CN103018367A - 何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法，将何首乌药材制成供试品溶液，将磷脂酰胆碱制成对照品溶液，以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A为流动相B，采用梯度洗脱的高效液相色谱法，运用蒸发光散色检测器进行检测。该方法精密度高，重复性好，回收率高，测量结果准确，可以作为何首乌药材中卵磷脂的含量测定方法。本发明在2010版中国药典的基础上，对何首乌药材的质量标准进行了提升。本发明的实施，能够更加有效地控制何首乌药材的质量，从而确保其临床用药的有效性及安全性，同时为何首乌药材的再开发应用奠定了基础。

Description

何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法

技术领域

本发明涉及对中药材进行定量检测的技术领域，尤其是一种何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法。

背景技术

何首乌为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块根，主产于湖北、广西、广东、贵州、四川、江苏等地，其性微温，味苦、甘、涩。何首乌的主要成分为二苯乙烯苷类、蒽醌类和磷脂类。其中卵磷脂能调节内分泌、保护心血管系统、增强免疫系统功能、增强记忆、延缓衰老、抑菌消炎和抗肿瘤等功效。2010年版《中国药典》只有二苯乙烯苷和蒽醌的含量测定方法，何首乌的卵磷脂含量测定方法没有记载，并且有关卵磷脂的含量测定的报道比较少。因此建立一种何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法可有效控制何首乌药材的质量,并为何首乌药材的再开发应用奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法，它精确度、重复性、回收率等指标均良好，提高了何首乌药材的质量控制标准，为何首乌药材的再开发应用奠定了基础。 

本发明是这样实现的：何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法，将何首乌药材制成供试品溶液，将磷脂酰胆碱制成对照品溶液，以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A为流动相B，采用梯度洗脱的高效液相色谱法，运用蒸发光散色检测器进行检测，实现对何首乌药材中所含的卵磷脂成分进行含量测定。

所述的流动相A中，甲醇-水-冰醋酸-三乙胺的比例为85:15:0.45:0.05；所述的流动相B中，正己烷-异丙醇-流动相A的比例为20:48:32。

所述的将何首乌药材制成供试品溶液具体是指，取过5号筛的何首乌粉末0.2g，置于250mL锥形瓶中，加入Folch试剂25mL，密塞，称定重量，于冷水中超声提取60min，取出称重并补重，静置后取上清液，并用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

所述的将磷脂酰胆碱制成对照品溶液具体是指，取磷脂酰胆碱0.0240g，置100ml的容量瓶中，用比例为2:1的三氯甲烷-甲醇溶解并稀释至刻度，配置成240μg/mL的对照品溶液。

梯度洗脱的条件是，流速为1ml/min，柱温为30～50℃，进样量为10μL，漂移管温度为90℃，载气流量为2.8L/min。

具体的含量测定方法包括以下步骤：

（1）色谱条件：色谱柱为SIL柱；甲醇-水-冰醋酸-三乙胺为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A为流动相B，梯度洗脱；柱温为30～50℃；

（2）对照品溶液的制备：称取磷脂酰胆碱，加三氯甲烷-甲醇溶解并稀释至刻度，得对照品溶液；

（3）供试品溶液的制备：取何首乌药材粉末适量，精密称定，加Folch试剂适量，超声提取60min，静置后取上清液，即得供试品溶液； 

（4）测定方法：按照步骤（1）所述色谱条件测定，即得。

前述步骤（1）的色谱条件与系统适用性试验为：

仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪；蒸发光散色检测器；

色谱柱：Agilent SIL柱(5μm，4.6×250mm)；

流动相：以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（比例为85:15:0.45:0.05）为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A（比例为20:48:32）为流动相B，梯度洗脱。

流速：1ml/min；

柱温：40℃；

进样量：10μL;

漂移管温度为90℃；

载气流量为2.8L/min。

流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：开始时，A相10%，B相90%，；第20min时，A相30%，B相70%。即按下表1进行洗脱：

表1 流动相梯度洗脱表

前述步骤（2）对照品溶液的制备为：取磷脂酰胆碱0.0240g，置100ml的容量瓶中，用比例为2:1的三氯甲烷-甲醇溶解并稀释至刻度，配置成240μg/mL的对照品溶液。

前述步骤（3）供试品溶液的制备为：取过5号筛的何首乌粉末0.2g，置于250mL锥形瓶中，加入Folch试剂25mL，密塞，称定重量，于冷水中超声提取60min，取出称重并补重，静置后取上清液，并用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

根据相关资料记载，何首乌药材中含有的卵磷脂成分，能调节内分泌、保护心血管系统、增强免疫系统功能、增强记忆、延缓衰老、抑菌消炎和抗肿瘤等功效，且在药材中相对含量较高。因此为更好地控制何首乌药材的质量，保证药物疗效，申请人参照中国药典，选定卵磷脂成分作为质量控制的指标成分，建立了相应的含量测定方法。

为了确保本发明含量测定方法科学、合理、可行，申请人对其进行了一系列的试验研究和考察：

一、仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪系列（美国安捷伦科技公司，包括四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、Chemstation工作站）；蒸发光散色检测器（Alltech ELSD 2000ES）；FA2004分析天平（上海良平仪器仪表有限公司）；SG8200HPT型超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）。磷脂酰胆碱对照品（又名卵磷脂）（美国sigma公司，批号：P3556）。甲醇（色谱纯，Fisher公司）；冰醋酸（A.R，天津市永大化学试剂有限公司）；三乙胺（色谱纯，Tedia公司）；异丙醇（色谱纯，SK Chemicals Uisan公司）；正己烷（色谱纯，Honewell Burdicke Jackion公司）；娃哈哈纯净水。实验用何首乌药材经贵阳中医学院何顺志教授鉴定均为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的块根。标本存于贵州大学中药天然药研究开发中心。

二、对照品溶液的制备：

取磷脂酰胆碱0.0240g，置100ml的容量瓶中，用比例为2:1的三氯甲烷-甲醇溶解并稀释至刻度，配置成240μg/mL的对照品溶液。

三、供试品溶液的制备：

取何首乌粉末，过五号筛，精密称定0.2g，置250mL锥形瓶中，加入Folch试剂25mL，密塞，称定重量，于冷水中超声提取60min，取出称重并补重，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

由于卵磷脂分子中含大量不饱和脂肪酸，易受温度影响而变质，60℃时卵磷脂开始降解，因此考虑超声低温提取。在该提取方式下分别从提取溶剂，提取时间，提取溶剂的用量三个方面进行考察。

1、提取溶剂的考察  

分别考察了甲醇、氯仿、乙酸乙酯和Folch试剂(氯仿:甲醇为2:1) 4种溶剂，实验过程如下:

精密称取何首乌粉末（过五号筛）0.2g，置250mL具塞锥形瓶中，精密加入不同提取溶剂25mL，密塞，称重，于冷水中超声提取60min，取出称重并补重，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

将所得供试品溶液照上述色谱条件进行测定，计算卵磷脂的含量。不同溶剂提取卵磷脂的含量效果如图1。

由结果可知，用Folch 试剂作为溶剂提取的峰面积最大，故选择Folch 试剂为提取溶剂。

2、提取时间的考察  

分别考察了30min、60min、90min三个提取时间卵磷脂的含量，方法如下:

称取何首乌粉末（过五号筛）0.2g, 精密称定，置250ml具塞三角瓶中，精密如入Folch 试剂25mL，密塞，称重，超声提取，取出称重并补重，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

将所得供试品溶液照上述色谱条件进行测定，计算卵磷脂的含量。每个提取时间重复实验3次，结果取平均值。不同提取时间卵磷脂的含量效果如图2。

结果表明提取时间为60min和90min卵磷脂的含量相差不大，考虑卵磷脂超声时间过长，水温易热，使卵磷脂降解，最后选择超声提取60min作为提取时间。

3、提取溶剂用量的考察

分别考察了25mL、50mL、75mL三种溶剂用量下卵磷脂的含量，方法如下：

称取何首乌粉末（过五号筛）0.2g, 精密称定，置250mL具塞三角瓶中，精密如入Folch 试剂25mL、50mL、75mL，密塞，称重，于冷水中超声提取60min，取出称重并补重，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

将所得供试品溶液照上述色谱条件进行测定，计算卵磷脂的含量。每个提取溶剂用量重复实验3次，结果取平均值。不同提取溶剂用量卵磷脂的含量效果如图3。

结果表明提取溶剂用量为25mL、50mL和75mL时，卵磷脂含量相差不大，因此提取溶剂用量选25ml。

4、供试品溶液制备方法的确定  

根据以上试验的结果可以得知，供试品溶液制备的试剂选择是Folch试剂，其用量为25mL，合理的提取时间为60min。

四、标准曲线的绘制

分别精密量取对照品溶液2μL 、4μL 、6μL 、8μL 、10μL，照上述色谱条件进行测定，以浓度C的对数值为横坐标，峰面积A的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。

卵磷脂线性关系测定回归方程为lgA=1.12lgC+4.66，r=0.9949。表明卵磷脂在48μg/mL~240μg/mL之间呈良好的线性关系，如图4.

五、精密度试验

按本发明所述含量测定方法下的色谱条件，精密吸取磷脂酰胆碱标准溶液（240μg/ml）10μl，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD值，结果见表2。

表2 精密度试验结果

由上表结果可知，本发明所述含量测定方法的精密度良好。

六、重复性试验

精密称取施秉何首乌药材样品 6 份,照本发明所述方法制备供试品溶液6份，分别测定，计算各份样品卵磷脂的含量，并计算RSD值，结果见表3。

表3 重复性试验结果

由上表结果可知，本发明所述含量测定方法的重复性良好。

七、稳定性试验

取施秉何首乌药材的样品溶液，分别于0、1、2 、3 、4h测定，结果见表4。

表4稳定性试验结果

由上表结果可知，供试品溶液中被测成分4h内稳定。

八、回收率试验

取已知卵磷脂含量的何首乌粉末6份（过五号筛），每份约0.1g，精密称定，置250mL具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品，按本发明所述含量测定方法下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按本发明所述含量测定方法下的色谱条件测定，计算回收率和RSD值，结果见表5。

表5 加样回收率试验结果

九、样品含量测定

取20批次不同产地的何首乌粉末（过五号筛）0.2g，精密称定，照本发明所述含量测定方法下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按本发明所述含量测定方法下的色谱条件测定，计算各供试品卵磷脂的含量，结果见表6。

表6 20批何首乌药材卵磷脂含量测定结果（n=3）

备注：1-都匀，2-都匀，3-贵阳，4-施秉，5-德江，6-印江，7-湄潭，8-凤岗，9-赫章，10-六枝，11-水城，12-安龙，13-兴义，14-兴仁， 15-关岭，16-宁谷，17-云南， 18-四川，19湖北-20-安徽。

经综合评价，该方法精密度高，重复性好，回收率高，测量结果准确，可以作为何首乌药材中卵磷脂的含量测定方法。

由于采用了上述的技术方案，本发明建立了何首乌药材中卵磷脂的HPLC含量测定方法，使得何首乌药材的质量标准更加完善。本发明在2010版中国药典的基础上，对何首乌药材的质量标准进行了提升。本发明的实施，能够更加有效地控制何首乌药材的质量，从而确保其临床用药的有效性及安全性，同时为何首乌药材的再开发应用奠定了基础。

附图说明

图1为不同溶剂提取的卵磷脂含量效果图；

图2为不同提取时间的卵磷脂含量效果图；

图3为不同用量提取溶剂的卵磷脂含量效果图；

图4为卵磷脂标准曲线；

图5为实施例1的对照品溶液的HPLC色谱图；

图6为实施例1的供试品溶液的HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明的实施例1：何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法为： 

（1）色谱条件与系统适用性试验：

仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪系列（美国安捷伦科技公司，包括四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、Chemstation工作站）；蒸发光散色检测器（Alltech ELSD 2000ES）；

色谱柱：Agilent SIL柱(5μm，4.6×250mm)；

流动相：以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（比例为85:15:0.45:0.05）为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A（比例为20:48:32）为流动相B，梯度洗脱；流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：开始时，A相10%，B相90%，；第20min时，A相30%，B相70%；即按下表9进行洗脱。

表7 流动相梯度洗脱表

流速：1ml/min；

柱温：40℃；

进样量：10μL；

漂移管温度为90℃；

载气流量为2.8L/min。

（2）对照品溶液的制备：取磷脂酰胆碱0.0240g，置100ml的容量瓶中，用比例为2:1的三氯甲烷-甲醇溶解并稀释至刻度，配置成240μg/mL的对照品溶液。

（3）供试品溶液的制备：取何首乌粉末，过五号筛，精密称定0.2g置于250mL锥形瓶中，加入Folch试剂25mL，密塞，称定重量，于冷水中超声提取60min，取出称重并补重，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

（4）测定法：按照步骤（1）所述色谱条件测定，即得。

本发明的实施例2：何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法为： 

（1）色谱条件与系统适用性试验：

仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪系列（美国安捷伦科技公司，包括四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、Chemstation工作站）；蒸发光散色检测器（Alltech ELSD 2000ES）；

色谱柱：Agilent SIL柱(5μm，4.6×250mm)；

流动相：以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（比例为85:15:0.45:0.05）为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A（比例为20:48:32）为流动相B，梯度洗脱；流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：开始时，A相10%，B相90%，；第20min时，A相30%，B相70%；即按下表9进行洗脱。

表8 流动相梯度洗脱表

流速：1ml/min；

柱温：35℃；

进样量：10μL；

漂移管温度为90℃；

载气流量为2.8L/min。

（2）对照品溶液的制备：取磷脂酰胆碱0.0240g，置100ml的容量瓶中，用比例为2:1的三氯甲烷-甲醇溶解并稀释至刻度，配置成240μg/mL的对照品溶液。

（3）供试品溶液的制备：取何首乌粉末，过五号筛，精密称定0.2g置于250mL锥形瓶中，加入Folch试剂50mL，密塞，称定重量，于冷水中超声提取60min，取出称重并补重，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

（4）测定法：按照步骤（1）所述色谱条件测定，即得。

本发明的实施例3：何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法为： 

（1）色谱条件与系统适用性试验：

仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪系列（美国安捷伦科技公司，包括四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Chemstation工作站）；蒸发光散色检测器（Alltech ELSD 2000ES）；

色谱柱：Agilent SIL柱(5μm，4.6×250mm)；

流动相：以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（比例为85:15:0.45:0.05）为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A（比例为20:48:32）为流动相B，梯度洗脱；流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：开始时，A相10%，B相90%，；第20min时，A相30%，B相70%；即按下表9进行洗脱。

表9 流动相梯度洗脱表

流速：1ml/min；

柱温：40℃；

进样量：10μL；

漂移管温度为90℃；

载气流量为2.8L/min。

（2）对照品溶液的制备：取磷脂酰胆碱0.0240g，置100ml的容量瓶中，用比例为2:1的三氯甲烷-甲醇溶解并稀释至刻度，配置成240μg/mL的对照品溶液。

（3）供试品溶液的制备：取何首乌粉末，过五号筛，精密称定0.2g置于250mL锥形瓶中，加入Folch试剂25mL，密塞，称定重量，于冷水中超声提取90min，取出称重并补重，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

（4）测定法：按照步骤（1）所述色谱条件测定，即得。

Claims (5)

1.一种何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法，其特征在于：将何首乌药材制成供试品溶液，将磷脂酰胆碱制成对照品溶液，以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A为流动相B，采用梯度洗脱的高效液相色谱法，运用蒸发光散色检测器进行检测，实现对何首乌药材中所含的卵磷脂成分进行含量测定。

2.根据权利要求1所述的何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法，其特征在于：所述的流动相A中，甲醇-水-冰醋酸-三乙胺的比例为85:15:0.45:0.05；所述的流动相B中，正己烷-异丙醇-流动相A的比例为20:48:32。

3.根据权利要求1所述的何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法，其特征在于：所述的将何首乌药材制成供试品溶液具体是指，取过5号筛的何首乌粉末0.2g，置于250mL锥形瓶中，加入Folch试剂25mL，密塞，称定重量，于冷水中超声提取60min，取出称重并补重，静置后取上清液，并用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

4.根据权利要求1所述的何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法，其特征在于：所述的将磷脂酰胆碱制成对照品溶液具体是指，取磷脂酰胆碱0.0240g，置100ml的容量瓶中，用比例为2:1的三氯甲烷-甲醇溶解并稀释至刻度，配置成240μg/mL的对照品溶液。

5.根据权利要求1所述的何首乌药材中卵磷脂成分的含量测定方法，其特征在于：梯度洗脱的条件是，流速为1ml/min，柱温为30～50℃，进样量为10μL，漂移管温度为90℃，载气流量为2.8L/min。

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