CN114903926B

CN114903926B - 珊瑚树叶中Vibsane型总二萜及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114903926B
Application number: CN202210479410.3A
Authority: CN
Inventors: 黄肖霄; 宋少江; 姚国栋; 薛小变; 吕天铭
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2022-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2042-05-05
Also published as: CN114903926A

Abstract

一种珊瑚树叶中Vibsane型总二萜及其制备方法和应用，属于植物医药技术领域。珊瑚树叶中Vibsane型总二萜的制备方法是将珊瑚树叶用提取溶剂提取，得到提取物；将提取物用石油醚萃取除油，并用乙酸乙酯萃取，去除溶剂，干燥，得到粗浸膏；将粗浸膏用大孔吸附树脂柱色谱进行梯度洗脱，洗脱溶剂为乙醇‑水溶液，收取90％馏分，去除洗脱溶剂，即为珊瑚树叶中Vibsane型总二萜。该制备方法工艺简单，成本低，可以工业化生产，且实验证实利用方法制得的Vibsane型总二萜具有明显的抗肝癌、乳腺癌活性，可以用于制备抗肿瘤药物，具备进一步开发为新药的潜力。

Description

珊瑚树叶中Vibsane型总二萜及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物医药技术领域，涉及珊瑚树叶中Vibsane型总二萜及其制备方法和应用，尤其涉及药用及园林作物珊瑚树叶中具有显著抗癌活性的Vibsane型总二萜的制备新方法。

背景技术

珊瑚树(Viburnum odoratissimum Ker-Gawl.var.odoratissimum)为五福花科(Adoxaceae)荚蒾属(Viburnum)植物。其枝叶可入药，具有通经活络之功效，多用来消炎、止痛、抗风湿，为民间传统用药。目前，从珊瑚树的枝叶中分离得到多种化学成分，其中，Vibsane型二萜类化合物是珊瑚树中的特征化合物。该类化合物结构复杂，具有显著的抗癌活性。现有技术中，尽管已有报道表明Vibsane型二萜为珊瑚树中的主要活性成分，但精确分离活性显著的 Vibsane二萜单体流程复杂、成本高，同时得到的活性化合物含量较低，实际开发为药物的难度较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种珊瑚树叶中Vibsane型总二萜及其制备方法和应用，主要是提供一种从珊瑚树叶中快速制备Vibsane型总二萜的制备方法，该制备方法工艺简单，成本低，且实验证实利用方法制得的Vibsane型总二萜具有明显的抗肝癌、乳腺癌活性，可以用于制备抗肿瘤药物，具备进一步开发为新药的潜力。

本发明的一种珊瑚树叶中Vibsane型总二萜的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：

将珊瑚树叶用提取溶剂提取，得到提取物；

将提取物用石油醚萃取除油，并用乙酸乙酯萃取，去除溶剂，干燥，得到粗浸膏；

步骤2：

将粗浸膏用大孔吸附树脂柱色谱进行梯度洗脱，洗脱溶剂为乙醇-水溶液，收取90％馏分，去除洗脱溶剂，即为珊瑚树叶中Vibsane型总二萜。

所述的步骤1中，珊瑚树叶为干燥的珊瑚树叶。

所述的步骤1中，提取采用的提取溶剂优选为甲醇或乙醇，甲醇或乙醇的体积浓度70～80％，提取次数优选为3～5次。

所述的步骤1中，去除溶剂优选为减压蒸馏。

所述的步骤1中，乙酸乙酯萃取时，按体积比，提取物：乙酸乙酯＝1:(2～3)。

所述的步骤2中，大孔吸附树脂柱色谱中，大孔吸附树脂选用D-101大孔吸附树脂或 HP-20大孔吸附树脂中的一种。

所述的步骤2中，梯度洗脱采用的乙醇-水溶液中，乙醇的质量百分比梯度为30％，60％， 90％。

所述的步骤2中，去除洗脱溶剂采用减压蒸馏去除。

本发明的珊瑚树叶中Vibsane型总二萜，通过以上制备方法制得，其珊瑚树叶中Vibsane 型总二萜的Vibsane型总二萜的质量百分含量≥65％。

一种药物组合物，包含珊瑚树叶中Vibsane型总二萜和药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的珊瑚树叶中Vibsane型总二萜或药物组合物作为预防或治疗抗肿瘤药物的应用。

所述的抗肿瘤药物为抗肝癌药物或抗乳腺癌药物。

特别适用于，抑制体外肿瘤细胞生长的活性，更具体的肿瘤细胞为HepG2细胞株，Hep3B 细胞株，MCF-7细胞株。

其中，抗肿瘤药物中珊瑚树叶中Vibsane型总二萜作用于HepG2细胞株的IC₅₀值为11.11～11.21μg/mL，抗肿瘤药物中珊瑚树叶中Vibsane型总二萜作用于Hep3B细胞株的IC₅₀值为9.64～9.82μg/mL，抗肿瘤药物中珊瑚树叶中Vibsane型总二萜作用于MCF-7细胞株的IC₅₀值为14.62～15.74μg/mL。

珊瑚树叶中Vibsane型总二萜或药物组合物，适用于体内抗癌活性。在两周的给药时间内，低剂量组珊瑚树叶中Vibsane型总二萜(100mg/kg)使裸鼠移植Hep3B肿瘤的体积缩小55％以上，高剂量组珊瑚树叶中Vibsane型总二萜(200mg/kg)使裸鼠移植Hep3B肿瘤的体积缩小 75％以上，优于阳性药索拉菲尼的40％，能够显著抑制裸鼠移植Hep3B肿瘤的生长，且未表现出明显毒性。

本发明的一种珊瑚树叶中Vibsane型总二萜及其制备方法和应用，其有益效果在于：

珊瑚树叶的Vibsane型总二萜具有比珊瑚树叶总提物更强的肝癌、乳腺癌细胞的抑制活性，并且可以抑制裸鼠移植HepG2、Hep3B、MCF-7肿瘤的生长。

本发明采用移植肝癌Hep3B细胞株的裸鼠模型对珊瑚树叶的Vibsane型总二萜的体内抗肝癌活性进行测试。结果表明，珊瑚树叶的Vibsane型总二萜能够抑制肝癌、乳腺癌的增殖并抑制人肝癌Hep3B裸鼠移植瘤的生长。毒性评估表明本发明所描述的珊瑚树叶Vibsane型总二萜对小鼠各脏器未表现出明显毒性。因此，本发明所述的珊瑚树叶的Vibsane型总二萜的抗癌作用安全有效，具有进一步开发为临床抗肝癌、乳腺癌预防和治疗药物的前景。

本发明的制备方法设计合理，具有过程工艺简单，可工业化生产的特点。

附图说明

图1为人肝癌Hep3B裸鼠肿瘤体积随给药量的变化情况；(a)在体裸鼠肿瘤；(b)为离体裸鼠肿瘤。

图2为不同给药量下，小鼠肿瘤体积随时间的变化曲线。

图3为不同给药量下，小鼠肿瘤大小的变化情况图。

图4为不同给药量下，小鼠体重随时间变化曲线。

图5为小鼠心、肝、脾、肺、肾随给药量的变化情况图。

图6为赫斯特(H&E)染色结果。

图7为免疫组织化学分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

一种珊瑚树叶中Vibsane型总二萜的制备方法，包括以下步骤：

取干燥珊瑚树叶1kg，用75％甲醇或乙醇提取3～5次，减压浓缩得到珊瑚树叶总提物；将所得珊瑚树叶粗提物经石油醚萃取除油，除去脂肪酸等小极性成分；随后经乙酸乙酯以珊瑚树叶提取物：乙酸乙酯萃取液1：2的体积比例萃取3次，合并经减压浓缩得乙酸乙酯层总浸膏。以HP-20经乙醇-水系统以30％、60％、90％的乙醇质量浓度比例进行洗脱，每个比例洗脱4～6个保留体积，回收溶剂，对90％流分减压浓缩得到珊瑚树叶中Vibsane型总二萜浸膏4.92g。利用紫外-可见光分光光度法，以15-O-methylvibsanin H为对照品，在230.5nm的波长处，配置标准曲线并测定吸光度，检测结果显示所得珊瑚树叶Vibsane型总二萜得含量为70.521％。

实施例2

一种珊瑚树叶中Vibsane型总二萜的制备方法，包括以下步骤：

取干燥珊瑚树叶1kg，用75％甲醇或乙醇提取3～5次，减压浓缩得到珊瑚树叶总提物；将所得珊瑚树叶粗提物经石油醚萃取除油；随后经乙酸乙酯以珊瑚树叶提取物：乙酸乙酯萃取液1：2的体积比例萃取3次，合并经减压浓缩得乙酸乙酯层总浸膏。以HP-20经乙醇-水系统以30％、60％、90％的乙醇质量浓度比例进行洗脱，每个比例洗脱4～6个保留体积，回收溶剂，对90％流分减压浓缩得到珊瑚树叶中Vibsane型总二萜浸膏4.46g。利用紫外-可见光分光光度法，以15-O-methylvibsanin H为对照品，在230.5nm的波长处，配置标准曲线并测定吸光度，检测结果显示所得珊瑚树叶Vibsane型总二萜得含量为72.436％。

实施例3

取干燥珊瑚树叶1kg，用75％甲醇或乙醇提取3～5次，减压浓缩得到珊瑚树叶总提物；将所得珊瑚树叶粗提物经石油醚萃取除油；随后经乙酸乙酯以珊瑚树叶提取物：乙酸乙酯萃取液1：2的体积比例萃取3次，合并经减压浓缩得乙酸乙酯层总浸膏。以HP-20经乙醇-水系统以30％、60％、90％的乙醇质量浓度比例进行洗脱，每个比例洗脱4～6个保留体积，回收溶剂，对90％流分减压浓缩得到珊瑚树叶中Vibsane型总二萜浸膏4.66g。利用紫外-可见光分光光度法，以15-O-methylvibsanin H为对照品，按照此方法制备的珊瑚树叶Vibsane型总二萜含量以标准曲线法，在230.5nm的波长处，配置标准曲线并测定吸光度，检测结果显示所得珊瑚树叶Vibsane型总二萜得含量为69.268％。

实施例4

一种珊瑚树叶中Vibsane型总二萜的制备方法，包括如下步骤：

将珊瑚树叶日光下晒干，用体积浓度为80％甲醇提取，减压浓缩得到珊瑚树叶提取物；提取次数为：4次；

将所得的珊瑚树叶提取物用石油醚萃取，除去脂肪酸等小极性成分；

将粗提物进一步用乙酸乙酯以珊瑚树叶提取物：乙酸乙酯萃取液1：2的体积比例进行萃取，重复三次并合并，减压回收溶剂；

将乙酸乙酯萃取所得粗提物利用D-101大孔吸附树脂柱色谱以乙醇-水中，乙醇的质量浓度为30％、60％、90％进行梯度洗脱得到三个流分A₁、A₂、A₃；

对流分A₃减压回收溶剂，即得到Vibsane二萜含量较高得粗流分。

实施例5

一种珊瑚树叶中Vibsane型总二萜的制备方法，包括如下步骤：

将珊瑚树叶日光下晒干，用体积浓度为75％甲醇提取，减压浓缩得到珊瑚树叶提取物；提取次数为：3次；

将粗提物进一步用乙酸乙酯以珊瑚树叶提取物：乙酸乙酯萃取液1：3的体积比例进行萃取，重复三次并合并，减压回收溶剂；

将乙酸乙酯萃取所得粗提物利用HP-20大孔吸附树脂柱色谱以乙醇-水中，乙醇的质量浓度为30％、60％、90％进行梯度洗脱得到三个流分A₁、A₂、A₃；

实施例6

一种珊瑚树叶中Vibsane型总二萜的制备方法，包括如下步骤：

将珊瑚树叶日光下晒干，用体积浓度为80％乙醇提取，减压浓缩得到珊瑚树叶提取物；提取次数为：4次；

对流分A₃减压回收溶剂，即得到Vibsane二萜含量较高得粗流分，即为。

应用例1

用实施例1～3制备得到的珊瑚树叶Vibsane型总二萜，对人肝癌HepG2,Hep3B及人乳腺癌MCF-7细胞增殖有明显的抑制作用。

采用改良MTT法：将融合为单层的HepG2、Hep3B和MCF-7肿瘤细胞消化为单细胞悬浮液，加入96孔培养板中，90μL/孔。在37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h后，加入一定浓度的受试样品，10μL/孔。受试样品组设置3个复孔。阴性对照为等体积的PBS，阳性对照为顺铂(DDP)，继续孵育48小时后，每孔加入10μl的MTT溶液5mg/ml，10μL/孔，避光37℃孵育2-4h；每孔加入100μl的MTT溶解buffer(20％SDS，1M HCl)，37℃孵育至结晶完全溶解；利用全自动酶标仪读取570nm及490nm处的吸光度，计算OD(570) -OD(490)的数值作为每孔的OD值；根据以下公式计算计算相对抑制率：细胞相对抑制率(％)＝100％-(实验组OD值/对照组平均OD值)×100％。用SPSS12.0软件计算各样品的IC₅₀值，结果见表1。

表1本发明Vinsane型总二萜对三种肿瘤细胞的抑制作用

应用例2

用实施例4～6制备得到的珊瑚树叶Vibsane型总二萜，对人肝癌HepG2,Hep3B及人乳腺癌MCF-7细胞增殖有明显的抑制作用。

所述的珊瑚树叶的Vibsane型总二萜具有比珊瑚树叶总提物更强的肝癌、乳腺癌细胞的抑制活性，并且可以抑制裸鼠移植HepG2、Hep3B、MCF-7肿瘤的生长。

采用改良MTT法，测试珊瑚树叶的Vibsane型总二萜对人肝癌HepG2细胞株，Hep3B细胞株及乳腺癌MCF-7细胞株的体外抗肿瘤作用进行评估。实验结果表明珊瑚树叶的Vibsane 型总二萜在体外对上述三种细胞株具有显著的细胞增殖抑制活性，IC₅₀值分别为11.11μg/ml， 9.64μg/ml，14.62μg/ml(见表2)。

表2珊瑚树总提物与Vibsane型总二萜对多种肿瘤细胞抑制作用的考察。

通过表2说明Vibsane型总二萜对肿瘤细胞的抑制作用具有选择性，并非对所有肿瘤细胞都均有抑制作用。

实施例5

用实施案列1～3制备得到的Vibsane型总二萜，对人肝癌Hep3B裸鼠移植瘤的生长具有明显的抑制作用。

取对数生长期Hep3B细胞，经胰酶消化后离心收集细胞，用PBS清洗一次后同转速再次离心，对得到的细胞采用无血清DMEM配成细胞悬液并控制细胞密度为1×107/mL。所用动物为SPF级BALB/c无胸腺裸鼠，雄性，6-8周龄，体重18-22g。实验育种严格遵守SPF级标准的要求。在无菌条件下，用1mL胰岛素针向每只裸鼠背后右侧前肢皮下旁进行注射Hep3B细胞悬液0.2mL。注射后每日观测裸鼠状况和皮下的肿瘤生长情况，当裸鼠皮下出现粟粒大小的结节时表示裸鼠模型构建成功。当肿瘤体积大约到100mm³时，将5只小鼠随机分配为一组，共4组。低剂量组为100mg/kg的Vibsane型总二萜，高剂量为200mg/kg的Vibsane型总二萜，阳性药组为30mg/kg的索拉非尼，对照组注射相同体积的生理盐水，均采用灌胃给药的方式，每2天一次，连续给药2周。结果表明经低剂量组及高剂量组Vibsane二萜给药后，小鼠肿瘤体积随时间显著减小，说明Vibsane型总二萜对人肝癌Hep3B裸鼠移植瘤的生长具有明显的抑制作用(图1、图2和图3)。

每次裸鼠给药前均观察并记录各组裸鼠体重、摄食、饮水、活动能力、大便形态、精神状态、反应及接种部位移植瘤的生长情况。给药期间，每天需用游标卡尺测量裸鼠肿瘤长径 (L)和短径(W)，肿瘤体积计算公式：V＝0.5236×L×W²，并分别计算四组肿瘤的平均体积，数据表示为mean±SD，并绘制为肿瘤生长随时间变化曲线。待药物干预2周后停止实验并按公式抑瘤率(％)＝[(V(control group)-V(drug groups))/V(control group)]×100％计算肿瘤体积与肿瘤生长抑制率。实验结果表明，与索拉菲尼对照组相比，Vibsane型总二萜干预期间裸鼠体重无显著改变(图4)。

化合物作用结束后，每只裸鼠腹腔注射1mL 10％水合氯醛进行深度麻醉处死并拍照。用消毒后的手术器械将移植瘤完整剥离，取出每只裸鼠的重要器官(心、肝、脾、肺、肾)，用电子分析天平称重、记录。取出的肿瘤及器官组织用0.85％生理盐水漂洗以洗去血液及物质，然后用手术刀切成适当的组织块。将每组每只裸鼠的肿瘤及器官组织分成两份，一份浸泡于 10％中性福尔马林溶液固定(组织块体积与10％中性福尔马林溶液体积的比例约为1:20)，另一份包装好后置于-80℃长期保存，并做好标记(图5)。将裸鼠脏器组织浸没于4％中性福尔马林中固定，将固定好的脏器组织放置于包埋盒中，放入组织自动脱水机上，经梯度酒精(70％、 80％、90％、95％和100％)脱水。经透明及充分浸蜡后，对组织进行包埋并切片，石蜡切片厚度为5μm。65℃烤箱烘烤3h，常温保存，备用。依次将切片放入二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min，蒸馏水洗。切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染色1-3min。紧接着将切片依次放入95％乙醇I 5min，95％乙醇II 5min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5 min，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片，在显微镜下观察(图6)。结果表明Vibsane型总二萜流分对裸鼠的心肝脾肺肾无明显的影响。

将裸鼠脏器组织浸没于4％中性福尔马林中固定，将固定好的脏器组织放置于包埋盒中，放入组织自动脱水机上，经梯度酒精(70％、80％、90％、95％和100％)脱水。经透明及充分浸蜡后，对组织进行包埋并切片，石蜡切片厚度为5μm。65℃烤箱烘烤3h，常温保存，备用。首先进行将石蜡切片置于摊片机上，50-60℃，摊片40-50min，用于固定切片上的病理组织。按如下步骤进行脱蜡：二甲苯Ⅰ(20min)，二甲苯Ⅱ(20min)，100％乙醇Ⅰ(10min)100％乙醇Ⅱ(10min)，95％的乙醇(5min)，85％乙醇(5min)，75％乙醇(5min)，蒸馏水洗3次(3min)，PBS缓冲液清洗3次(3min)。每张组织切片加一滴过氧化酶阻断溶液(3％ H₂O₂)37℃孵育20min，PBS缓冲液洗片3次，每次5min；组织切片在柠檬酸盐缓冲液中加热以进行抗原修复。然后，在室温下用正常山羊血清处理切片20min。并在4℃下用一级抗体孵育过夜。组织切片室温复温45min，回收一抗，PBS缓冲液洗片3次(5min)；每张组织切片滴加一滴生物素标记的山羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育30min，甩去二抗，PBS缓冲液洗片3次(5min)；甩去PBS缓冲液，每张组织切片滴加一滴链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，37℃孵育30min，PBS缓冲液洗片3次，每次5min；最后，用DAB染色，用中性树脂密封，自然风干，在显微镜下观察。抗体包括Ki67、Bax、p-AKT(图7)。结果表明Bax阳性比例明显增加，Ki67以及p-AKT的阳性比例下降，表明Vibsane型总二萜可以明显抑制 Hep3B细胞异种移植模型的生长。

综合以上分析结果表明，Vibsane型总二萜可以明显的抑制Hep3B裸鼠移植瘤的体积和大小，且对小鼠体重及主要脏器物明显影响，在体内安全有效。

Claims

1.一种珊瑚树叶中Vibsane型总二萜在制备抗肝癌、抗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述珊瑚树叶中Vibsane型总二萜的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：

将珊瑚树叶用提取溶剂提取，得到提取物；采用的提取溶剂为甲醇或乙醇，甲醇或乙醇的体积浓度70~80%，提取次数为3~5次；

将提取物用石油醚萃取除油，并用乙酸乙酯萃取，去除溶剂，干燥，得到粗浸膏；乙酸乙酯萃取时，按体积比，提取物：乙酸乙酯=1:(2~3)；

步骤2：

将粗浸膏用大孔吸附树脂柱色谱进行梯度洗脱，大孔吸附树脂柱色谱中，大孔吸附树脂选用D-101大孔吸附树脂或HP-20大孔吸附树脂中的一种，洗脱溶剂为乙醇-水溶液，梯度洗脱采用的乙醇-水溶液中，乙醇的质量百分比梯度为30%，60%，90%，收取90%馏分，去除洗脱溶剂，即为珊瑚树叶中Vibsane型总二萜；

所述珊瑚树叶中Vibsane型总二萜的Vibsane型总二萜的质量百分含量≥65%。