CN109324137B - 一种细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法 - Google Patents

一种细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法，所述细锥香茶菜乙素的含量测定方法为：色谱条件：Thermo Accucore C18(4.6mm×150mm，2.0μm)；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸，等度洗脱；检测波长：210‑280nm；柱温：20‑30℃；流速：0.8‑1.2mL·min‑1；进样量：10μL；对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；HPLC法测定。本发明以细锥香茶菜乙素为测定指标，采用高效液相色谱法，建立细锥香茶菜药材的含量测定方法，为细锥香茶菜药材的质量控制及评价研究提供实验依据；所述测定方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，为细锥香茶菜药材的深度开发利用和相关制剂的安全有效和质量可控提供依据。

Description

一种细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法
技术领域
本发明涉及一种细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法，属于药品技术的领域。
背景技术
细锥香茶菜Isodon coetsa(Buch.-Ham.ex D.Don)Hara，唇形科香茶菜属植物，分布于我国西南的贵州、云南、西藏、四川和广西等省份。因其治疗肝炎、萎缩性胃炎及各种肿瘤效果良好，在民间得到了广泛的应用。通过文献查阅分析，有关细锥香茶菜的质量控制方面报道较少，目前仅有对其中总黄酮及挥发油成分的含量进行过报道，其主要活性二萜成分含量测定方面研究尚属空白。本实验首先通过柱色谱、制备液相等各种分离手段对细锥香茶菜中主要活性二萜成分进行分离纯化，经核磁数据比对，分离纯化得到了一个含量较大的二萜化合物细锥香茶菜乙素。据文献查阅可知，细锥香茶菜乙素为细锥香茶菜药材的主要活性成分，具有显著的抗肿瘤、抗癌及治疗白血病等药理作用。因目前未见关于细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素含量测定方法的研究报道，不利于对细锥香茶菜的进一步开发利用。另外，没有对其药效成分进行定量检测，难以控制药材及其相关制剂的质量，无法保证临床用药的安全性和有效性。
发明内容
本发明目的在于，提供一种细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法。本发明以细锥香茶菜乙素为测定指标，采用高效液相色谱法，建立细锥香茶菜药材的含量测定方法，为细锥香茶菜药材的质量控制及评价研究提供实验依据；所述测定方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，为细锥香茶菜药材的深度开发利用和相关制剂的安全有效和质量可控提供依据。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：一种细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法，所述细锥香茶菜乙素的含量测定方法为：
色谱条件：Thermo Accucore C18，4.6mm×150mm，2.0μm；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液，等度洗脱；检测波长：210-280nm；柱温：20-30℃；流速：0.8-1.2mL·min-1；进样量：10μL；
对照品溶液的制备：精密称取细锥香茶菜乙素对照品，置容量瓶中，加90-100％甲醇溶液配成0.3000-0.6000mg·mL-1的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取细锥香茶菜药材粉末1.8-2.2g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入30～90％乙醇溶液15～25mL，称定重量，回流提取，取出，放冷，加30～90％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，通过0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；
HPLC法测定：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即可。
前述的细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法中，等度洗脱程序为：0～20min，70％A。
前述的细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法中，所述的回流提取是：在水浴温度80℃下回流提取2h。
前述的细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法中，所述检测波长：234nm；柱温：25℃；流速：1mL·min-1。
前述的细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法中，所述对照品溶液的制备是：精密称取细锥香茶菜对照品12.50mg，置容量瓶中，加甲醇溶液配成0.5000mg·mL-1的对照品溶液。
前述的细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法中，所述供试品溶液的制备是：取细锥香茶菜药材粉末2.0g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入65％乙醇溶液20mL，称定重量，回流提取，取出，放冷，加加入65％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，通过0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。发明人进行了大量的实验，以下是部分实验研究
实验例1.含量测定方法考察
1仪器和试药
1.1仪器
Thermo UltiMate-3000型高效液相色谱仪(美国赛默公司)；DAD检测器；ThermoAccucore C18(4.6mm×150mm，2.0μm)；AG135型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；DK-98-Ⅱ型水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)等。
1.2试剂
甲醇(美国天地有限公司，色谱纯；国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)；重蒸馏水；细锥香茶菜乙素(实验室自制，纯度为99.99％)。
1.3药材
供试样品由发明人采于贵州开阳，经贵阳中医学院赵俊华教授准确鉴定为唇形科香茶菜属植物细锥香茶菜Isodon coetsa(Buch.-Ham.ex D.Don)Hara。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：Thermo Accucore C18(4.6mm×150mm，2.0μm)；流动相：甲醇(A)与0.1％磷酸水溶液(B)，等度洗脱(70％A)；检测波长：234nm；柱温：25℃；流速：1mL·min-1；进样量：10μL。
2.2溶液的制备
(1)对照品溶液的制备
精密称取细锥香茶菜乙素对照品12.50mg，置容量瓶中，加甲醇溶液配成0.5000mg·mL-1的对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
取本品粉末约2.0g，精密称定，置50mL三角锥形瓶中，精密加入65％乙醇溶液20mL，称定重量，回流提取(水浴温度80℃)2h，取出，放冷，加65％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，通过0.45μm微孔滤膜过滤，即供试品溶液。
2.3专属性考察
精密吸取对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂各10μL，按拟定的色谱条件，依法测定。结果表明供试品溶液色谱中待测的目标峰与细锥香茶菜乙素对照品色谱峰保留时间和UV光谱图一致，分离度大于1.5且达到基线分离，峰纯度在98％以上，说明所建立方法具有较强的专属性。如图1所示。
2.4线性范围的考察
分别精密吸取细锥香茶菜乙素对照品溶液(0.5000mg·mL-1)1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，5.0mL置于5mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀释定容至刻度，摇匀，配制成系列浓度对照品溶液，精密吸取上述溶液10μL，按拟定的色谱条件注入高效液相色谱仪。以对照品进样量(X)为横坐标，峰面积值(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝14.897X-0.2409，r＝0.9999，结果表明细锥香茶菜乙素进样量在1.0000～5.0000μg范围内与峰面积值呈良好的线性关系。如表1、图2所示。
表1线性范围考察结果(n＝6)
Figure BDA0001869056330000031
Figure BDA0001869056330000041
2.5精密度试验
精密吸取细锥香茶菜对照品溶液(0.3000mg·mL-1)，按拟定的色谱条件，连续进样6次，每次10μL，测定细锥香茶菜乙素成分的峰面积(见图3)，计算峰面积的RSD值为0.08％，符合质量标准分析方法验证技术要求(RSD在2.0％以内)，表明仪器精密度良好。结果如图3、表2所示。
表2精密度试验结果(n＝6)
Figure BDA0001869056330000051
2.6重复性试验
取同一批号的待测药材，按照拟定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液6份，按拟定的色谱条件分别进样测定，每次10μL，结果细锥香茶菜的平均含量为3.46mg/g(见图4)，计算其含量的RSD值为0.90％，符合质量标准分析方法验证技术要求(RSD在3.0％以内)，表明该法测定的重复性良好。结果如表3所示。
表3重复性试验结果(n＝6)
Figure BDA0001869056330000052
2.7稳定性试验
取与重复性试验同一批号的待测药材，按拟定的方法制备供试品溶液1份，以拟定的色谱条件，于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h、24h分别进样10μL，测定细锥香茶菜成分的峰面积值(见图5)。计算其峰面积的RSD值为1.43％，结果表明供试品溶液在24h内稳定。结果如表4所示。
表4稳定性试验结果(n＝9)
Figure BDA0001869056330000061
2.8加样回收率试验
取与重复性试验同一批号的待测药材6份，每份约1.0g，精密称定，按照1:1比例加入细锥香茶菜乙素对照品，分别按拟定的供试品溶液制备方法进行供试品溶液制备。按拟定的色谱条件，分别进样测定，并记录细锥香茶菜乙素色谱峰的峰面积值(见图6)，计算细锥香茶菜乙素的平均回收率为94.89％，RSD值为1.10％，符合质量标准分析方法验证技术要求(回收率限度在90～108％)，表明该法测定结果的准确度高。结果如表5所示。
表5加样回收率试验结果(n＝6)
Figure BDA0001869056330000071
2.9样品的测定
分别取5批细锥香茶菜药材，每份约2.0g，精密称定，按拟定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按拟定的色谱条件，分别进样测定，每份样品重复测定3次，并记录细锥香茶菜乙素色谱峰的峰面积值(见图7)，以标准曲线法计算干品药材中细锥香茶菜乙素的含量。结果如表6所示。
表6 5批细锥香茶菜药材干品测定结果(n＝3)
Figure BDA0001869056330000081
3讨论
3.1色谱条件选择
本实验采用DAD检测器3D图谱对检测波长进行了筛选，结果表明细锥香茶菜乙素在234nm处有最大吸收。本文采用甲醇-水，乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水等溶剂系统，结果均不理想，经过进一步优化，选择甲醇-0.1％磷酸水作为最终流动相。分别对ThermoAccucoreC18(4.6mm×150mm，2.0μm)，依利特Hypersil ODS(250mm×4.6mm，5μm)，Agilent SB-C18(150mm×4.6mm，5μm)，Pntulips BP-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，4种不同的色谱柱进行分析比较，结果表明，Thermo Accucore C18(4.6mm×150mm，2.0μm)柱检测时，细锥香茶菜乙素色谱峰检测灵敏度高，且峰形、分离度均较好，故选之。分别设定20℃、25℃、30℃的检测柱温，结果表明柱温为25℃时，细锥香茶菜色谱峰保留时间适中，峰形、分离效果均较好。分别设置进样量5μL、10μL、15μL、20μL，结果表明进样量为10μL时，细锥香茶菜乙素色谱峰的峰形、分离效果较好。
3.2提取条件考察
分别采用35％、50％、65％、80％、95％乙醇溶液作为提取溶剂，结果表明65％乙醇溶液提取率最高，故选之。本实验比较了超声提取法和回流提取法，结果回流提取细锥香茶菜乙素的含量明显优于超声提取，故选择回流提取法。分别设置提取时间为1h、1.5h、2h、2.5h、3h，结果表明提取时间为2h时，细锥香茶菜乙素的提取率较高，故选之。分别设定1：8、1：10、1：12、1：14、1：16的料液比，结果表明1：10的料液比提取率相对较高，故选择料液比为1：10。本发明测定方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠。
与现有技术相比，本发明以细锥香茶菜乙素为测定指标，采用高效液相色谱法，建立细锥香茶菜药材的含量测定方法，为细锥香茶菜药材的质量控制及评价研究提供实验依据；所述测定方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，为细锥香茶菜药材的深度开发利用和相关制剂的安全有效和质量可控提供依据。
附图说明
图1是专属性考察HPLC色谱及UV光谱图(其中A：空白溶液；B：对照品溶液；C：供试品溶液；D：细锥香茶菜乙素对照品溶液UV光谱图；E：供试品溶液中细锥香茶菜乙素UV光谱图)；
图2是细锥香茶菜乙素标准曲线图；
图3是精密度试验HPLC色谱叠加图；
图4是重复性试验HPLC色谱叠加图；
图5是稳定性试验HPLC色谱叠加图；
图6是加样回收率试验HPLC色谱叠加图；
图7是5批细锥香茶菜药材样品HPLC色谱叠加图。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1：
一种细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法，所述细锥香茶菜乙素的含量测定方法为：
色谱条件Thermo Accucore C18(4.6mm×150mm，2.0μm)；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液，等度洗脱；洗脱程序为：0～20min，70％A；
检测波长：234nm；柱温：25℃；流速：1mL·min-1；进样量：10μL。
对照品溶液的制备：精密称取细锥香菜菜乙素对照品，置容量瓶中，加95％甲醇溶液配成0.4500mg·mL-1的对照品溶液。
供试品溶液的制备：取细锥香茶菜药材粉末2.0g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入65％乙醇溶液20mL，称定重量，回流提取，取出，放冷，加65％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，通过0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
HPLC法测定：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并以标准曲线法计算含量，即可。

Claims (1)

1.一种细锥香茶菜药材中细锥香茶菜乙素的含量测定方法，其特征在于：所述细锥香茶菜乙素的含量测定方法为：
色谱条件：Thermo Accucore C18，4.6mm×150mm，2.0μm；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液，等度洗脱；检测波长：234nm；柱温：25℃；流速：1mL·min-1；进样量：10μL；等度洗脱程序为：0～20min，70％A；
对照品溶液的制备：精密称取细锥香茶菜乙素对照品，置容量瓶中，加90-100％甲醇溶液配成0.3000-0.6000mg·mL-1的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取细锥香茶菜药材粉末1.8-2.2g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入30～90％乙醇溶液15～25mL，称定重量，回流提取，取出，放冷，加30～90％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，通过0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；所述的回流提取是：在水浴温度80℃下回流提取2h；
HPLC法测定：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即可；
所述对照品溶液的制备是：精密称取细锥香茶菜对照品12.50mg，置容量瓶中，加甲醇溶液配成0.5000mg·mL-1的对照品溶液；
所述供试品溶液的制备是：取细锥香茶菜药材粉末2.0g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入65％乙醇溶液20mL，称定重量，回流提取，取出，放冷，加加入65％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，通过0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
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