma farmaceutica reconstituida pueda administrarse inmediatamente a un sujeto.
Un sujeto tambien puede supervisarse a intervalos de tiempo periodicos para evaluar la eficacia de un cierto regimen terapeutico. Por ejemplo, los estados de activacion de ciertas moleculas de transduccion de senales pueden cambiar basandose en el efecto terapeutico del tratamiento con uno o mas de los farmacos anticancerosos descritos en el presente documento. El sujeto puede supervisarse para evaluar la respuesta y comprender los efectos de ciertos farmacos o tratamientos en un enfoque individualizado. Ademas, los sujetos que inicialmente responden a un farmaco anticanceroso especffico o combinacion especffica de farmacos anticancerosos pueden volverse refractarios al farmaco o combinacion de farmacos, lo que indica que esos sujetos han desarrollado resistencia adquirida al farmaco. Estos sujetos pueden interrumpir su terapia en curso y puede prescribirse un tratamiento alternativo de acuerdo con los metodos de la presente invencion.
VIII. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invencion reivindicada.
Los ejemplos de la Publicacion PCT N.° WO 2011/008990 (PCT/US2010/042182), presentada el 15 de julio de 2010, y del documento de Estados Unidos US 2012-0270745.
Ejemplo 1. Perfilado funcional de multiples protefnas de rutas de senalizacion en pacientes con cancer gastrico.
RESUMEN
Aunque la gastrectomfa es el unico tratamiento curativo en pacientes con cancer gastrico (GCA), una alta tasa de recurrencia que varfa del 40 ~ 60 % despues de la cirugfa curativa aun representa una baja supervivencia global. Para mejorar adicionalmente la supervivencia, existe la necesidad urgente de identificar marcadores moleculares de pronostico fiables para la supervivencia o recurrencia despues de la quimio-radioterapia adyuvante, lo cual evolucionara hacia el desarrollo de estrategias de tratamiento adaptadas a los pacientes. Por lo tanto, los presentes solicitantes han desarrollado una plataforma de inmunoensayo multiplexada para el perfilado funcional de las protefnas de las rutas de transduccion de senales usando una plataforma de inmuno-micromatriz multiplexada. En el presente documento informamos sobre el perfilado funcional de HER1, HER2, HER3, cMET, PI3K e IGF1R en GCA.
INTRODUCCION
El cancer gastrico metastasico sigue siendo un desaffo terapeutico para los oncologos debido a su mal pronostico. La amplificacion y/o sobreexpresion de HER2 esta presente en muchos casos de cancer gastrico. En la busqueda de una nueva diana terapeutica para el cancer gastrico, el trastuzumab ha demostrado efectos beneficiosos en la supervivencia de pacientes con GCA metastasico HER2(+). Sin embargo, los pacientes HER2 (+) con frecuencia no responden al trastuzumab debido a su resistencia primaria o adquirida. En los estudios de los presentes solicitantes, se analizaron niveles de expresion/activacion de protefnas en rutas de transduccion de senales para inspeccionar la prevalencia de protefnas de las rutas que podrfan establecerse como dianas, para la seleccion racional de inhibidores o combinaciones de agentes. En el presente documento se presenta el perfilado de expresion/activacion de HER2, p95-HER2 y otras protefnas de rutas con potencial transactivacional para HER2 y otras rutas paralelas para establecer el trabajo preliminar para ensayos clfnicos futuros que incorporen agentes dirigidos a HER2 en GCA.
METODOS
Inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (CEER™, por sus siglas en ingles): Se unen protefnas diana presentes en lisados de tejidos a anticuerpos de captura especfficos impresos sobre una superficie de nitrocelulosa y las protefnas no diana no unidas se retiran del portaobjetos. La interaccion enzimatica entre uno de los anticuerpos detectores contra el epftopo alternativo en la protefna diana capturada conjugada con Glucosa Oxidasa (GO) y los otros anticuerpos detectores especfficos para sitios fosforilados en la protefna diana u otro epftopo no solapante conjugado con HRP da como resultado la generacion/amplificacion de senales (vease la Figura 1).
Impresion de portaobjetos: Se imprimen anticuerpos de captura para cada protefna diana especffica por triplicado en dilucion seriada. Cada portaobjetos contiene controles de lfnea celular para la generacion de una curva patron para la cuantificacion precisa de muestras en cada ensayo de portaobjetos.
Muestras clfnicas: Los tejidos de cancer gastrico ultracongelados procedfan de pacientes con GCA confirmado histologicamente localizado (Samsung Medical Center). Las muestras de tejido ultracongelado se lisaron en 100 pl
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de tampon de lisis y los lisados resultantes se almacenaron a -80 °C antes del analisis posterior. RESULTADOS
Aunque el 7 % de los pacientes en esta cohorte expresaban altos niveles de HER2 (31/447) por IHC, aproximadamente el 12 % de los pacientes mostraron un nivel significativo de expresion de HER2 por el ensayo CEER™. Se detecto HER2 truncado (o p95HER2) en el 5,6 % (25/447) de los pacientes con GCA como se muestra en la Figura 2. Se encontraron niveles variables de expresion de HER3 en aproximadamente un 40 % de los pacientes.
Se encontraron altos niveles de HER1 en muestras con menor expresion de HER2. El nivel de HER3-P mostro un alto grado de correlacion con la activacion de HER3-T y PI3K. La expresion de IGF1R en esta cohorte fue relativamente menor en la mayorfa de las muestras. Los niveles de p95HER2 fueron prominentes en muestras con mayor expresion de HER2, sin embargo, los indicios de activacion de p95HER2 tenfan una distribucion mas amplia. Con frecuencia se observo co-activacion de HER1 para pacientes con activacion de cMET (vease la Figura 3).
CONCLUSION
El tratamiento de GCA recurrente o metastasico puede optimizarse basandose en el perfilado de biomarcadores funcionales especfficos de la enfermedad, llevando a estrategias de tratamiento adaptadas para los pacientes. Una direccion combinada a HER1 y cMET en sub-GCA puede beneficiar a los pacientes con un patron de co-activacion. Como CEER™ puede realizarse incluso con una cantidad limitada de tejido, la incidencia de alteracion en protefnas de las rutas de transduccion durante el transcurso de un regimen terapeutico puede guiar a los medicos a encontrar mejores estrategias de tratamiento y soportar el desarrollo clfnico de terapias dirigidas de evolucion o combinadas/secuenciadas.
Ejemplo 2. Perfilado exhaustivo de protefnas de las rutas en un panel de ifneas celulares de cancer gastrico RESUMEN
Con la llegada de la terapia dirigida molecularmente en el cuidado del cancer, el perfilado de protefnas de rutas para farmacos dirigidos tiene mucha importancia. Sin embargo, una de las causas de las dificultades para predecir la respuesta en un regimen dirigido probablemente es la consecuencia del conocimiento limitado de los cambios anomalos en las protefnas de una ruta de transduccion de senales de un tumor. Un nivel profundo de comprension del mecanismo mediante el cual la activacion anomala de protefnas de una ruta produce un fenotipo neoplasico en celulas tumorales y de como la interrupcion establecida como diana conduce a la respuesta clfnica serfa un logro comun para los medicos y los profesionales que desarrollan los farmacos. En el presente documento, se presenta el perfil de mutacion exhaustivo junto con la expresion y/o activacion de protefnas de las rutas (HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF1T, cKIT, Shc, PI3K, AKT, ERK, Src, FAK, PTEN y otras protefnas senal) y su modulacion en respuesta a tratamientos con farmacos dirigidos. El mecanismo de resistencia en subclases de GCA a diversos inhibidores puede utilizarse para disenar opciones de tratamiento racionales con seleccion, combinacion y/o secuenciacion de farmacos dirigidos.
INTRODUCCION
El perfilado de respuestas celulares preclfnicas de muestras de tumor se ha convertido en la piedra angular en el desarrollo de nuevos agentes terapeuticos para el cancer. Por lo tanto, los presentes solicitantes aplicaron el sistema de micromatriz de protefnas multiplexada del inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (CEER™) para perfilar funcionalmente protefnas de transduccion de senales en 30 lfneas celulares GCA bien caracterizadas por sus alteraciones geneticas. La combinacion de caracterizacion genetica y de la ruta funcional en estas lfneas celulares permitio una subclasificacion diversa y distinta de GCA y puede proporcionar una hoja de ruta para estudios clfnicos y el desarrollo de farmacos.
METODOS
CEER™: Protefnas diana presentes en lisados de tejido se unen a anticuerpos de captura especfficos impresos en una superficie de nitrocelulosa y las protefnas no diana no unidas se retiran del portaobjetos. La interaccion enzimatica entre uno de los anticuerpos detectores contra un epftopo alternativo en una protefna diana capturada conjugada con Glucosa Oxidasa (GO) y los otros anticuerpos detectores especfficos para sitios fosforilados en una protefna diana u otro epftopo no solapante conjugado con HRP da como resultado la generacion/amplificacion de senales (vease, Figura 1).
Analisis de multiples efectos del farmaco: ~1 x 104 celulas se cultivaron en una placa de 24 pocillos y se desarrollaron en medios de crecimiento apropiados. Se anadieron Lapatinib, inhibidor de cMET o ambos agentes (combo) a una concentracion 1 pM durante 4 horas y se lisaron para un perfilado de la ruta posterior.
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La Figura 4A ilustra un perfil de expresion/activacion exhaustivo de 30 lineas celulares de GCA. La Figura 4B proporciona imagenes de inmunomatriz ejemplares para el perfil de rutas de la lfnea celular SNU5. Las Figuras 4C-G proporcionan un resumen de perfiles de rutas basales para las lineas celulares SNU5 (C), SNU484 (D), SNU1 (E), MKN45 (F) y KATOIII (G) y su modulacion despues del tratamiento con farmaco. El grado de activacion se diferencia con colores con diferentes intensidades.
CONCLUSION
El tratamiento de GCA recurrente o metastasico puede optimizarse basandose en el perfilado funcional especifico de la enfermedad de biomarcadores que conducen a estrategias de tratamiento adaptadas al paciente. Ademas, la incidencia de alteracion en proteinas de rutas de transduccion durante el tratamiento puede determinarse facilmente por la plataforma CEER™, que requiere cantidades limitadas de muestras de tumor (por ejemplo, FNA, CTC, etc.) para guiar mejor a los medicos para combinar o secuenciar los agentes apropiados.
Ejemplo 3. El perfilado de fosforilacion de tirosina identifica rutas activadas concomitantemente en cancer gastrico
El estudio presentado en este ejemplo ilustra que los canceres gastricos pueden segregarse basandose en los perfiles de fosforilacion de rutas de senalizacion de receptores de factores de crecimiento clave que son activos en este tipo de cancer.
RESUMEN
Actualmente, el trastuzumab es la unica terapia dirigida conocida beneficiosa en ~20 % de los canceres gastricos metastasicos. Una mayor comprension de las RTK activadas en estos canceres heterogeneos puede hacer avanzar significativamente el desarrollo terapeutico dirigido; sin embargo, esto se ve obstaculizado por la incapacidad de buscar redes de fosforilacion en especimenes clinicos. Utilizando un nuevo inmunoensayo, CEER™, los presentes solicitantes demuestran, por primera vez, la presencia de variantes truncadas de HER2 en canceres gastricos avanzados. Los presentes solicitantes tambien demuestran la presencia de RTK activadas concomitantemente que influyen en los tiempos de supervivencia sin enfermedad de canceres gastricos recurrentes. El agrupamiento jerarquico de RTK activadas revela el co-agrupamiento de muestras que expresan HER1:c-MET, HER2:HER3 e IGF1R-PI3K activados en canceres gastricos. Los estudios in vitro en celulas y celulas tumorales primarias demuestran que ciertos patrones de RTK regulados de forma diferencial pueden guiar la direccion terapeutica. En general, el estudio de los presentes solicitantes tiene fuertes implicaciones para el desarrollo de farmacos y la supervision terapeutica en canceres gastricos.
SIGNIFICADO
Excepto en el caso de una subserie de canceres HER2(+), no hay un tratamiento aceptado globalmente consenso para la mayoria de los canceres gastricos avanzados debido a la ausencia de marcadores moleculares para dirigir enfoques de tratamiento eficaces. En el presente documento, usando un nuevo ensayo de diagnostico clinico, los presentes solicitantes presentan, en 434 muestras de cancer gastrico en estadio avanzado, CTC y celulas tumorales derivadas de liquido ascitico raras, que ciertas RTK activadas concomitantemente distinguen distintas subseries de canceres gastricos. Los patrones de activacion de RTK diferenciales se correlacionan con la supervivencia sin la enfermedad despues de la cirugfa. Las ramificaciones de los analisis de fosforilacion dirigidos realizados directamente en tejidos clinicos son significativas, incluyendo la mejora de la comprension de directores moleculares especiales de subtipos de cancer gastrico, lo que ayuda a la identificacion de nuevos marcadores de pronostico, paradigmas de tratamiento y supervision longitudinal de la respuesta terapeutica o la progresion de la enfermedad despues de la administracion del farmaco.
INTRODUCCION
Con la llegada de la era de la terapia dirigida molecularmente en el campo de la oncologfa, muchos oncologos han experimentado respuestas espectaculares e inesperadas a agentes dirigidos molecularmente en pacientes con cancer metastasico refractario que, de otra forma, estarfan con cuidados paliativos. Sin embargo, los criterios de seleccion de pacientes para los agentes terapeuticos dirigidos actualmente son imperfectos. Incluso los pacientes seleccionados basandose en sus perfiles de dianas, con frecuencia no responden a los agentes establecidos como diana o desarrollan resistencia despues de tener una respuesta inicial espectacular. La mayoria de los problemas que impiden mejorar el efecto terapeutico beneficioso con agentes dirigidos son: (1) una activacion de la ruta concomitante y redundante en subgrupos de pacientes; (2) el desarrollo de resistencia mediante la activacion de acontecimientos de senalizacion alternativos que desvfan la protefna o proteinas dirigidas originalmente mediante la comunicacion entre rutas; (3) la alteracion de caracterfsticas moleculares y patologicas segun metastatiza y progresa el cancer a lo largo del transcurso del tratamiento anticanceroso; (4) la disponibilidad limitada de repetir las biopsias durante o despues de los tratamientos; y (5) la limitacion de diagnosticos complementarios para farmacos dirigidos
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con el fin de identificar posibles mecanismos de resistencia a farmacos para tratar la enfermedad "en desarrollo".
Aproximadamente la mitad del complemento de tirosina quinasa del quinoma humano esta implicada en los canceres humanos y proporciona dianas para el tratamiento del cancer, asf como biomarcadores para la seleccion de los pacientes (Blume-Jensen y Hunter, 2001; Hochgrafe et al., 2010). Ademas, ciertos estudios previos han mostrado la coactivacion de tirosina quinasas receptoras (RTK) en subseries de varios canceres tales como glioblastoma multiforme (Stommel et al., 2007), cancer de mama (Hochgrafe et al., 2010; Liu et al.; 2011; Xu et al., 2011), cancer de pulmon (Engelman y Janne, 2008; Engelman y Settleman, 2008), cancer de cabeza y cuello (Xu et al., 2011) y cancer gastrico (Liu et al., 2011). Los presentes solicitantes han desarrollado un inmunoensayo basado en proximidad que utiliza la formacion de un unico inmunocomplejo que requiere la co-localizacion de dos anticuerpos conjugados con enzimas detectores una vez que las protefnas diana estan capturadas en la micromatriz, Inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (CEER™, como se muestra en la Figura 5). Este formato de ensayo permite a los presentes solicitantes establecer el perfil de RTK y las expresiones y activaciones de protefnas de las rutas aguas abajo de una manera muy sensible a nivel de una sola celula (sensibilidad de aproximadamente 100 zeptomoles) y, por lo tanto, adecuada para el analisis multiplexado de rutas redundantes con activacion (o posible activacion) de ruta concomitante.
El cancer gastrico es la causa principal de muerte por cancer en todo el mundo, con una incidencia de 18,9/100.000 al ano y una tasa de mortalidad de 14,7/100.000 al ano (Cunningham et al., 2005) y es la malignidad mas comun en Corea (Bae y Park, 2002). El cancer gastrico metastasico sigue siendo un desaffo terapeutico para los oncologos debido a su mal pronostico. Actualmente, el trastuzumab es el unico agente dirigido activo que ha resultado ser eficaz para el cancer gastrico en un ensayo aleatorizado de fase III (Bang et al., 2010). Otras protefnas de la ruta activadas conocidas en el cancer gastrico incluyen la familia del receptor del factor de crecimiento epidermico humano (HER), el receptor del factor de transicion epitelial mesenquimatico o factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (receptor cMET), la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo 1 (IGF1R). De esta manera, los presentes solicitantes han usado la plataforma CEER™ multiplexada para determinar los niveles de RTK activadas en 434 tejidos de cancer gastrico ultracongelados y han intentado categorizar a los pacientes con cancer gastrico en posibles subgrupos (HER1, HER2, variantes truncadas de HER2, p95HER2, HER3, cMET, PI3K e IGF1R). Basandose en sus patrones de activacion de protefnas de las rutas, los presentes solicitantes han observado la activacion de multiples protefnas senal en un subgrupo de tumores, y han propuesto la hipotesis de que las entradas de activacion de rutas redundantes conducirfan a una senalizacion residual aguas abajo, limitandose de esta manera la eficacia antitumoral de la monoterapia dirigida contra una sola RTK. Los presentes solicitantes realizaron experimentos de prueba de principio para investigar el efecto antitumoral de inhibidor de HER1/2 + inhibidor de cMET en lfneas celulares de cancer gastrico con cMET y HER co-activados. Por ultimo, los presentes solicitantes desarrollaron una herramienta potencialmente potente que puede permitir a los medicos supervisar las alteraciones basales y posteriores en el perfil de activacion de RTK durante el tratamiento, usando celulas tumorales circulantes y celulas malignas aisladas de lfquido peritoneal (lfquido ascftico). Considerado en conjunto, el estudio de los presentes solicitantes proporciona indicios de la activacion de RTK concomitante en tejidos humanos de cancer gastrico y establecieron una herramienta clfnica para supervisar la activacion de RTK segun evoluciona el cancer durante el tratamiento y la progresion.
RESULTADOS
Caracterfsticas de los pacientes
En la Tabla 1 se proporcionan las caracterfsticas de 434 pacientes incluidos en el analisis. Todos los pacientes se sometieron a gastrectomfas con diseccion del ganglio linfatico D2. De 434 pacientes, 242 (55,8 %) pacientes se sometieron a una gastrectomfa subtotal con diseccion de ganglio linfatico D2. De acuerdo con el sistema de estadificacion AJCC 2002, 86 pacientes tuvieron la patologfa en estadio I, 116 en estadio II, 126 en estadio III y 106 en estadio IV (35 pacientes con M1 metastasico). En el momento del analisis, 226 pacientes habfan muerto y 237 pacientes tenfan una recurrencia documentada. En relacion con la patologfa, 70 pacientes tenfan carcinoma de celulas en anillo de sello. La tasa de supervivencia global en 5 anos fue del 52,4 % y la tasa de supervivencia sin enfermedad en 5 anos fue del 50,0 %. Todos los tejidos de cancer gastrico primarios se obtuvieron en el momento de la cirugfa y se congelaron inmediatamente para el analisis molecular futuro.
Tabla 1: Caracterfsticas de pacientes del conjunto de muestras clfnicas de cancer gastrico.
Caracterfsticas
N=434
Edad (anos) Mediana, intervalo
61,26 - 87
Sexo Hombres Mujeres
285 (65,7 %) 149 (34,3 %)
Tipo de gastrectomfa Gastrectomfa subtotal Gastrectomfa total
242 (55,8 %) 192 (44,2 %)
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Caracterfsticas
N=434
Localizacion del tumor
Cardias
12 (2,8 %)
Cuerpo
142 (32,7 %)
Antro
280 (64,5 %)
Grado
Tubular de bien a moderadamente diferenciado
138 (31,8 %)
Tubular poco diferenciado
186 (42,9 %)
Celula en anillo de sello
70 (16,1 %)
Mucinoso
32 (7,4 %)
Papilar
2 (0,5 %)
Hepatoide
2 (0,5 %)
Otros.
4 (0,9 %)
Tipo de Lauren (N=397)
Intestinal
154 (38,8 %)
Difuso
225 (56,7 %)
Mixto
18 (4,5 %)
Invasion linfovascular
Presente/identificada
256 (59,0 %)
No presente/no identificada
178 (41,0 %)
Estadio AJCC (2002)
I
86 (19,8 %)
II
116 (26,7 %)
III
126 (29,0 %)
IV
106 (24,4 %)
Los canceres gastricos expresan HER2 y su variante truncada, p95HER2
La eficacia superior del anticuerpo dirigido a HER2, trastuzumab, en combinacion con quimioterapia ha preparado el terreno para las terapias dirigidas molecularmente en los canceres gastricos. Sin embargo, no todos los pacientes con cancer gastrico que expresan HER2 seleccionados por inmunohistoqufmica e hibridacion in situ fluorescente responden a este tratamiento, lo cual pone en relieve la necesidad de biomarcadores mas predictivos. Los presentes solicitantes realizaron un analisis en profundidad del estado HER2 incluyendo su estado activado en los especfmenes de cancer gastrico obtenidos a partir de 434 pacientes.
El estado HER2 de la cohorte de muestras con cancer gastrico de los presentes solicitantes se determino por IHC mediante el ensayo HercepTest convencional, seguido de un analisis FISH para los tejidos con una puntuacion IHC de 2+. En el estudio de los presentes solicitantes, las muestras positivas para HER2 (HER2(+)) se definen como muestras con una puntuacion HER2-IHC de 3+ o 2+ ademas de una amplificacion del gen HER2 como se determina por FISH. Las muestras negativas para HER2 (HER2(-)) incluyen muestras con una puntuacion HER2-IHC 2+ sin una amplificacion del gen HER2 o muestras con una puntuacion HER2-IHC 1+/0. Basandose en estas definiciones que son especfficas para canceres gastricos (Hofmann et al., 2008), se confirmo que 50 de 434 (11,5 %) pacientes eran HER2(+) por inmunohistoqufmica y/o FISH en la cohorte de pacientes de los presentes solicitantes (Tabla 2). De acuerdo con otros informes (Grabsch et al., 2010; Hofmann et al., 2008; Tanner et al., 2005), la expresion de HER2 variaba con el histotipo de Lauren, observandose un mayor numero de muestras HER2+ (36 de 60 (72 %)) en los canceres intestinales en comparacion con los canceres gastricos de tipo difuso o mixto. Es importante indicar que la mayorfa de las muestras “negativas para HER2” siguen expresando HER2 total, aunque a niveles claramente inferiores que la poblacion de pacientes positivos para HER2 (Figura 6A). Cuando se volvieron a analizar muestras de cancer gastrico HER2(+) para la expresion de HER2 usando la directriz IHC especffica para canceres de mama HER2-IHC, el 78 % (39/50) se mantuvieron como 3+ o 2+, pero el 22 % restante (11/50) se evaluo como 1+ (Tabla 2).
Como la inmunohistoqufmica y las tecnologfas FISH no proporcionan una lectura del estado activado de HER2 y pueden ignorar una baja expresion de HER2, los presentes solicitantes a continuacion analizaron los niveles de expresion de la protefna HER2 total y fosforilada usando el ensayo CEER™ basado e inmuno-micromatriz (Kim et al., 2011) (Figura 5) en este conjunto de muestras de pacientes. Los presentes solicitantes previamente habfan desarrollado algoritmos para convertir los valores de RFU obtenidos en un ensayo CEER™ en Unidades Calculadas (CU), una unidad funcional convencional basada en controles de la lfnea celular con expresion y activacion de HER2 conocidas (Kim et al., 2011). Como se predijo, se observaron niveles de expresion de HER2 sustancialmente mayores por CEER™ en tumores HER2(+) segun IHC/FISCH en comparacion con los tumores HER2(-) como se muestra en la Figura 6A (con un valor medio de 77,9 UC frente a 4,3 CU, valor p 8.18E-10). Ademas, CeER™ revelo un nivel significativo de heterogeneidad en la expresion de HER2 dentro de la poblacion de tumores HER2(+), un rasgo que se ha notificado frecuentemente en canceres gastricos debido a la naturaleza focal o “clonal” del patron de distribucion celular de HER2 (Hofmann et al., 2008). Esto tambien da como resultado unicamente un grado
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moderado de concordancia entre las lecturas de IHC y FISH para HER2 (ensayo ToGA, 87,5 %), lo que conduce a la complejidad en el desarrollo de diagnosticos de hER2 para canceres gastricos. En el analisis de los presentes solicitantes, el 64 % (32/50) de los canceres HER2(+) segun IHC/FISH tambien mostraron expresion de HER2 segun CEER™. Es interesante indicar que ~20 % de los canceres HER2(-) tambien eran positivos para la expresion de HER2 por CEER™. Debe tenerse en cuenta que los presentes solicitantes han comparado previamente la expresion de HER2 mediante IHC y CEER™ en 293 pacientes con cancer de mama que inicialmente mostraron una concordancia del 83 % (Figura 7), sin embargo, tras el ajuste de las lecturas de IHC con una expresion basada en transferencia de western (WB) de HER2, la comparacion revelo una concordancia del 96 % entre CEER™ e IHC ajustado con WB (Kim et al., 20l1).
Los presentes solicitantes exploraron la presencia de variantes de HER2 alternativas en canceres gastricos. Uno de los mecanismos importantes para la resistencia a trastuzumab en el 70-80 % de los canceres de mama que sobreexpresan HER2 es la acumulacion de formas truncadas del receptor HER2, p95HER2, que carece del dominio de union a trastuzumab extracelular (Scaltriti et al., 2007). Los presentes solicitantes desarrollaron un ensayo basado en CEER™ altamente sensible y especffico para analizar especfficamente p95HER2 total en canceres gastricos. Esto se consiguio usando una plataforma de inmuno-microensayo mediada por anticuerpo triple en lisados de tejidos tumorales enriquecidos para las variantes truncadas de HER2 despues de la eliminacion inmuno- magnetica de HER2 de longitud completa (Figura 8). La lectura del ensayo de p95HER2 total fue relativa a las senales generadas a partir de las curvas patron generadas usando un lisado de celulas de control procedente de la lfnea celular de cancer de mama BT474. Usando la plataforma de ensayo de p95HER2 basada en CEER™, se detectaron especfficamente, por primera vez, formas truncadas de HER2, ademas de HER2 de longitud completa, en canceres gastricos. La expresion de p95HER2 se analizo en una subserie de muestras tumorales del grupo HER2(+) (31 muestras) y del grupo HER2(-) (27 muestras) que demostraron una expresion significativa de HER2 de longitud completa segun se detectaba por CEER™. Una muestra del grupo HER2(-) no pudo analizarse de forma precisa debido a problemas tecnicos. La incidencia de p95HER2 en nuestra cohorte de pacientes con cancer gastrico fue de aproximadamente un 77 % (en 24 de 31) en los especfmenes HER2(+). De forma similar a lo que ocurrfa con la expresion de HER2 de longitud completa, la mayor parte de la expresion de HER2 truncado (79 % de p95HER2 expresado en HER2(+)) se observo en los canceres gastricos de tipo intestinal. Tambien se detecto expresion de p95HER2 en un pequeno porcentaje de tumores (2,6 % o 10/384 en total) que eran HER2(-) por IHC/FISH, pero que mostraron una expresion de HER2 significativa basada en CEER™. Estos comprendfan -37 % (10/27) de una subserie de muestras de HER2(-) que se analizaron con respecto a p95HER2. Sin embargo, la expresion media de p95HER2 en muestras de cancer gastrico HER2(+) fue significativamente mayor que la observada en muestras HER2(-) (5083,6 UC en HER2(+) frente a 437,0 uC en HER2(-), valor p = 1,27e-05). Se uso un valor lfmite de 500 UC para evaluar la positividad para p95HER2 (como se muestra en la Figura 6B) por 20 pg de tejido analizado. Considerados en conjunto, los datos de los presentes solicitantes indican que un analisis exhaustivo de la expresion de HER2 tanto de longitud completa como truncado proporciona valor al desarrollo adicional de estrategias de direccion a HER2 en canceres gastricos.
Heterogeneidad en perfiles de activacion de rutas en canceres gastricos: rutas de senalizacion coactivadas
Habiendo determinado la presencia de HER2 y sus isoformas truncadas en el cancer gastrico, los presentes solicitantes exploraron la presencia de formas totales y fosforiladas (activadas) de varias moleculas de senalizacion que son dianas de farmacos. Estas inclufan los miembros RTK del eje de la HER quinasa (HER1, HER2 y HER3), c- MET, IGF1R y PI3K. En la Figura 9A se muestran imagenes representativas de matrices de rutas de CEER™ multiplexadas. En el panel de estudio de los presentes solicitantes, los tumores de 202 pacientes (46,5 %) no tuvieron una actividad detectable de las RTK ensayadas en el panel de estudio. Por el contrario, los patrones de activacion de rutas para el resto de los pacientes, como se representa en un analisis de agrupamiento de rutas (Figura 9B), variaban ampliamente, demostrando algunos canceres gastricos una activacion concomitante de multiples rTk tales como HER2/HER3, HER1/2/3, HER1/3/c-MET o HER3/c-MET, mientras que otros se fosforilaron solo en una unica protefna. El contenido de tumor de todas las muestras analizadas fue de al menos un 70 % basandose en su examen histologico. Sin embargo, la pan-expresion de citoqueratina fue claramente variable, indicando heterogeneidad en el contenido epitelial de canceres gastricos. Basandose en este perfilado, los presentes solicitantes categorizaron la cohorte de 434 muestras de cancer gastrico de acuerdo con sus firmas de activacion de RTK y su estado de HER2.
Eje HER en canceres gastricos (Tabla 3): De todas las RTK que se analizaron, los presentes solicitantes descubrieron que al menos un miembro receptor del eje HER estaba activado en el 41 % de las muestras de cancer gastrico en la serie de datos de los presentes solicitantes. Aproximadamente un 66 % de los canceres HER2(+) y ~38 % de los canceres HER2(-) demostraron activacion de un miembro receptor de la HER quinasa. Ademas, ~36 % de las muestras con un receptor activado de HER quinasa no presentaban una activacion concomitante de las rutas de c-MET o IGF1R. HER2 y HER3 estaban fosforilados en mayores porcentajes de pacientes con cancer gastrico HER2(+) (50 % y 36 %) en comparacion con los canceres HER2(-), en los que estaban activados en ~22 % y ~24 % de las muestras, respectivamente. HER1 fosforilado no parecfa tener dicha preferencia por los canceres positivos para HER2 y se activaba de forma equivalente tanto en los canceres gastricos positivos para HER2 como en los negativos para HER2 (26 % en HER2(+) y 25 % en HER2(-)). Histologicamente, la mayorfa de los canceres gastricos del tipo intestinal positivos para HER2 expresaban un HER2 activado (en 22/36 o ~61 %) seguido de HER3
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(en 13/36 o ~36 %), expresando un 36 % global de los canceres gastricos de tipo intestinal una ruta HER2 activada. En general, la activacion de HER2 estaba mas concentrada en los canceres de tipo intestinal (35,7 %) y de tipo mixto (33,3 %) que en los canceres de tipo difuso (19,1 %). Por el contrario, se observo HER1 activado en la mayorfa de los canceres gastricos de tipo intestinal (24,7 %) y de tipo difuso (25,8 %). HER3 activado se expresaba de forma equivalente entre los tres histotipos de cancer gastrico.
Como la funcion de senalizacion del eje de la HER quinasa es dependiente de la dimerizacion del receptor activado, los presentes solicitantes examinaron los diversos pares de miembros de HER activados. La coactivacion de HER2 con HER3 era preferida en canceres positivos para HER2 (13/50 o 26 %), con 7/13 muestras con activacion de HER2:HER3 sin coactivacion de HER1. Por otra parte, los canceres gastricos negativos para HER2 no demostraban una preferencia por ningun par de dfmeros de HER quinasa especffico, expresandose los tres pares de dfmeros activados posibles (HER1:hEr2, HER1:HER3 y HER2:HER3) en ~15 % cada una de las muestras HER2(-). La triple activacion de receptores HER1/2/3 se observo en un 11,5 % de canceres gastricos, con una distribucion similar entre canceres HER2(+) y HER2(-).
Los presentes solicitantes tambien examinaron el estado de los miembros receptores del eje de HER activados con respecto a la expresion de p95HER2 en las muestras. Los canceres gastricos p95HER2(+), HER2(+) tenfan una predileccion por HER2 de longitud completa activado (expresado en 16/24 o ~67 % de p95HER2(+), HeR2(+)) en comparacion con HER1 activado (expresado en 5/24 o ~21 % de p95HER2(+), hEr2(+)) o HeR3 activado (expresado en 9/24 o ~37 % de p95HER2(+), HER2(+)). Sin embargo, los canceres gastricos p95HER2(+), HER2(-) no tenfan dicha preferencia, demostrando el 50 % (5/10) de las muestras p95HER2(+), HER2(-) una activacion de los tres miembros receptores del eje de la HER quinasa.
Canceres gastricos con c-MET activado (Tabla 4): De forma similar a HER1, la fosforilacion de c-MET se distribufa de forma equivalente entre canceres gastricos HER2(+) (22 %) y HER2(-) (25 %). Ademas, la distribucion de c-MET activado basada en el histotipo de Lauren fue similar en canceres gastricos de tipo intestinal (31,2 %) y difuso (24,4 %). Ninguno de los canceres gastricos de tipo mixto demostro la presencia de cMET activado en el conjunto de muestras de los presentes solicitantes.
La mayorfa de muestras de cancer gastrico con c-MET activado (~71 % o 77/108) demostraron una activacion concomitante de miembros receptores de HER quinasa. Por lo tanto, los presentes solicitantes investigaron adicionalmente los receptores del eje de HER preferidos que se comunican con la ruta de c-MET en canceres gastricos. Coexistfa una expresion activada de c-MET y p95HER2 en 5/24 y 1/10 muestras HER2(+) y HER2(-), respectivamente, que expresaban p95HER2. En general, c-MET se coactivaba de forma preferente con HER1 (en 66/434 o 15,2 %) en comparacion con HER2 (10,1 %) o HER3 (9,7 %). Se observo la misma tendencia en canceres gastricos HER2(-) donde el 15,4 % de los canceres demostro una coactivacion c-MET-HER1. De hecho, 13/66 canceres gastricos con coactivacion de c-MET-HER1 no demostraban una coactivacion de HER2 o HER3. Estas observaciones sugieren una posible comunicacion entre las rutas de senalizacion de c-MET y HER1 en canceres gastricos. La activacion de c-MET nunca coexistfa con la activacion de HER3 a menos que HER1 y/o HER2 tambien estuvieran fosforilados en la misma muestra. Aproximadamente un 7 % de las muestras de cancer gastrico demostraron una coactivacion de los tres miembros receptores del eje de HER con c-MET.
Canceres gastricos con IGF1R activado (Tabla 5): De forma similar a la activacion de HER3, la ruta de senalizacion dirigida por el receptor de IGF1 era activa en un mayor porcentaje de canceres HER2(+) (30 %) en comparacion con los canceres HER2(-) (24,5 %). Ademas, como se observo con HER3 fosforilado, IGF1R activado se distribufa de forma equivalente entre los tres subtipos de cancer gastrico histologicos; es decir, un 26 % de canceres intestinales, un 24 % de canceres gastricos de tipo difuso y un 28 % de canceres gastricos de tipo mixto. Esta distribucion llevo a los presentes solicitantes a investigar si habfa una coactivacion de IGF1R-HER3 en su conjunto de muestras. Efectivamente, IGF1R estaba coactivado de forma maxima con fosfo-HER3, especialmente en canceres HER2(+), donde el 22 % u 11/50 muestras HER2(+) demostraron una coactivacion de IGF1R-HER3. Sin embargo, en canceres HER2(-), el porcentaje de coactivacion de IGF1R con HER3 (en 51/384 muestras o 13,8 %) fue similar a la coactivacion de IGF1R con HER1 (en 53/384 muestras o 13,3 %). Le segufa de cerca la coactivacion de IGF1R:HER2 (en 45/384 muestras u 11,7 %). En general, 34/434 muestras de cancer gastrico demostraron coactivacion de todos los miembros del eje de la HER quinasa con IGF1R, de las que 28 muestras tambien demostraron una coactivacion de c-MET. Sin embargo, c-MET raramente se coactivaba con IGF1R en ausencia de coactivacion de un miembro receptor de la HER quinasa. Ademas, las coactivaciones de c-MET:IGF1R se observaron principalmente en canceres gastricos HER2(-). Pocas muestras p95HER2(+) demostraron una activacion de IGF1R (7/24 muestras HER2(+) y 3/10 muestras HeR2(-)).
Las muestras de cancer gastrico se agruparon en un mapa de calor basandose en los perfiles de activacion basados en deciles de los seis marcadores evaluados en este estudio. El analisis de agrupamiento se realizo para confirmar los patrones de correlacion de activacion de RTK mencionados anteriormente en los canceres gastricos (Figura 9B). El analisis demostro que los patrones de activacion de c-MET:pHER1, pHER2:pHER3 e IGF1R:PI3K estan muy correlacionados en el conjunto de muestras de los presentes solicitantes, formando el grupo c-MET-pHER1 una subserie distinta. Esto estaba de acuerdo con los patrones de coactivacion de RTK que se han observado previamente. Un analisis adicional de rutas de senalizacion que son residentes aguas abajo de estas RTK
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analizadas, tales como PI3K, revelo que, en la poblacion de cancer gastrico no seleccionada, se observaba maximamente actividad PI3K con coactivacion de IGF1R (77/108 muestras o 71,3 %) seguido de coactivacion de HER3 (71/108 muestras o 65,7 %). Esto esta de acuerdo con el analisis de agrupamiento y los estudios presentados que refuerzan adicionalmente la validez del ensayo CEER™.
En resumen, el analisis exhaustivo de los presentes solicitantes de miembros receptores del eje de la HER quinasa fosforilada, c-MET e IGF1R, revelo que los canceres gastricos son significativamente heterogeneos con respecto a la actividad de las RTK analizadas y, efectivamente, pueden segregarse en diferentes subclases basandose en sus perfiles de activacion de RTK. Ademas, en los canceres gastricos son muy prevalentes rutas de senalizacion concomitantes en lugar de cualquier otra senal. Dichas segregaciones moleculares pueden ayudar a guiar los estudios de pronostico y terapeuticos para subtipos de cancer gastrico.
La segregation de muestras basandose en los perfiles de activacion de rutas basados en CEER™ se correlaciona con la supervivencia sin enfermedad despues de la cirugia
Los presentes solicitantes investigaron el impacto del perfilado de fosforilacion basado en CEER™ sobre el pronostico clfnico de canceres gastricos. Se analizo la supervivencia sin la enfermedad de los pacientes despues de una cirugia curativa tras segregar a los pacientes en grupos basandose en los perfiles de activacion de rutas de senalizacion de sus muestras de tumor obtenidas en el momento de la cirugia. Inicialmente, los presentes solicitantes analizaron las diferencias de supervivencia sin enfermedad entre pacientes con tumores HER2(+) frente a pacientes con tumores HER2(-). Los tumores HER2(+) son principalmente de un histotipo intestinal que responde claramente a terapias anti-HER2. Por lo tanto, los presentes solicitantes investigaron si los tiempos de recurrencia de los tumores HER2(+) pueden diferir de los de los canceres gastricos HER2(-). Sin embargo, no se observaron dichas diferencias incluso despues de que las muestras se ajustaran para su estadio de tumor. Como era de esperar intuitivamente, la mediana de los tiempos de supervivencia sin enfermedad de los pacientes con cancer gastrico, tanto con tumores HER2(+) como con tumores HER2(-), se reducfa progresivamente al aumentar el estadio del tumor desde el estadio I al estadio IV.
Como solo una subserie de canceres gastricos tanto HER2(+) como HER2(-) demostraron una activacion de las RTK analizadas en el estudio de los presentes solicitantes, se razono que las RTK activadas pueden influir en la progresion de estos tumores. Por lo tanto, se analizaron las diferencias de supervivencia entre pacientes sin activacion de RTK frente a pacientes con activacion de RTK >1, determinada por el ensayo CEER™. No se observaron diferencias significativas en la supervivencia entre los dos grupos hasta que tambien se tuvieron en cuenta los estadios del tumor. Como los pacientes con GCA con la enfermedad en estadio I tfpicamente muestran un gran efecto beneficioso por la reseccion quirurgica curativa mientras que los pacientes con la enfermedad en estadio IV estan limitados a opciones de tratamiento paliativas, los presentes solicitantes intentaron investigar si el grado de activacion de RTK tenia algun impacto sobre el resultado clfnico de los pacientes con la enfermedad en los estadios II y III. Una vez segregadas las muestras basandose en sus estadios del tumor, estaba claro que los pacientes en estadio II y III con activacion de RTK >1 demostraban una peor supervivencia sin progresion que aquellos en los que no estaba activada ninguna de las RTK analizadas. La mediana de los tiempos de supervivencia de pacientes con estadios de tumor II+III y activacion de RTK >1 fue significativamente menor que la de aquellos con activacion de RTK 0 (Figura 10A; estadios tumorales II+III: 32,63 meses para activacion de RTK >1 frente a 76,53 meses para activacion de RTK 0 (p=0,0318, cociente de riesgo=0,69)). Las diferencias significativas en las medianas de los tiempos de supervivencia se mantuvieron tambien en muestras solo HER2(-) (Figura 10B; estadios tumorales II+III: 30,10 meses para activacion de RTK >1 frente a 68,13 meses para activacion de RTK 0 (p=0,0190, cociente de riesgo=0,64)). Estos datos indican claramente que las RTK analizadas en este estudio, en diversas combinaciones, influyen en la supervivencia sin enfermedad en los canceres gastricos. Una observacion importante de este analisis es que es el estado activado de las RTK, y no simplemente el estado de expresion, lo que contribuye a la supervivencia sin enfermedad de los pacientes despues de una cirugia curativa. Como es evidente en la Figura 9A, varias muestras de cancer gastrico expresan diversas RTK a altos niveles, sin embargo, en la mayorfa de las muestras solo esta fosforilada una subserie o no esta fosforilada ninguna de esas RTK. Para el analisis de supervivencia, solo se analizaron las muestras con activacion de RTK significativa.
En un esfuerzo por explorar la contribucion de las RTK individuales a la supervivencia sin progresion, los presentes solicitantes se concentraron en las muestras de cancer gastrico con HER1 y c-MET activados. Las razones de centrarse en estas RTK fueron diversas. c-MET presenta amplificacion del gen en un numero significativo de canceres gastricos; sin embargo, los inhibidores anti-MET de un solo agente no han podido demostrar un efecto clfnico beneficioso en estos canceres (Jhawer et al., 2008). Otros investigadores han notificado una eficacia superior de la terapia de combinacion para c-MET y HER1 en modelos preclfnicos de canceres gastricos (Corso et al., 2010). En el analisis basado en CEER™ de los presentes solicitantes de los especfmenes clfnicos de cancer gastrico, se ha observado coactivacion de c-MET y HER1 incluyendo el coagrupamiento de dichas muestras. Esto indica que las caracterfsticas de senalizacion globales en muestras de cancer gastrico que coexpresan p-HER1:p-cMET pueden ser claramente diferentes de las de las muestras que expresan p-cMET sin HER1 activado. Los presentes solicitantes compararon la supervivencia sin progresion en conjuntos de muestras p-HER1(-):p-cMET(+) y p- HER1(+):p-cMET(+). Hubo una diferencia significativa en las medianas de los tiempos de supervivencia de estas
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cohortes en el conjunto global de muestras de cancer gastrico (Figura 11; 46,17 meses para p-HER1(+):p-cMET(+) frente a 82,80 meses para p-HER1(-):p-cMET(+) (p=0,0184, cociente de riesgo=0,51). Se observaron resultados similares en muestras unicamente HER2(-) (Figura 10C). Posteriormente se analizaron las cohortes p-HER1(-):p- cMET(+) y p-HER1(+):p-cMET(+) en conjuntos de muestras HER2(-) ajustadas para el estadio del tumor. Aunque los canceres gastricos en estadio I no mostraron ninguna diferencia significativa en la supervivencia sin enfermedad despues de la cirugfa para pacientes con diferentes estados de activacion de RTK, el cancer p-cMET(+) en estadio I revelo diferencias significativas con el subtipo con HER1 coactivado. La coactivacion de cMET y HER1 mostro una peor supervivencia sin enfermedad en comparacion con los pacientes en estadio I con activacion de cMET solo (Figura 10D). Los datos de los presentes solicitantes indican fuertemente que las muestras de cancer gastrico p- HER1(+):p-cMET(+) tienen un peor pronostico y que es valioso determinar las caracterfsticas de las rutas de senalizacion de una manera especffica de estadio para determinar las opciones terapeuticas para dichos pacientes. Los pacientes con cancer gastrico con la enfermedad en estadio I necesitan caracterizarse adicionalmente basandose en el estado de activacion de las rutas para identificar candidatos para opciones de tratamiento adyuvante mas agresivas despues de la cirugfa.
La direccion terapeutica puede guiarse basandose en los perfiles de RTK en sistemas modelo de cancer gastrico
Usando el ensayo CEER™, los presentes solicitantes categorizaron mas de 16 lfneas celulares de cancer gastrico basandose en sus perfiles de activacion de RTK y los datos fueron concordantes con los observados en tejidos de cancer gastrico (Hoe et al., 2011). Se presentan datos para unos pocos de estos modelos. Se identificaron celulas de cancer gastrico con MET amplificado, SNU5 y SNU484, que co-expresaban niveles apreciables de protefnas HER1 y c-MET. Sin embargo, el perfilado de fosforilacion demostro la expresion de pHER1 y pHER2 ademas de pMET en estas celulas como se habfa detectado previamente en una subserie de especfmenes clfnicos de cancer gastrico. Las celulas NCI-87 (N87), que son bien conocidas como celulas de cancer gastrico con HER2 amplificado, demostraron expresion solo de pHER2 dentro del panel de fosfo-RTK analizado. Las celulas KATO III con FGFR2 amplificado mostraron bajos niveles de protefnas pHER1, pHER2, pHER3 y pMET como se muestra en la Figura 12.
Basandose en la observacion de que en sistemas modelo de cancer gastrico estan presentes patrones de activacion heterogeneos de RTK que tambien se observan en subseries de pacientes con cancer gastrico, los presentes solicitantes propusieron la hipotesis de que esta informacion podrfa utilizarse para dirigir prospectivamente decisiones terapeuticas en canceres gastricos. Por lo tanto, los presentes solicitantes realizaron experimentos de “prueba de concepto” usando el inhibidor dual de tirosina quinasa de HER1/2 (TKI), lapatinib, y los inhibidores de MET, PHA-665.752 y foretinib. Como se muestra en la Figura 12, lapatinib anulaba la activacion de HER2 en celulas NCI-87 sin alterar los niveles totales de HER2, pero no podia hacer lo mismo en celulas SNU5 o SNU484 con MET amplificado. Por otra parte, el inhibidor de MET anulaba pMET en celulas SNU5 y SNU484. De manera interesante, pHER1 y pHER2 tambien se bloqueaban parcialmente en celulas con MET amplificado con inhibicion de MET, pero no en celulas NCI-87 que no presentaban ninguna actividad de MET significativa. Esto indicaba que las rutas de senalizacion de las quinasas de MET y HER pueden estar asociadas con los canceres gastricos con MET amplificado. Ademas, un tratamiento combinado con lapatinib y foretinib durante 4 horas bloqueaba completamente las actividades quinasa de HER y quinasa de MET, incluyendo las de los efectores de senalizacion aguas abajo, PI3K y Shc, en celulas SNU5 y SNU484 con MET amplificado. Esto indica que en dichos canceres gastricos pueden ser mas utiles los enfoques terapeuticos combinatorios.
Para examinar el efecto fenotfpico de la inhibicion de las rutas sobre la inhibicion del crecimiento de celulas cancerosas, los presentes solicitantes realizaron ensayos citotoxicos usando los tratamientos terapeuticos respectivos. De acuerdo con los datos del perfilado de RTK, el valor de CI50 para lapatinib en celulas SNU5 con c- MET amplificado era > 1,0 pM/l, mientras que era casi dos ordenes de magnitud menor a 0,058 pM/l para PHA 665.752. Sin embargo, el valor de CI50 para la combinacion de lapatinib + PHA 665752 era incluso menor a 0,018 pM/l, lo cual coincidfa con el bloqueo maximo de las rutas de senalizacion de la quinasa de HER y MET con el tratamiento combinado (p= 0,01). Estos experimentos indican que una inhibicion combinada de las quinasas de HER y MET puede ser mas beneficiosa en esta clase de canceres gastricos que las terapias con un solo agente. Por el contrario, las celulas KATO III, que mostraron una inhibicion incompleta de las rutas de senalizacion en presencia de los agentes terapeuticos dirigidos, demostraron inhibiciones mfnimas del crecimiento celular (CI50 > 1,0 pM/l) con los tratamientos de farmaco individuales o combinados. Considerados en conjunto, estos estudios en modelos preclfnicos demuestran claramente que la plataforma CEER™ puede buscar simultaneamente el estado de multiples activaciones de RTK en canceres gastricos, que despues pueden usarse para seleccionar y supervisar resultados terapeuticos.
Investigacion de la utilidad de CTC y CTA para estudiar perfiles de RTK en pacientes con cancer gastrico
Como se demuestra en modelos preclfnicos de cancer gastrico, pueden utilizarse patrones de activaciones de RTK como se determina por la tecnologfa CEER™ para guiar decisiones terapeuticas y supervisar respuestas de tratamiento. Sin embargo, en la clfnica no siempre se dispone de biopsias tumorales de seguimiento para supervisar las alteraciones moleculares. Por lo tanto, los presentes solicitantes intentaron establecer una plataforma de evaluacion de RTK usando celulas tumorales circulantes (CTC) y celulas tumorales ascfticas (CTA), que eran mas
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faciles de conseguir. El numero de CTC por paciente variaba ampliamente como se muestra por los niveles variables de CK encontrados por el ensayo CEER™ y los resultados de 4 de estos pacientes se muestran en la Figura 13A. Aunque solo se mostraron la expresion y activacion de HER1 y HER2, los presentes solicitantes observaron patrones heterogeneos de otras activaciones de RTK en CTC aisladas de pacientes con cancer gastrico metastasico. Ademas, los presentes solicitantes han aislado de forma satisfactoria celulas malignas de lfquido ascftico, otra fuente de celulas cancerosas no invasiva en el cancer gastrico. En un drenaje de 100 ml de lfquido ascftico, se encontraron cantidades varias magnitudes mayores de celulas tumorales (> 1 x 103 a 1 x 104) que los rendimientos tfpicos de CTC en 7,5 ml de sangre. Los patrones de activacion de RTK heterogeneos observados en CTC de cancer gastrico tambien se encontraron en CTA aisladas a partir de pacientes con cancer gastrico.
A continuacion, los presentes solicitantes determinaron si las rutas de senalizacion en estas celulas tumorales (CTC y CTA) serfan responsables de las perturbaciones de ligando y/o farmaco. Esto podrfa proporcionar una informacion valiosa en relacion con la funcionalidad y la respuesta al farmaco de las rutas de senalizacion en CTC/CTA, lo cual puede ser indicativo de los canceres in situ. Tras el tratamiento con una combinacion de lapatinib e inhibidores de c- MET, se observo una inhibicion dependiente de la dosis de HER1, HER2 y c-MET fosforilados en CTC aisladas a partir de pacientes con cancer gastrico. Se muestra un ejemplo representativo en la Figura 13B. En este conjunto particular de CTC, tambien se observo una activacion concomitante de IGF1R tras el tratamiento inhibidor. El mecanismo preciso de este fenomeno y de si se produce tambien en canceres gastricos no se conoce en este momento. Posteriormente se trataron CTA positivas para EpCAM con cocteles de factores de crecimiento (EGF, HRG, HGF e IGF1) con o sin coctel de lapatinib y PHA-665752 a 37 °C durante 4 horas. La plataforma se ensayo tras varios aislamientos de CTA diferentes. Se muestran ejemplos representativos de CTA aisladas de tres pacientes diferentes con cancer gastrico que demostraron distintas rutas activadas (Figuras 13C-E). Se observaron niveles significativos de p-HER1, p-HER2 asf como p-cMET en las tres series de CTA, lo que indica que la combinacion de lapatinib y PHA-665752 puede beneficiar a estos pacientes particulares. De hecho, esta combinacion de agentes terapeuticos dirigidos pudo reducir las fosforilaciones de estas 3 dianas, aunque en grados variables. Aun queda por ver si, efectivamente, esta combinacion de farmacos se traducirfa o no en un efecto clfnico beneficioso para dichos pacientes. Sin embargo, el perfilado de otras RTK activadas en CTA indico que HER3 e IGF1R tambien se activaban a niveles variables en algunas muestras que no podfan inhibirse eficazmente por el coctel inhibidor. Es posible que estas RKT activadas puedan influir en el resultado de los agentes terapeuticos ensayados. De hecho, un paciente (005-116) demostro un aumento en p-IGF1R con tratamiento inhibidor. De forma similar, un analisis de las moleculas de senalizacion aguas abajo de las RTK activadas (PI3K, SHC, Erk y AKT) revelo heterogeneidad en terminos de sus perfiles de activacion e inhibicion tras los tratamientos con ligando y farmaco. Los datos de los presentes solicitantes demuestran claramente una plataforma no invasiva para la evaluacion de rutas de senalizacion antes y despues de tratamientos terapeuticos en pacientes con cancer gastrico.
ANALISIS
En este estudio, los presentes solicitantes proporcionan indicios de que los canceres gastricos pueden segregarse basandose en los perfiles de fosforilacion o rutas de senalizacion de receptores de factores de crecimiento clave que son activos en este tipo de cancer. El cancer gastrico es una enfermedad sumamente heterogenea con un amplio espectro de pronosticos en terminos de recurrencia y respuesta a la quimioterapia. La heterogeneidad se reconoce a varios niveles, incluyendo distinciones histopatologicas (Lauren, 1965), anatomicas (Blot et al., 1991; Crew y Neugut, 2006) y epidemiologicas (Carneiro et al., 2004; Correa et al., 1990; Uemura et al., 2001; You et al., 1993). Se estan empezando a realizar esfuerzos recientes para clasificar adicionalmente los canceres gastricos basandose en sus expresiones genicas distintivas (Ooi et al., 2009; Shah et al., 2011; Tay et al., 2003). El estudio de los presentes solicitantes identifica ademas otro nivel de heterogeneidad en canceres gastricos basado en perfiles de activacion de rutas de senalizacion que afectan directamente a la seleccion y resultado de los agentes terapeuticos dirigidos en este tipo de cancer.
El analisis de la fosforilacion establecida como diana en muestras clfnicas se ha visto obstaculizado por la ausencia de ensayos clfnicos que puedan usarse facilmente y que sean suficientemente sensibles para funcionar en cantidades limitadas de tejidos clfnicos y producir al mismo tiempo una puntuacion y diferenciar los patrones de activacion de multiples rTk. En este estudio, los presentes solicitantes han usado un inmunoensayo nuevo y altamente sensible, CEER™, directamente en muestras clfnicas de cancer gastrico ultracongelado que pueden multiplexarse para analizar especfficamente formas totales y fosforiladas de varias protefnas. Los presentes solicitantes demostraron que ~53 % de pacientes con cancer gastrico tienen al menos una RTK activada entre las moleculas de HER1, HER2, HER3, c-MET e IGF1R. Entre las RTK analizadas en este estudio, los miembros de la familia de HER fueron las tirosina quinasas activadas con mas frecuencia. La expresion de miembros de la familia de HER se ha correlacionado previamente con la progresion del tumor y un mal pronostico en los canceres gastricos (Allgayer et al., 2000; Garcia et al., 2003; Hayashi et al., 2008); sin embargo, el estudio de los presentes solicitantes es la primera demostracion de sus perfiles de activacion. Aunque varios canceres gastricos con miembros de la quinasa de HER activados no demostraban activacion de otros miembros de la familia de RTK analizados, los canceres con c-MET activado casi siempre mostraban una co-activacion de HER y/o IGF1R. El analisis de agrupamiento mostro que los canceres gastricos con HER2 activado se agrupaban con los que tenfan HER3 activado, c-MET se agrupaba con HER1 y los canceres gastricos con IGF1R activado estaban mas proximos a los canceres gastricos con PI3K activado. Los perfiles de fosforilacion de RTK se segregaron basandose en el histotipo
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de Lauren y el estado HER2 de los tumores. Basandose en diferencias en los perfiles de expresion genica, ciertos estudios recientes (Shah et al., 2011) han clasificado los canceres gastricos como “no difuso proximal”, “difuso” y “no difuso distal” con una sugerencia de que estas distinciones pueden tener un impacto significativo sobre el tratamiento clfnico actual de canceres gastricos. Ademas de proporcionar nuevas perspectivas en la biologfa caracterfstica de estos subtipos de cancer gastrico basandose en sus perfiles de quinasas activas, la identificacion de patrones de activacion de RTK especfficos concordantes con la histopatologfa de canceres gastricos puede permitir ahora el ensayo terapeutico dirigido por la hipotesis de los candidatos de farmaco disponibles.
Una observacion sorprendente del analisis de los presentes solicitantes es que una cantidad significativa de canceres gastricos (48 % de HER2 positivos y ~32 % de HER2 negativos) no tienen una sola RTK activa, mas bien se dirigen por redes de RTK activadas de forma concomitante. Este descubrimiento tiene fuertes implicaciones para el desarrollo de farmacos ya que sugiere que los canceres gastricos podrfan presentar resistencia a tratamientos dirigidos individuales, y una combinacion de agentes dirigidos puede ser mas eficaz en dichas subseries de canceres gastricos. De hecho, un ensayo de fase II de monoterapia con foretinib (XL-880) en pacientes con cancer gastrico no seleccionados no pudo demostrar una respuesta objetiva (Jhawer et al., 2008) y solo se observa actividad de trastuzumab en una subserie de pacientes con cancer gastrico HER2(+). Segun el conocimiento de los presentes solicitantes, su estudio es la primera demostracion de la activacion de multiples rutas de RTK en muestras clfnicas de cancer gastrico. Previamente se han notificado observaciones similares en glioblastomas (Stommel et al., 2007) y en canceres de mama (Hochgrafe et al., 2010) donde el tratamiento combinatorio guiado por sus perfiles de activacion de RTK era superior a los tratamientos con un solo agente. Los presentes solicitantes identificaron que las fosforilaciones de cMET/HER1 estan muy asociadas en los canceres gastricos HER2 negativos y que los pacientes con dicho cancer gastrico tienen una supervivencia significativamente menor. Se ha notificado una comunicacion entre el eje de c-MET y HER1 en lfneas celulares de cancer gastrico y de cancer de pulmon (Engelman et al., 2007; Liu et al., 2011). Ciertos estudios recientes indican que la senalizacion de la quinasa de HER promueve la resistencia a la inhibicion de cMET en cancer gastrico y el bloqueo simultaneo de las dos familias de senalizacion puede ser mas beneficioso (Corso et al., 2010; Liu et al., 2011). Los resultados de los presentes solicitantes demuestran que la inhibicion terapeutica combinatoria de HER1 y cMET es una actividad antitumoral mas eficaz en celulas con HER1/MET coactivados que la monoterapia contra cualquiera de las dianas.
Se observa actividad de trastuzumab en canceres de mama que sobreexpresan la protefna HER2. Este descubrimiento ahora se ha extendido a los canceres gastricos y el trastuzumab esta aprobado por la FDA para el tratamiento de canceres gastricos avanzados HER2(+) (Bang et al., 2010). De hecho, el trastuzumab es la unica terapia dirigida en canceres gastricos que demuestra un efecto beneficioso sobre la supervivencia. Sin embargo, esta claro por los recientes resultados del estudio ToGA que el trastuzumab no beneficia a todos los pacientes con cancer gastrico HER2(+), ya que el trastuzumab mas una quimioterapia convencional produjo una tasa de respuesta global del 47 % en canceres gastricos HER2(+). El presente analisis basado en CEER™ de los presentes solicitantes proporciona al menos cuatro razones posibles para esta ausencia de respuesta e indica que la puntuacion de multiples marcadores, incluyendo la puntuacion de sus estados activos, puede ser mas beneficiosa para predecir las respuestas a los agentes terapeuticos dirigidos. Una posibilidad de la ausencia de respuesta del trastuzumab es el alto grado de heterogeneidad en la expresion de HER2 en canceres gastricos como se demuestra por el ensayo CEER™ que contribuye a la complejidad en el desarrollo de diagnosticos de HER2 eficaces. Aunque se han definido criterios de puntuacion de HER2 por IHC/FISH modificados para canceres gastricos que son distintos de las directrices para el cancer de mama, estos aun no pueden detectar eficazmente el estado heterogeneo de HER2 en todos los canceres gastricos y no pueden predecir de forma suficientemente precisa los respondedores al agente anti-HER2. En segundo lugar, solo el 50 % de los canceres gastricos HER2(+) expresan HER2 fosforilado, como se revela por el analisis CEER™. La ausencia de una ruta de HER2 activa sugiere que la senalizacion de HER2 puede no contribuir significativamente a la supervivencia al tumor en todos los canceres gastricos HER2(+); por lo tanto, su inhibicion con trastuzumab no darfa como resultado una inhibicion tumoral medible. En tercer lugar, las rutas de senalizacion, tales como las dirigidas por HER1, HER3, c-MET e IGF1R que, como demostraron los presentes solicitantes, son activas en un 26 %, 36 %, 22 % y 30 % de los canceres gastricos HER2(+) respectivamente, pueden proporcionar senales de supervivencia tumoral alternativas que promueven la resistencia al trastuzumab. Se sabe que los heterodfmeros HER2:HER3 no pueden bloquearse eficazmente por trastuzumab en los canceres de mama (Agus et al., 2002; Cho et al., 2003; Ghosh et al., 2011) y que la senalizacion de IGF1R promueve la resistencia a trastuzumab (Huang et al., 2010; Nahta et al., 2005). Ademas, recientes indicios preclfnicos en modelos de xenoinjerto de cancer gastrico (Yamashita-Kashima et al., 2011) demuestran que el tratamiento combinado de trastuzumab con pertuzumab es superior al trastuzumab solo en modelos HER2(+), en parte debido a la inhibicion eficaz de la senalizacion del heterodfmero HER2:HER3. Por ultimo, los estudios de los presentes solicitantes usando el inmunoensayo CEER™ basado en proximidad demuestran la presencia de p95HER2, fragmentos carboxi-terminales truncados de HER2, en el 46 % de los canceres gastricos HER2(+), que tambien puede contribuir a la resistencia al trastuzumab de los canceres gastricos. P95HER2 en canceres de mama promueve la resistencia al tratamiento con herceptin debido a la ausencia de un epftopo extracelular que reconoce trastuzumab (Scaltriti et al., 2007) ademas de un peor pronostico (Saez et al., 2006) y una mayor propension a la metastasis (Molina et al., 2002). Sin embargo, aun falta una validacion clfnica a gran escala de la expresion de p95HER2 debido a las dificultades tecnicas asociadas con la deteccion inmunohistoqufmica de p95HER2 en especfmenes incluidos en parafina. Aunque dos grupos han generado anticuerpos monoclonales contra p95HER2, aun esta pendiente su validacion clfnica (Parra-Palau et al., 2010; Sperinde et al., 2010) ya que los descubrimientos
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conflictivos recientes de los estudios Gepar-Quattro no pudieron correlacionar los niveles de p95HER2 con la resistencia a trastuzumab (Loibl et al., 2011). Debe tenerse en cuenta que los presentes solicitantes han tenido exito en la deteccion de p95HER2 en especfmenes clfnicos de cancer gastrico ultracongelados usando el ensayo CEER™. La frecuencia de aparicion de p95HER2 en canceres gastricos (77 % de HER2(+)) es mayor que la notificada en canceres de mama (~30 % de HER2(+)). La eficacia de trastuzumab frente a lapatinib en celulas de cancer gastrico que expresan HER2 de longitud completa o p95HER2 truncado puede ensayarse, ya que varios estudios indican el uso del TKI anti-HER2, lapatinib, en canceres p95HER(2+) (Arribas et al., 2011; Saez et al., 2006). Ademas, la expresion de p95HER2 puede validarse en un ensayo de quimioterapia + lapatinib neoadyuvante de fase II en pacientes con cancer gastrico. Los canceres gastricos HER2 negativos constituyen la mayor proporcion (~88 %) de la poblacion entera de canceres gastricos analizada en el estudio de los presentes solicitantes, pero no hay terapias dirigidas aprobadas para esta poblacion. Basandose en el ensayo CEER™, algunos de estos canceres expresan la protefna HER2 pero a niveles significativamente menores en comparacion con la poblacion HER2(+). De hecho, los presentes solicitantes detectaron 84 muestras con un nivel significativo de HER2 fosforilado, indicando que estos canceres pueden utilizar la senalizacion del receptor HER2 activo para promover el crecimiento tumoral y, de esta forma, podrfan responder a diversos agentes dirigidos a HER2. Se ha descubierto que el trastuzumab es beneficioso en una fraccion de pacientes con cancer de mama con un estado HER2(-), como se determina por IHC (Paik et al., 2008). Ademas de la senalizacion de HER2 activo, los presentes solicitantes identificaron varios subgrupos de pacientes con HER1, HER3, c-MET e IGF1R activados en canceres gastricos HER2(-) que tambien pueden contribuir en el crecimiento de tumores HER(2). Debe destacarse que la proporcion de muestras que expresan pHER1, pHER2 y pHER3 encontradas en el estudio de los presentes solicitantes se parece a las presentadas en los canceres de mama (Frogne et al., 2009). La sobreexpresion de la protefna HER3 se ha correlacionado con un mal pronostico en canceres gastricos (Begnami et al., 2011; Hayashi et al., 2008) y se sugirio como una diana terapeutica potencial. En el analisis de los presentes solicitantes, aproximadamente el 24 % de los canceres gastricos HER2(-) expresaban la senalizacion de HER3 activo, co-expresando una proporcion significativa de estos canceres HER2 y HER1 fosforilados. Esto indica que la senalizacion de HER3 puede jugar un papel significativo en los canceres gastricos.
Despues de anos de experiencia con agentes dirigidos molecularmente, los presentes solicitantes ahora reconocen que el cancer metastasico es una enfermedad en evolucion con rutas resistentes emergentes durante el tratamiento. Los oncologos se encontraran con un dilema entre la necesidad de volver extraer una biopsia para planear tratamientos posteriores y la posibilidad clfnica de obtener esta nueva biopsia. Por lo tanto, los presentes solicitantes desarrollaron una plataforma de perfilado de activacion de RTK que usa CTC y celulas malignas aisladas de fluidos corporales (por ejemplo, lfquido ascftico). Los presentes solicitantes demostraron que el ensayo CEER™ es suficientemente sensible para perfilar las CTC. Con las CTC, los presentes solicitantes pueden supervisar longitudinalmente el estado de RTK a establecer como diana durante el tratamiento y en la progresion. Dado el hecho de que no todos los pacientes con cancer metastasico tienen CTC disponibles para el analisis, los presentes solicitantes tambien aislaron celulas malignas de fluidos corporales tales como lfquido ascftico maligno de pacientes con cancer gastrico y han demostrado satisfactoriamente que la activacion de RTK puede perfilarse en estas celulas. Esto ampliara definitivamente el espectro de aplicabilidad y viabilidad clfnica del ensayo fosfo-RTK en pacientes con cancer gastrico. Los presentes solicitantes aislaron celulas cancerosas de lfquido ascftico maligno y activaron rutas usando factores de crecimiento y despues trataron las celulas tumorales con TKI ex vivo como un posible sistema sustituto para ensayar la eficacia de agentes que se dirigen a protefnas de rutas especfficas en un paciente para aplicar agentes terapeuticos dirigidos basados en los indicios y desarrollar estrategias para superar la farmacorresistencia.
Ahora nos estamos aproximando a una era de medicina personalizada para el cancer y de investigacion clfnica dirigida a biomarcadores. Los descubrimientos de los presentes solicitantes que demuestran una multiple co- activacion de RTK proporcionan una explicacion razonable de las bajas tasas de respuesta de la monoterapia en los canceres gastricos. En el futuro, se podra considerar un tratamiento dirigido combinatorio por adelantado en subseries de pacientes con cancer gastrico con multiples rutas de senalizacion. Con una herramienta de supervision que utiliza CTC y/o fluidos corporales, se pueden identificar rapidamente los tratamientos de seguimiento requeridos tras la progresion de la enfermedad que se dirigen a rutas de senalizacion alternativas.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Cohorte de pacientes y obtencion de especfmenes de tejidos
Todos los pacientes se sometieron a gastrectomfa con diseccion radical de ganglios linfaticos con intencion curativa. Para el analisis final se disponfa de 447 tejidos ultracongelados recogidos del tumor gastrico primario resecado quirurgicamente. Todos los tejidos ultracongelados se recogieron (antes de que transcurrieran 30 minutos) en el campo quirurgico por el cirujano y se sometieron a congelacion instantanea en nitrogeno lfquido y se almacenaron en un congelador a -80 °C hasta el uso posterior.
En los especfmenes de tumor se confirmo la presencia de area tumoral > 70 % por el patologo. Para el analisis, se prepararon pequenas piezas de tejidos congelados (3 secciones de 10 pm) usando una cuchilla de afeitar enfriada previamente y despues se lisaron en 100 pl de tampon de lisis. Los lisados resultados se almacenaron a -80 °C
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antes del analisis posterior.
Revision de histopatologia y determinacion del estado HER2
Todos los portaobjetos tenidos con H&E disponibles se revisaron centralmente por dos patologos. Todos los especfmenes de tumor procedfan de tumores gastricos primarios resecados quirurgicamente. El estado HER2 se determino por inmunohistoqufmica (IHC). El analisis IHC se realizo usando el HercepTest™ (Dako, Glostrup, Dinamarca). Los niveles de expresion de protefna HER2 se puntuaron como 0 a 3+, de acuerdo con las recomendaciones del panel consenso sobre la puntuacion de HER2 para cancer gastrico (Hofmann et al., 2008; Ruschoff et al., 2010). Para FISH, se uso el kit de sonda de ADN de HER2 PathVysion (Abbott, Des Plaines, IL). Para contar las senales de hibridacion se uso el sistema de analisis de imagenes Ariol (Genetix, San Jose, USA). Se contaron 40 celulas tumorales invasivas. Todas las muestras con relaciones de HER2/CEP17 entre 1,8 y 2,2 segun el analisis de imagenes se puntuaron manualmente mediante el recuento de mas de 60 celulas no solapantes. Una relacion de mas de 2,2 1,8 a 2,2 o menos de 1,8 se clasifico como positiva, dudosa o negativa con respecto a la amplificacion, respectivamente. La polisomfa del cromosoma 17 se definio como una senal de CEP17 de mas de seis copias en promedio por celula. De los 447 especfmenes, 434 especfmenes se incluyeron en el analisis final.
Inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (CEER™)
Se aclararon portaobjetos de inmuno-micromatriz 2 veces con TBST (Tris 50 mM/NaCl 150 mM/Tween-20 al 0,1 %, pH 7,2-7,4), se bloquearon con 80 pl de Tampon de Bloqueo de Whatman durante 1 hora a TA, y despues se lavaron 2 veces con TBST. Se anadieron controles de lisado diluidos en serie en 80 pl de tampon de dilucion (BSA al 2 %/TritonX-100 al 0,1 %/TBS, pH 7,2-7,4) y se anadieron muestras para designar sub-matrices en portaobjetos, y posteriormente se incubaron durante 1 hora a TA. Los portaobjetos se lavaron 4 veces (3 min cada vez), se anadieron Ac detectores en 80 pl de tampon de reaccion y se incubaron durante 2 horas a TA. Despues de lavar los portaobjetos con TBST para retirar los Ac detectores no unidos, se anadieron 80 pl de solucion de biotina-tiramida (5 pg/ml en glucosa/50 mM/PBS) preparada a partir de 400 pg/ml en solucion de etanol (Perkin-Elmer Life Science) y se incubaron durante 15 min en la oscuridad. El proceso de amplificacion de senal de tiramida mediada por glucosa- oxidasa (GO)/HRP se termino lavando con TBST 4 veces, 3 min cada vez. La deposicion local de biotina-tiramida se detecto por incubacion con estreptavidina (SA)-Alexa647 (Invitrogen) a 0,5 pg/ml en BSA al 2 %/Triton al 0,1 %/TBS durante 40 minutos. Despues de finalizar la incubacion, los portaobjetos se lavaron 4 veces con TBST, se secaron y se mantuvieron en la oscuridad hasta que se obtuvieron imagenes por escaneado de la micromatriz.
Enriquecimiento en HER2 truncado
Se eliminaron receptores p185-ERBB2 de longitud completa de lisados usando anticuerpos acoplados a perlas magneticas especfficos para el dominio extracelular (DEC) de HER2 como se muestra en la Figura 8. Los lisados de los que se retiro el p185-HER2 resultantes, que contenfan protefnas receptoras HER2 truncadas (t-HER2) que carecfan del DEC, se usaron para la cuantificacion posterior de la expresion y fosforilacion de t-HER2.
Analisis de datos de CEER™
Se escanearon portaobjetos en cuatro escenarios de aumento por fotomultiplicador (PMT) para aumentar el rango dinamico eficaz. Se promediaron las intensidades de senal corregidas con respecto al efecto de fondo para los puntos impresos por triplicado. Se usaron varios criterios para filtrar los datos para el analisis posterior, incluyendo lfmites sobre huellas de puntos, coeficiente de variacion para replicas de puntos y efecto de fondo global de la capa de soporte. Para cada ensayo, se genero una curva patron a partir de lisados de celulas de control diluidos en serie preparados a partir de lfneas celulares con protefnas de transduccion de senales bien caracterizadas. Los datos se ajustaron a una ecuacion de cinco parametros obtenida en funcion de la concentracion de anticuerpo de captura y PMT. La curva patron para cada marcador se ajusto en funcion del logaritmo de la intensidad de la senal, medida como unidad de fluorescencia relativa (RFU) frente a concentracion logarftmica de lisados celulares y referenciada con respecto a las lfneas celulares patron. Por ejemplo, se uso una curva patron de lisados celulares diluidos en serie preparados a partir de BT474 para normalizar la expresion de HER2 y el grado de fosforilacion en cada muestra (Figura 14). Por lo tanto, una muestra con 1 UC de expresion de HER2 tiene el valor de RFU equivalente al valor de RFU de 1 celula BT474 de referencia patron. Como las celulas de referencia tienen 1~2x106 receptores HER1 o HER2 por celula con aproximadamente un 10 % de receptores fosforilados, 1 UC representa la expresion de 1~2x106 RTK o 1~2x105 RTK fosforiladas (Kim et al., 2011). Se determino un valor del lfmite de deteccion (LOD) por UC menor de 1 UC tanto para la expresion como para la activacion de HER2. Las predicciones individuales de cada dilucion y el aumento se promediaron en una sola prediccion final.
Determinacion de marcadores por CEER™ y agrupamiento de mapa de calor
Entre los desaffos estadfsticos para evaluar datos de biomarcadores para uso en una situacion clfnica se encuentra la determinacion de los niveles lfmite de diagnostico optimos. En ausencia de valores del intervalo de referencia, la positividad para un biomarcador dado se definio como mayor que el tercer cuartil para un biomarcador individual en
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la poblacion de pacientes de este estudio. Los pacientes se clasificaron basandose en el valor de UC del ensayo CEER™ para un biomarcador dado. Los pacientes mayores que el lfmite del tercer cuartil se consideraron con el mayor riesgo de tener niveles elevados de biomarcador y, por lo tanto, rutas de senalizacion potencialmente activadas. Se realizo un analisis de supervivencia posterior para acceder a la calidad predictiva de estos lfmites.
El perfil de biomarcadores de las muestras de tumor se represento por un mapa de calor. Cada celula se colored basandose en el rango del decil de la activacion de ese marcador. Cada marcador se clasifico por deciles, representados por un sombreado distinto, indicando el color la escala. Se mostro tanto el agrupamiento en filas (pacientes) como en columnas (marcador). Se uso el algoritmo de asociacion completo para obtener un agrupamiento jerarquico (o dendrograma) por agrupamiento secuencial de las observaciones mas correlacionadas usando la funcion hclust en R, llamada por la funcion heatmap.2 disponible con la biblioteca gplots del entorno estadfstico R: A Language and Environment for Statistical Computing (
http://www.r-project.org/). Los subgrupos de marcadores se definen por el agrupamiento y permiten comparaciones de perfiles de marcadores para los pacientes.
Impresion de micromatriz multiplexada
Se imprimieron anticuerpos de captura sobre portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa (ONCYTE®, Grace Bio-Labs) usando impresoras sin contacto (Nanoplotter, GeSIM). El diametro del punto fue de aproximadamente 175 pm, y los portaobjetos se mantuvieron en una camara de secado a 4 °C. Se imprimieron aproximadamente 500 pl de Ac de captura por triplicado y concentraciones de diluciones seriadas de 1 mg/ml, 0,5 mg/ml y 0,25 mg/ml. Las IgG de raton purificadas sirvieron como controles negativos. En la Figura 5 se muestran configuraciones de portaobjetos de inmunomatriz.
Conjugacion y purificacion de anticuerpos
Se activaron Ac espedficos de diana (monoclonales de raton contra diferentes epftopos presentes en protemas de transduccion de senales humanas) y las enzimas detectoras correspondientes glucosa oxidasa (GO) o peroxidasa de rabano picante (HRP) con agente de reticulacion bifuncional, succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1- carboxilato (SMCC), y se acoplaron realizando conjugados de anticuerpo-enzima (Gibson et al., 1964; Kappler and Hackett, 1963). Los conjugados se purificaron por HPLC. Las actividades de los Ac en los conjugados purificados se determinaron por ELISA competitivo y las actividades enzimaticas despues de la conjugacion se detectaron por ensayos funcionales espedficos para enzimas detectoras.
Cultivo celular y reactivos
Se adquirieron lmeas de celulas de cancer gastrico humanas del Korea Cell Line Bank (KCLB, Seul, Corea). Todas las lmeas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640 (PAA Laboratories GmbH, Austria) suplementado con suero bovino fetal inactivado termicamente al 10 %, antibiotico/antimicotico. Las celulas se incubaron a 37 °C en CO2 al 5 % y el medio se cambio dos veces por semana. Despues de la confluencia, las celulas se subdividieron en nuevos matraces hasta el final del experimento.
Se obtuvieron lmeas celulares de control de ensayo CEER™, celulas MDA-MB-468, T47D, HCC827 y BT474 con grados variables de expresion de ErbB-RTK (Dragowska et al., 2004; Filmus et al., 1987; Imai et al., 1982) a partir de la ATCC y se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 % en el caso de MDA-MB-468 (medio esencial mmimo de Dulbecco, DMEM, FBS al 10 %), BT474 (DMEM, FBS al 10 %), y HCC827 y T47D (RPMI 1640, FBS al 10 %, 0,2 U/ml de insulina bovina). Las celulas se contaron y se lavaron con PBS 1X antes de la estimulacion con factor de crecimiento. Las celulas MDA-MB-468 se estimularon con factor de crecimiento epidermico (EGF) 100 nM o factor de crecimiento de transformacion a (TGFa), las celulas T47D se estimularon con heregulina p (HRGp) 20 nM o factor de crecimiento similar a la insulina de tipo 1 (IGF1) 100 ng/ml en medio de crecimiento sin suero durante 5 o 15 min. Las celulas estimuladas se lavaron con PBS 1X y despues se lisaron (tampon de lisis: Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1 % y Na3VO4 2 mM) y se mantuvieron en hielo durante 30 min antes de coger el sobrenadante para un ensayo posterior o se mantuvieron a -80 °C.
Tratamiento con farmaco
Las celulas se sembraron en placas a 2x105 celulas/placas de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C y se trataron con 1 pM/ml de lapatinib, foretinib o combinacion durante 4 h a 37 °C. Las celulas se recogieron despues del tratamiento con farmaco y se sedimentaron por centrifugacion. Para el analisis de las protemas, los alimentos celulares se almacenaron a -80 °C antes de la extraccion de la protema.
Ensayo de inhibicion del crecimiento celular
La inhibicion del crecimiento celular se determino mediante el ensayo CellTiter 96 One Solution Assay (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, se sembraron celulas (3 x 103 en 100 pl/pocillo) en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas a 37 °C y se trataron con farmacos (lapatinib o foretinib o combinacion)
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durante 3 d a 37 °C. Despues del tratamiento con farmaco, se anadio solucion de MTS a cada pocillo y la incubacion se continuo durante 4 h a 37 °C. El valor de absorbancia (DO) de cada pocillo se midio con un lector de microplacas fijado a 490 nm. Todos los experimented se realizaron por triplicado.
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Ejemplo 4. Modelo de raton personalizado para terapia de cancer gastrico
Este ejemplo describe un modelo de raton (un “avatar”) para ayudar a los medicos a identificar el farmaco o combinacion (por ejemplo, coctel) de farmacos anticancerosos mas eficaces que pueden administrarse a un paciente para combatir un tumor particular tal como un tumor gastrico.
Un “avatar” incluye un raton u otro animal sobre el cual se injerta tejido de un tumor humano para crear un modelo personalizado del cancer de un paciente. En un ejemplo de este enfoque, se analiza un tumor gastrico de un paciente (por ejemplo, cancer gastrico en estadio I o II, tal como cancer gastrico de tipo difuso) con respecto a la presencia o nivel de expresion y/o activacion de uno o mas analitos tal como cMET y HER1, y opcionalmente HER2 y/o HER3, asf como otros componentes de la ruta de transduccion de senales. Despues se crea un modelo de raton personalizado de ese cancer gastrico especffico por xenoinjerto de una pieza del tumor del paciente en ratones inmunodeficientes. Despues puede ensayarse la respuesta del tumor del xenoinjerto a un farmaco anticanceroso o a una combinacion (por ejemplo, coctel) de farmacos anticancerosos. Por ejemplo, si en el tumor gastrico del paciente estan activados tanto cMEt como HER1 (por ejemplo, como se determina por la tecnologfa CEER™), puede ensayarse una combinacion de un inhibidor de cMEt y un inhibidor de HER1 en el tumor del xenoinjerto presente en el avatar para determinar si este es un tratamiento eficaz para el cancer de ese paciente. Si el tumor del xenoinjerto responde al coctel inhibidor (por ejemplo, el tumor se reduce), al paciente se le puede administrar esa terapia combinada particular.

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo in vitro para predecir la supervivencia de un sujeto que tiene cancer gastrico en estadio I despues de la cirugfa del tumor, comprendiendo el metodo:
    (a) determinar la presencia de activacion o el nivel de activacion de al menos dos analitos que comprenden cMET y HER1 en una celula cancerosa obtenida del sujeto, en donde cMET y HER1 estan coactivados en la celula cancerosa; y
    (b) predecir la supervivencia del sujeto basandose en la presencia de activacion o el nivel de activacion de dichos al menos dos analitos determinados en la etapa (a), en donde se predice que el sujeto tiene peor supervivencia que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el metodo predice la supervivencia sin enfermedad o la supervivencia sin progresion del sujeto.
  3. 3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el cancer gastrico es un cancer gastrico de tipo difuso.
  4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la etapa (a) comprende ademas determinar la presencia o nivel de activacion de al menos un analito adicional que comprende HER2 y/o HER3 en la celula cancerosa.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en donde HER2 no esta activado en la celula cancerosa, en donde opcionalmente se predice que el sujeto tiene una peor supervivencia que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1 y/o HER2.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 4, en donde estan coactivados cMET, HER1 y HER3, pero HER2 no esta activado en la celula cancerosa, en donde opcionalmente se predice que el sujeto tiene una peor supervivencia que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1, HER2 y/o HER3.
  7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la etapa (a) comprende determinar la presencia o el nivel de activacion de los analitos con un inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (CEER™).
  8. 8. Una composicion que comprende un inhibidor de cMET y un inhibidor de HER1 para uso en el tratamiento de cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde cMET y HER1 estan coactivados en el cancer gastrico en estadio I, y en donde el sujeto tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMet en ausencia de activacion de HER1.
  9. 9. La composicion de la reivindicacion 8 para uso en el tratamiento de cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde la composicion se va a administrar al sujeto como terapia primaria.
  10. 10. La composicion de las reivindicaciones 8 o 9 para uso en el tratamiento de cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde la composicion se va a administrar como una composicion adyuvante despues de una cirugfa tumoral.
  11. 11. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 para uso en el tratamiento de cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde HER2 no esta activado en el cancer gastrico en estadio I, en donde opcionalmente el sujeto tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMet en ausencia de activacion de HER1 y/o HER2.
  12. 12. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11 para uso en el tratamiento de cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde HER3 esta activado en el cancer gastrico en estadio I, en donde opcionalmente el sujeto tiene peor supervivencia y/o peor pronostico que los sujetos con cancer gastrico en estadio I con activacion de cMET en ausencia de activacion de HER1, HER2 y/o HER3.
  13. 13. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 8-12 para uso en el tratamiento de cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde el inhibidor de cMET se selecciona del grupo que consiste en AMG102, ARQ197, JNJ-38877605, PF-2341066, PF-04217903, SGX523, GSK1363089/XL880, XL184, MGCD265, MK-2461, PHA- 665752 y combinaciones de los mismos, o en donde el inhibidor de HER1 se selecciona del grupo que consiste en erlotinib, lapatinib, gefitinib, BIBW-2992 y combinaciones de los mismos.
  14. 14. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13 para uso en el tratamiento de cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde la presencia de activacion o el nivel de activacion de cMET y HER1 se determina en una celula cancerosa obtenida a partir del sujeto, en donde la celula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en una celula tumoral primaria, una celula tumoral circulante (CTC), una celula tumoral ascftica (CTA) y
    combinaciones de las mismas.
  15. 15. La composicion de la reivindicacion 14 para uso en el tratamiento de un cancer gastrico en estadio I en un sujeto, en donde la presencia de activacion o el nivel de activacion de cMET y HER1 se determina con un 5 inmunoensayo colaborativo reactivo potenciado por enzimas (CEER™).
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