CN103597354A - 用于预测和改善胃癌患者存活的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于预测具有早期胃癌的受试者在肿瘤手术后的术后存活的测定法和方法。本发明通过施用针对癌症中活化的信号转导蛋白生物标志物定制的组合疗法，还提供了用于治疗具有早期胃癌的受试者的方法。在特定的实施方案中，本发明方法依赖于检测获自受试者的癌细胞中信号转导蛋白分析物的特定组合的活化状态或水平。因此，可将本发明方法特别地用于预测具有早期胃癌的受试者的存活或预后，并通过与单一疗法对照，鉴定可以受益于组合疗法的受试者，来指导术前和术后治疗决定。

Description

用于预测和改善胃癌患者存活的方法
相关申请的交互引用
本申请要求2011年4月4日提交的美国临时申请号61/471,678和2012年1月25日提交的美国临时申请号No.61/590,787的优先权的权益，所述申请的公开在此处出于全部目的以其整体引用作为参考。
发明背景
多种人恶性肿瘤都表现出持续的c-Met刺激、过表达或突变，包括乳腺、肝、肺、卵巢、肾、胃(胃部)和甲状腺的癌。值得注意地，已经在具有特定遗传形式的乳头状肾癌患者中明确鉴定了c-Met的活化突变，直接表明c-Met涉及人类肿瘤发生。由于c-Met受体的异常调节或者其配体，肝细胞生长因子(HGF)的过量表达，c-Met信号通路的异常信号传递与侵袭性表型相关。大量证据表明，c-Met信号传递参与了几种癌症的进程和传播，并且增加其在疾病中作用的了解已经产生了将c-Met和HGF作为癌症药物研发中主要靶标的相当大兴趣。
该兴趣导致多种具有潜在临床应用的c-Met通路拮抗剂的研发。通路选择性抗癌药物研发的三种主要方法包括配体/受体相互作用的拮抗、酪氨酸激酶催化活性的抑制和受体/效应子相互作用的阻断。
c-Met是肝细胞生长因子(HGF)，也称为分散因子的细胞表面受体。HGF是与血纤维蛋白溶酶原丝氨酸蛋白酶家族的成员高度相关的多结构域糖蛋白。其通过间质细胞分泌为单链、失活的多肽，并通过许多蛋白酶切割成其活性异二聚体。
HGF结合诱导了c-Met受体同型二聚化和催化位点内两个酪氨酸残基(Y1234和Y1235)的磷酸化，调节激酶活性。羧基端尾巴包括酪氨酸Y1349和Y1356，当磷酸化时，其用作为胞内接头蛋白质的停泊位点，导致下游信号传递。在胚胎发生和成年期间，c-Met受体在许多器官的上皮细胞中表达，包括肝、胰腺、前列腺、肾、肌肉和骨髓。
一种c-Met介导的感兴趣癌症是胃癌。胃癌是世界范围内癌症死亡的主要原因，每年具有18.9/100,000的发生率。据估计，胃癌的发生率为934,000例，其中56％的新发病例发生在东亚。根据2002年的Central Tumor Registry数据，在韩国，胃癌占全部癌症的20.8％。尽管在胃癌患者中，胃切除术是唯一的治愈性治疗，但治愈性手术后40-60％的高复发率仍是整体存活差的原因。
目前，几种c-Met拮抗剂的初步临床结果都处于临床研究中。这些制剂，包括单克隆抗体、配体/受体相互作用的干扰物质(disruptor)，以及小分子酪氨酸激酶抑制剂都是令人鼓舞的。几种多重靶向疗法也已经处于临床研究中，并且已经显示出很有希望，特别是对于酪氨酸激酶抑制剂。就c-Met在多种癌症中的所起的作用而言，存在个体治疗的合适选择和策略的需求。这对于c-Met介导的胃癌更是如此。本发明满足了这些以及其他需求。
发明概述
本发明提供了用于预测具有早期(例如，I期或II期或者处于两期之间的过渡期)胃癌的受试者在肿瘤手术后的存活的测定法和方法。在某些方面，本发明提供了用于预测组合疗法在具有早期胃癌的受试者中的治疗有效性和/或应答的测定法和方法。本发明还提供了通过施用针对胃癌中活化的信号转导蛋白生物标志物而定制的组合疗法，治疗具有早期胃癌的受试者的方法。在特定的事实方案中，本发明方法依赖于在获自具有早期胃癌的受试者的癌细胞中检测特定组合的信号转导蛋白分析物的活化状态或水平。因此，鉴于所检测的分析物的活化状态或水平，本文中所述的方法可以特别地用于预测具有早期胃癌的受试者的存活或预后，并通过与单一疗法对照，鉴定可以受益于组合疗法的受试者，来指导肿瘤手术前和肿瘤手术后的治疗决定。
下文实施例3中所述的研究描述了多通道CEERTM平台的用途，以测定新鲜的冰冻胃癌组织中活化的RTK水平，并将胃癌患者分类成可能的亚组(例如，HER1、HER2、HER2的截短变体、p95HER2、HER3、cMET、PI3K和IGF1R)。基于其通路蛋白质活化模式，在肿瘤的亚组中观察到了多个信号蛋白质活化，以及冗余性通路活化输入导致的剩余的下游信号传递，因此限制了靶向单个RTK的单一疗法的抗肿瘤有效性。测定了cMET-和HER-共活化的胃癌细胞系中与cMET抑制剂组合的HER1/2抑制剂的抗肿瘤效果。我们研发了强有力的工具，其使用循环肿瘤细胞和分离自腹膜液(腹水)的恶性细胞，能使临床医师可以在治疗期间监测RTK活化谱的基线和发展改变。总之，本研究提供了在胃癌人组织中伴随性RTK活化的证据，并且建立了在治疗和进程期间随着癌症发展，监测RTK活化的临床工具。
因此，在某些方面，本发明提供了预测具有I期或II期胃癌的受试者在肿瘤手术后的存活的方法，该方法包括：
(a)在获自受试者的癌细胞中测定包含cMET和HER1的至少两种分析物的存在或活化水平；和
(b)基于步骤(a)中测定的至少两种分析物的存在或活化水平，预测受试者的存活。
在一些实施方案中，该方法预测了具有I期或II期胃癌的受试者的无病存活或无进展存活。在某些实例中，I期胃癌是IA期或IB期胃癌。在某些其他实例中，II期胃癌是IIA期或IIB期胃癌。
在特定的实施方案中，cMET和HER1在癌细胞中是共活化的。在此类实施方案中，与具有cMET活化、不存在HER1活化的I期或II期胃癌受试者比较，预测该受试者具有更差的存活(例如，更差的预后)。
在一些实施方案中，I期或II期胃癌与组织亚型相对应，例如肠型、扩散型或混合型胃癌。在特定的实施方案中，I期或II期胃癌是扩散型胃癌。
在其他实施方案中，步骤(a)还包括测定胃癌细胞中包含HER2和/或HER3的至少一种其他分析物的存在或活化水平。在某些实例中，在癌细胞中，cMET和HER1是共活化的，但HER2并不活化。在此类实例中，与具有cMET活化、不存在HER1和/或HER2活化的I期或II期胃癌受试者比较，预测该受试者具有更差的存活(例如，更差的预后)。在某些其他实例中，在癌细胞中，cMET、HER1和HER3是共活化的，但HER2并不活化。在此类实例中，与具有cMET活化、不存在HER1、HER2和/或HER3活化的I期或II期胃癌受试者比较，预测该受试者具有更差的存活(例如，更差的预后)。
在某些实施方案中，该方法还包括：
(c)基于步骤(a)中测定的至少cMET或HER1的存在或活化水平，将单独的cMET抑制剂或者与HER1抑制剂组合的cMET抑制剂施用给受试者。
在一些实施方案中，当cMET和HER1在癌细胞中共活化时，并且任选地当癌细胞中HER2未活化和/或HER3活化时，将cMET抑制剂与HER1抑制剂组合施用。
可以使用任意多种技术测定信号转导分子的总表达和活化(例如，磷酸化)水平和/或状态。在某些实施方案中，使用如本文中所述的免疫测定法如单检测测定法或邻近双检测测定法(例如，协同酶增强的反应免疫测定法(Collaborative Enzyme Enhanced Reactive Immunoassay)(CEERTM))检测样品如癌细胞的细胞提取物中信号转导分子的表达和/或活化(例如，磷酸化)水平和/或状态。
在特定的实施方案中，步骤(a)包括使用CEERTM测定分析物(例如，至少cMET和HER1，以及任选地HER2和/或HER3)的存在或活化水平。
CEERTM技术描述于本文以及以下专利文件中，所述每一专利文件在本文中出于全部目的以其整体引入作为参考：PCT专利公开号WO2008/036802、WO2009/012140、WO2009/108637、WO2010/132723、WO2011/008990和WO2011/050069；和PCT申请号PCT/US2011/066624。
在其他方面，本发明提供了治疗具有I期或II期胃癌的受试者的方法，该方法包括：
将包含cMET抑制剂和HER1抑制剂的组合疗法施用给受试者，其中cMET和HER1在I期或II期胃癌中是共活化的。
在一些实施方案中，该方法改善了具有I期或II期胃癌的受试者的预后(例如，增加了无病存活或无进展存活)。在某些实例中，I期胃癌是IA期或IB期胃癌。在某些其他实例中，II期胃癌是IIA期或IIB期胃癌。
在其他实施方案中，与具有cMet活化、不存在HER1活化的I期或II期胃癌受试者比较，受试者(例如，开始组合疗法之前)具有更差的存活和/或更差的预后。
在其他实施方案中，在I期或II期胃癌中，cMET和HER1是共活化的，但HER2是没有活化的。在此类实施方案中，与具有cMet活化、不存在HER1和/或HER2活化的I期或II期胃癌受试者比较，受试者(例如，开始组合疗法之前)具有更差的存活和/或更差的预后。
又在其他实施方案中，在I期或II期胃癌中，cMET、HER1和HER3是共活化的。在此类实施方案中，与具有cMet活化、不存在HER1、HER2和/或HER3活化的I期或II期胃癌受试者比较，受试者(例如，开始组合疗法之前)具有更差的存活和/或更差的预后。
在一些实施方案中，将组合疗法作为最初的疗法(primary therapy)(例如，作为手术前的治疗，以收缩胃肿瘤的大小)施用给受试者。在其他实施方案中，将组合疗法作为手术后辅助疗法(例如，肿瘤手术后)施用给受试者。在特定的实施方案中，可以在手术前作为最初的疗法和手术后作为辅助疗法施用组合疗法。
在某些实施方案中，cMET抑制剂选自foretinib(GSK1363089/XL-880)、PHA-665752、AMG102、MetMAb、ARQ197、JNJ-38877605、PF-2341066、PF-04217903、SGX523、XL184、MGCD265、MK-2461及其组合。在某些其他实施方案中，HER1抑制剂选自埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、BIBW-2992及其组合。在特定的实施方案中，组合疗法包括cMET抑制剂foretinib和/或PHA-665752和HER1抑制剂拉帕替尼。
在特定的实施方案中，在获自受试者的癌细胞中，测定分析物如cMET和HER1，以及任选地HER2和/或HER3(以及其他信号转导蛋白生物标志物)的存在或活化水平。在一些实例中，癌细胞选自原发性肿瘤细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、腹水肿瘤细胞(ATC)及其组合。
在某些实施方案中，该方法进一步包括在施用组合疗法之前获自受试者的癌细胞中，测定分析物如cMET和HER1，以及任选地HER2和/或HER3(以及其他信号转导蛋白生物标志物)的存在或活化水平，例如以测定在I期或II期胃癌中，cMET和HER1是否是共活化的。在特定的实施方案中，用CEERTM测定此类分析物的存在或活化水平。
本发明的其他目的、特征和优点对于本领域技术人员而言从以下详细说明和附图中是显而易见的。
附图简述
2010年7月15日提交的PCT公开号WO2011/008990(PCT/US2010/042182)和2012年1月19日提交的美国申请号13/354,257的附图在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。
图1显示本发明邻近测定法模式(例如，协同酶增强的反应免疫测定法(CEERTM))的一个实施方案，其在生物样品中测定活化的(例如，磷酸化的)和总的分析物水平中是特别有用的。
图2显示通过CEERTM(上)和IHC(下左)的RTK的表达。在产生图之前，按“HER2、PI3K、HER3、cMET、HER1、IGF1R”的顺序排列每一患者中信号蛋白质的水平。还显示了GCA患者中p95HER2的存在(下左)及其在每一具有IHC亚型的HER2中的水平(下右)。
图3显示了通过多维比例(A)和模式(B)产生的示例性共活化相关指数。
图4A-G显示实施例2中所述的一组胃癌细胞系中通路蛋白质的综合谱的结果。
图5显示了CEERTM测定法的原理和阵列布局的示例性简图说明。
图6显示胃癌中HER2和p95HER2表达。(A)患者0.25μg裂解物样品中的HER2表达的CU分布。x-轴表示IHC/FISH状态，并且y-轴表示如从BT474标准曲线中测定的来自CEERTM测定法的CU值。显示了两组之间的分离，与IHC/FISH阳性群体(50/434)的中位数11比较，IHC/FISH阴性群体(384/434)的中位数为0。没有显示定量限以上的一个饱和样品。框代表四分位距，75％的在上部和25％的在下部。框中部的线代表中位数。线(whisker)延伸至四分位距的1.5倍内的最高值和最低值。通过威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon signed-rank test)测定P值<.001。(B)20μg裂解物中，肿瘤样品的亚集(58/434)中p95HER2的CU分布。x-轴表示IHC状态，并且y-轴表示来自p95的CEERTM测定法的CU值。在测定法之前，通过免疫-耗竭去除了全长HER2。数据点基于通过IHC和FISH的HER2状态着色。如所示，通过FISH分析测定具有IHC为2的一个数据点为阳性。在图下部，CU值显示了具有IHC为3的样品。在通过CEERTM测定的p95为阳性的34例样品中，其中24(71％)例通过IHC/FISH测定为HER2(+)。
图7显示了通过IHC和CEERTM在乳腺癌中HER2表达的比较。(A)中显示了乳腺癌中每一IHC亚组中基于CEERTM的HER2表达的分布。IHC和CEERTMHER2状态之间存在17％(38/227)的不一致调用(call)(C-一致，D-不一致)。(B)中总结了100例样品(包括具有不一致调用的全部)的IP-W分析的结果。显示了CEERTM和IPW之间一致性调整的HER状态。
图8显示了使用CEERTM测定法测定全长和截短型p95HER2表达策略的非限制性实例。
图9显示了胃癌中磷酸化标志物的谱。(A)显示了指定信号转导蛋白质的通路谱的代表性免疫阵列图。阵列信号强度从黑色/深蓝色(低)至红色/白色(高/饱和)变动。(B)基于CEERTM测定法在10μg裂解物浓度中测量的活化(磷酸化)标志物的CU值进行的434例样品的热图和分层聚类。每一列显示一种标志物，并且每一行显示一例患者。用色标描述活化的相对水平，其中红色表示活化的最高水平，并且绿色表示最低水平。通过十分位数排列每一标志物(列)的CU值。将0至0.1之间的不稳定性(Jitter)加入到每一生物标志物CU值中，以产生相等大小的二进制目标文件(bin)。行和列树形图显示了分层聚类计算的结果。
图10显示了基于活化的RTK谱的胃癌的无病存活差异。(A&B)治愈性手术后，肿瘤II+III期胃癌样品的无病存活差异。该分析在具有0RTK活化对比≥1RTK活化的群组之间比较了总胃癌样品集(A)或仅HER2(-)胃癌样品集(B)。在具有II+III期胃癌的全部患者中，两组的中位数存活为32.63月(≥1RTK活化)和76.53月(0RTK活化)，并且在具有HER2(-)II+III期胃癌患者中，为30.10月(≥1RTK活化)和68.13月(0RTK活化)。(C&D)治愈性手术后，比较HER2(-)(C)或I期、HER2(-)(D)胃癌样品中，c-MET(+)HER1(-)对比c-MET(+)HER1(+)群组的无病存活差异。HER2(-)患者中两组的中位数存活为46.17月(c-MET(+)HER1(+))和82.80月(c-MET(+)HER1(-))。没有定义两组中具有HER2(-)I期胃癌的患者的中位数存活时间。显示了每一组的样品数、p-值和危险比。
图11显示了c-MET(+)HER1(-)对比c-MET(+)HER1(+)胃癌群组之间的无病存活差异。治愈性手术后，在全部(HER2(+)和HER2(-))胃癌样品中比较c-MET(+)HER1(-)对比c-MET(+)HER1(+)群组的无病存活差异。胃癌患者中两组的中位数存活为46.17月(c-MET(+)HER1(+))和82.80月(c-MET(+)HER1(-))。显示了每一组的样品数、p-值和危险比。
图12显示了胃癌细胞中活化的HER1/HER2和MET的抑制。显示了拉帕替尼/cMET抑制剂处理后通路蛋白质的调节，以及用各个治疗剂处理的通路抑制对癌细胞生长抑制的表型影响。分别用红色、黄色和绿色箭头显示HER1、HER2和c-MET。
图13显示了来自胃癌患者的CTC和ATC的磷酸化标志物谱。(A)显示了分离自胃癌患者的CTC中HER1和HER2的表达和活化。使用CEERTM检测了CTC裂解物中的磷酸-HER1、磷酸-HER2、总HER1、总HER2和CK。(B)用指定剂量的药物(拉帕替尼和cMET抑制剂)处理分离自从胃癌患者005-110中获得的腹水的肿瘤细胞4小时。通过CEERTM检测处理后磷酸-蛋白质的调节。药物处理后，观察到了pHER1、pHER2和p-cMET水平以剂量依赖的方式的明显降低。同时观察到了靶特异性信号降低，还观察到了非靶向RTK、IGF1R的活化的增加。(C-E)在37℃，在2μM抑制剂混合物(拉帕替尼和PHA-665,752)或DMSO存在或不存在的情况下，用生长因子(EGF、调蛋白、HGF和IGF)的混合物处理分离自从胃癌患者中收集的腹水的肿瘤细胞4小时。完成生长因子/药物处理后，裂解细胞，并使用CEERTM进行分析。将相对CU定义为CU与基线(没有药物处理和没有生长因子刺激)的比率。生长因子处理诱导了多个信号转导蛋白质的活化。药物处理降低了对应的靶蛋白质的活化。
图14显示了总HER2和磷酸化HER2的标准曲线。将制备自BT474的连续稀释的细胞裂解物的标准曲线用于归一化每一样品中HER2的表达和磷酸化的程度。将每一曲线作图为对数信号强度(测量为相对荧光单位(RFU)对比细胞裂解物的对数浓度)的函数，并参照标准细胞系。图像显示了单一PMT设定，但多PMT扫描衍生了定量的动态范围。
图15是表2。该表基于胃癌(GCA)和乳腺癌(BCA)评分标准，显示了HER2(+)和HER2(-)胃癌样品的HER2基因扩增状态(‘1’为基因扩增和‘0’为基因未扩增)和HER2IHC得分(表示为‘0’、‘1’、‘2’或‘3’)。以色度显示胃癌样品的组织学亚型：肠型(浅灰)、扩散型(中灰)和混合型(深灰)。该表还总结了每一样品中p95HER2的表达状态(‘1’为p95(+)，‘0’为p95(-)，‘ND’为未测定)和HER1、HER2、HER3、c-MET、IGF1R和PI3K信号传递分子的磷酸化状态(‘1’为磷酸化和‘0’为未磷酸化)。分别显示了各个标记物的CU截止值。
图16是表3。该表就每一活化的HER激酶轴受体成员及其与其他HER成员的共活化而言，显示了样品成员的分布。显示了样品的HER2状态和组织学亚型。
图17是表4。该表就活化的c-MET受体及其与其他RTK的共活化模式而言，显示了样品成员的分布。显示了样品的HER2状态和组织学亚型。
图18是表5。该表就活化的IGF1受体及其与其他RTK的共活化模式而言，显示了样品成员的分布。显示了样品的HER2状态和组织学亚型。
发明详述
简介
随着肿瘤学领域中分子靶向疗法时代的到来，许多肿瘤学家已经对在否则将已经进行支持性治疗的难治性、转移癌症患者中的分子靶向制剂经历了意料外的和戏剧性的回应。然而，在临床上，即使基于其靶标谱选择的患者通常不会对靶向制剂产生应答，或者在具有显著的初始应答后产生抗性。阻碍靶向制剂的治疗性益处增强的主要问题包括：(1)患者亚组中伴随性的和冗余性通路活化；(2)由于通过通路交叉对话，绕过最初靶向的蛋白质的备选信号传导事件的活化，产生了抗性；(3)在抗癌治疗过程期间，由于癌症转移或发展，分子和病理学特征的改变；(4)治疗期间或之后，再次活组织检查的有限利用度；和(5)针对靶向制剂的以鉴定解决“发展中的”疾病的可能药物抗性机制的指南(companion)诊断的局限性。
胃癌是世界范围内癌症死亡的主要原因，具有每年18.9/100,000的发生率和每年14.7/100,000的死亡率(参见例如，Cunningham等人，Ann.Oncol.，16Suppl1，i22-23(2005))，并且其是韩国最常见的恶性肿瘤。由于较差的预后，转移性胃癌对于医学肿瘤学家而言，仍是治疗挑战。当前，曲妥珠单抗是在随机III期试验中证实对胃癌有效的唯一活性靶向制剂(参见例如，Bang，Y.J.等人，Lancet，376：687-697(2010))。胃癌中其他已知活化的通路蛋白质包括人上皮生长因子受体(HER)家族、间质上皮转化因子或肝细胞生长因子(HGF)受体(cMET)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，以及胰岛素样因子1受体(IGF1R)。
本发明显示，可以基于在该癌症类型中活化的关键生长因子受体信号传递通路的磷酸化谱分离胃癌。特别地，本发明基于信号传递通路活化谱，鉴定了胃癌中不均匀性的水平，其可能直接影响该癌症类型中靶向治疗剂的选择和结果。在特别的方面，已经将高度敏感的和新的免疫测定法，CEERTM用于胃癌临床样品，其可以多通道特异性分析几种蛋白质的总的和磷酸化形式。实施例3中所述的研究显示，>40％的胃癌患者具有HER1、HER2、HER3、c-MET、PI3K和IGF1R分子中至少一种活化的信号转导激酶。在该研究的RTK分析中，HER家族成员是最频繁活化的酪氨酸激酶，HER3在28％的胃癌中活化，其次是HER2(21％)和HER1(15.7％)。此外，实施例3中所述的研究显示HER2阳性胃癌主要表现出活化的HER2和HER3，而HER2阴性癌症一般具有活化的HER1、HER3和c-MET通路，并且HER2活化的胃癌是不同于c-MET活化的胃癌的亚组。此外，实施例3中所述的研究显示大多数胃癌(>75％的HER2阳性和～85％的HER2阴性胃癌)不具有任一单独活化的RTK，不过它们受伴随性活化的RTK的网络驱动。
值得注意地，实施例3中所述的研究显示，p-HER1：p-cMET共表达的胃癌样品中整体信号传递特征与表达p-cMET而HER1未活化的样品是不同的。对于p-HER1(-)：p-cMET(+)对比p-HER1(+)：p-cMET(+)样品集合，观察到了中位数存活时间的显著差异。事实上，该研究显示，当与HER2-阴性样品集合中仅cMET活化的I期患者比较时，cMET和HER1的共活化显示出更差的无病存活。同样地，该研究显示，cMET和HER1(以及任选地HER3)的共活化与HER2-阴性、扩散型胃癌密切相关，并且此类胃癌患者具有显著更差的存活。因此，该研究显示，与针对单独靶标的单一疗法对照，HER1和cMET二者的组合治疗性抑制在HER1和cMET共活化的癌细胞中是更有效的的抗肿瘤策略。
II.定义
如本文中所用，除非另外明确指明，以下术语具有其所属的含义。
术语“癌症”意图包括以异常细胞的非受控性生长为特征的一类疾病的任何成员。该术语包括全部已知的癌症和肿瘤病症，无论其特征是恶性的、良性的、软组织或实体，以及包括转移前和转移后癌症的全部分期和等级的癌症。不同类型的癌症的实例包括但不限于，消化和胃肠癌症如胃癌(例如，胃部癌症)、结直肠癌、胃肠间质肿瘤(GIST)、胃肠类癌瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌和食道癌；乳腺癌；肺癌(例如，非小细胞肺癌)；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌；前列腺癌；卵巢癌；肾癌(例如，肾细胞癌)；中枢神经系统的癌症；皮肤癌；和淋巴瘤；神经胶质瘤；choriocarcinomas；头颈癌；骨肉瘤；和血癌。如本文中所述，“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。在某些实施方案中，胃癌与组织亚型相对应，例如如肠型、扩散型和/或混合型。
术语“分析物”包括测定其存在、量(表达水平)、活化状态或水平和/或同一性的任何目的分子，一般是大分子如多肽。在某些实施方案中，分析物是信号转导分子例如如，HER(EGFR)或c-Met信号传递通路的组分。
术语“信号转导分子”或“信号转导物”包括实现这样的过程的蛋白质和其他分子，其中细胞将胞外信号或刺激转变成应答，通常涉及细胞内有序顺序的生物化学反应。信号转导分子的实例分别包括但不限于，受体酪氨酸激酶如EGFR(例如，EGFR/HER1/ErbB1、HER2/Neu/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4)、VEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLK1/KDR、VEGFR3/FLT4、FLT3/FLK2、PDGFR(例如，PDGFRA、PDGFRB)、c-KIT/SCFR、INSR(胰岛素受体)、IGF-IR、IGF-IIR、IRR(胰岛素受体相关受体)、CSF-1R、FGFR1-4、HGFR1-2、CCK4、TRK A-C、c-MET、RON、EPHA1-8、EPHB1-6、AXL、MER、TYRO3、TIE1-2、TEK、RYK、DDR1-2、RET、c-ROS、V-钙粘着蛋白、LTK(白细胞酪氨酸激酶)、ALK(退行发育淋巴瘤激酶)、ROR1-2、MUSK、AATYK1-3和RTK106；截短形式的受体酪氨酸激酶如具有缺失氨基端胞外结构域的截短型HER2受体(例如，p95ErbB2(p95m)、p110、p95c、p95n等)；受体酪氨酸激酶二聚体(例如，p95HER2/HER3、p95HER2/HER2、HER2/HER2、HER2/HER3、HER1/HER2、HER2/HER3、HER2/HER4等)；非受体酪氨酸激酶如BCR-ABL、Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack和LIMK；酪氨酸激酶信号传递级联组分如AKT(例如，AKT1、AKT2、AKT3)、MEK(MAP2K1)、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PI3K(例如，PIK3CA(p110)、PIK3R1(p85))、PDK1、PDK2、磷酸酶和张力蛋白类似物(PTEN)、SGK3、4E-BP1、P70S6K(例如，p70S6激酶剪接变体αI)、蛋白酪氨酸磷酸酶(例如，PTP1B、PTPN13、BDP1等)、RAF、PLA2、MEKK、JNKK、JNK、p38、Shc(p66)、Ras(例如，K-Ras、N-Ras、H-Ras)、Rho、Rac1、Cdc42、PLC、PKC、p53、细胞周期蛋白D1、STAT1、STAT3、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)、磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)、mTOR、BAD、p21、p27、ROCK、IP3、TSP-1、NOS、GSK-3β、RSK1-3、JNK、c-Jun、Rb、CREB、Ki67和桩蛋白；核激素受体如雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、雄激素受体、糖皮质激素受体、矿物类皮质激素受体、维生素A受体、维生素D受体、类视黄醇受体、甲状腺激素受体和孤儿受体；核受体共活化物和阻抑物如乳腺癌中扩增的-1(amplified in breast cancer-1)(AIB1)和核受体共阻抑物1(NCOR)；及其组合。
术语“HER信号传递通路的组分”包括HER激酶受体的上游配体、HER激酶受体的结合配偶体和/或通过HER激酶受体调节的下游效应子分子的任意一个或多个。HER信号传递通路组分的实例包括但不限于，调蛋白(heregulin)、HER1/ErbB1、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4、AKT(例如，AKT1、AKT2、AKT3等)、MEK(MAP2K1)、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PI3K(例如，PIK3CA(p110)、PIK3R1(p85)等)、PDK1、PDK2、PTEN、SGK3、4E-BP1、P70S6K(例如，剪接变体αI)、蛋白酪氨酸磷酸酶(例如，PTP1B、PTPN13、BDP1等)、HER二聚体(例如，HER1/HER1、HER1/p95HER2、HER1/HER2、HER1/HER3、HER1/HER4、HER2/HER2、HER2/p95HER2、HER2/HER3、HER2/HER4、HER3/HER3、HER3/p95HER2、HER3/HER4、HER4/HER4、HER4/p95HER2等)、GSK-3β、PIP2、PIP3、p27及其组合。
术语“c-Met信号传递通路的组分”包括c-Met的上游配体、c-Met的结合配偶体和/或通过c-Met调节的下游效应子分子的任意一个或多个。c-Met信号传递通路组分的实例包括但不限于，肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)、丛蛋白B1、CD44v6、AKT(例如，AKT1、AKT2、AKT3)、MEK(MAP2K1)、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、STAT(例如，STAT1、STAT3)、PI3K(例如，PIK3CA(p110)、PIK3R1(p85))、GRB2、Shc(p66)、Ras(例如，K-Ras、N-Ras、H-Ras)、GAB1、SHP2、SRC、GRB2、CRKL、PLCγ、PKC(例如，PKCα、PKCβ、PKCδ)、桩蛋白、FAK、内收蛋白、RB、RB1、PYK2及其组合。
术语“活化状态”指特定信号转导分子如HER或c-Met信号传递通路组分是否是活化的。相似地，术语“活化水平”指特定信号转导分子如HER或c-Met信号传递通路组分活化的程度。活化状态通常对应于一个或多个信号转导分子的磷酸化、泛素化和/或络合状态。活化状态的非限制性实例(在括弧中列出)包括：HER1/EGFR(EGFRvIII、磷酸化(p-)EGFR、EGFR：Shc、泛素化(u-)EGFR、p-EGFRvIII)；ErbB2(p-ErbB2、p95HER2(截短型ErbB2)、p-p95HER2、ErbB2：Shc、ErbB2：PI3K、ErbB2：EGFR、ErbB2：ErbB3、ErbB2：ErbB4)；ErbB3(p-ErbB3、ErbB3：PI3K、p-ErbB3：PI3K、ErbB3：Shc)；ErbB4(p-ErbB4、ErbB4：Shc)；c-MET(p-c-MET、c-Met：HGF复合物)；AKT1(p-AKT1)；AKT2(p-AKT2)；AKT3(p-AKT3)；PTEN(p-PTEN)；P70S6K(p-P70S6K)；MEK(p-MEK)；ERK1(p-ERK1)；ERK2(p-ERK2)；PDK1(p-PDK1)；PDK2(p-PDK2)；SGK3(p-SGK3)；4E-BP1(p-4E-BP1)；PIK3R1(p-PIK3R1)；c-KIT(p-c-KIT)；ER(p-ER)；IGF-1R(p-IGF-1R、IGF-1R：IRS、IRS：PI3K、p-IRS、IGF-1R：PI3K)；INSR(p-INSR)；FLT3(p-FLT3)；HGFR1(p-HGFR1)；HGFR2(p-HGFR2)；RET(p-RET)；PDGFRA(p-PDGFRA)；PDGFRB(p-PDGFRB)；VEGFR1(p-VEGFR1、VEGFR1：PLCγ、VEGFR1：Src)；VEGFR2(p-VEGFR2、VEGFR2：PLCγ、VEGFR2：Src、VEGFR2：肝素硫酸酯、VEGFR2：VE-钙粘着蛋白)；VEGFR3(p-VEGFR3)；FGFR1(p-FGFR1)；FGFR2(p-FGFR2)；FGFR3(p-FGFR3)；FGFR4(p-FGFR4)；TIE1(p-TIE1)；TIE2(p-TIE2)；EPHA(p-EPHA)；EPHB(p-EPHB)；GSK-3β(p-GSK-3β)；NFKB(p-NFKB)、IKB(p-IKB、p-P65：IKB)；BAD(p-BAD、BAD：14-3-3)；mTOR(p-mTOR)；Rsk-1(p-Rsk-1)；Jnk(p-Jnk)；P38(p-P38)；STAT1(p-STAT1)；STAT3(p-STAT3)；FAK(p-FAK)；RB(p-RB)；Ki67；p53(p-p53)；CREB(p-CREB)；c-Jun(p-c-Jun)；c-Src(p-c-Src)；桩蛋白(p-桩蛋白)；GRB2(p-GRB2)、Shc(p-Shc)、Ras(p-Ras)、GAB1(p-GAB1)、SHP2(p-SHP2)、GRB2(p-GRB2)、CRKL(p-CRKL)、PLCγ(p-PLCγ)、PKC(例如，p-PKCα、p-PKCβ、p-PKCδ)、内收蛋白(p-内收蛋白)、RB1(p-RB1)和PYK2(p-PYK2)。
如本文中所用，术语“样品”包括获自患者的任何生物学样本。样品包括但不限于，全血、血浆、血清、红血细胞、白血细胞(例如，外周血单核细胞)、导管灌洗液、腹水、胸膜溢出物、乳头抽出物、淋巴(例如，弥散的淋巴结肿瘤细胞)、骨髓抽出物、唾液、尿液、粪便(即，大便)、痰、支气管灌洗液、泪液、细针抽出物(例如，通过随机乳晕细针穿刺术(random periareolar fine needle aspiration)获取)、任意其他体液、组织样品(例如，肿瘤组织)如肿瘤(例如，穿刺活检)或淋巴结(例如，前哨淋巴结活检)的活检组织、组织样品(例如，肿瘤组织)如手术切除的肿瘤及其细胞提取物。在一些实施方案中，样品是全血或其分级组分如血浆、血清或细胞沉淀。在其他实施方案中，样品通过使用本领域已知的技术，从全血或其细胞部分中分离实体肿瘤的循环细胞获得。又在其他实施方案中，样品是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)肿瘤组织样品，例如来自实体肿瘤如胃癌。在特定的实施方案中，样品是制备自获自具有胃癌的受试者的冰冻组织的肿瘤裂解物或提取物。
“活组织检查”指移出组织样品用于诊断或者用于预后评价的过程，以及指组织标本本身。可以将本领域已知的任何活组织检查技术用于本发明的方法和组合物。除其他因素外，活组织检查技术的应用通常取决于待评价的组织类型以及肿瘤的大小和类型(即，实体的或者混悬的(即，血液或腹水))。代表性活组织检查技术包括切除活组织检查、切开式活组织检查、针吸活组织检查(例如，中心穿刺活组织检查、细针抽吸活组织检查等)、手术活组织检查和骨髓活组织检查。在例如，Harrison’s Principles of Internal Medicine，Kasper，等人编辑，第16版，2005，第70章，以及整个第V部分中讨论了活组织检查技术。本领域技术人员应当理解，可以进行活组织检查技术，以鉴定给定组织样品中的癌细胞和/或癌变前的细胞。
术语“受试者”或“患者”或“个体”通常包括人类，但还可以包括其他动物例如如，其他灵长类动物、啮齿类动物、犬、猫、马、绵羊、猪等。
如本文中所用，术语“稀释系列”意图包括具体样品(例如，细胞裂解物)或试剂(例如，抗体)的一系列递减浓度。稀释系列通常通过这样的方法产生，包括将测定量的起始浓度的样品或试剂与稀释剂(例如，稀释缓冲液)混合，以产生更低浓度的样品或试剂，并重复该过程足够的次数，以获得期望数量的一系列稀释物。可以将样品或试剂连续地稀释至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、500或1000倍，以产生包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个递减浓度的样品或试剂的稀释物系列。例如，可以通过将一定量的起始浓度的捕获抗体与相等量的稀释缓冲液混合，以产生0.5mg/ml浓度的捕获抗体，来产生包含1mg/ml起始浓度的捕获抗体的2-倍连续稀释的稀释物系列，并且可以重复该过程，以获得0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.0325mg/ml等的捕获抗体浓度。
如本文中所用，术语“优良(superior)的动态范围”指测定法在少至一个细胞或者多至上千个细胞中检测特定分析物的能力。例如，本文中所述的免疫测定法拥有优良的动态范围，因为使用捕获抗体浓度的稀释系列，它们可以有利地在约1-10,000个细胞(例如，约1、5、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500或10,000个细胞)中检测特定的目的信号转导分子。
“阵列”或“微阵列”包含在固体支持物例如如，玻璃(例如，玻璃载片)、塑料、芯片、针、过滤器、珠子(例如，磁珠、聚苯乙烯珠等)、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)等)、纤维束或任意合适的底物上固定化或受限制的捕获货抗体的不同集合和/或稀释系列。捕获抗体通常通过共价或非共价相互作用(例如，离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)固定化或受限制在固体支持物上。在某些实例中，捕获抗体包含与固体支持物结合的捕获剂相互作用的捕获标签。用于本文中所述的测定法的阵列通常包含在不同的已知/可编址位置中与固体支持物的表面偶联的多个不同捕获抗体和/或捕获抗体浓缩物(concentration)。
术语“捕获抗体”意图包括对样品如细胞提取物中的一种或多种目的分析物特异的(即，结合、连接或形成复合物)固定化抗体。在特定的实施方案中，将捕获抗体限制在阵列中的固体支持物上。用于固定化固体支持物上任意多种信号转导分子的合适捕获抗体可获自Upstate(Temecula，CA)、Biosource(Camarillo，CA)、Cell SignalingTechnologies(Danvers，MA)、R&D Systems(Minneapolis，MN)、Lab Vision(Fremont，CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)、Sigma(St.Louis，MO)和BD Biosciences(San Jose，CA)。
如本文中所用，术语“检测抗体”包括其对样品中的一种或多种目的分析物是特异的(即，结合、连接或形成复合物)含可检测标记的抗体。术语还包括对一种或多种目的分析物特异的抗体，其中抗体可以与包含可检测标记的另一种类连接。可检测标记的实例包括但不限于，生物素/链霉亲和素标记、核酸(例如，寡核苷酸)标记、化学活性标记、荧光标记、酶标记、放射性标记及其组合。用于检测任意多种信号转导分子的活化状态和/或总量的合适检测抗体可获自Upstate(Temecula，CA)、Biosource(Camarillo，CA)、Cell Signaling Technologies(Danvers，MA)、R&D Systems(Minneapolis，MN)、Lab Vision(Fremont，CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)、Sigma(St.Louis，MO)和BD Biosciences(San Jose，CA)。作为非限制性实例，针对信号转导分子如EGFR、c-KIT、c-Src、FLK-1、PDGFRA、PDGFRB、AKT、MAPK、PTEN、Raf和MEK的多种磷酸化形式的磷酸-特异性抗体可获自Santa Cruz Biotechnology。
术语“活化状态-依赖性抗体”包括对样品中一种或多种目的分析物的特定活化状态特异的(即，结合、连接或形成复合物)检测抗体。在优选的实施方案中，活化状态-依赖性抗体检测一种或多种分析物如一种或多种信号转导分子的磷酸化、泛素化和/或络合状态。在一些实施方案中，使用活化状态-依赖性抗体检测受体酪氨酸激酶的EGFR家族成员的磷酸化和/或EGFR家族成员之间异二聚体复合物的形成。在特定的实施方案中，可将活化状态-依赖性抗体用于检测一种或多种以下信号转导分子中的一个或多个磷酸化位点(磷酸化位点对应于氨基酸在人蛋白质序列中的位置)：EGFR/HER1/ErbB1(例如，酪氨酸(Y)1068)；ErbB2/HER2(例如，Y1248)；ErbB3/HER3(例如，Y1289)；ErbB4/HER4(例如，Y1284)；c-Met(例如，Y1003、Y1230、Y1234、Y1235和/或Y1349)；SGK3(例如，苏氨酸(T)256和/或丝氨酸(S)422)；4E-BP1(例如，T70)；ERK1(例如，T185、Y187、T202和/或Y204)；ERK2(例如，T185、Y187、T202和/或Y204)；MEK(例如，S217和/或S221)；PIK3R1(例如，Y688)；PDK1(例如，S241)；P70S6K(例如，T229、T389，和/或S421)；PTEN(例如，S380)；AKT1(例如，S473和/或T308)；AKT2(例如，S474和/或T309)；AKT3(例如，S472和/或T305)；GSK-3β(例如，S9)；NFKB(例如，S536)；IKB(例如，S32)；BAD(例如，S112和/或S136)；mTOR(例如，S2448)；Rsk-1(例如，T357和/或S363)；Jnk(例如，T183和/或Y185)；P38(例如，T180和/或Y182)；STAT3(例如，Y705和/或S727)；FAK(例如，Y397、Y576、S722、Y861，和/或S910)；RB(例如，S249、T252、S612和/或S780)；RB1(例如，S780)；内收蛋白(例如，S662和/或S724)；PYK2(例如，Y402和/或Y881)；PKCα(例如，S657)；PKCα/β(例如，T368和/或T641)；PKCδ(例如，T505)；p53(例如，S392和/或S20)；CREB(例如，S133)；c-Jun(例如，S63)；c-Src(例如，Y416)；和桩蛋白(例如，Y31和/或Y118)。
术语“不依赖活化状态的抗体”包括不考虑其活化状态，对样品中一种或多种目的分析物特异的(即，结合、连接或形成复合物)的检测抗体。例如，不依赖活化状态的抗体可以检测一种或多种分析物(如一种或多种信号转导分子)的磷酸化和非磷酸化形式。
术语“温育”可与“接触”和“暴露”同义使用，并且除非另外指明，并不表示任何特定时间或温度需求。
“受体酪氨酸激酶”或“RTK”包括以跨膜结构域和酪氨酸激酶基序为特征的56个蛋白质的家族。RTK在调节生长、分化、附着、迁移以及凋亡的细胞信号传递和传输信号中发挥作用。受体酪氨酸激酶的突变活化和/或过量表达可以转化细胞，并通常在癌症的发展和增殖中起着关键作用。RTK已经成为多种分子靶向制剂如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、吉非替尼、埃罗替尼、舒尼替尼、伊马替尼、尼洛替尼等的靶标。一种完全表征的信号转导通路是MAP激酶通路，其负责转导来自表皮生长因子(EGF)的信号，以促进细胞的细胞增殖。
术语“无病存活”包括特定疾病(例如，癌症)治疗后的时间的长度，其间患者在没有疾病指征(例如，没有已知的复发)的情况下存活。在某些实施方案中，无病存活是用于评价特定疗法的有效性的临床参数，其通常以1或5年的单位测量。
术语“无进展存活”包括特定疾病(例如，癌症)治疗期间和治疗后的时间的长度，其间患者在具有疾病但没有疾病的其他症状的情况下存活。
术语“整体存活率”包括描述在诊断为患病(如癌症)或治疗疾病后存活确定时间段的患者的临床端点。
III.实施方案的描述
本发明提供了用于预测具有早期(例如，I期或II期或者处于两期之间的过渡期)胃癌的受试者在肿瘤手术后的存活的测定法和方法。在某些方面，本发明提供了用于预测组合疗法在具有早期胃癌的受试者中的治疗有效性和/或应答的测定法和方法。本发明还提供了通过施用针对胃癌中活化的信号转导蛋白生物标志物而定制的组合疗法，治疗具有早期胃癌的受试者的方法。在特定的事实方案中，本发明方法依赖于检测在获自具有早期胃癌的受试者的癌细胞中特定组合的信号转导蛋白分析物的活化状态或水平。因此，鉴于所检测的分析物的活化状态或水平，本文中所述的方法可以特别地用于预测具有早期胃癌的受试者的存活或预后，并且通过鉴定受试者而用来指导肿瘤手术前和肿瘤手术后的治疗决定，与单一疗法相反，就分析物检测到的活化状态或者水平而言，所述受试者可以受益于组合疗法。
在某些方面，本发明提供了预测具有I期或II期胃癌的受试者在肿瘤手术后的存活的方法，该方法包括：
(a)在获自受试者的癌细胞中测定包含cMET和HER1的至少两种分析物的存在或活化水平；和
(b)基于步骤(a)中测定的至少两种分析物的存在或活化水平，预测受试者的存活。
在一些实施方案中，该方法预测了具有I期或II期胃癌的受试者的无病存活或无进展存活。在某些实例中，I期胃癌是IA期或IB期胃癌。在某些其他实例中，II期胃癌是IIA期或IIB期胃癌。在一个备选的实施方案中，受试者具有0期胃癌。在另一个备选的实施方案中，受试者具有晚期(例如，III期如IIIA、IIIB或IIIC期或IV期)胃癌。参见例如，Washington，Ann.Surg.Oncol.，17：3077-9(2010)对AJCC胃癌分期系统的第7版的说明，所述文献的公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。
在特定的实施方案中，cMET和HER1在癌细胞中是共活化的。在此类实施方案中，与具有cMET活化、不存在HER1活化的I期或II期胃癌受试者比较，预测该受试者具有更差的存活(例如，更差的预后)。更差存活结果的非限制性实例包括寿命缩短、癌症复发的时间缩短、发展成癌症症状的时间缩短、复发的更高风险及其组合。
在一些实施方案中，I期或II期胃癌与组织亚型相对应，例如肠型、扩散型或混合型胃癌。在特定的实施方案中，I期或II期胃癌是扩散型胃癌。在其他实施方案中，cMET和HER1在扩散型胃癌中是共活化的。在此类实施方案中，与具有cMET活化、不存在HER1活化和/或扩散型胃癌的I期或II期胃癌受试者比较，预测该受试者具有更差的存活(例如，更差的预后)。
在其他实施方案中，步骤(a)还包括测定癌症细胞中包含HER2和/或HER3的至少一种其他分析物的存在或活化水平。在某些实例中，在癌细胞中，cMET和HER1是共活化的，但HER2并不活化。在此类实例中，与具有cMET活化、不存在HER1和/或HER2活化的I期或II期胃癌受试者比较，预测该受试者具有更差的存活(例如，更差的预后)。在某些其他实例中，在癌细胞中，cMET、HER1和HER3是共活化的，但HER2并不活化。在此类实例中，与具有cMET活化、不存在HER1、HER2和/或HER3活化的I期或II期胃癌受试者比较，预测该受试者具有更差的存活(例如，更差的预后)。
在一些实施方案中，具有I期或II期胃癌的受试者的更差存活结果包括与对照受试者(例如，具有cMET活化，但HER1并不活化的I期或II期胃癌受试者)比较，寿命、无病存活或无进展存活缩短了数天、数周、数月或数年(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50天、周、月或年)。
在某些实施方案中，癌细胞分离自肿瘤组织样品如原发性胃肿瘤样品，例如I期或II期胃肿瘤。在一些实例中，癌细胞选自原发性肿瘤细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、腹水肿瘤细胞(ATC)及其组合。在特定的实例中，细胞提取物产生自分离的癌细胞。
在某些实施方案中，该方法还包括：
(c)基于步骤(a)中测定的至少cMET或HER1的存在或活化水平，将单独的cMET抑制剂或者与HER1抑制剂组合的cMET抑制剂施用给受试者。
在一些实施方案中，当cMET和HER1在癌细胞中共活化时，并且任选地当癌细胞中HER2未活化和/或HER3活化时，将cMET抑制剂与HER1抑制剂组合施用。本文中描述了cMET抑制剂与HER1抑制剂的非限制性实例。在特定的实施方案中，将cMET抑制剂foretinib和/或PHA-665752与HER1抑制剂拉帕替尼组合施用。在其他实施方案中，将一种或多种其他抗癌药物施用给受试者。下文描述了合适的其他抗癌药物的实例。
在特定的实施方案中，步骤(a)包括用CEERTM测定分析物(例如，至少cMET和HER1，以及任选地HER2和/或HER3以及其他信号转导蛋白生物标志物)的存在或活化水平。在其他实施方案中，步骤(a)还包括测定一种或多种分析物(例如，至少cMET和HER1和任选地HER2和/或HER3，以及其他信号转导蛋白生物标志物)的存在或表达水平。在特定的实施方案中，用CEERTM测定此类分析物的存在或表达水平。在某些实施方案中，针对每一分析物产生的标准曲线，校准分析物的表达水平和/或活化水平。
在某些实例中，本发明方法还包括将步骤(b)中的预测结果以可读格式提供给使用者(例如，临床医师如肿瘤学家或全科医师)的步骤。在一些实例中，该方法还包括将步骤(b)中的预测结果发送或报告给临床医师如肿瘤学家或全科医师。在其他实例中，该方法还包括在计算机数据库或其他例如在实验室储存信息的合适机器或设备中记录或储存步骤(b)中的预测结果。
在其他方面，本发明提供了治疗具有I期或II期胃癌的受试者的方法，该方法包括：
将包含cMET抑制剂和HER1抑制剂的组合疗法施用给受试者，其中cMET和HER1在I期或II期胃癌中是共活化的。
在一些实施方案中，该方法改善了具有I期或II期胃癌的受试者的预后(例如，增加无病存活或无进展存活)。在某些实例中，I期胃癌是IA期或IB期胃癌。在某些其他实例中，II期胃癌是IIA期或IIB期胃癌。在一个备选的实施方案中，受试者具有0期)胃癌。在一个备选的实施方案中，受试者具有晚期(例如，III期如IIIA、IIIB或IIIC期或IV期)胃癌。参见例如，Washington，Ann.Surg.Oncol.，17：3077-9(2010)对AJCC胃癌分期系统的第7版的说明，所述文献的公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。
在某些实施方案中，与具有cMET和HER1共活化、没有接受组合疗法的I期或II期胃癌的对照受试者比较，该方法增加了具有I期或II期胃癌的受试者的存活(例如，增加无病存活或无进展存活)数天、数周、数月或数年(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50天、周、月或年)。
在其他实施方案中，与具有cMet活化、不存在HER1活化的I期或II期胃癌受试者比较，受试者(例如，开始组合疗法之前)具有更差的存活和/或更差的预后。更差存活结果的非限制性实例包括寿命缩短、癌症复发的时间缩短、发展成癌症症状的时间缩短、复发的更高风险及其组合。
在其他实施方案中，在I期或II期胃癌中，cMET和HER1是共活化的，但HER2是没有活化的。在此类实施方案中，与具有cMet活化、不存在HER1和/或HER2活化的I期或II期胃癌受试者比较，受试者(例如，开始组合疗法之前)具有更差的存活和/或更差的预后。
又在其他实施方案中，在I期或II期胃癌中，cMET、HER1和HER3是共活化的。在此类实施方案中，与具有cMet活化、不存在HER1、HER2和/或HER3活化的I期或II期胃癌受试者比较，受试者(例如，开始组合疗法之前)具有更差的存活和/或更差的预后。
在一些实施方案中，与对照受试者(例如，具有cMET活化但HER1未活化的I期或II期胃癌的对照受试者)比较，具有I期或II期胃癌的受试者的更差存活结果包括寿命、无病存活或无进展存活缩短了数天、数周、数月或数年(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50天、周、月或年)。
在一些实施方案中，将组合疗法作为最初的疗法(例如，作为手术前的治疗，以收缩胃肿瘤的大小)施用给受试者。在其他实施方案中，将组合疗法作为手术后辅助疗法(例如，肿瘤手术后)施用给受试者。在特定的实施方案中，可以在手术前作为最初的疗法和手术后作为辅助疗法施用组合疗法。在某些实例中，将治疗有效量的cMET抑制剂和HER1抑制剂施用给受试者。
在某些实施方案中，cMET抑制剂选自foretinib(GSK1363089/XL-880)、PHA-665752、AMG102、MetMAb、ARQ197、JNJ-38877605、PF-2341066、PF-04217903、SGX523、XL184、MGCD265、MK-2461及其组合。在某些其他实施方案中，HER1抑制剂选自埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、BIBW-2992及其组合。在特定的实施方案中，组合疗法包括cMET抑制剂foretinib和/或PHA-665752和HER1抑制剂拉帕替尼。
在其他实施方案中，本发明方法还包括将一种或多种其他抗癌药物施用给受试者。在特定的实施方案中，抗癌药物包括干扰癌细胞中活化的信号转导通路组分的功能的制剂，包括但不限于抗信号传递剂(即，细胞抑制药物)如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗增殖剂；化疗剂(即，细胞毒性剂)；激素治疗剂；放疗剂；疫苗；和/或具有能降低或消除异常细胞如癌细胞的非受控性生长的能力的任何其他化合物。在优选的实施方案中，一种或多种其他抗癌药物选自pan-HER抑制剂、HER3抑制剂、HER1/2抑制剂、HER1/2/4抑制剂、IGF-1R抑制剂、MEK抑制剂、PI3K抑制剂、mTOR抑制剂及其组合。
适用于本发明的抗信号传递制剂的实例包括但不限于，单克隆抗体如曲妥珠单抗
Figure BDA00004293245900002615
帕妥珠单抗(2C4)、阿仑组单抗
Figure BDA0000429324590000262
贝伐单抗
Figure BDA0000429324590000263
西妥昔单抗
Figure BDA0000429324590000264
吉妥单抗帕尼单抗(VectibixTM)、利妥昔单抗和托西莫单抗
Figure BDA0000429324590000268
酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼
Figure BDA0000429324590000269
舒尼替尼
Figure BDA00004293245900002610
埃罗替尼
Figure BDA00004293245900002611
拉帕替尼(GW-572016；
Figure BDA00004293245900002612
)、卡纽替尼(CI1033)、semaxinib(SU5416)、伐他拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY43-9006；)、伊马替尼甲磺酸盐
Figure BDA00004293245900002614
来氟米特(SU101)、凡德他尼(ZACTIMATM；ZD6474)、培利替尼(EKB-569)、CP-654577、CP-724714、HKI-272、PKI-166、AEE788、BMS-599626、HKI-357、BIBW-2992、ARRY-334543、JNJ-26483327及其组合。
抗增殖剂的实例包括mTOR抑制剂如西罗莫司(雷帕霉素)、坦罗莫司(CCI-779)、依维莫司(RAD001)、BEZ-235和XL765；AKT抑制剂如1L6-羟甲基-手性-肌醇-2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八烷基-sn-甘油碳酸盐、9-甲氧基-2-甲基玫瑰树碱醋酸盐(methylellipticiniumacetate)、1，3-二氢-1-(1-((4-(6-苯基-1H-咪唑并[4，5-g]喹恶啉-7-基)苯基)甲基)-4-哌啶基(piperidinyl))-2H-苯并咪唑-2-酮、10-(4’-(N-二乙胺基)丁基)-2-氯苯氧胺、3-甲酰色酮缩氨基硫脲(Cu(II)Cl2复合物)、API-2、来源于原癌基因TCL1的氨基酸10-24的15-基体肽(Hiromura等人，J.Biol.Chem.，279：53407-53418(2004)、KP372-1，以及在Kozikowski等人，J.Am.Chem.Soc.，125：1144-1145(2003)和Kau等人，CancerCell，4：463-476(2003)中所述的化合物；PI3K抑制剂如PX-866、渥曼青霉素、LY294002、五羟黄酮、河豚毒素柠檬酸盐、硫丙酰胺马来酸盐、GDC-0941(957054-30-7)、IC87114、PI-103、PIK93、BEZ-235(NVP-BEZ235)、TGX-115、ZSTK474、(-)-鱼藤素、NU7026、杨梅黄素、坦度替尼、GDC-0941bismesylate、GSK690693、KU-55933、MK-2206、OSU-03012、哌立福新、曲西立滨、XL-147、PIK75、TGX-221、NU7441、PI828、XL-765和WHI-P154；MEK抑制剂如PD98059、ARRY-162、RDEA119、U0126、GDC-0973、PD184161、AZD6244、AZD8330、PD-0325901和ARRY-142886；IGF-1R抑制剂如BMS-536924；及其组合物。
pan-HER抑制剂的非限制性实例包括PF-00299804、奈拉替尼(HKI-272)、AC480(BMS-599626)、BMS-690154、PF-02341066、HM781-36B、CI-1033、BIBW-2992及其组合物。
化疗剂的非限制性实例包括基于铂的药物(例如，奥沙利铂、顺铂、卡铂、螺铂、异丙铂、沙铂等)、烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑、氮芥、乌拉莫司汀、噻替派、亚硝基脲类等)、抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、氨甲喋呤、甲酰四氢叶酸、卡培他滨、阿糖胞苷、氮尿苷、氟达拉滨、吉西他滨
Figure BDA0000429324590000271
培美曲塞雷替曲塞等)、植物生物碱(例如，长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、鬼臼毒素、紫杉醇
Figure BDA0000429324590000273
多西他赛
Figure BDA0000429324590000274
等)、拓扑异构酶抑制剂(例如，伊立替康、拓扑替康、安吖啶、依托泊苷(VP16)、依托泊苷磷酸、替尼泊苷等)、抗肿瘤抗生素(例如，多柔比星、阿霉素、柔红霉素、表柔比星、放线菌素、博来霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等)，其可药用盐、其立体异构物、其衍生物、其类似物及其组合。
激素治疗剂的实例包括但不限于，芳香酶抑制剂(例如，氨鲁米特、阿那曲唑
Figure BDA0000429324590000275
来曲唑
Figure BDA0000429324590000276
伏氯唑、依西美坦
Figure BDA0000429324590000277
4-雄烯-3，6，17-三酮(6-OXO)、1，4，6-androstatrien-3，17-二酮(ATD)、福美坦
Figure BDA0000429324590000278
等、选择性雌激素受体调节物(例如，巴多昔芬、氯米芬、氟维司群、拉索昔芬、雷洛昔芬、他莫昔芬、托瑞米芬等)、类固醇(例如，地塞米松)、非那雄胺，以及促性腺素释放激素激动剂(GnRH)如戈舍瑞林，其可药用盐、其立体异构物、其衍生物、其类似物及其组合。
用于本发明的癌症疫苗的非限制性实例包括来自ActiveBiotech的ANYARA、来自Northwest Biotherapeutics的DCVax-LB、来自IDM Pharma的EP-2101、来自Pharmexa的GV1001、来自IderaPharmaceuticals的IO-2055、来自Introgen Therapeutics的INGN225，以及来自Biomira/Merck的Stimuvax。
放疗剂的实例包括但不限于，放射性核素如47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At和212Bi，任选地与指向肿瘤抗原的抗体缀合。
在某些实施方案中，一种或多种其他抗癌药物包括用于HER1/2的拉帕替尼、用于HER1/2/4的吉非替尼、用于HER1/2的BIBW-2992、用于IGF-1R的BMS-536924、用于MEK的PD-325901、用于PI3K的BEZ-235和mTOR及其组合。
在特定的实施方案中，在获自受试者的癌细胞中测定分析物如cMET和HER1，以及任选地HER2和/或HER3(以及其他信号转导蛋白生物标志物)的存在或活化水平。在一些实例中，癌细胞选自原发性肿瘤细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、腹水肿瘤细胞(ATC)及其组合。
在某些实施方案中，本方法还包括在获自施用组合疗法之前的受试者的癌细胞中，测定分析物如cMET和HER1，以及任选地HER2和/或HER3(以及其他信号转导蛋白生物标志物)的存在或活化水平，例如以测定cMET和HER1在I期和II期胃癌中是否是共活化的。在特定的实施方案中，用CEERTM测定此类分析物(例如，至少cMET和HER1，任选地HER2和/或HER3)的存在或活化水平。
在某些实施方案中，本方法还包括在获自施用组合疗法之前的受试者的癌细胞中，测定分析物如cMET和HER1，以及任选地HER2和/或HER3(以及其他信号转导蛋白生物标志物)的存在或活化水平，例如以测定cMET和HER1在I期和II期胃癌中是否是共活化的。在特定的实施方案中，用CEERTM测定此类分析物(例如，至少cMET和HER1，任选地HER2和/或HER3)的存在或活化水平。在某些其他实施方案中，针对每一分析物产生的标准曲线，校准分析物的表达水平和/或活化水平。
在一些实施方案中，将特定目的分析物的表达水平和/或活化水平表示为相对荧光单位(RFU)，其对应于使用例如邻近测定法如CEERTM测定的分析物的信号强度。在其他实施方案中，将特定目的分析物的表达水平和/或活化水平表示为“-”、“±”、“+”、“++”、“+++”、“++++”，其对应于使用例如邻近测定法如CEERTM测定的分析物的信号强度。在一些实例中，将使用例如邻近测定法如CEERTM测定的特定目的分析物的不可检测或最低可检测水平表达和/或活化表示为“-”或“±”。在其他实例中，将使用例如邻近测定法如CEERTM测定的特定目的分析物的低水平表达和/或活化表示为“+”。仍又在其他实例中，将使用例如邻近测定法如CEERTM测定的特定目的分析物的中等水平表达和/或活化表示为“++”。在另外的实例中，将使用例如邻近测定法如CEERTM测定的特定目的分析物的高水平表达和/或活化表示为“+++”。在其他实例中，将使用例如邻近测定法如CEERTM测定的特定目的分析物的非常高水平表达和/或活化表示为“++++”。
在其他实施方案中，针对分析物产生的标准曲线，通过校准或归一化使用邻近测定法如CEERTM测定的RFU值，来定量特定目的分析物的表达水平和/或活化水平。在某些实例中，可以基于标准曲线计算计算单位(CU)值。在某些其他实例中，根据特定目的分析物的信号强度的上述说明，可将CU值表示为“-”、“±”、“+”、“++”、“+++”、“++++”。美国申请号13/365,638的实施例3提供了在细胞如癌细胞中信号转导通路蛋白质的定量的数据分析的非限制性实例，所述公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。
在特定的实施方案中，可以计算特定目的分析物的CU值，并与截断值比较，以测定细胞或样品对于该分析物是否是阳性还是阴性。在某些实例中，当表示为CU值时，目的分析物的截断值可以为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、500000或者500000以上CU。在特定的实施方案中，1CU表示表达约1-2×106个RTK和/或约1-2×105个活化的(例如，磷酸化的)RTK(参见下文实施例3)。
在特定的实施方案中，目的分析物的CU值等于或大于截断值，表明细胞或样品(例如，细胞提取物)对于该分析物是阳性的，例如该分析物在细胞或样品中是过量表达和/或活化的(例如，磷酸化的)。作为非限制性实例，将约500CU的截断值用于p95HER2阳性的评分。作为另一非限制性实例，将约6或7(例如，6.7CU)的截断值用于磷酸化HER1(p-HER1)存在的评分。作为又另一非限制性实例，将约41或42(例如，41.6CU)的截断值用于磷酸化HER2(p-HER2)存在的评分。作为另一非限制性实例，将约1124或1125(例如，1124.3CU)的截断值用于磷酸化HER3(p-HER3)存在的评分。作为另一非限制性实例，将约6或7(例如，6.1CU)的截断值用于磷酸化cMET(p-cMET)存在的评分。作为又另一非限制性实例，将约69或70(例如，69.2CU)的截断值用于磷酸化IGF1R(p-IGF1R)存在的评分。作为另一非限制性实例，将约175或176CU(例如，175.3CU)的截断值用于磷酸化PI3K(p-PI3K)存在的评分。图15(表2)显示了本文中所述的示例性截断值用于测定特定样品对于p95HER2表达和/或HER1、HER2、HER3、cMET、IGF1R和/或PI3K磷酸化是否是阳性的用途。
在某些实施方案中，截断值是相对于所分析的样品的特定量而言的，例如可以通过邻近测定法如CEERTM，基于所分析的样品的量(例如，通过CEERTM分析至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100或100以上μg的组织)来测定特定的截断值。作为非限制性实例，可以将约500CU的截断值用于每一特定量(例如，20μg)所分析组织p95HER2阳性的评分(参见，下文实施例3)。
为了保留原位活化状态，通常在分离细胞后，优选地在96、72、48、24、6或1小时内，更优选地在30、15或5分钟内，立即提取信号转导蛋白质。通常还可以以纳摩尔至微摩尔浓度的生长因子温育分离的细胞约1-30分钟，以恢复或刺激细胞转导物活性(参见例如，Irish等人，Cell，118：217-228(2004))。刺激性生长因子包括上皮生长因子(EGF)、调蛋白(HRG)、TGF-α、PIGF、血管生成素(Ang)、NRG1、PGF、TNF-α、VEGF、PDGF、IGF、FGF、HGF、细胞因子等。为了评价各个患者的可能抗癌治疗，可以在生长因子刺激之前、期间和/或之后用不同剂量的一种或多种抗癌药物温育分离的细胞。可以进行生长因子刺激几分钟或几小时(例如，约1-5分钟至约1-6小时)。分离、用抗癌药物和/或生长因子刺激后，使用本领域已知的任意技术裂解细胞，以提取信号转导蛋白质。优选地，生长因子刺激后，在约1-360分钟之间开始细胞裂解，并且更优选地以两个不同的时间间隔：(1)生长因子刺激后约1-5分钟；和(2)生长因子刺激后约30-180分钟之间。备选地，可以将裂解物储存于-80℃，直到使用。
在某些实施方案中，本发明还包括测定癌细胞中一种或多种(例如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55种或者55种以上)其他分析物的表达水平(例如，总量)和/或活化水平(例如，磷酸化或复合物形成的水平)。
可以在样品如来自癌细胞的细胞提取物中查询的其他分析物如信号转导分子的非限制性实例包括但不限于，受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶信号传递级联组分、核激素受体、核受体共活化物、核受体阻抑物及其组合。在某些实例中，可以在样品如来自癌细胞的细胞提取物中测定一种或多种以下其他分析物的存在或表达和/或活化水平：p95HER2、HER4(ErbB4)、PI3K、SHC、Raf、SRC、MEK、NFkB-IkB、mTOR、PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、EPH-A、EPH-B、EPH-C、EPH-D、FGFR、c-KIT、FLT-3、TIE-1、TIE-2、c-FMS、PDGFRA、PDGFRB、Abl、FTL3、RET、HGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、IGF-1R、ER、PR、NCOR、AIB1、AKT、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PDK1、PDK2、PTEN、SGK3、4E-BP1、P70S6K、蛋白酪氨酸磷酸酶(例如，PTP1B、PTPN13、BDP1等)、受体二聚物、GSK-3β、PIP2、PIP3、p27及其组合。
在一个特定的实施方案中，本发明包括测定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10种以上标志物如以下分析物：HER1、HER2、HER3、p95HER2、cMET、IGF-1R、cKIT、PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)、SHC和/或VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)的表达水平(例如，总量)和/或活化水平(例如，磷酸化或复合物形成的水平)。
在某些优选的实施方案中，本发明包括(i)测定至少一种或多种HER1、HER2、HER3、cMET、IGF-1R、PI3K和/或SHC的表达水平和/或(ii)测定至少一种或多种HER1、HER2、HER3、cMET、IGF-1R、PI3K和/或SHC的活化水平。在一些实施方案中，活化水平对应于HER1、HER2、HER3、cMET、IGF-1R和/或SHC的磷酸化水平。在某些其他事实方案中，活化水平对应于PI3K复合物的水平。PI3K复合物的实例包括但不限于，包含二聚化的受体酪氨酸激酶对、PI3Kp85亚基(例如，PIK3R1)和PI3K p110亚基(例如，α或β亚基如PIK3CA或PIK3CB)的一种或多种复合物；参见例如，2011年9月2日提交的美国临时申请号No.61/530,621，所述申请的公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。
在一些实施方案中，测定一种或多种分析物的表达水平包括用对相应分析物特异的一种或多种抗体检测细胞提取物中一种或多种分析物的每一种的总量。在特定的实施方案中，在不考虑待检测的分析物的活化状态的情况下，抗体与分析物结合，即抗体检测分析物的非活化和活化形式二者。
可以使用多种技术中的任意测定总表达水平和/或状态。在某些实施方案中，使用如本文中所述的免疫测定法如单检测测定法或邻近双检测测定法(例如，协同酶增强的反应免疫测定法(CEERTM))检测样品如来自细胞系(例如，胃癌细胞系)或肿瘤组织(例如，胃肿瘤组织)的细胞提取物中一种或多种目的分析物(如信号转导分子)的总表达水平和/或状态。
在某些实施方案中，测定一种或多种分析物的表达(例如，总)水平，包括：
(i)将产生自细胞的细胞提取物与捕获抗体的一个或多个稀释系列(例如，对一种或多种分析物特异的捕获抗体)孵育(例如，接触)，以形成多个捕获的分析物，其中将捕获抗体限制在固体支持物上(例如，以将细胞提取物中存在分析物转变成包含分析物和捕获抗体的捕获的分析物的复合物)；
(ii)将多个捕获的分析物与包含对相应分析物特异的一种或多种第一和第二不依赖活化状态的抗体(例如，对一种或多种分析物特异的第一和第二不依赖活化状态的抗体)的检测抗体孵育(例如，接触)，以形成多种可检测的捕获分析物(例如，以将捕获的分析物的复合物转变成包含捕获的分析物和检测抗体的可检测的捕获分析物的复合物)，
其中用促进部分(facilitating moiety)标记第一不依赖活化状态的抗体，用信号扩增对的第一成员标记第二不依赖活化状态的抗体，并且促进部分产生通向并与信号扩增对的第一成员反应的氧化剂；
(iii)将多个可检测的捕获分析物与信号扩增对的第二成员孵育(例如，接触)，以产生扩增的信号；和
(iv)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的扩增信号。
在某些其他实施方案中，测定为截短型受体(例如，p95HER2)的一种或多种分析物的表达(例如，总)水平，包括：
(i)将产生自细胞的细胞提取物与对全长受体(例如，全长HER2)的胞外结构域(ECD)结合区特定的多个珠子孵育(例如，接触)；
(ii)从细胞提取物中去除多个珠子，从而去除全长受体(例如，全长HER2)，以形成没有全长受体(例如，全长HER2)的细胞提取物(例如，以将细胞提取物转变成没有特定全长受体或全长受体家族的细胞提取物)；
(iii)将没有全长受体(例如，全长HER2)的细胞提取物与对全长受体(例如，全长HER2)的胞内结构域(ICD)结合区特异的一个或多个捕获抗体孵育(例如，接触)，以形成多个捕获的截短型受体，其中将捕获抗体限制在固体支持物上(例如，以将缺失全长抗体的细胞提取物中存在截短型受体转变成包含截短型受体和捕获抗体的复合物)；
(iv)将多个捕获的截短型受体与包含对全长受体(例如，全长HER2)的ICD结合区特异的一种或多种第一和第二不依赖活化状态的抗体的检测抗体孵育，以形成多种可检测的捕获截短型受体(例如，以将捕获的截短型受体的复合物转变成包含捕获的截短型受体和检测抗体的可检测的捕获截短型受体的复合物)，
其中用促进部分标记第一不依赖活化状态的抗体，用信号扩增对的第一成员标记第二不依赖活化状态的抗体，并且促进部分产生通向并与信号扩增对的第一成员反应的氧化剂；
(v)将多个可检测的捕获截短型受体与信号扩增对的第二成员孵育(例如，接触)，以产生扩增的信号；和
(vi)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的扩增信号。
可以用促进部分直接标记或者用促进部分间接标记第一不依赖活化状态的抗体，例如通过与第一不依赖活化状态的抗体缀合的寡核苷酸与缀合于促进部分的互补寡核苷酸之间的杂交。相似地，可以用信号扩增对的第一成员直接标记或者用信号扩增对的第一成员间接标记第二不依赖活化状态的抗体，例如通过与第二不依赖活化状态的抗体缀合的结合对的第一成员与信号扩增对的第一成员缀合的结合对的第二成员之间的结合，。在某些实例中，结合对的第一成员是生物素，并且结合对的第二成员是亲和素如链霉亲和素或中和亲和素。
在一些实施方案中，促进部分可以例如是葡萄糖氧化酶。在某些实例中，可以如例如，PCT公开号WO2009/108637的实施例16-17中所述，将葡萄糖氧化酶和第一不依赖活化状态的抗体与巯基-活化的葡聚糖分子缀合，所述专利的公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。巯基-活化的葡聚糖分子通常具有约500kDa(例如，约250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或750kDa)的分子量。在其他实施方案中，氧化剂可以例如是过氧化氢(H2O2)。又在其他实施方案中，信号扩增对的第一成员可以例如是过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)。在其他实施方案中，信号扩增对的第二成员可以例如是酪胺(tyramide)试剂(例如，生物素-酪胺)。优选地，扩增信号通过生物素-酪胺的过氧化物酶氧化产生，以产生活化的酪胺(例如，以将生物素-酪胺转变成活化的酪胺)。例如，基于信号检测试剂的加入，可以直接地检测或者间接地检测活化的酪胺。信号检测试剂的非限制性实例包括链霉亲和素标记的荧光团，以及链霉亲和素标记的过氧化物酶和显色试剂例如如3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)的组合。
在某些实例中，可以将辣根过氧化物酶和第二不依赖活化状态的抗体与巯基-活化的葡聚糖分子缀合。巯基-活化的葡聚糖分子通常具有约70kDa(例如，约40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100kDa)的分子量。
截短型受体通常是全长受体的片段，并且与全长受体共有胞内结构域(ICD)结合区。在某些实施方案中，全长受体包含胞外结构域(ECD)结合区、跨膜结构域和胞内结构域(ICD)结合区。不被任何特定理论所束缚，可以通过全长受体的ECD的蛋白裂解处理或者通过从位于跨膜区之前、之内或之后的甲硫氨酸残基备选地起始翻译，来产生截短型受体，例如以产生具有缩短的ECD的截短型受体或包含膜相关的或胞质的ICD片段的截短型受体。
在某些优选的实施方案中，截短型受体是p95HER2，并且相应的全长受体是HER2。然而，本领域技术人员应当理解，可以将本文中所述的用于检测截短型蛋白质的方法应用于许多不同的蛋白质，包括但不限于EGFR VIII突变体(涉及成胶质细胞瘤、结直肠癌等)、其他截短型受体酪氨酸激酶、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶等。PCR公开号WO2009/108637的实施例12提供了使用具有优良的动态范围的多通道、高通量、邻近双检测微阵列ELISA检测细胞中的截短型受体(如p95HER2)的本发明测定方法的示例性实施方案，所述专利的公开在此处处于全部目的以其整体引入作为参考。
在一些实施方案中，对ECD结合区特异的多个珠子包含链霉亲和素-生物素对，其中链霉亲和素与珠子连接，并且生物素与抗体连接。在某些实例中，抗体是对全长受体(例如，全长HER2)的ECD结合区特异的。
在一些实施方案中，捕获抗体的每一稀释系列包含一系列递减的捕获抗体浓度。在某些实例中，将捕获抗体连续稀释至少2倍(例如，2、5、10、20、50、100、500或1000倍)，以产生包含在阵列上定点的一组(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或25个以上)递减的捕获抗体浓度的稀释系列。优选地，在阵列上定点了每一捕获抗体稀释物的至少2、3、4、5或6个重复。
在其他实施方案中，固体支持物包含玻璃(例如，玻璃载片)、塑料、芯片、针、过滤器、珠子、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)等)、纤维束或任意合适的底物。在优选的实施方案中，将捕获抗体限制(例如，通过共价或非共价相互作用)在包被了硝酸纤维素的玻璃载片上，例如如可购自Whatman Inc.(FlorhamPark，NJ)的
Figure BDA0000429324590000371
载片。构建适用于本发明的抗体阵列的示例性方法描述于例如，PCT公开号WO2009/108637中，所述专利的公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。
在其他实施方案中，测定一种或多种分析物的活化水平包括用对每一待检测的分析物的磷酸化形式特异的抗体检测细胞提取物中一种或多种分析物的磷酸化水平。
可以使用多种技术测定磷酸化水平和/或状态。例如，本领域已知，可以通过使用特异性识别蛋白质的磷酸化形式的抗体的免疫测定法检测磷酸化蛋白质(参见例如，Lin等人，Br.J.Cancer，93：1372-1381(2005))。免疫测定法通常包括免疫印迹(例如，蛋白印迹)、RIA和ELISA。免疫测定法的更特定类型包括抗原捕获/抗原竞争、抗体捕获/抗原竞争、双抗体夹心、抗体捕获/抗体过量和抗体捕获/抗原过量。在本文和Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，1988，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA中描述了制备抗体的方法。可以从头合成或者从商业或非商业来源获得磷酸-特异性抗体。还可以通过具有以[γ-32p]ATP或[γ-33p]ATP形式放射性磷酸盐的代谢性标记的细胞，测定磷酸化水平和/或状态。磷酸化蛋白质变成放射性的，并因此可以通过闪烁计数、放射显影等追踪和定量(参见例如，Wang等人，J.Biol.Chem.，253：7605-7608(1978))。例如，可以从细胞中提取代谢性标记的蛋白质、通过凝胶电泳分离、转移到膜、用对特定分析物特异的抗体探查并进行放射自显影，以检测32p或33p。备选地，可以在膜转移和抗体探查之前进行凝胶放射自显影。
在特定的实施方案中，使用如本文中所述的免疫测定法如单检测测定法或邻近双检测测定法(例如，协同酶增强的反应免疫测定法(CEERTM))检测样品如来自细胞系(例如，胃癌细胞系)或肿瘤组织(例如，胃肿瘤组织)的细胞提取物中一种或多种目的分析物的活化(例如，磷酸化)水平和/或状态。
在某些实施方案中，测定一种或多种分析物的活化(例如，磷酸化)水平，包括：
(i)将产生自细胞的细胞提取物与捕获抗体(例如，对一种或多种分析物特异的捕获抗体)的稀释系列孵育(例如，接触)，以形成多个捕获的分析物，其中将捕获抗体限制在固体支持物上(例如，以将细胞提取物中存在的分析物转变成包含分析物和捕获抗体的捕获分析物的复合物)；
(ii)将多个捕获的分析物与包含对相应分析物特异的不依赖活化状态的抗体(例如，对一种或多种分析物特异的不依赖活化状态的抗体)和对相应分析物特异的活化状态-依赖性抗体(例如，对一种或多种分析物特异的活化状态-依赖性抗体)的检测抗体孵育(例如，接触)，以形成多个可检测的捕获分析物(例如，以将捕获的分析物复合物转变成包含捕获的分析物和检测抗体的可检测捕获分析物的复合物)，
其中用促进部分标记不依赖活化状态的抗体，用信号扩增对的第一成员标记活化状态-依赖性抗体，并且促进部分产生通向并与信号扩增对的第一成员反应的氧化剂；
(iii)将多个可检测的捕获分析物与信号扩增对的第二成员孵育(例如，接触)，以产生扩增的信号；和
(vi)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的扩增信号。
在某些实施方案中，测定为截短型受体(例如，p95HER2)的一种或多种分析物的活化(例如，磷酸化)水平，包括：
(i)将产生自细胞的细胞提取物与对全长受体(例如，全长HER2)的胞外结构域(ECD)结合区特异的多个珠子孵育(例如，接触)；
(ii)从细胞提取物中去除多个珠子，从而去除全长受体(例如，全长HER2)，以形成没有全长受体(例如，全长HER2)的细胞提取物(例如，以将细胞提取物转变成没有特异性受体或全长受体家族的细胞体提取物)；
(iii)将没有全长受体(例如，全长HER2)的细胞提取物与对全长受体(例如，全长HER2)的胞内结构域(ICD)结合区特异的多个捕获抗体孵育(例如，接触)，以形成多个捕获的截短型受体，其中将捕获抗体限制在固体支持物上(例如，以将缺失全长抗体的细胞提取物中存在的截短型受体转变成截短型受体和捕获抗体的复合物)；
(iv)将多个捕获的截短型受体与包含对全长受体(例如，全长HER2)的ICD结合区特异的不依赖活化状态的抗体和活化状态-依赖性抗体的检测抗体孵育(例如，接触)，以形成多种可检测的捕获截短型受体(例如，以将捕获的截短型受体的复合物转变成包含捕获的截短型受体和检测抗体的可检测的捕获截短型受体的复合物)，
其中用促进部分标记不依赖活化状态的抗体，用信号扩增对的第一成员标记活化状态-依赖性抗体，并且促进部分产生通向并与信号扩增对的第一成员反应的氧化剂；
(v)将多个可检测的捕获截短型受体与信号扩增对的第二成员孵育(例如，接触)，以产生扩增的信号；和
(vi)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的扩增信号。
可以用促进部分直接标记或者用促进部分间接标记不依赖活化状态的抗体，例如通过与不依赖活化状态的抗体缀合的寡核苷酸和与促进部分缀合的互补寡核苷酸之间的杂交。相似地，可以用信号扩增对的第一成员直接标记或者用信号扩增对的第一成员间接标记活化状态-依赖性抗体，例如通过与活化状态-依赖性抗体缀合的结合对的第一成员与信号扩增对的第一成员缀合的结合对的第二成员之间的结合。在某些实例中，结合对的第一成员是生物素，并且结合对的第二成员是亲和素如链霉亲和素或中和亲和素。
在一些实施方案中，促进部分可以例如是葡萄糖氧化酶。在某些实例中，可以如例如，PCT公开号WO2009/108637的实施例16-17中所述，将葡萄糖氧化酶和不依赖活化状态的抗体与巯基-活化的葡聚糖分子缀合，所述专利的公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。巯基-活化的葡聚糖分析通常具有约500kDa(例如，约250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或750kDa)的分子量。在其他实施方案中，氧化剂可以例如是过氧化氢(H2O2)。又在其他实施方案中，信号扩增对的第一成员可以例如是过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)。在其他实施方案中，信号扩增对的第二成员可以例如是酪胺(tyramide)试剂(例如，生物素-酪胺)。优选地，扩增信号通过生物素-酪胺的过氧化物酶氧化产生，以产生活化的酪胺(例如，以将生物素-酪胺转变成活化的酪胺)。例如，基于信号检测试剂的加入，可以直接地检测或者间接地检测活化的酪胺。信号检测试剂的非限制性实例包括链霉亲和素标记的荧光团，以及链霉亲和素标记的过氧化物酶和显色试剂例如如3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)的组合。
在某些实例中，可以将辣根过氧化物酶和活化状态依赖的抗体与巯基-活化的葡聚糖分子缀合。巯基-活化的葡聚糖分子通常具有约70kDa(例如，约40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100kDa)的分子量。
截短型受体通常是全长受体的片段，并且与全长受体共有胞内结构域(ICD)结合区。在某些实施方案中，全长受体包含胞外结构域(ECD)结合区、跨膜结构域和胞内结构域(ICD)结合区。不被任何特定理论所束缚，可以通过全长受体的ECD的蛋白裂解处理或者通过从位于跨膜区之前、之内或之后的甲硫氨酸残基备选地起始翻译，来产生截短型受体，例如以产生具有缩短的ECD的截短型受体或包含膜相关的或胞质的ICD片段的截短型受体。
在某些优选的实施方案中，截短型受体是p95HER2，并且相应的全长受体是HER2。然而，本领域技术人员应当理解，可以将本文中所述的用于检测截短型蛋白质的方法应用于许多不同的蛋白质，包括但不限于EGFR VIII突变体(涉及成胶质细胞瘤、结直肠癌等)、其他截短型受体酪氨酸激酶、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶等。PCR公开号WO2009/108637的实施例12提供了使用具有优良的动态范围的多通道、高通量、邻近双检测微阵列ELISA检测细胞中的截短型受体如p95HER2的本发明测定方法的示例性实施方案，所述专利的公开在此处处于全部目的以其整体引入作为参考。
在一些实施方案中，对ECD结合区特异的多个珠子包含链霉亲和素-生物素对，其中链霉亲和素与珠子连接，并且生物素与抗体连接。在某些实例中，抗体是对全长受体(例如，全长HER2)的ECD结合区特异的。
在一些实施方案中，捕获抗体的每一稀释系列包含一系列递减的捕获抗体浓度。在某些实例中，将捕获抗体连续稀释至少2倍(例如，2、5、10、20、50、100、500或1000倍)，以产生包含在阵列上定点的一组(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或25个以上)递减的捕获抗体浓度的稀释系列。优选地，在阵列上定点了每一捕获抗体稀释物的至少2、3、4、5或6个重复。
在其他实施方案中，固体支持物包含玻璃(例如，玻璃载片)、塑料、芯片、针、过滤器、珠子、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)等)、纤维束或任意合适的底物。在优选的实施方案中，将捕获抗体限制(例如，通过共价或非共价相互作用)在包被了硝酸纤维素聚合物的玻璃载片上，例如如可购自Whatman Inc.(Florham Park，NJ)的
Figure BDA0000429324590000411
载片。构建适用于本发明的抗体阵列的示例性方法描述于例如，PCT公开号WO2009/108637中，所述专利的公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。
IV.单检测测定法
在一些实施方案中，用于在细胞如肿瘤细胞的细胞提取物中检测一种或多种目的分析物(例如，一种或多种信号转导分子如HER和/或c-Met信号通路的一种或多种组分)的表达和/或活化水平或状态的测定法是具有优良的动态范围的多通道、高通量双抗体测定法。作为非限制性实例，用于测定法的两种抗体可以包括：(1)对特定的目的分析物特异的捕获抗体；和(2)对分析物的活化形式特异的检测抗体(即，活化状态-依赖性抗体)。活化状态-依赖性抗体能检测例如分析物的磷酸化、泛素化和/或络合状态。备选地，检测抗体包括活性状态-独立的抗体，其检测细胞提取物中分析物的总量。不依赖活化状态的抗体通常能检测分析物的活化和非活化形式二者。
在一个特定的实施方案中，用于检测目的分析物的表达或活化水平的双抗体测定法包括：
(i)将细胞提取物与捕获抗体的一个或多个稀释系列孵育，以形成多个捕获的分析物；
(ii)将多个捕获的分析物与对相应的分析物特异的检测抗体孵育，以形成多个可检测的捕获分析物，其中检测抗体包含用于检测分析物的活化(例如，磷酸化)水平的活化状态-依赖性抗体或用于检测分析物的表达水平(例如，总量)的不依赖活化状态的抗体；
(iii)将多个可检测的捕获分析物与信号扩增对的第一和第二成员孵育(例如，接触)，以产生扩增的信号；和
(iv)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的扩增信号。
本文中所述的双抗体测定法通常是基于抗体的阵列，其包含在不同可编址位置与固体支持物的表面偶联的具有一定范围的捕获抗体浓度的多种不同捕获抗体。用于本发明的合适固体支持物的实例如上所述。
就分析物结合而言，优选地选择捕获抗体和检测抗体，以最小化它们之间的竞争(即，捕获和检测抗体二者可以同时结合其相应的信号转导分子)。
在一个实施方案中，检测抗体包含结合对的第一成员(例如，生物素)，并且信号扩增对的第一成员包含结合对的第二成员(例如，链霉亲和素)。使用本领域熟知的方法，可以将结合对成员与检测抗体或者与信号扩增对的第一成员直接或间接地偶联。在某些实例中，信号扩增对的第一成员是过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、细胞色素c过氧化物酶、嗜酸细胞过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、脱碘酶等)，并且信号扩增对的第二成员是酪胺试剂(例如，生物素-酪胺)。在这些实例中，扩增信号通过过氧化物酶氧化酪胺试剂产生，以在过氧化氢(H2O2)存在的情况下，产生活化的酪胺。
可以直接地检测活化的酪胺或基于信号检测试剂(例如如，链霉亲和素标记的荧光团或链霉亲和素标记的过氧化物酶和显色剂的组合)的添加而检测活化的酪胺。适用于本发明的荧光团的实例包括但不限于，Alexa
Figure BDA0000429324590000431
染料(例如，Alexa555)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM；罗丹明、德克萨斯红、四罗丹明异硫氰酸盐(tetrarhodamine isothiocynate，TRITC)、a CyDyeTM氟(例如，Cy2、Cy3、Cy5)等。使用本领域熟知的方法，可以将链霉亲和素标记与荧光团或过氧化物酶直接或间接偶联。适用于本发明的显色剂的非限制性实例包括3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、3，3’-二氨基联苯胺(DAB)、2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、4-氯-1-萘酚(4CN)和/或还原卟啉。
在PCT公开号WO2009/108637的实施例3中提供了实施本文中所述双抗体测定法的示例性方法，所述专利的公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。
在双抗体方法的另一个实施方案中，本发明提供了用于检测截短型受体的表达或活化水平的方法，该方法包括：
(i)将细胞提取物与对全长受体的胞外结构域(ECD)结合区特异的多个珠子孵育；
(ii)从细胞提取物中去除多个珠子，从而去除全长受体，以形成没有全长受体的细胞提取物；
(iii)将没有全长受体的细胞提取物与对全长受体的胞内结构域(ICD)结合区特异的一个或多个捕获抗体的稀释系列孵育，以形成多个捕获的截短型受体；
(iv)将多个捕获的截短型受体与对全长受体的ICD结合区特异的检测抗体孵育，以形成多种可检测的捕获截短型受体，其中检测抗体包含用于检测截短型受体的活化(例如，磷酸化)水平的活化状态-依赖性抗体或用于检测截短型受体的表达水平(例如，总量)的不依赖活化状态的抗体；
(v)将多个可检测的捕获截短型受体与信号扩增对的第一和第二成员孵育，以产生扩增的信号；和
(vi)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的扩增信号。
在某些优选的实施方案中，截短型受体是p95HER2，并且相应的全长受体是HER2。在某些其他实施方案中，对胞外结构域(ECD)结合区特异的多个珠子包含链霉亲和素-生物素对，其中链霉亲和素与珠子连接，并且生物素与抗体连接(例如，其中抗体是对全长受体的ECD结合区特异的)。
PCT公开号WO2009/108637的图14A显示，用指向目的受体的胞外结构域(ECD)的抗体包被的珠子结合了全长受体(例如，HER2)，而非截短型受体(例如，p95HER2)，以从测定中去除了任何全长受体，所述专利的公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。PCT公开号WO2009/108637的图14B显示，截短型受体(例如，p95HER2)一旦与捕获抗体结合，那么就可以通过对全长受体(例如，HER2)的胞外结构域(ICD)特异的检测抗体检测。检测抗体可以与辣根过氧化物酶(HRP)直接缀合。然后进行酪胺信号扩增(TSA)，以产生待检测的信号。可以查询截短受体(例如，p95HER2)的表达水平或活化状态，以测定例如，其总浓度或其磷酸化状态、泛素化状态和/或络合状态。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于实施如上所述的双抗体测定法的试剂盒，包括：(a)限制在固体支持物上的一个或多个捕获抗体的稀释系列；和(b)一个或多个检测抗体(例如，不依赖活化状态的抗体和/或活化状态-依赖性抗体)。在一些实例中，试剂盒还可以含有使用试剂盒检测细胞如肿瘤细胞的一个或多个信号转导分子的表达水平和/或活化状态的方法的说明。就实施本发明的特定方法而言，试剂盒还可以含有上述任何另外的试剂，例如如信号扩增对的第一和第二成员、酪胺信号扩增试剂、洗涤缓冲液等。
V邻近双检测测定法
在一些实施方案中，用于在细胞如肿瘤细胞的细胞提取物中检测一种或多种目的分析物(例如，一种或多种信号转导分析如HER和/或c-Met信号通路的一种或多种组分)的表达和/或活化水平的测定法是具有优良的动态范围的多通道、高通量邻近(即，三抗体)测定法。作为非限制性实例，用于邻近测定法的三种抗体可以包括：(1)对特定的目的分析物特异的捕获抗体；和(2)对分析物的活化形式特异的检测抗体(即，活化状态-依赖性抗体)；和(3)检测分析物的总量的检测抗体(即，不依赖活化状态的抗体)。活化状态-依赖性抗体能检测例如分析物的磷酸化、泛素化和/或络合状态，而不依赖活化状态的抗体能检测分析物的总量(即，活化和非活化形式二者)。
在一个特定的实施方案中，用于检测目的分析物的活化水平或状态的邻近测定法包括：
(i)将细胞提取物与捕获抗体的一个或多个稀释系列孵育，以形成多个捕获的分析物；
(ii)将多个捕获的分析物与包含对相应的分析物特异的一个或多个不依赖活化状态的抗体和一个或多个活化状态-依赖性抗体的检测抗体孵育，以形成多个可检测的捕获分析物，
其中用促进部分标记不依赖活化状态的抗体，用信号扩增对的第一成员标记活化状态-依赖性抗体，并且促进部分产生通向并与信号扩增对的第一成员反应的氧化剂；
(iii)将多个可检测的捕获分析物与信号扩增对的第二成员孵育，以产生扩增的信号；和
(iv)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的扩增信号。
在另一个特定的实施方案中，用于检测目的分析物为截短型受体的活化水平或状态的邻近测定法包括：
(i)将细胞提取物与对全长受体的胞外结构域(ECD)结合区特异的多个珠子孵育；
(ii)从细胞提取物中去除多个珠子，从而去除全长受体，以形成没有全长受体的细胞提取物；
(iii)将没有全长受体的细胞提取物与对全长受体的胞内结构域(ICD)结合区特异的一个或多个捕获抗体孵育，以形成多个捕获的截短型受体；
(iv)将多个捕获的截短型受体与包含对全长受体的ICD结合区特异的一个或多个不依赖活化状态的抗体和一个或多个活化状态-依赖性抗体的检测抗体孵育，以形成多个可检测的捕获截短型受体，
其中用促进部分标记不依赖活化状态的抗体，用信号扩增对的第一成员标记活化状态-依赖性抗体，并且促进部分产生通向并与信号扩增对的第一成员反应的氧化剂；
(v)将多个可检测的捕获截短型受体与信号扩增对的第二成员孵育，以产生扩增的信号；和
(vi)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的扩增信号。
在某些优选的实施方案中，截短型受体是p95HER2，并且相应的全长受体是HER2。在某些其他实施方案中，对胞外结构域(ECD)结合区特异的多个珠子包含链霉亲和素-生物素对，其中生物素与珠子连接，并且生物素与抗体连接(例如，其中抗体是对全长受体的ECD结合区特异的)。
在备选的实施方案中，可以用促进部分标记活化状态-依赖性抗体，并且用信号扩增对的第一成员标记不依赖活化状态的抗体。
作为另一非限制性实例，用于邻近测定法的三种抗体包括：(1)对特定目的分析物特异的捕获抗体；(2)检测分析物的总量的第一检测抗体(即，第一不依赖活化状态的抗体)；和(3)检测分析物的总量的第二检测抗体(即，第二不依赖活化状态的抗体)。在优选的实施方案中，第一和第二不依赖活化状态的抗体识别分析物上不同的(例如，截然不同的)表位。
在一个特定的实施方案中，用于检测目的分析物的表达水平的邻近测定法包括：
(i)将细胞提取物与捕获抗体的一个或多个稀释系列孵育，以形成多个捕获的分析物；
(ii)将多个捕获的分析物与包含对相应的分析物特异的一个或多个第一和第二不依赖活化状态的抗体的检测抗体孵育，以形成多个可检测的捕获分析物，
其中用促进部分标记第一不依赖活化状态的抗体，用信号扩增对的第一成员标记第二不依赖活化状态的抗体，并且促进部分产生通向并与信号扩增对的第一成员反应的氧化剂；
(iii)将多个可检测的捕获分析物与信号扩增对的第二成员孵育，以产生扩增的信号；和
(iv)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的扩增信号。
在另一个特定的实施方案中，用于检测为截短型受体的目的分析物的表达水平的邻近测定法包括：
(i)将细胞提取物与对全长受体的胞外结构域(ECD)结合区特异的多个珠子孵育；
(ii)从细胞提取物中去除多个珠子，从而去除全长受体，以形成没有全长受体的细胞提取物；
(iii)将没有全长受体的细胞提取物与对全长受体的胞内结构域(ICD)结合区特异的一个或多个捕获抗体孵育，以形成多个捕获的截短型受体；
(iv)将多个捕获的截短型受体与包含对全长受体的ICD结合区特异的一个或多个第一和第二不依赖活化状态的抗体的检测抗体孵育，以形成多个可检测的捕获截短型受体，
其中用促进部分标记第一不依赖活化状态的抗体，用信号扩增对的第一成员标记第二不依赖活化状态的抗体，并且促进部分产生通向并与信号扩增对的第一成员反应的氧化剂；
(v)将多个可检测的捕获截短型受体与信号扩增对的第二成员孵育，以产生扩增的信号；和
(vi)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的扩增信号。
在某些实施方案中，截短型受体是p95HER2，并且全长受体是HER2。在某些其他实施方案中，对胞外结构域(ECD)结合区特异的多个珠子包含链霉亲和素-生物素对，其中生物素与珠子连接，并且生物素与抗体连接(例如，其中抗体是对全长受体的ECD结合区特异的)。
在备选的实施方案中，可以用信号扩增对的第一成员标记第一不依赖活化状态的抗体，并且可以用促进部分标记第二不依赖活化状态的抗体。
本文中所述的邻近测定法通常是基于抗体的阵列，其包含在不同可编址位置的固体支持物的表面偶联的具有一定范围的捕获抗体浓度的一种或多种不同捕获抗体。用于本发明的合适固体支持物的实例如上所述。
就分析物结合而言，优选地选择捕获抗体、不依赖活化状态的抗体和活化状态-依赖性抗体，以最小化它们之间的竞争(即，全部抗体可以同时结合其相应的信号转导分子)。
在一些实施方案中，用于检测一种或多种分析物的活化水平的不依赖活化状态的抗体或者，备选地，用于检测一种或多种分析物的表达水平的第一不依赖活化状态的抗体还包含可检测部分。在此类实例中，可检测部分的量与细胞提取物中一种或多种分析物的量相关。可检测部分的实例包括但不限于，荧光标记、化学反应性标记、酶标记、放射性标记等。优选地，可检测部分是荧光团如Alexa
Figure BDA0000429324590000491
染料(例如，Alexa
Figure BDA0000429324590000492
647)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM；罗丹明、德克萨斯红、四罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)、CyDyeTM氟(例如，Cy2、Cy3、Cy5)等。使用本领域熟知的方法，可以将可检测部分与不依赖活化状态的抗体直接或间接偶联。
在某些实例中，用促进部分直接标记用于检测一种或多种分析物的活化水平的不依赖活化状态的抗体或者，备选地，直接标记用于检测一种或多种分析物的表达水平的第一不依赖活化状态的抗体。使用本领域熟知的方法，可以将促进部分与不依赖活化状态的抗体偶联。用于本发明的合适的促进部分包括能产生通向(即，指向)并与促进部分邻近的(即，在空间上靠近或接近的)的另一分子反应(即，结合、连接或形成复合物)的氧化剂的任何分子。促进部分的实例包括但不限于，酶如葡萄糖氧化酶或催化涉及分子氧(O2)作为电子受体的氧化/还原反应的任意其他酶，以及光敏剂如亚甲蓝、玫瑰红、卟啉、方酸染料、酞菁等。氧化剂的非限制性实例包括过氧化氢(H2O2)、单态氧，以及在氧化/还原反应中转移氧原子或获得电子的任意其他化合物。优选地，在合适的底物(例如，葡萄糖、光等)存在的情况下，当两个部分相互邻近时，促进部分(例如，葡萄糖氧化酶、光敏剂等)产生通向并与信号扩增对的第一成员(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、受保护性基团保护的半抗原、通过硫醚键与酶抑制剂连接的失活的酶等)反应的氧化剂(例如，过氧化氢(H2O2)、单态氧等)。
在某些其他实例中，通过与不依赖活化状态的抗体缀合的寡核苷酸连接体和与促进部分缀合的互补寡核苷酸连接体之间的杂交，用促进部分间接标记用于检测一种或多种分析物的活化水平的不依赖活化状态的抗体或，备选地，间接标记用于检测一种或多种分析物的表达水平的第一不依赖活化状态的抗体。使用本领域熟知的方法，可以将寡核苷酸连接体与促进部分或者与不依赖活化状态的抗体偶联。在一些实施方案中，与促进部分缀合的寡核苷酸连接体和与不依赖活化状态的抗体缀合的寡核苷酸连接体具有100％的互补性。在其他实施方案中，例如，在严格杂交条件下杂交后，寡核苷酸连接体对包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个或6个以上错配区。本领域技术人员应当理解，可以将对不同分析物特异的不依赖活化状态的抗体与相同的寡核苷酸连接体或者与不同的寡核苷酸连接体缀合。
与促进部分或者与不依赖活化状态的抗体缀合的寡核苷酸连接体的长度是可以变化的。通常，连接体序列可以为至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个核苷酸长度。通常，产生用于偶联的随机核酸序列。作为非限制性实例，可以将寡核苷酸连接体的文库设计成具有三个不同的连续结构域：间隔区结构域；特征结构域；和缀合结构域。优选地，在不会破坏与其缀合的促进部分或不依赖活化状态的抗体的功能的情况下，设计可以有效偶联的寡核苷酸连接体。
可以设计寡核苷酸连接体序列，以防止或最小化在多种测试条件下的任何二级结构形成。通常仔细监测连接体内每一区段的熔解温度，以允许其参与整个测定方法。通常，连接体序列区段的熔解温度的范围在1-10℃之间。可以将用于在指定离子浓度下测定熔解温度、二级结构和发夹结构的计算机算法(例如，OLIGO6.0)用于分析每一连接体内三个不同结构域的每一个。还可以针对其结构特征，以及其与其他缀合的寡核苷酸连接体序列的兼容性，来分析整体组合的序列，例如它们在严格杂交条件下是否与互补的寡核苷酸连接体杂交。
寡核苷酸连接体的间隔区提供了缀合结构域与寡核苷酸交联位点的足够分离。缀合结构域的功能是通过核酸杂交，将用互补寡核苷酸连接体序列标记的分子与缀合结构域连接。可以在抗体-分析物(即，抗原)复合物形成之前或之后实施核酸-介导的杂交，条件是更灵活的测定格式。与许多直接抗体缀合方法不同，将相对小寡核苷酸与抗体或其他分子连接对抗体针对其靶分析物的特异亲和力或对缀合的分子的功能具有最小的影响。
在一些实施方案中，可以将寡核苷酸连接体的特征序列结构域用于复合的多通道蛋白质测定法。可以将多个抗体与具有不同特征序列的寡核苷酸连接体缀合。在多通道免疫测定法中，可以将用合适的探针标记的报告寡核苷酸序列用于检测多通道测定格式中抗体与其抗原之间的交叉-反应性。
使用几种不同的方法，可以将寡核苷酸连接体与抗体或其他分子缀合。例如，可以合成在5’或3’末端为巯基的寡核苷酸连接体。可以使用还原剂(例如，TCEP-HCl)去保护巯基，并且可以通过脱盐旋转柱纯化得到的连接体。可以使用异源双功能交叉连接体如SMCC，将得到的去保护的寡核苷酸连接体与抗体或者其他类型的蛋白质的伯胺缀合。备选地，可以用可溶于水的碳二亚胺EDC处理寡核苷酸上的5’-磷酸基，以形成磷酸酯，并随后与含胺的分子偶联。在某些实例中，3’-核糖残基上的二醇可以氧化成醛基，并然后使用还原性氨基化，与抗体或其他类型的蛋白质的胺基缀合。在某些其他实例中，可以合成在3’或5’末端用生物素修饰的寡核苷酸连接体，并与链霉亲和素标记的分子缀合。
可以使用本领域已知的多种技术，例如那些在Usman等人，J.Am.Chem.Soc.，109：7845(1987)；Scaringe等人，Nucl.Acids Res.，18：5433(1990)；Wincott等人，Nucl.Acids Res.，23：2677-2684(1995)；和Wincott等人，Methods Mol.Bio.，74：59(1997)中所述的技术合成寡核苷酸连接体。总之，使用常见的核酸保护和偶联基团，如二甲氧三苯甲基在5’-末端和亚磷酰胺在3’-末端进行寡核苷酸的合成。用于寡核苷酸合成的合适试剂、用于核酸去保护的方法，以及用于核酸纯化的方法是本领域技术人员已知的。
在某些实例中，用信号扩增对的第一成员直接标记用于检测一种或多种分析物的活化水平的活化状态-依赖性抗体或者，备选地，用于检测一种或多种分析物的表达水平的第二不依赖活化状态的抗体。使用本领域熟知的方法啊，可以将信号扩增对成员与活化状态-依赖性抗体偶联以检测活性水平或者与第二不依赖活化状态的抗体偶联以检测表达水平。在某些其他实例中，通过与活化状态-依赖性抗体或者第二不依赖活化状态的抗体缀合的结合对的第一成员和与信号扩增对的第一成员缀合的结合对的第二成员之间的结合，用信号扩增对的第一成员间接标记活化状态-依赖性抗体或第二不依赖活化状态的抗体。使用本领域熟知的方法，可以将结合对成员(例如，生物素/链霉亲和素)与信号扩增对成员或者与活化状态-依赖性抗体或第二不依赖活化状态的抗体偶联。信号扩增对成员的实例包括但不限于，过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、细胞色素c过氧化物酶、嗜酸细胞过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、脱碘酶等。信号扩增对成员的其他实例包括受保护基团保护的半抗原和通过硫醚与酶抑制剂连接而失活的酶。
在邻近通道(proximity channeling)的一个实例中，促进部分是葡萄糖氧化酶(GO)，并且信号扩增对的第一成员是辣根过氧化物酶(HRP)。当GO与底物如葡萄糖接触时，其产生氧化剂(即，过氧化氢(H2O2))。如果HRP在与GO邻近的通道内，那么由GO产生的H2O2将通向并与HRP复合，以形成HRP-H2O2复合物，在信号扩增对的第二成员(例如，化学发光底物如鲁米诺或异鲁米诺或者荧光底物如酪胺(例如，生物素-酪胺)、高香草酸或4-羟苯乙醇酸)存在的情况下，其产生扩增的信号。在邻近测定法中使用GO和HRP的方法描述于例如，Langry等人，U.S.Dept.of Energy Report No.UCRL-ID-136797(1999)中。当将生物素-酪胺用作为信号扩增对的第二成员时，HRP-H2O2复合物氧化酪胺，以产生共价结合附近的亲核残基的反应性酪胺自由基。可以直接地检测或基于信号检测试剂(例如如，链霉亲和素标记的荧光团或链霉亲和素标记的过氧化物酶和显色剂的组合)的添加检测活化的酪胺。适用于本发明的荧光团的实例包括但不限于，Alexa
Figure BDA0000429324590000521
染料(例如，Alexa
Figure BDA0000429324590000522
555)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM；罗丹明、德克萨斯红、四罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)、CyDyeTM氟(例如，Cy2、Cy3、Cy5)等。使用本领域熟知的方法，可以将链霉亲和素标记与荧光团或过氧化物酶直接或间接偶联。适用于本发明的显色剂的非限制性实例包括3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、3，3’-二氨基联苯胺(DAB)、2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、4-氯-1-萘酚(4CN)和/或还原卟啉。
在邻近通道的另一实例中，促进部分是光敏剂，并且信号扩增对的第一成员是具有用保护基团保护的多个半抗原标记的大分子，所述保护基团防止半抗原与特定结合配偶体(例如，配体、抗体等)结合。例如，信号扩增对成员可以是用保护性生物素、香豆素和/或荧光素分子标记的葡聚糖分子。合适的保护基团包括但不限于，苯氧基-、analino-、烯烃-、硫醚-和硒醚-保护基团。适用于本发明邻近测定法的其他光敏剂和保护性半抗原分子描述于美国专利号5,807,675中。当用光激发光敏剂时，其产生氧化剂(即，单态氧)。如果半抗原分子在与光敏剂邻近的通道内，那么由光敏剂产生的单态氧将通向并与半抗原的保护基团上的硫醚反应，以产生羰基(酮或醛)和亚磺酸，从半抗原中释放保护基团。然后，可将未保护的半抗原用于与信号扩增对的第二成员(例如，可以产生可检测信号的特异性结合配偶体)特异性结合。例如，当半抗原是生物素时，特异性结合配偶体可以是酶标记的链霉亲和素。示例性酶包括碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、HRP等。洗涤以去除未结合的试剂后，可以通过加入可检测的(例如，荧光的、化学发光的、显色的)酶的底物产生可检测信号，并使用本领域已知的合适方法和仪器检测。备选地，可以使用酪胺信号扩增来扩增可检测信号，并直接地检测或在加入如上所述的信号检测试剂后检测活化的酪胺。
又在邻近通道的另一实例中，促进部分是光敏剂，并且信号扩增对的第一成员是酶-抑制剂复合物。酶和抑制剂(例如，磷酸标记的葡聚糖)通过可切割的连接体(例如，硫醚)连接在一起。当用光激发光敏剂时，其产生氧化剂(即，单态氧)。如果酶-抑制剂复合物在与光敏剂邻近的通道内，那么由光敏剂产生的单态氧将通向并与可切割的连接体反应，从酶中释放抑制剂，从而活化酶。加入酶底物，以产生可检测的信号，或者备选地，加入扩增试剂，以产生扩增的信号。
在邻近通道的另一实例中，促进部分是HRP，信号扩增对的第一成员是如上所述的保护性半抗原或酶-抑制剂复合物，并且保护基团包含对烷氧基苯酚。苯二胺和H2O2的添加产生了反应性次苯基二亚胺，其通向受保护的半抗原或者酶-抑制剂复合物，并与对烷氧基苯酚保护基团反应，以产生暴露的半抗原或反应性酶。如上所述产生并检测扩增的信号(参见例如，美国专利号5,532,138和5,445,944)。
实施本文中所述的邻近测定法的示例性方法提供于PCT公开号WO2009/108637的实施例4中，所述专利的公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。
在另一个实施放哪中，本发明提供了实施如上所述的邻近测定法的试剂盒，包括：(a)限制在固体支持物上的捕获抗体的一个或多个稀释系列；和(b)一个或多个检测抗体(例如，不依赖活化状态的抗体和用于检测活性水平的活化状态-依赖性抗体的组合和/或用于检测表达水平的第一和第二不依赖活化状态的抗体的组合)。在一些实例中，试剂盒还可以含有使用试剂盒检测细胞如肿瘤细胞的一个或多个信号转导分子的表达水平和/或活化状态的方法的说明。就实施本发明的特定方法而言，试剂盒还可以含有上述任何另外的试剂，例如如信号扩增对的第一和第二成员、酪胺信号扩增试剂、促进部分的底物、洗涤缓冲液等。
VI.抗体的产生
几种方法可以实现商业不可得到的用于根据本发明在肿瘤细胞中分析信号转导分子的表达和活化水平的抗体的产生和选择。例如，一种方法是使用本领域已知的蛋白质表达和纯化方法来表达和/或纯化目的多肽(即，抗原)，而另一方法是使用本领域已知的固相肽合成方法合成目的多肽。参见例如，Guide to Protein Purification，Murray P.Deutcher编辑，Meth.Enzymol.，第182卷(1990)；Solid Phase PeptideSynthesis，Greg B.Fields编辑，Meth.Enzymol.第289卷(1997)；Kiso等人，Chem.Pharm.Bull.，38：1192-99(1990)；Mostafavi等人，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1：255-60，(1995)；和Fujiwara等人，Chem.Pharm.Bull.，44：1326-31(1996)。然后，可以将纯化或合成的多肽例如注射到小鼠或兔子中，以产生多克隆或单克隆抗体。本领域技术人员应当知道，可将许多方法用于抗体的产生，例如如在Antibodie，A Laboratory Manual，Harlow和Lane编辑，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)中所述。本领域技术人员还应当知道，还可以通过多种方法从遗传信息中制备模拟抗体(例如，保留抗体的功能结合区)的结合片段或Fab片段。参见例如，Antibody Engineering：A Practical Approach，Borrebaeck编辑，OxfordUniversity Press，Oxford(1995)；和Huse等人，J.Immunol.，149：3914-3920(1992)。
本领域技术人员应当知道，可以将许多方法用于产生抗体或结合片段，并筛选和选择多种目的多肽的亲和力和特异性，但这些方法不会改变本发明的范围。
多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体、其片段，以及纯化抗体的方法的更详细描述见于PCT公开号WO2010/132723中，所述专利的公开在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。
本领域技术人员应当知道，还可以将与抗体具有相似的功能的任何结合分子，例如对样品中一种或多种目的分析物特异的结合分子或结合配偶体用于本发明方法。合适的抗体样分子的实例包括但不限于，结构域抗体、unibody、纳米抗体、鲨鱼抗原反应性蛋白质、avimer、adnectin、anticalm、亲和力配体、多聚体、适配体、affibody、trinectin等。
VII.施用方法
根据本发明方法，通过本领域已知的任何便利方法，将本文中所述的抗癌药物施用给受试者。可将本发明方法用于预测抗癌药物或抗癌药物的组合在患胃肿瘤的受试者中的治疗有效性。还可将本发明方法用于预测胃肿瘤对用抗癌药物或抗癌药物的组合的治疗的应答。还可将本发明方法用于选择或鉴定用于治疗胃肿瘤的合适抗癌药物或抗癌药物的组合。通过给受试者施用cMET和HER1抑制剂的组合疗法，还可将本发明用于治疗患I期或II期胃癌的受试者。本领域技术人员应当知道，可以单独地或者作为与常规化疗、放疗、激素疗法、免疫疗法和/或手术组合的治疗方法的一部分，施用本文中所述的一种或多种抗癌药物。
在某些实施方案中，抗癌药物包括抗-信号传递基(即，细胞抑制药物)如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗-增殖剂；化疗剂(即，细胞毒性药物)；激素治疗剂；放疗剂；疫苗；和/或具有能降低或消除异常细胞如癌细胞的非受控性生长的能力的任何其他化合物。在一些实施方案中，用与至少一种化疗剂组合的一种或多种抗-信号传递剂、抗-增殖剂和/或激素治疗剂治疗受试者。上文描述了示例性单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、抗-增殖剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂和疫苗。
在一些实施方案中，可以将本文中所述的抗癌药物与常规免疫治疗剂共施用，包括但不限于，免疫刺激剂(例如，卡介苗(BCG)、左旋咪唑、白细胞介素-2、α-干扰素等)、免疫毒素(例如，抗-CD33单克隆抗体-加利车霉素缀合物、抗-CD22单克隆抗体-假单胞菌属(pseudomonas)外毒素缀合物等)，以及放射免疫性疗法(例如，与111In、90Y或131I缀合的抗-CD20单克隆抗体等)。
根据需要，可以将抗癌药物与合适的可药用赋形剂一起施用，并且可以通过可接受的施用模式实施。因此，施用可以例如为经口的、经口腔的、经舌下的、经牙龈的、经腭的、静脉内的、局部的、皮下的、经皮的、经皮肤的、肌肉内的、关节内的、胃肠外的、小动脉内的、真皮内的、心室内的、颅内的、腹膜内的、膀胱内的、鞘内的、瘤腔内的(intralesional)、鼻内的、直肠内的、阴道内的或者通过吸入。“共施用”意为在施用第二药物(例如，另一抗癌药物、用于降低与抗癌药物治疗相关的副作用的药物、放疗剂、激素治疗剂、免疫治疗剂等)的同时、刚好之前或者刚好之后施用抗癌药物。
可以重复地，例如至少2、3、4、5、6、7、8或多次施用抗癌药物的治疗有效量，或者可以通过连续灌注施用剂量。剂量可以采取固体、半固体、冻干的粉末的形式或者流体剂量形式，例如如片剂、丸剂、药粒、胶囊、粉末、溶液、悬浮液、乳剂、栓剂、保留灌肠、乳膏、软膏、洗液、凝胶、气溶胶、泡沫等，优选地以适合于简单施用精确剂量的单位剂量形式。
如本文中所用，术语“单位剂量形式”指适合作为人类受试者和其他哺乳动物的单位剂量的在物理上分离的单位，每一单位含有与合适的可药用赋形剂(例如，注射液)相关的、经计算可产生期望的攻击、耐受性和/或治疗作用的预定量的抗癌药物。此外，可以制备更高浓度的剂量形式，然后可以从中产生更多稀释的单位剂量形式。因此，更高浓度的剂量形式基本上含有例如多于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10次以上抗癌药物的量
用于制备此类剂量形式的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，MackPublishing Co.，Easton，PA(1990))。剂量形式通常包括常规的可药用运载体或赋形剂，并且可以另外地包括其他制剂、运载体、辅助剂、稀释剂、组织渗透增强剂、增溶剂等。通过本领域熟知的方法，可以将合适的赋形剂定做成特定的剂量形式和施用途径(参见例如，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，见上文)。
合适的赋形剂的实例包括但不限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、淀粉、金合欢树胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明教、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和聚丙烯酸如卡波姆，例如，卡波姆941，卡波姆980，卡波姆981，等。剂量形式可以另外地包含润滑剂如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂如甲基-、乙基-和丙基-羟基-苯酸盐(即，对羟基苯甲酸酯类)；pH调节剂如无机酸和有机酸和碱；甜味剂；和芳香剂。剂量形式还可以包含生物可分解的聚合珠子、葡聚糖和包含环糊精的复合物。
对于经口的施用，治疗有效剂量可以以片剂、胶囊、乳剂、悬浮液、溶液、糖浆、喷雾、锭剂、粉末和持续释放制剂的形式。用于经口施用的合适赋形剂包括可药用等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。
在一些实施方案中，治疗有效剂量可以采取丸剂、片剂或胶囊的形式，并因此，与抗癌药物一起的剂量形式可以含有以下任何：稀释剂如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等；崩解剂如淀粉及其衍生物；润滑剂如硬脂酸镁等；和结合剂如淀粉、金合欢树胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素及其衍生物。还可以将抗癌药物配制成配置在例如聚乙二醇(PEG)运载体中的栓剂。
可以通过在运载体例如如，生理盐水(例如，0.9％w/v氯化钠)、含水葡萄糖、甘油、乙醇等中溶解或者分散抗癌药物和任选地一种或多种可药用辅助剂，来制备流体剂量形式，以形成例如用于经口的、局部的或静脉内施用的溶液或悬浮液。还可以将抗癌药配制成保留灌肠。
对于局部施用，治疗有效剂量可以以乳剂、洗液、凝胶、泡沫、乳膏、凝胶剂、溶液、悬浮液、软膏和经皮敷料的形式。对于通过吸入的施用，可以通过喷雾器将抗癌药以干粉或液体形式递送。对于胃肠外的施用，治疗有效剂量可以以无菌的注射液和无菌包装的粉末的形式。优选地，在约4.5至约7.5的pH配制注射液。
还可以以冻干形式提供治疗有效剂量。此类剂量形式可以包括在施用之前重构的缓冲液，例如碳酸氢盐，或者缓冲液可以包括在例如用水重构的冻干剂量形式中。冻干剂量形式还可以包含合适的血管收缩剂，例如肾上腺素。可以在注射器中提供冻干剂量形式，任选地与用于重构的缓冲液组合包装，以使可以将重构的剂量形式立即施用给受试者。
在可以在定期的时间间隔监测受试者，以评估某些治疗方案的有效性。例如，基于用本文中所述的一种或多种抗癌药物治疗的治疗效果，可以改变某些信号转导分子的活化状态。可以监测受试者，以评估在个体化方法中某些药物或治疗的应答，并推定作用。此外，最初应答特定抗癌药物或抗癌药物的组合的受试者可能对药物或药物组合变得无感应，表明这些受试者已经产生了获得性药物抗性。可以中断这些受试者的当前疗法，并备选地根据本发明方法指定治疗。
VIII.实施例
提供了以下实施例来说明，而并非限制要求专利保护的本发明。
2010年7月15日提交的PCT公开号WO2011/008990(PCT/US2010/042182)和2012年1月19日提交的美国专利申请号13/354,257的实施例在此处出于全部目的以其整体引入作为参考。
实施例1.胃癌患者中多个信号通路蛋白质的功能谱
摘要
尽管胃切除术是胃癌(GCA)患者的唯一治愈性治疗，但治愈性手术后40～60％的高复发率仍是整体存活差的原因。为了进一步改善存活，存在鉴定用于辅助性放化疗后存活或复发的可靠分子预后标志物的急切需求，其可能导致患者-定制的治疗策略的研发。因此，我们使用多通道免疫微阵列平台，研发了用于信号转导通路蛋白质的功能谱的多通道免疫测定平台。在此，我们报道了GCA中HER1、HER2、HER3、cMET、PI3K和IGF1R的功能谱。
简介
由于预后差，转移性胃癌仍是医学肿瘤学家面临的治疗挑战。在许多胃癌病例中存在HER2扩增和/或过量表达。在胃癌的新治疗靶标的寻找中，曲妥珠单抗在具有HER2(+)的转移性GCA患者中显示出存活益处。然而，由于原发性或获得性抗性，HER2(+)患者通常并不应答曲妥珠单抗。在我们的研究中，为了调查用于抑制剂或制剂组合的合理选择的可靶向通路蛋白质的流行性，我们分析了信号转导通路中蛋白质的表达/活化水平。在此，为了给GCA中涉及HER2靶向制剂的未来临床试验铺设基础，我们报道了HER2、p95-HER2和其他具有针对HER2和其他平行通路的跨活性(transactivational)潜能的通路蛋白质的表达/活化谱。
方法
协同酶增强的反应免疫测定法(CEERTM)：将组织裂解物中存在的靶蛋白质与印模在硝酸纤维素表面上的特异性捕获抗体结合，并从载玻片中去除未结合的非-靶蛋白质。用葡萄糖氧化酶(GO)缀合的针对捕获的靶-蛋白质上备选表位的检测抗体之一与用HRP缀合的对靶-蛋白质或另一非重叠表位上的磷酸化位点特异的其他检测抗体之间的酶促相互作用导致了信号产生/扩增(参见，图1)。
载玻片印模：以连续稀释的方式，一式三份地印模每一特定靶蛋白质的捕获抗体。每一载玻片含有用于标准曲线产生的细胞系对照，其用于每次载玻片运行时，样品的准确定量。
临床样品：快速冰冻的胃癌组织来自具有局部的、组织学确认的GCA的患者(Samsung Medical Center)。在100μL裂解缓冲液中裂解快速冰冻的组织样品，并在随后的分析之前，将最终的裂解物储存于-80℃。
结果
尽管通过IHC，在该群组中7％的患者表达高水平的HER2(31/447)，但通过CEERTM测定法，大约12％的患者显示出显著水平的HER2表达。如图2中所示，在5.6％(25/447)的GCA患者中检测到了截短型HER2(或p95HER2)。在大约40％的患者中发现了不同水平的HER3表达。
在具有更低的HER2表达的样品中发现了更高水平的HER1。HER3-P水平显示出与HER3-T和PI3K活化高度相关。在该组群中，IGF1R的表达在大多数样品中相对更低。p95HER2水平在具有更高HER2表达的样品中是显著的，然而p95HER2活化的证据具有更广泛的分布。通常在具有cMET活化的患者中观察到HER1的共活化(参见，图3)。
结论
基于生物标志物的疾病特异性功能谱，可以优化复发或转移性GCA的治疗，导致患者-定制的治疗策略。在亚GCA中，组合地靶向HER1和cMET可以使具有共活化模式的患者受益。由于CEERTM甚至可以用有限量的组织进行，所以在治疗方案的过程期间，转导通路蛋白质改变的发生率可以指导临床医师设计更好的治疗策略，并支持改进或组合/顺次靶向治疗的临床研发。
实施例2.一组胃癌细胞系中通路蛋白质的综合谱
摘要
癌症护理中随着分子靶向疗法的到来，用于靶向药物的通路蛋白质谱是最重要的。然而，难以预测靶向方案中应答的原因之一可能是由于肿瘤信号转导通路中蛋白质异常改变的有限知识。对于临床医师和药物研发者而言，深入了解通路蛋白质的异常活化引起的肿瘤细胞的肿瘤表型的机制，以及靶向干扰如何导致的临床应答是共同的目标。在此，我们报道了综合的突变谱和通路蛋白质表达和/或活化(HER1、HER2、p95HER2、HER3、cMET、IGF1T、cKIT、Shc、PI3K、AKT、ERK、Src、FAK、PTEN和其他他信号蛋白质)，及其应答靶向药物治疗的调节。可将GCA亚型对多种抑制剂的抗性的机制用于设计合理的治疗选择，以及靶向药物选择、组合和/或排序。
简介
肿瘤样品的临床前细胞应答谱是新癌症治疗剂的研发中的基石。因此，我们应用协同酶增强的反应免疫测定法(CEERTM)多通道蛋白质微阵列系统在功能上描绘了已经完全表征了其遗传改变的30种GCA细胞系中的信号转导蛋白质。这些细胞系中遗传和功能通路特征的组合允许对各种不同的GCA亚分类，并提供了临床研究和药物研发的线路图。
方法
 方γ
CEERTM：组织裂解物中存在的靶蛋白质与硝酸纤维素表面上印模的特异性捕获抗体结合，并且从载玻片上去除未结合的非-靶蛋白质。用葡萄糖氧化酶(GO)缀合的针对捕获的靶-蛋白质上备选表位的检测抗体之一与用HRP缀合的对靶-蛋白质或另一非重叠表位上的磷酸化位点特异的其他检测抗体之间的酶促相互作用导致了信号产生/扩增(参见，图1)。
多药物作用分析：将～1X104个细胞接种在24-孔板中，并在合适的生长培养基中培养。将拉帕替尼、cMET抑制剂或者两种抑制剂(组合)以1μM浓度加入4小时并裂解用于随后的通路描绘。
结果
图4A显示30种GCA细胞系的综合表达/活化谱。图4B提供了SNU5细胞系通路谱的示例性微阵列图。图4C-G提供了细胞系SNU5(C)、SNU484(D)、SNU1(E)、MKN45(F)和KATOIII(G)及其药物处理后调解的基线通路谱的概括。用具有不同强度的突出显示区分活化的程度。
结论
基于生物标志物的疾病特异性功能谱，可以优化复发或转移性GCA的治疗，导致患者-定制的治疗策略。此外，通过需要有限量的肿瘤样品(例如，FNA、CTC等)的CEERTM平台可容易测定的治疗期间转导通路蛋白质改变的发生率可以更好地指导临床医师组合或排序合适的制剂。
实施例3.鉴定胃癌中同时活化的通路的酪氨酸磷酸化谱
本实施例中显示的研究表明，基于在该癌症类型中活化的关键生长因子受体信号通路的磷酸化谱，可以对胃癌分类。
概述
目前，曲妥珠单抗是在～20％的转移性胃癌中有益的唯一已知的靶向疗法。在这些异质性癌症中活化的RTK的增加理解可以显著地提高靶向治疗的研发；然而，其受到我们不能查询临床样本中的磷酸化网络的阻碍。使用新的免疫测定法CEERTM，我们第一次证明了晚期胃癌中截短型HER2变体的存在。我们还证明了影响复发胃癌的无病存活时间的伴随性活化的RTK的存在。活化的RTK的分级聚类显示了胃癌中表达活化的HER1：c-MET、HER2：HER3和IGF1R-PI3K的样品的共聚类。在细胞和原发性肿瘤细胞的体外研究中显示，差异调节的RTK模式可以指导治疗靶向。总之，我们的研究强烈涉及胃癌的药物研发和治疗监测。
重要性
除HER2(+)癌症亚集外，由于缺少指导有效治疗方法的分子标志物，对于大多数晚期胃癌而言，还不存在全世界都接受的治疗共识。在本文中，使用新的临床诊断测定法，我们在434例晚期胃癌样品、罕见CTC和来源于腹水的肿瘤中显示了证据，即伴随性活化的RTK区别了胃癌的不同亚集。差异RTK活化模式与术后无病存活相关。直接对临床组织进行靶向磷酸化分析的分支(Ramification)是显著的，包括改进我们对胃癌亚型的独特分子驱动者的理解、帮助鉴定新的预后标志物、治疗范式，以及在药物施用后纵向监测治疗应答或疾病进程。
简介
随着肿瘤学领域中分子靶向疗法时代的到来，许多肿瘤学家已经对在否则将已经进行支持性治疗的难治性、转移癌症患者中的分子靶向制剂经历了意料外的和戏剧性的回应。然而，目前靶向治疗的患者选择标准还不完善。即使基于其靶标谱选择患者，通常不会对靶向制剂产生应答，或者在具有显著的初次应答后产生抗性。阻碍靶向制剂的治疗性益处增强的主要问题包括：(1)患者亚组中伴随性的和冗余性通路活化；(2)由于通过通路交叉对话，绕过最初靶向的蛋白质的备选信号传导事件的活化，产生了抗性；(3)在抗癌治疗过程期间，由于癌症转移或发展，分子和病理学特征的改变；(4)治疗期间或之后，再次活组织检查的有限利用度；和(5)针对靶向制剂的以鉴定解决“发展中的”疾病的可能药物抗性机制的指南(companion)诊断的局限性。
大约一半人类激酶组(kinome)的酪氨酸激酶组分(complement)都涉及人类癌症，并提供了癌症治疗的靶标，以及患者选择的生物标志物(Blume-Jensen和Hunte，2001；Hochgrafe等人，2010)。然而，以前的研究显示，在几种癌症如多形性成胶质细胞瘤(Stommel等人，2007)、乳腺癌(Hochgrafe等人，2010；Liu等人，2011；Xu等人，2011)、肺癌(Engelman和Janne，2008；Engelman和Settleman，2008)、头颈癌(Xu等人，2011)和胃癌(Liu等人，2011)的亚集中显示出受体酪氨酸激酶(RTK)的共活化。我们已经研发了基于邻近的免疫测定法，协同酶增强的反应免疫测定法(CEERTM，如图5中所示)，其利用独特的免疫复合物的形成，所述独特的免疫复合物的形成需要两种检测酶缀合的抗体的共定位，条件是在微阵列上捕获了靶蛋白质。该测定法格式使得我们可以在单细胞水平以非常敏感的方式(约100介摩级(zeptomole)的敏感性)描绘RTK和下游通路蛋白质表达和活化，并因此适合于多通道分析具有伴随性通路活化(或活化可能)的冗余性通路。
胃癌是世界范围内癌症死亡的主要原因，具有每年18.9/100,000的发生率和每年14.7/100,000的死亡率(Cunningham等人，2005)，并且其是韩国最常见的恶性肿瘤(Bae和Park，2002)。由于较差的预后，转移性胃癌对于医学肿瘤学家而言，仍是治疗挑战。当前，曲妥珠单抗是在随机III期试验中证实对胃癌有效的唯一活性靶向制剂(Bang等人，2010)。胃癌中其他已知活化的通路蛋白质包括人上皮生长因子受体(HER)家族、间质上皮转化因子或肝细胞生长因子(HGF)受体(cMET)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，以及胰岛素样因子1受体(IGF1R)。因此，我们使用多通道CEERTM平台测定了434例新鲜冰冷的胃癌组织中活化的RTK的水平，并期望将胃癌患者分类成可能的亚组(HER1、HER2、HER2的截短型变体、p95HER2、HER3、cMET、PI3K和IGF1R)。基于其通路蛋白质活化模式，我们在肿瘤的亚组中观察到多个信号蛋白质活化，并且我们假设冗余性通路活化输入会导致剩余的下游信号传导，因此限制靶向单个RTK的单一疗法的抗肿瘤有效性。我们进行了原理实验的验证，以研究cMET和HER共活化的胃癌细胞系中HER1/2抑制剂+cMET抑制剂的抗肿瘤效果。最终，我们研发了可能的强有力工具，其使用循环肿瘤细胞和分离自腹膜液(腹水)的恶性细胞，能使临床医师可以在治疗期间监测RTK活化谱的基线和发展改变。总之，我们的研究提供了在胃癌人组织中伴随性RTK活化的证据，并且我们建立了在治疗和进程期间随着癌症发展监测RTK活化的临床工具。
结果
患者特征
表1中提供了分析中包括的434例患者的特征。全部患者都接受了具有D2淋巴结清扫术的胃切除术。在434例患者中，242(55.8％)例患者接受了具有D2淋巴结清扫术的胃次全切除术。根据AJCC2002分期系统，86例患者具有病理学I期、116例具有II期、126例具有III期，并且106例具有IV期(35例患者具有转移性M1)。在分析时，226例患者已经死亡，并且237例患者已经记录了复发。对于病理学，70名患者具有印戒细胞癌。5年整体存活率为52.4％，并且5年无病存活率为50.0％。在手术时获得了全部原发性胃癌组织，并立即迅速冰冻，用于将来的分子分析。
表1：胃癌临床样品集的患者特征
Figure BDA0000429324590000661
Figure BDA0000429324590000671
胃癌表达HER2及其截短变体，p95HER2
与化疗组合的HER2靶向抗体，曲妥珠单抗的优良有效性为在胃癌中进行分子靶向疗法铺平了道路。然而，并非通过免疫组织化学和原位荧光杂交选择的全部表达HER2的胃癌患者都对该治疗应答，突出了对更多预测性生物标志物的需求。我们对HER2进行了深入的分析，包括其在获自434例患者的胃癌样本中的活化状态。
通过标准IHC Hercep测试，然后通过FISH分析那些具有2+IHC得分的组织，测定了我们的胃癌样品群组的HER2状态。在我们的研究中，除了通过FISH测定HER2基因扩增外，将HER2阳性(HER2(+))样品定义为具有3+或2+的HER2-IHC得分的样品。HER2阴性(HER2(-))样品包括没有HER2基因扩增的具有2+HER2-IHC得分的样本或者具有1+/0HER2-IHC得分的样品。基于这些对胃癌特异的定义(Hofmann等人，2008)，通过免疫组织化学和/或FISH，在我们的患者群组中，将434例患者中的50例(11.5％)确定为HER2(+)(表2)。与其他报道(Grabsch等人，2010；Hofmann等人，2008；Tanner等人，2005)一致，与扩散型或混合型胃癌比较，Lauren组织型中HER2表达不同，并且在肠型胃癌中观察到了更高数量的HER2(+)样品(36/50(72％))。值得注意的是，大多数‘HER2阴性’样品仍表达总HER2，虽然以比HER2阳性患者群明显更低的水平(图6A)。当使用对乳腺癌HER2-IHC特异的IHC准则再次分析HER2(+)胃癌样品的HER2表达时，78％(39/50)仍为3+或2+，但剩余22％(11/50)得分为1+(表2)。
由于免疫组织化学和FISH技术没有提供HER2活化状态的读数，并且可能会丢失低HER2表达，我们接下来在该患者样品集中，使用基于免疫微阵列的CEERTM测定法分析了总的和磷酸化HER2蛋白质的表达水平(Kim等人，2011)(图5)。我们以前已经研发了将在CEERTM测定法中获得的RFU值转变成计算单位(CU)(基于具有已知的HER2表达和活化的细胞系对照的标准功能单位)的算法(Kim等人，2011)。如所预期，如图6A中所示，在IHC/FISH HER2(+)肿瘤中比在HER2(-)肿瘤中，通过CEERTM观察到了基本上更高的HER2表达水平(具有77.9CU对比4.3CU的平均值，p-值8.18E-10)。此外，在HER2(+)肿瘤群体内，CEERTM显示出显著水平的HER2表达的不均匀性，一种由于HER2细胞分布模式的集中或“克隆(clonal)”特性，在胃癌中经常报道的特性(Hofmann等人，2008)。这也造成在IHC和FISH对HER2的结果读出之间仅中等程度的一致性(ToGA试验，87.5％)，导致了研发用于胃癌的HER2诊断的复杂性。在我们的分析中，64％(32/50)的IHC/FISH HER2(+)癌症通过CEERTM也显示出HER2表达。有趣地，～20％的HER2(-)癌症通过CEERTM也是HER2表达阳性。重要地，我们以前已经通过IHC和CEERTM在293例乳腺癌患者中比较了HER2表达，其最初显示出83％的一致性(图7)，然而基于用HER2蛋白印迹(WB)的表达调整的IHC读数，CEERTM和经WB调整的IHC之间的比较显示出96％的一致性(Kim等人，2011)。
我们探测了胃癌中交替的HER2变体的存在。在70-80％的HER2过量表达的乳腺癌中，曲妥珠单抗抗性的一个重要机制是缺少胞外结合曲妥珠单抗的结构域的HER2受体的截短型，p95HER2的积累(Scaltriti等人，2007)。我们研发了高度敏感的和特异的基于CEERTM的测定法，以特异性分析胃癌中的总p95HER2。这通过在免疫磁珠耗竭全长HER2后，在截短型HER2变体富集的肿瘤组织裂解物中使用三抗体介导的免疫微测定法平台实现(图8)。总p95HER2测定法读数与产生自使用来自BT474乳腺癌细胞系的对照细胞裂解物产生的标准曲线的信号相关。使用基于CEERTM的p95HER2测定法平台，除全长HER2之外，可以在胃癌中第一次特异性检测HER2的截短型形式。在来自如通过CEERTM检测，显示出显著的全长HER2表达的HER2(+)组(31个样品)和HER2(-)组(27个样品)的肿瘤样品亚集中分析了p95HER2表达。由于技术问题，不能准确分析HER2(-)组中的一个样品。p95HER2在我们的胃癌患者组群中的发生率为HER2(+)样本中大约77％(24/31)。与全长HER2表达相似，在肠型胃癌中观察到了大多数截短型HER2表达(HER2(+)中79％表达p95HER2)。在通过IHC/FISH为HER2(-)，但显示出显著的基于CEERTM的HER2表达的小百分比肿瘤(2.6％或总的来说10/384)中也检测了p95HER2表达。这包含了～37％(10/27)分析了p95HER2的HER2(-)的亚集。然而，在HER2(+)胃癌样品中p95HER2的平均表达比在HER2(-)样品中观察到的p95HER2的平均表达显著更高(HER2(+)的5083.6CU对比HER2(-)中的437.0CU，p-值＝1.27e-05)。将每20μg分析组织500CU的截断值用于评分p95HER2阳性(如图6B中所示)。总之，我们数据显示，综合分析全长和截短型HER2表达二者为在胃癌中进一步研发靶向HER2的策略提供了重要价值。
胃癌中通路活化谱的不均匀性：共活化的信号通路
在测定了HER2及其截短同种型在胃癌中的存在后，我们探测了为药物靶标的几种信号传递分子的总的和磷酸化(活化)形式的存在。这些包括HER激酶轴的RTK成员(HER1、HER2和HER3)、c-MET、IGF1R和PI3K。图9A中显示了多通道CEERTM通路阵列的代表性图。在我们研究组中，在来自202例患者(46.5％)的肿瘤中没有可检测的在我们研究组中测试的RTK的活化。相反，如在通路聚类分析中所示(图9B)，剩下患者的通路活化模式在一些胃癌中广泛不同，表明了多种RTK如HER2/HER3、HER1/2/3、HER1/3/c-MET或HER3/c-MET的伴随性活化，而其他仅在单个蛋白质上磷酸化。基于其组织学检测，全部分析样品的肿瘤含量为至少70％。然而，角蛋白表达明显不同，表明了胃癌的上皮含量的不均匀性。基于该图谱，我们根据其RTK活化特征和HER2状态分类了434例胃癌样品组群。
胃癌中的HER轴(表3)：在我们分析的全部RTK中，我们发现，在我们的数据集中，在41％的胃癌样品中，HER轴的至少一个受体成员是活化的。大约66％的HER2(+)和～38％的HER2(-)癌症表现出HER激酶受体成员的活化。此外，具有活化的HER激酶受体的～36％的样品并不表现出c-MET或IGF1R通路的伴随性活化。与HER2(-)癌症(分别在～22％和～24％的样品中是活化的)比较，HER2和HER3在HER2(+)胃癌患者中的磷酸化百分比更高(50％和36％)。对于HER2阳性癌症，磷酸化HER1并不表现出该优先性，并且在HER2阳性和阴性胃癌二者中是活化相当的(HER2(+)中为26％和在HER2(-)中为25％)。在组织学上，大多数HER2阳性、肠型胃癌表达活化的HER2(22/36或～61％)，然后是HER3(13/36或～36％)，具有整体上36％的肠型胃癌表达活化的HER2通路。总之，与扩散型癌症(19.1％)比较，在肠型(35.7％)和混合型(33.3％)癌症中HER2活化更集中。相反，在大多数肠型(24.7％)和扩散型(25.8％)胃癌中观察到了活化的HER1。在全部三种胃癌组织型中，活化的HER2表达相当。
由于HER激酶轴的信号传递功能依赖于活化的受体二聚化，所以我们观察了不同对的活化的HER成员。在HER2阳性癌症中优选地是HER2和HER3的共活化(13/50或26％)，其中7/13HER2：HER3活化的样品不存在HER1共活化。另一方面，HER2阴性胃癌并不表现出任何特异性HER激酶二聚体对的优先性，其中在～15％的每一HER2(-)样品中表达全部三种可能的活化二聚体对(HER1：HER2、HER1：HER3和HER2：HER3)。在11.5％具有相似的HER2(+)和HER2(-)癌症分布的胃癌中，观察到了HER1/2/3受体的三重活化。
就样品中p95HER2表达而言，我们还观察了活化的HER轴受体成员的状态。与活化的HER1(在5/24或～21％的p95HER2(+)、HER2(+)中表达)或活化的HER3(在9/24或～37％的p95HER2(+)、HER2(+)中表达)比较，p95HER2(+)、HER2(+)胃癌具有活化全长HER2的偏好(在16/24或～67％的p95HER2(+)、HER2(+)中表达)。然而，p95HER2(+)、HER2(-)胃癌没有该优先性，其中50％(5/10)的p95HER2(+)、HER2(-)样品表明了全部三种HER激酶轴受体成员的活化。
c-MET活化的胃癌(表4)：与HER1相似，在HER2(+)(22％)和HER2(-)(25％)胃癌之间c-MET的磷酸化分布相当。此外，基于Lauren组织型的活化c-MET分布在肠型(31.2％)和扩散型(24.4％)胃癌中相似。没有混合型胃癌表明在我们样品集中存在活化的c-MET。
大多数c-MET活化的胃癌样品(～71％或77/108)表现出HER激酶受体成员的伴随性活化。因此，我们进一步研究了在胃癌中与c-MET通路交叉对话的优选的HER轴受体。分别在5/24和1/10表达p95HER2的HER2(+)和HER2(-)样品中共存在活化的c-MET和p95HER2表达。在整体上，与HER2(10.1％)或HER3(9.7％)比较，c-MET优先地与HER1共活化(66/434或15.2％)。在HER2(-)胃癌中观察到了相同的趋势，其中15.4％的癌症显示出c-MET-HER1共活化。事实上，13/66具有c-MET-HER1共活化的胃癌并不显示出HER2或HER3的共活化。这些观察表明，在胃癌中c-MET和HER1信号传递通路之间可能具有交叉对话。c-MET活化从不与HER3活化共存在，除非HER1和/或HER2在同一样品中也磷酸化。大约7％的胃癌样品显示出全部三种HER轴受体成员与c-MET的共活化。
IGFIR活化的胃癌(表5)：与HER3活化相似，与HER2(-)癌症(24.5％)比较，由IGF1受体驱动的信号传递通路在更高百分比的HER2(+)癌症(30％)中是活化的。此外，如用磷酸化HER3所观察，活化的IGF1R在这三种组织型胃癌亚集之间是分布相当的；即26％的肠型癌症，24％的扩散型胃癌和28％的混合型胃癌。这种分布致使我们研究在我们的样品集中是否存在IGF1R-HER3共活化。IGF1R的确与磷酸-HER3最大程度地共活化(特别是在HER2(+)癌症中)，其中22％或11/50HER2(+)样品显示出IGF1R-HER3共活化。然而，在HER2(-)癌症中，IGF1R与HER3共活化的百分比(51/384个样品或13.8％)与IGF1R与HER1共活化(53/384个样品或13.3％)相似。IGF1R：HER2共活化紧随其后(45/384个样品或11.7％)。在整体上，34/434胃癌样品显示出HER激酶轴的全部成员与IGF1R的共活化，其中28例样品还显示出c-MET共活化。然而，在HER激酶受体成员共活化不存在的情况下，c-MET极少与IGF1R共活化。此外，c-MET：IGF1R共活化主要在HER2(-)胃癌中观察到。极少p95HER2(+)样品显示出IGF1R活化(7/24个HER2(+)样品和3/10个HER2(-)样品)。
在该研究中，基于6个评价标志物的基于十分位数(decile-based)的活化谱，将胃癌样品聚类成热图(heatmap)。进行聚类分析，以证实胃癌中前述RTK活化相关模式(图9B)。分析显示，在我们的样品集中c-MET：pHER1、pHER2：pHER3和IGF1R：PI3K活化模式与c-MET-pHER1聚类形成的不同亚集密切相关。这与我们以前观察的RTK共活化模式一致。这些分析的RTK的剩余下游信号传递通路如PI3K的进一步分析显示，在未选择的胃癌群体中，最大限度地观察到了PI3K活性与IGF1R共活化(77/108个样品或71.3％)，然后是HER3共活化(71/108个样品或65.7％)。这与聚类分析一致，并且报道的研究进一步增强了CEERTM测定法的有效性。
总之，磷酸化HER激酶轴受体成员、c-MET和IGF1R的综合分析显示，就分析的RTK的活性而言，胃癌是显著不均匀的，并且事实上，基于其RTK活化谱，可以分成不同的亚型。此外，在胃癌中，伴随性信号传递通路是高度普遍的，而不是任何一种信号。该分子分类可以帮助指导胃癌亚型的预后和治疗研究。
基于与术后无病存活相关的基于CEERTM的通路活化谱的样品分离
我们研究了基于CEERTM的磷酸化谱对胃癌临床预后的影响。基于在手术时获得的肿瘤样品的信号传递通路活化谱，在将患者分成组别后，分析了治愈性手术后的患者的无病存活。最初，我们分析了具有HER2(+)肿瘤的患者与具有HER2(-)肿瘤的患者之间的无病存活差异。HER2(+)肿瘤大多数都是肠型组织型，其明确应答抗-HER2疗法。因此，我们研究了HER2(+)肿瘤的复发时间是否不同于HER2(-)胃癌的复发时间。然而，没有观察到差异，甚至在将样品根据其肿瘤分期调整之后。如直觉所预期，胃癌患者(HER2(+)和HER2(-)肿瘤二者)的中位数无病存活时间随着肿瘤分期的增加(I期至IV期)逐渐降低。
在我们的研究中，因为只有HER2(+)和HER2(-)胃癌二者的亚集显示出所分析的RTK的活化，我们推理，活化的RTK可能会影响这些肿瘤的进程。因此，如通过CEERTM测定法所测定，我们分析了没有RTK活化的患者相对于具有≥1RTK活化的患者之间的存活差异。在两组间没有观察到存活的显著差异，直到将肿瘤分期也考虑进去。由于具有I期疾病的GCA患者极大地受益于治愈性手术切除，而具有IV期疾病的患者受限于姑息治疗选择，所以我们研究了RTK活化的程度是否对具有II和III期疾病的患者的临床结果具有任何影响。一旦基于其肿瘤分期分类样品，明显的是，具有≥1RTK活化的II和III期患者比所分析的RTK都未活化的那些患者显示出更差的无进展存活。具有II+III期和≥1RTK活化的肿瘤的患者的中位数存活时间比具有0RTK活化的那些患者显著更低(图10A；II+III期肿瘤：对于≥1RTK活化的而言为32.63个月对比对于0RTK活化的而言为76.53个月(p＝0.0318，危险比＝0.69))。在仅HER2(-)的样品中也维持了中位数存活时间的显著差异(图10B；II+III期肿瘤：对于≥1RTK活化的而言为30.10个月对比对于0RTK活化的而言为68.13个月(p＝0.0190，危险比＝0.64))。这些数据明确表明，在该研究中分析的RTK以多种组合影响了胃癌的无病存活。该分析中的重要观察是，RTK的活化状态，而非简单的表达状态对治愈性手术后患者的无病存活有影响。如从图9A中显而易见，许多胃癌样品都高水平表达多种RTK，然而，在大多数样品中，仅一个亚集或者那些RTK都没有磷酸化。对于存活分析，仅分析了具有显著的RTK活化的样品。
为了探测各个RTK对无进展存活的贡献，我们集中于HER1和c-MET活化的胃癌样品。集中于这些RTK的原因有几点。c-MET是在大批胃癌中扩增的基因；然而，在这些癌症中，单一制剂抗-MET抑制剂不能显示出临床益处(Jhawer等人，2008)。其他人报道了c-MET和HER1组合疗法在胃癌的临床前模型中的更优有效性(Corso等人，2010)。在我们自己的基于CEERTM的胃癌临床样本分析中，我们观察到了HER1和c-MET的共活化，包括此类样品的共聚类。这表明，p-HER1：p-cMET共表达胃癌的整体信号特征可能明显地不同于表达p-cMET而无活化的HER1的样品。我们比较了p-HER1(-)：p-cMET(+)和p-HER1(+)：p-cMET(+)样品集的无进展存活。在全部胃癌样品集中，这些组群的中位数存活时间存在显著差异(图11；p-HER1(+)：p-cMET(+)的46.17个月对比p-HER1(-)：p-cMET(+)的82.80个月(p＝0.0184，危险比＝0.51)。在只有HER2(-)的样品中观察到了相似的结果(图10C)。随后，在肿瘤分期调整的HER2(-)样品集中分析了p-HER1(-)：p-cMET(+)和p-HER1(+)：p-cMET(+)组群。尽管对于具有不同RTK活化状态的患者而言，I期胃癌在术后无病存活方面没有显示出显著的差异，但p-cMET(+)I期胃癌与HER1活化亚型显示出了显著差异。当与仅具有cMET活化的I期患者比较时，cMET和HER1的共活化显示出更差的无病存活(图10D)。我们的数据强烈表明，p-HER1(+)：p-cMET(+)胃癌样品具有更差的预后，并且存在以分期特异性方式测定信号传递通路特征的价值，以确定此类患者的治疗选择。基于通路活化状态，需要进一步表征具有I期疾病的胃癌患者，以鉴定在手术后更有效的辅助治疗的候选者。
基于胃癌模型系统中RTK谱来指导治疗靶向
使用CEERTM测定法，基于其RTK活化谱，我们分类了>16种胃癌细胞系，并且数据与在胃癌组织中观察到的数据一致(Hoe等人，2011)。数据表示为几种此类模型。鉴定到MET-扩增的胃癌细胞，SNU5和SNU484共表达明显水平的HER1和c-MET蛋白质。然而如前所述，磷酸化谱显示，在这些细胞中除pMET外，pHER1和pHER2的表达存在于胃癌临床样本的亚集中。熟知为HER2扩增胃癌细胞的NCI-87(N87)细胞在分析的磷酸-RTK组中仅显示出pHER2的表达。如图12中所示，FGFR2-扩增的KATO III细胞显示出低水平的pHER1、pHER2、pHER3和pMET蛋白质。
基于在胃癌患者的亚集中也观察到的，在胃癌模型系统中存在的不均匀性RTK活化模式的观察，我们推断可有希望将该信息用于胃癌中的直接治疗决定。因此，我们使用双-HER1/2酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、拉帕替尼和MET抑制剂、PHA-665,752和foretinib进行了“概念证明”实验。如图12中所示，拉帕替尼在NCI-87细胞中消除了HER2活化，而没有改变总HER2水平，但在MET-扩增的SNU5或SNU484细胞中却不能如此。在另一方面，MET抑制剂取消了SNU5和SNU484细胞中的pMET。有趣地，用MET抑制剂的MET扩增细胞中也部分阻断了pHER1和pHER2，但在并不表现出任何显著的MET活性的NCI-87细胞中却不会。这表明，MET和HER激酶信号传递通路可能在MET扩增的胃癌中是联系的。此外，在MET扩增的SNU5和SNU484细胞中，用拉帕替尼和foretinib组合处理4小时完全阻断了HER激酶和MET激酶活性，包括那些下游信号传递效应子，PI3K和Shc。这表明，在此类胃癌中，组合治疗方法可能更有用。
为了检测通路抑制对癌细胞生长抑制的表型影响，我们使用各个治疗剂处理进行了细胞毒性测定法。与RTK谱数据一致，在c-MET扩增的SNU5细胞中，拉帕替尼的IC50为>1.0μM/L，而对于PHA665,752的0.058μM/L，其几乎低了两个数量级。然而，拉帕替尼+PHA665,752组合的IC50甚至更低，为0.018μM/L，其与用组合处理HER激酶和MET信号传递通路的最大阻断一致(p＝0.01)。这些实验表明，与单制剂疗法对照，HER和MET激酶的组合抑制可能更有益于这种类型的胃癌。相反，在靶向治疗剂存在的情况下显示出信号传递通路的不完全抑制的KATO III细胞，在用单或组合药物处理二者的情况下，表现出最小的细胞生长抑制(IC50>1.0μM/L)。总之，在临床前模型中的这些研究显示，CEERTM平台可以在胃癌中同时查询多个RTK活化的状态，因此可用于选择和监测治疗结果。
探查CTC和ATC用于胃癌患者中研究RTK谱的用途
如在胃癌临床前模型中所示，可以将通过CEERTM技术测定的RTK活化的模式用于指导治疗决定和监测治疗应答。然而，在临床上，监测分子改变的随访肿瘤活组织检查并非总是可得到的。因此，我们使用更容易得到的循环肿瘤细胞(CTC)和腹水肿瘤细胞(ATC)建立了RTK评价平台。如通过CEERTM测定法发现的CK的不同水平所示，每一患者的CTC数量是广泛变化的，并且来自4例此类患者的结果显示于图13A中。尽管仅显示了HER1和HER2表达和活化，我们在分离自转移性胃癌患者的CTC中观察到了其他RTK活化的不均匀性模式。此外，我们已经从腹水(胃癌中非侵袭性癌细胞的另一来源)中分离了恶性细胞。在导出的100mL腹水中，发现了比7.5ml血液中CTC的一般产量高几个数量级的肿瘤细胞(>1×103至1×104)。在分离自胃癌患者的ATC中也发现了如在胃癌CTC中所观察到的不均匀性RTK活化模式。
接下来，我们测定了这些肿瘤细胞(CTC和ATC)中的信号传递通路是否会应答配体和/或药物干扰。就CTC/ATC中信号传递通路的功能性和药物应答性而言，这可以潜在地提供指示原位癌症的有价值信息。用拉帕替尼和c-MET抑制剂的组合处理后，在分离自胃癌患者的CTC中观察到了磷酸化HER1、HER2和c-MET的剂量依赖性抑制。
图13B中显示了代表性实例。在该特定的CTC集合中，我们还观察到了抑制剂处理后IGF1R的伴随性活化。目前，该现象的精确机制，以及其是否在胃癌中发生还是未知。随后，在37℃，在拉帕替尼和PHA-665,752混合物存在或不存在的情况下，用生长因子(EGF、HRG、HGF和IGF1)的混合物处理EpCAM-阳性ATC4小时。在几种不同的ATC分离物中测试了平台。图13C-E显示了分离自表现出不同活化通路的三种不同胃癌患者的ATC的代表性实例。在全部三种集合的ATC中观察到了p-HER1、p-HER2以及p-cMET的显著水平，表明拉帕替尼和PHA-665,752的组合可以有益于这些特定的患者。事实上，即使程度不同，靶向治疗剂的组合能降低这3种靶标的磷酸化。这种药物组合是否能在实际上转变成此类患者的临床益处还有待观察。然而，ATC中其他活化的RTK谱表明在不受抑制剂混合物有效抑制的一些样品中，HER3和IGF1R也不同水平地活化。可能的是，活化的RTK可以影响测试治疗剂的结果。事实上，用抑制剂治疗一例患者(005-116)显示出p-IGF1R的增加。相似地，配体和药物处理后，就其活化和抑制谱而言，活化的RTK下游信号传递分子(PI3K、SHC、Erk和AKT)的分析显示出不均匀性。我们的数据明确显示了用于在胃癌患者中治疗剂处理之前和之后评价信号传递通路的非侵入性平台。
讨论
在该研究中，我们提供了基于在该癌症类型中活化的关键生长因子受体信号传递通路的磷酸化谱分离胃癌的证据。就复发和对化疗的应答而言，胃癌是极其不均匀性的疾病，具有各种不同的预后。不均匀性表现在几个水平，包括组织病理学的(Lauren，1965)、解剖学的(Blot等人，1991；Crew和Neugut，2006)和流行病学的(Carneiro等人，2004；Correa等人，1990；Uemura等人，2001；You等人，1993)差别。基于其基因表达特征，最近的尝试开始进一步分类胃癌(Ooi等人，2009；Shah等人，2011；Tay等人，2003)。我们的研究也基于信号传递通路活化谱鉴定了胃癌中另一水平的不均匀性，所述信号传递通路活化谱直接影响了该癌症类型中靶向治疗剂的选择和结果。
由于缺少容易可用的临床测定法(其足够敏感，以可用于有限数量的临床组织，并还可以评分并区分多个RTK的活化模式)，阻碍了临床样品的靶向磷酸化分析。在该研究中，我们将高度敏感的和新的免疫测定法CEERTM，直接用于快速冷冻的胃癌临床样品，所述免疫测定法CEERTM可以多通道地特异性分析几种蛋白质的总和磷酸化形式。我们显示，～53％的胃癌患者具有HER1、HER2、HER3、c-MET和IGF1R分子中的至少一种RTK活化。在该研究中的RTK中，HER家族成员是最经常活化的酪氨酸激酶。HER家族成员的表达在胃癌中与肿瘤进程和差的预后相关(Allgayer等人，2000；Garcia等人，2003；Hayashi等人，2008)；然而，我们的研究第一次显示了其活化谱。尽管具有活化的HER激酶成员的几种胃癌并没有显示出其他分析的RTK家族成员的活化，但c-MET活化的癌症几乎总显示出HER和/或IGF1R的共活化。聚类分析显示，HER2活化的胃癌与那些具有活化的HER3的胃癌成组，c-MET以及HER1和IGF1R活化的胃癌与PI3K活化的胃癌最接近。基于Lauren组织型和肿瘤的HER2状态，我们分类RTK磷酸化谱。基于基因表达谱的差异，最近的研究(Shah等人，2011)已经将胃癌分类成“邻近未扩散型”、“扩散型”和“远端未扩散型”，建议这些差别对胃癌的当前临床治疗具有显著的影响。基于其活化激酶谱，除提供了这些胃癌亚型的不同生物学的最新了解外，与胃癌的组织病理学一致的特异性RTK活化模式的鉴定目前允许现有药物候选物的假设驱动的(hypothesis-driven)治疗性测试。
从我们的分析中，显著的观察结果是相当数量的胃癌(48％的HER2阳性和～32％的HER2阴性)都不具有任何单独活化的RTK，相反，它们受伴随性活化的RTK的网络驱动。该发现对药物研发具有强烈的提示，因为其表明，胃癌可能对单独的靶向治疗表现出抗性，并且靶向制剂的组合在此类胃癌的亚集中可能更有效。事实上，foretinib(XL-880)单一疗法的II期试验在非选择性胃癌患者中不能显示出客观应答(Jhawer等人，2008)，并且仅在HER2(+)胃癌患者的亚集中观察到了曲妥珠单抗活性。据我们所知，我们的研究是第一次在胃癌临床样品中证明多个RTK通路活化。在成胶质细胞瘤(Stommel等人，2007)和乳腺癌(Hochgrafe等人，2010)中已经报道了相似的观察结果，其中通过其RTK活性谱指导的组合治疗药优于单制剂治疗。我们已经鉴定，cMET/HER1磷酸化与HER2阴性胃癌是紧密相关的，并且此类胃癌患者具有显著更差的存活。在胃癌和肺癌细胞系中已经报道了c-MET和HER1轴之间的交叉对话(Engelman等人，2007；Liu等人，2011)。最近的研究报道，HER激酶信号传递在胃癌中促进抗cMET抑制，并且两种信号传递家族的同时阻断可能更有益((Corso等人，2010；Liu等人，2011)。我们的结果显示，与针对任一靶标的单一疗法对照，HER1和cMET的组合治疗抑制在HER1/MET共活化的细胞中具有更有效的抗肿瘤活性。
在过量表达HER2蛋白质的乳腺癌中可以观察到曲妥珠单抗活性。该发现已经延伸至胃癌，并且曲妥珠单抗是FDA批准的HER2(+)晚期胃癌的治疗剂(Bang等人，2010)。事实上，曲妥珠单抗是在胃癌中显示出存活益处的唯一靶向疗法。然而，从最近的ToGA试验结果中显而易见，曲妥珠单抗并非有益于全部HER2(+)胃癌患者，因为曲妥珠单抗加上标准化疗在HER2(+)胃癌中给出了47％的整体应答率。对于这种不应答，我们当前的基于CEERTM的分析提供了至少4个可能的原因，并表明多个标志物的得分，包括其活性状态可能在预测对靶向治疗剂的应答中更有益。曲妥珠单抗不应答的一种可能性是如通过CEERTM测定法所显示的胃癌中HER2表达的高度不均匀性，这造成了研发有效的HER2诊断的复杂性。尽管已经给胃癌定义了修饰的IHC/FISH-HER2得分标准(其不同于乳腺癌准则)，但它们仍不能在全部胃癌中有效地捕获不均匀性HER2状态，并且不能足够准确地预测抗-HER2应答者。第二，如通过CEERTM分析所显示，仅50％的HER2(+)胃癌表达磷酸化HER2。缺少活化的HER2通路表明HER2信号传递可能并不在全部HER2(+)胃癌中显著地有助于肿瘤存活；因此，用曲妥珠单抗抑制它可能不会导致可测量的肿瘤抑制。第三，我们所显示的信号传递通路，例如那些由HER1、HER3、c-MET和IGF1R驱动的信号传递通路分别在26％、36％、22％和30％的HER2(+)胃癌中是活化的，其可以提供促进抗曲妥珠单抗的备选的肿瘤存活信号。已知在乳腺癌中，曲妥珠单抗不能有效地阻断HER2：HER3异二聚体(Agus等人，2002；Cho等人，2003；Ghosh等人，2011)，并且IGF1R信号传递促进了曲妥珠单抗抗性((Huang等人，2010；Nahta等人，2005)。此外，胃癌异体移植模型中的最近临床前证据(Yamashita-Kashima等人，2011)显示，在HER2(+)模型中，曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合治疗要优于单独的曲妥珠单抗，部分是因为有效的抑制了HER2：HER3异二聚体信号传递。最后，我们的研究使用基于邻近的CEERTM免疫测定法显示，在46％的HER2(+)胃癌中存在的p95HER2(HER2的截短型羧基端片段)在胃癌中也有助于曲妥珠单抗抗性。除更差的预后(Saez等人，2006)和更高的转移性倾向(Molina等人，2002)外，由于缺少识别曲妥珠单抗的胞外表位(Scaltriti等人，2007)，在乳腺癌中p95HER2促进了对赫赛汀治疗的抗性。然而，由于与在石蜡包埋的样本中免疫组织化学检测p95HER2相关的技术困难，仍缺少p95HER2表达的大规模临床验证。尽管两个研究组已经产生了针对p95HER2的单克隆抗体，但由于最近来自GeparQuattro研究的矛盾发现(其未能关联p95HER2水平和曲妥珠单抗抗性)(Loibl等人，2011)，它们的临床验证仍然待定(Parra-Palau等人，2010；Sperinde等人，2010)。应当注意，我们使用CEERTM测定法，已经在快速冰冻的胃癌临床样本中成功检测到p95HER2。胃癌中p95HER2存在的频率(77％的HER2(+))要高于乳腺癌中报道的频率(～30％的HER2(+))。可以测试曲妥珠单抗对比拉帕替尼在表达全长HER2或截短型p95HER2的胃癌细胞中的有效性，因为几个研究已经显示了抗HER2TKI，拉帕替尼在p95HER2(+)癌症中的用途(Arribas等人，2011；Saez等人，2006)。此外，在胃癌患者中，II期新辅助拉帕替尼+化疗试验验证了p95HER2表达。在我们的研究中分析了形成整个胃癌群体的大部分(～88％)的HER2阴性胃癌，但对于该群体，还不存在经批准的靶向疗法。基于CEERTM测定法，这些癌症中的一些仍表达HER2蛋白质，但与HER2(+)群体比较，以显著更低的水平表达。事实上，我们检测了84例具有显著水平的磷酸化HER2的样品，显示这些癌症可能利用活化的HER2受体信号传递来促进肿瘤生长，并因此可能是多种HER2靶向剂的可能应答者。如通过IHC所测定，发现曲妥珠单抗在具有HER2(-)状态的一部分乳腺癌患者中是有益的(Paik等人，2008)。除活化的HER2信号传递外，我们在HER2(-)胃癌中鉴定了具有活化的HER1、HER3、c-MET和IGF1R的患者的几个亚组，其也可能有助于驱动HER2(-)肿瘤生长。值得注意的是，在我们的研究中发现的表达pHER1、pHER2和pHER3的样品比例类似于那些在乳腺癌中报道的比例(Frogne等人，2009)。在胃癌中，HER3蛋白质过量表达与预后差相关(Begnami等人，2011；Hayashi等人，2008)，并且建议将其作为潜在的治疗靶标。在我们的分析中，大约24％的HER2(-)胃癌表达活化的HER3信号传递，其中这些癌症的相当大部分共表达磷酸化的HER2和HER1。这表明HER3信号传递可能在胃癌中发挥着重要的作用。
在经历了分子靶向制剂的数年后，我们目前认识到，转移性癌症是在治疗期间发生抗性通路的发展中的疾病。肿瘤学家在再次活组织检查以计划随后的治疗的必要性和再次活组织检查的临床可行性之间遭遇了困境。因此，我们使用分离自体液(例如，腹水)的CTC和恶性细胞，研发了RTK活化谱平台。我们显示，CEERTM测定法对于描绘CTC足够敏感。在CTC的情况下，我们可以在治疗和进程期间纵向监测靶向的-RTK状态。考虑到并不是全部转移性癌症患者都具有可用于分析的CTC的事实，那么我们还可以从体液，例如来自胃癌患者的恶性腹水中分离恶性细胞，并且已经成功显示，可以在这些细胞中描绘RTK活化。这明确地扩展了磷酸-RTK测定法在胃癌患者中的实用性和临床可行性的范围。为了应用循证靶向治疗剂，并且研发克服药物抗性的策略，我们从恶性腹水中分离了癌细胞，并使用生长因子活化通路，并然后用TKI作为可能的替代系统离体外处理肿瘤细胞，以测试靶向特定通路蛋白质的制剂在患者中的有效性。
我们现在正快速地接近个体化癌症医学和生物标志物驱动临床研究的年代。我们的发现显示，多个RTK共活化提供了单一疗法在胃癌中应答率低的合理解释。在将来，我们可以在具有多个信号传递通路的胃癌患者亚群中考虑首要的组合靶向治疗。使用利用CTC和/或体液的监测工具，我们可以基于疾病进程，快速地确定靶向备选信号传递通路的所需后续治疗。
实验方法
患者组群和组织样本取得
全部患者都经历了治愈性目的的具有根治性淋巴结清扫术的胃切除术。将收集自手术切除的原发性胃肿瘤的447例新鲜冰冻组织用于最终的分析。全部新鲜冰冻组织都由外科医师在手术室收集(在<30分钟内)，并立即快速冷冻于液氮中，并储存于-80℃直到后来使用。
肿瘤样本由病理学家确认存在>70％的肿瘤区域。对于分析，使用预冷的刀片制备冰冻组织的小切片(10μm剖面×3)，然后将其在100μL的裂解缓冲液中裂解。在后续分析之前，将得到的裂解液储存于-80℃。
组织病理学检查和HER2状态测定
主要由两位病理学家集中检查全部可得到的H&E染色切片。全部肿瘤样本都来自手术切除的原发性胃肿瘤。通过免疫组织化学(IHC)测定HER2状态。使用HercepTestTM(Dako，Glostrup，Denmark)进行IHC分析。根据专家对胃癌的HER2评分的一致建议，将HER2蛋白质表达水平评分为0至3+(Hofmann等人，2008；Ruschoff等人，2010)。对于FISH，使用PathVysion HER2DNA探针试剂盒(Abbott，Des Plaines，IL)。将Ariol图像分析系统用于计数杂交信号(Genetix，San Jose，美国)。计数了40个侵袭性肿瘤细胞。通过计数60个以上非重叠细胞，人工地评分通过图像分析HER2/CEP17的比率在1.8至2.2之间的全部样品。将2.2以上、1.8至2.2或1.8以下的比率分别分类为用于扩增的阳性、不确定或阴性。将染色体17多体性定义为CEP17信号在平均每一细胞上6个以上的拷贝。在447例样本中，将434例样本纳入了最终的分析。
协同酶增强的反应免疫测定法(CEERTM)
用TBST(50mM Tris/150mM NaCl/0.1％Tween-20，pH7.2-7.4)漂洗免疫-微阵列玻片2次，用80μL Whatman Blocking缓冲液室温封闭1小时，然后用TBST洗涤2次。在80μL稀释缓冲液(2％BSA/0.1％TritonX-100/TBS，pH7.2-7.4)中连续稀释裂解物对照，和样品加入到玻片上指定的亚-阵列中，然后室温孵育1小时。洗涤玻片4次(每次3分钟)，并将检测Ab加入到80μL的反应缓冲液中，并室温孵育2小时。用TBST洗涤玻片，以去除未结合的检测Ab后，加入80μL制备自400μg/mL乙醇溶液(Perkin-Elmer Life Science)中的生物素-酪胺溶液(50mM葡萄糖/PBS中5μg/ml)，并避光孵育15分钟。通过用TBST洗涤4次，每次3分钟，终止葡萄糖-氧化酶(GO)/HRP介导的酪胺信号扩增进程。通过用2％BSA/0.1％Triton/TBS中0.5μg/mL的链霉亲和素(SA)-Alexa647(Invitrogen)孵育40分钟，来检测生物素-酪胺的局部沉积。孵育完成后，用TBST洗涤玻片4次，干燥并避光保存，直到通过微阵列扫描器成像。
截短型HER2富集
如图8中所示，使用磁珠偶联的对HER2的胞外结构域(ECD)特异的抗体去除裂解物中的全长p185-ERBB2受体。将得到的含缺ECD的截短型HER2(t-HER2)受体蛋白质的耗竭p185-HER2的裂解物用于随后t-HER2表达和磷酸化的定量。
CEERTM数据分析
以4个光电倍增管(PMT)放大设定扫描玻片，以增加有效的动态范围。平均三次重复印模的点的背景校正信号强度。将几个标准用于筛选用于进一步分析的数据，包括点印模上的极限、点复制的变异系数，以及整体充填背景(pad background)。对于每一测定，标准曲线产生自连续稀释的对照细胞裂解物，其制备自具有完全表征的信号转导蛋白质的细胞系。将数据拟合为5-参数等式，衍生为捕获-抗体浓度和PMT的函数。将每一标志物的标准曲线拟合为对数信号强度的函数，测量为相对荧光单位(RFU)对比细胞裂解物的对数浓度并参照标准细胞系。例如，将制备自BT474的连续稀释的细胞裂解物的标准曲线用于归一化每一样品中HER2表达和磷酸化的程度(图14)。因此，具有1CU的HER2表达的样品具有与1个标准参照BT474细胞的RFU值相等的RFU值。对于每一细胞具有1～2×106HER1或HER2受体(具有大约10％的磷酸化受体)的参照细胞，1CU表示1～2×106RTK或1～2×105磷酸化RTK的表达(Kim等人，2011)。对于HER2的表达和活化二者，测定的CU的检测极限(LOD)值为1CU以下。将来自每一稀释和放大的各个预测平均化成单个最终预测。
CEERTM标志物测定和热图聚类
评价用于临床背景的生物标志物数据的统计学挑战是测定最佳的诊断截断水平。在不存在参考范围值的情况下，将给定生物标志物的阳性定义为大于本研究患者群体中各个生物标志物的第三个四分位数。基于CEERTM测定给定生物标志物的CU值排列患者。将那些高于第三个四分位数截断值的患者考虑为处于具有升高的生物标志物水平的最高风险中，并因此可能活化了信号通路。进行后续的存活分析，以评估这些截断值的预测质量。
通过热图显示了肿瘤样品的生物标志物谱。基于标志物活化的十分位数排列着色每一细胞。每一标志物按十分位数排列，以不同的色度显示，其中刻度显示了颜色。显示了行(患者)和列(标志物)聚类二者。使用可从statistical environment R：A Language and Environmentfor Statistical Computing的gplots library(http：//www.r-proiect.org/)得到的称为heatmap.2函数的R中的hclust函数，通过顺序分组最相关的观察结果，将完全连锁算法用于获得分层聚类(或者树形图)。通过聚类确定标志物的亚组，并允许比较患者的标志物谱。
多通道微阵列印模
使用无触点印模器(non-contact printer)(Nanoplotter，GeSiM)，将捕获抗体印模在硝酸纤维素包被的玻璃片
Figure BDA0000429324590000851
Grace Bio-Labs)上。点直径为大约175μm，将玻片4℃保持于脱水室中。一式三份地，并且以1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL的连续稀释浓度印模大约500pL的捕获Ab。将纯化的小鼠-IgG用作为阴性对照。图5显示了免疫阵列玻片布局。
抗体缀合和纯化
用双功能交联剂，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)活化靶特异性-Ab(针对人信号转导蛋白质上不同表位的小鼠单克隆抗体)和相应的检测酶葡萄糖氧化酶(GO)或辣根过氧化物酶，并偶联制备抗体-酶缀合物(Gibson等人，1964；Klapper和Hackett，1963)。通过HPLC纯化缀合物。通过竞争ELISA测定纯化的缀合物中Ab的活性，并通过对检测酶特异的功能测定法检测缀合后酶的活性。
细胞培养和试剂
人胃癌细胞系购自韩国细胞系库(KCLB，首尔，韩国)。将全部细胞系都培养于补充了10％热灭活胎牛血清、抗生素/抗霉菌素的RPMI-1640培养基(PAA Laboratories GmbH，澳大利亚)中。在37℃、5％CO2中孵育细胞，并每周更换培养基两次。汇合后，将细胞亚分成新的烧瓶，直到实验最后。
具有不同程度的ErbB-RTK表达的CEERTM测定法对照细胞系，MDA-MB-468、T47D、HCC827和BT474细胞(Dragowska等人，2004；Filmus等人，1987；Imai等人，1982)获自ATCC，并在37℃、5％CO2中培养MDA-MB-468(Dulbecco’s最低必需培养基，DMEM，10％FBS)，BT474(DMEM，10％FBS)，以及HCC827和T47D(RPMI1640，10％FBS，0.2U/ml牛胰岛素)。计数细胞，并在生长因子刺激之前用1×PBS洗涤。用100nM表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGFα)刺激MDA-MB-468细胞，用在无血清生长培养基中的20nM调蛋白β(HRGβ)或100ng/mL胰岛素样生长因子-1(IGF1)刺激T47D细胞5或15分钟。用1×PBS洗涤刺激的细胞，并然后裂解(裂解缓冲液50mM Tris，pH7.4、150mM NaCl、1％Trition X-100和2mMNa3VO4)，并在获取上清液用于后续测定之前保存于冰上30分钟或者保存于-80℃。
药物处理
将细胞以2x105个细胞接种在6孔板上，并在37℃孵育24小时，并在37℃，用1μM/ml的拉帕替尼、foretinib或组合处理4小时。药物处理后收获细胞，并通过离心沉淀细胞。对于蛋白质分析，在提取细胞之前，将细胞沉淀储存于-80℃。
细胞生长抑制测定
根据厂商方法，通过CellTiter96Aqueous One Solution测定法(Promega)测定细胞生长抑制。简言之，将细胞(100uL中3×103个/孔)接种在96孔板上，并在37℃孵育24小时，并在37℃用药物(拉帕替尼或foretinib或组合)处理3天。药物处理后，每孔加入MTS溶液，并在37℃继续孵育4小时。用设定在490nm的微孔板读取器测定每孔的吸光值(OD)。全部试验重复进行三次。
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实施例4.用于胃癌治疗的个体化小鼠模型
该实施例描述了小鼠模型(“avatar”)，以帮助医师鉴定可以施用给患者，以对抗特定肿瘤如胃癌的最有效抗癌药物或抗癌药物的组合(例如，混合物)。
“avatar”包括这样的小鼠或其他动物，其中移植了来自人类肿瘤的组织，以产生某一患者的癌症的个体化模型。在该方法的一个实例中，分析了患者的胃肿瘤(例如，I或II期胃癌如扩散型胃癌)的一种或多种分析物如cMET和HER1，和任选地HER2和/或HER3，以及其他细胞转导通路组分的存在或表达和/或活化水平。然后通过将患者肿瘤的小片异体移植到免疫缺陷小鼠上，产生特定胃癌的个体化小鼠模型。然后测试了异体移植肿瘤对抗癌药物或抗癌药物的组合(例如，混合物)的应答。例如，cMET和HER1二者在患者的胃肿瘤中是活化的(例如，如通过CEERTM技术所测定)，可以在avatar上存在的异体移植肿瘤上测试cMET抑制剂和HER1抑制剂的组合，以确定其是否是用于患者的癌症的有效治疗。如果异体移植肿瘤应答抑制剂混合物(例如，肿瘤缩小)，那么可以将特定的组合疗法施用给患者。
所有在本说明书中引用的参考文献和专利申请在此处引入作为参考，就如同每一出版物或专利申请被明确和单独地引入作为参考一样。尽管为了明确理解的目的，已经通过说明和实施例的方式，详细描述了上述发明，但在本发明的教导下，对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行某些改变和修改而不背离所附权利要求的精神或范围。

Claims (26)

1.预测具有I或II期胃癌的受试者肿瘤手术后的存活的方法，所述方法包括：
(a)在获自所述受试者的癌细胞中测定包含cMET和HER1的至少两种分析物的存在或活化水平；和
(b)基于步骤(a)中测定的所述至少两种分析物的存在或活化水平，预测所述受试者的存活。
2.权利要求1的方法，其中所述方法预测所述受试者的无病存活或无进展存活。
3.权利要求1或2的方法，其中cMET和HER1在所述癌细胞中是共活化的。
4.权利要求3的方法，其中与具有cMET活化、不存在HER1活化的I或II期胃癌受试者比较，预测所述受试者具有更差的存活。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述胃癌是扩散型胃癌。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤(a)进一步包括测定所述癌细胞中包含HER2和/或HER3的至少一种另外的分析物的存在或活化水平。
7.权利要求6的方法，其中cMET和HER1是共活化的，但HER2在所述癌细胞中是没有活化的。
8.权利要求7的方法，其中与具有cMET活化、不存在HER1和/或HER2活化的I或II期胃癌受试者比较，预测所述受试者具有更差的存活。
9.权利要求6的方法，其中在所述癌细胞中cMET、HER1和HER3是共活化的，但HER2没有活化。
10.权利要求9的方法，其中与具有cMET活化的、不存在HER1、HER2和/或HER3活化的I或II期胃癌受试者比较，预测所述受试者具有更差的存活。
11.权利要求1-10中任一项的方法，进一步包括：
(c)基于步骤(a)中测定的至少cMET和HER1的存在或活化水平，将单独的cMET抑制剂或者与HER1抑制剂组合的cMET抑制剂施用给所述受试者。
12.权利要求11的方法，其中当cMET和HER1在所述癌细胞中是共活化的，并且任选地所述癌细胞中HER2未活化和/或HER3是活化的时，将cMET抑制剂与HER1抑制剂组合施用。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中步骤(a)包括使用协同酶增强的反应免疫测定法(CEERTM)测定所述分析物的存在或活化水平。
14.用于治疗具有I或II期胃癌的受试者的方法，所述方法包括：
将包含cMET抑制剂和HER1抑制剂的组合疗法施用给所述受试者，其中cMET和HER1在所述I或II期胃癌中是共活化的。
15.权利要求14的方法，其中所述受试者与具有cMet活化、不存在HER1活化的I或II期胃癌受试者比较，具有更差的存活和/或更差的预后。
16.权利要求14或15的方法，其中将所述组合疗法作为最初的疗法施用给所述受试者。
17.权利要求14-16中任一项的方法，其中将所述组合疗法作为辅助疗法在肿瘤手术之后施用给所述受试者。
18.权利要求14-17中任一项的方法，其中HER2在所述I或II期胃癌中是没有活化的。
19.权利要求18的方法，其中所述受试者与具有cMet活化、不存在HER1和/或HER2活化的I或II期胃癌受试者比较，具有更差的存活和/或更差的预后。
20.权利要求14-19中任一项的方法，其中HER3在所述I或II期胃癌中是活化的。
21.权利要求20的方法，其中所述受试者与具有cMet活化、不存在HER1、HER2和/或HER3活化的I或II期胃癌受试者比较，具有更差的存活和/或更差的预后。
22.权利要求14-21中任一项的方法，其中所述cMET抑制剂选自AMG102、MetMAb、ARQ197、JNJ-38877605、PF-2341066、PF-04217903、SGX523、GSK1363089/XL880、XL184、MGCD265、MK-2461、PHA-665752及其组合。
23.权利要求14-22中任一项的方法，其中所述HER1抑制剂选自埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、BIBW-2992及其组合。
24.权利要求14-23中任一项的方法，其中所述cMET和HER1的存在或活化水平在获自所述受试者的癌细胞中测定。
25.权利要求24的方法，其中所述癌细胞选自原发性肿瘤细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、腹水肿瘤细胞(ATC)及其组合。
26.权利要求24或25的方法，其中所述cMET和HER1的存在或活化水平用协同酶增强的反应免疫测定法(CEERTM)测定。
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