CN106432520B - 一种蛴螬多糖组分及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药现代化领域，具体涉及一种蛴螬多糖组分及其制备方法和用途。所述蛴螬多糖组分具有以下特征中的一个或者多个：单糖的组成及其摩尔比为：鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1∶2.8～3.4∶11.6～12.5∶12.6～13.1；重均分子量为7×103～10×103Da；总糖含量为40％～55％；蛋白质含量为10％～20％；糖醛酸含量为25％～37％；硫酸基含量为8％～11％。本发明将蛴螬粉碎成粗粉后，用碱水提取、醇液沉淀的方法提取总多糖，除蛋白、脱色素、透析后，用阴离子交换柱分级，酸性部分用尺寸排阻色谱进一步分离纯化，得到的20kD以下组分透析后，浓缩干燥。本发明提供的蛴螬多糖组分具有明显的抗肿瘤、降血糖、降血压、抗氧化、抗衰老或增强免疫的作用。

Description

一种蛴螬多糖组分及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于中药现代化领域，具体涉及一种蛴螬多糖组分及其制备方法，以及该多糖组分在制备抗肿瘤、增强免疫、降血糖、抗氧化、降血压、抗衰老药物及保健品中的应用。
背景技术
糖类是人类或动植物三大能源(脂肪、蛋白质、糖类化合物)之一，是自然界中广泛分布的一类重要的有机化合物，在人体的生命活动中起着重要的作用。它是一切生命维持生命活动所需能量的主要来源。因糖类是多羟基化合物，且羟基立体构型的多样性、多聚糖单糖残基成键位置的多变性、高级空间结构的复杂性，单糖链状环状形式的存在以及在环状结构中端基碳存在的α或β构型，给糖类成分尤其是多糖的研究带来了极大的挑战。
现代研究表明，糖类成分在细胞间信号传导、受精、胚胎发育、抗微生物的粘附与感染、调节机体免疫功能等方面有着重要的作用。此外，与癌细胞的转移、炎症的发生等也有密切的联系。越来越多的研究发现糖类，主要是多糖具有突出的活性，在多种疾病中具有治疗作用。多糖是由10个或10个以上单糖基通过糖苷键连接而成的直链或支链的大分子聚合物。根据单糖组成的不同，多糖可以分为均多糖和杂多糖。自然界中单糖种类有200多种，在聚合成多糖时，它们可以通过多种不同的结合位点连接。目前已知的多糖结构中，除单糖基之外，还含有糖醛酸、氨基糖、糖醇等，并且有其他取代基，如：O-乙酰基、N-乙酰基、磺酸基等。这些基团的取代，增加了多糖结构的复杂性。多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抗衰老、抗突变、保护肾脏、保护肝脏、防辐射、抗病毒、抗疲劳等多种药理作用。
多糖根据来源分为动物多糖、植物多糖、微生物多糖和海藻多糖。目前，多糖的研究多集中在于植物、菌类、藻类，而对于动物多糖的研究相对较少。动物多糖广泛存在于动物的组织器官中，尤其是在动物结缔组织中含量较为丰富。常见的有壳聚糖、糖原、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素等。在动物中药如阿胶、海参、羚羊角中存在的多糖，已被证明有显著的抗凝、降血压等活性。
蛴螬是鞘翅目金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子Holotrichia diomphalia Bates及同属近缘昆虫的干燥幼虫。主产江苏、安徽、四川、河北、山东、河南和东北等地。味咸，微温，有小毒，归肝经。始载于《神农本草经》，具有破瘀、散结、止痛、解毒的作用，可治疗血瘀经闭、症瘕、折伤瘀痛、痛风、破伤风、喉痹、痈肿、丹毒。文献报道，蛴螬主要含有脂肪酸类、氨基酸、多肽或蛋白质、糖类、生物碱、有机酸盐、甾体化合物等[曹蔚，等.蛴螬的药学研究进展.陕西中医.2013,34(2):250-251]。目前报道的蛴螬主要活性成分集中于脂溶性部位和体内的抗菌肽：崔春爱、宋莲莲和金华等分别发现蛴螬石油醚提取物显著的抑制人肺癌A549细胞、宫颈癌HeLa细胞和人乳腺癌MCF-7细胞的增殖[崔春爱，等.蛴螬提取物对人肺癌A549细胞诱导凋亡作用的形态学观察.山东医药.2008，48(27):7-8；宋莲莲，等.蛴螬石油醚提取物对人宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响.中草药.2006,37(6):488-492；金华，等.蛴螬提取物对MCF-7人乳腺癌细胞株凋亡的影响.中国病理生理杂志.2008,24(1):93-96]；金哲等[金哲，等.蛴螬提取物体外对人MGC-803胃癌细胞株凋亡相关基因作用的研究.中国中医药科技.2004,11(2):90-92]研究发现蛴螬乙酸乙酯提取物在体外对人胃癌MGC-803细胞株有诱导凋亡的作用；蛴螬乙醇提取物对实验性急性肝细胞损伤具有一定的保护作用[Oh WY,et a1.Effect of Holotrichia diomphalia larvae on liver fibrosis andhepatotoxicity in rats.Journal of Ethnopharmacology.2003,87(2-3):175-180]；蛴螬抗菌肽holotricin I和holotricin II能分别抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌[LeeSY,et al.Purification and molecular cloning of cDNA for an inducibleantibacterial protein of larvae of a coleopteran insect,Holotrichiadiomphalia.Journal of Biochemistry(Tokyo).1994,115(1):82-86；Lee SY,eta1.Purification and cDNA cloning of an antifungal protein from the hemolymphof Holotrichia diomphaiia larvae.Biological pharmaceutical bulletin.1995,18(8):1049-1052]。对于蛴螬多糖，目前有相关提取分离方法的研究报道，但其活性报道较少。
目前对蛴螬多糖的提取分离研究如下：阚飞等[蛴螬多糖的提取分离和体外对小鼠免疫细胞增殖的影响.南京农业大学学报.2009,32(2):161-164]将蛴螬漂洗干净匀浆，加入3倍体积的乙醇沉淀，用水溶解，Sevag法除蛋白，D-Hank's液透析，得到蛴螬多糖的水溶液。进一步用柱层析处理后得到了两个对小鼠免疫细胞有增殖作用组分，这两种组分尚未进行进一步的分离纯化，均一性和结构无法鉴定。
目前分离得到的蛴螬多糖组分较少，结构特征不甚明了；对于蛴螬多糖的活性，除了多糖大多具有的免疫调节活性以外，其它作用鲜有报道。
多糖的抗肿瘤作用大多是通过激活机体的免疫系统，即促进淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的成熟、分化和增殖等产生的。肿瘤的生长和转移依赖于血管的生成。肿瘤血管的生成也是肿瘤侵袭、转移的重要环节。当实体瘤体积达到2～3mm3以上时，若没有新生血管提供营养，肿瘤将无法生长。因此，抑制肿瘤血管生成可以减慢肿瘤的生长和转移。卵巢癌、宫颈癌、肝细胞癌、甲状腺癌、神经内分泌癌等均是对抗血管生成药物敏感的肿瘤。肿瘤血管的生成是一个多因素、多步骤的复杂过程，主要包括内皮细胞的增殖及迁移等，同时涉及血管内皮生长因子(VEGF)及相关抑制因子之间的调节失衡。研究发现，硫酸乙酰肝素类多糖化合物如PI-88和WSS25均能抑制血管生成促进因子，如VEGF和纤维母细胞生长因子-2(FGF2)的表达，抑制血管生成。昆布多糖硫酸酯可以拮抗碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，明显抑制小鼠移植瘤的生长。灵芝多糖和云芝多糖能减少VEGF在癌细胞中的分泌来抑制肿瘤的生长。但目前发现的具有抑制肿瘤血管转移作用的多糖均与蛴螬多糖的结构特征有显著的差异。
体内产生的自由基过多或者自由基的清除能力下降与多种疾病的发生息息相关。自由基可以直接损伤细胞膜，同时，它的连锁反应将导致基因突变或细胞死亡。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物(GSH-PX)、脂质过氧化物(LPO)和丙二醛(MDA)存在于血液或组织里，衰老或肿瘤等疾病时，前三者的活性降低，而后两者的含量则增加。抗氧化剂一般通过两条途径实现抗氧化，一是直接清除过量的自由基，二是通过增强体内的抗氧化系统，抑制自由基的产生。
因此，仍需要对蛴螬多糖的组分、制备方法和用途进行研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明人对蛴螬多糖进行了系统的研究：本发明人首次发现了多种蛴螬多糖组分；发现水提取的蛴螬多糖(中性多糖)与碱水提取的蛴螬多糖(酸性多糖)相比，性质和活性差异很大；酸性多糖各组分间的单糖组成也有明显差异，从而导致药理活性又有很大差异。在提取、分离和纯化方面，糖类成分的分离纯化方法可根据其结构特点来选择。在发现蛴螬酸性多糖有显著活性之后，本发明人进一步对提取溶液进行了优化，确定了碱水回流提取的方法。在进行分离纯化之前，一般进行简单的脱蛋白或除色素等步骤。脱色主要有吸附法(DEAE-纤维素、硅藻土、活性炭、大孔吸附树脂)、氧化法。本发明人在对各种方法进行比较后，优选氧化法脱色素的方法，以保证活性组分的纯度。
本发明人研究也发现，蛴螬多糖组分可显著提高衰老模型血液与组织中的SOD、CAT和GSH-PX活性，降低MDA含量，表明蛴螬多糖有显著的抗氧化作用。
由此，本发明的第一个目的是提供一种蛴螬多糖组分。
本发明提供的蛴螬多糖组分，其具有以下特征中的一个或者多个：单糖的组成及其摩尔比为：鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1∶2.8～3.4∶11.6～12.5∶12.6～13.1；重均分子量为7×103～10×103Da；总糖含量为40％～55％；蛋白质含量为10％～20％；糖醛酸含量为25％～37％；硫酸基含量为8％～11％。
进一步地，所述蛴螬多糖组分为淡黄色、无定型粉末、溶于水，与苯酚-硫酸试剂反应显黄色。
本发明的蛴螬多糖组分具有分子量分布范围窄、理化特征和单糖组成明确的特点。
本发明的第二目的是提供上述的蛴螬多糖组分的制备方法。该制备方法可以批量得到具有重大应用价值的蛴螬多糖。
本发明提供的蛴螬多糖组分的制备方法，包括以下步骤：
(1)脱脂：将蛴螬粉碎后用有机溶剂脱脂，脱脂后的蛴螬药渣干燥；
(2)碱水提取：将上述干燥药渣用碱水回流提取，将水提液减压浓缩成提取浓缩液，冷却至室温；
(3)沉淀析出：向上述提取浓缩液加入适量的沉淀溶剂，静置，析出沉淀，离心，沉淀备用；
(4)除蛋白：将上述沉淀除去大部分蛋白，离心除去沉淀，保留水相，浓缩干燥，得到浓缩干燥物；
(5)除色素：将上述浓缩干燥物除色素，水溶液备用；
(6)小分子杂质的去除：对上述水溶液进行水透析除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，减压浓缩，备用；
(7)分离：将上述浓缩液离心，取上清，上DEAE-sephadex A-25或DEAE-纤维素柱，用水溶液洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用氯化钠水溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集氯化钠水溶液的洗脱液，将其减压浓缩为洗脱浓缩液；
(8)纯化：将上述洗脱浓缩液离心后，上尺寸排阻色谱柱，用水洗脱，收集分子量20kD以下组分的洗脱液，浓缩干燥，即得所述蛴螬多糖组分。
优选地，本发明提供的蛴螬多糖组分的制备方法，包括以下步骤：
(1)脱脂：将蛴螬粉碎，用有机溶剂回流、浸渍或渗漉法脱脂，脱脂后的蛴螬药渣干燥；
(2)碱水提取：将上述干燥药渣用相当于其重量4～12倍的碱水在80～100℃回流2～6小时，提取2～4次，合并水提液，将其减压浓缩至相当于原体积1/5～1/50的提取浓缩液，冷却至室温；
(3)沉淀析出：搅拌下向上述提取浓缩液加入2～4倍体积的甲醇、无水乙醇或丙酮，0～30℃静置4～24小时后，析出沉淀，离心，沉淀备用；
(4)除蛋白：将上述沉淀采用反复冻融法、Sevag法或两种方法合用除去大部分蛋白，离心除去沉淀，保留水相，浓缩干燥，得到浓缩干燥物；
(5)除色素：将上述浓缩干燥物用双氧水法、大孔吸附树脂法、活性碳法或多种方法合用除色素，水溶液备用；
(6)小分子杂质的去除：用截流分子量2000-8000Da的透析膜对上述水溶液进行水透析除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，将其减压浓缩至相当于原体积1/5～1/100的浓缩液，备用；
(7)分离：将上述浓缩液离心，取上清，上DEAE-sephadex A-25或DEAE-纤维素柱，用水溶液洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L氯化钠水溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集0.5mol/L氯化钠水溶液洗脱液，将其减压浓缩至相当于原体积1/2～1/200的洗脱浓缩液；
(8)纯化：将上述洗脱浓缩液离心后，上Sephadex G-100、Sephadex G-75、Sephacryl S-400或Sephrose CL-6B凝胶柱，用水洗脱，收集分子量20kD以下组分的洗脱液，浓缩干燥，即得所述蛴螬多糖组分。
优选地，步骤(1)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙醚、石油醚、苯或氯仿。
优选地，步骤(2)中，所述碱水为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸钾水溶液、氨水中的一种或多种的混合物；优选为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。
优选地，步骤(5)中，所述除色素方法为双氧水法，即取所述浓缩干燥物，用相当于其重量100～3000倍的30％过氧化氢水溶液60～90℃回流1～5小时。
更具体地，本发明提供的蛴螬多糖组分的制备方法，包括以下步骤：
(1)脱脂：将蛴螬干燥药材粉碎，用相当于蛴螬重量2～8倍的乙醇在80～100℃加热回流提取2～4小时，共提取2～3次进行脱脂处理，弃提取液，脱脂后的蛴螬药渣干燥；
(2)碱水提取：将上述干燥药渣用相当于其重量5～8倍的0.05～0.3mol/L的氢氧化钠水溶液80～100℃回流2～3小时，提取2～3次，合并水提液，将其减压浓缩至相当于原体积1/5～1/30的提取浓缩液，冷却至室温；
(3)沉淀析出：搅拌下向上述提取浓缩液加入2～3倍体积的无水乙醇，0～30℃静置6～12小时后，析出沉淀，离心，沉淀备用；
(4)除蛋白：将上述沉淀反复冻融3～10次，再采用Sevag法除蛋白2～5次，离心除去沉淀，保留水相，浓缩干燥，得到浓缩干燥物；
(5)除色素：将上述浓缩干燥物用双氧水法除色素，脱色条件为样品重量100～3000倍的30％过氧化氢水溶液60～90℃回流1～5小时；水溶液备用；
(6)小分子杂质的去除：用截流分子量5000-8000Da的透析膜对上述水溶液进行水透析除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，将其减压浓缩至相当于原体积1/10～1/60的浓缩液，备用；
(7)分离：将上述浓缩液离心，取上清，上DEAE-sephadex A-25柱，用水溶液洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L的氯化钠水溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集0.5mol/L氯化钠水溶液洗脱液，将其减压浓缩至相当于原体积1/10～1/150的洗脱浓缩液；
(8)纯化：将上述洗脱浓缩液离心后，上Sephadex G-100或SephacrylS-400凝胶柱，用水洗脱，收集分子量20kD以下组分的洗脱液，浓缩干燥，即得所述蛴螬多糖组分。
由此，本发明提供一种蛴螬多糖组分，其通过上述的任意一种制备方法制成。
本发明的第三个目的是提供上述蛴螬多糖组分在制备抗肿瘤、降血糖、降血压、抗氧化、抗衰老或增强免疫的药物或者保健品中的用途。
优选地，上述蛴螬多糖组分在制备肿瘤血管生成抑制剂的药物中的用途。
优选地，所述肿瘤包括卵巢癌、宫颈癌、肝细胞癌、甲状腺癌、神经内分泌癌等对抗血管生成药物敏感的肿瘤。
附图说明
图1为模型组肿瘤组织CD34免疫组化染色图。
图2为20mg/kg蛴螬多糖组肿瘤组织CD34免疫组化染色图。
图3为50mg/kg蛴螬多糖组肿瘤组织CD34免疫组化染色图。
具体实施方式
下面列举典型实施例，对本发明进一步说明，但不以任何形式构成对本发明的限制。
实施例1
称取10kg干燥蛴螬药材，粉碎为中粉；用40000mL无水乙醇回流提取2小时(脱脂)，滤出乙醇提取液，把蛴螬药渣按上述方法再处理1次，滤出乙醇提取液，残渣挥干乙醇，40℃干燥后，用60000mL 0.1mol/L的NaOH水溶液回流提取3次，每次2h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至10000mL，冷却至室温后加入3倍体积无水乙醇，4℃静置12小时后，3000g离心15分钟，收集沉淀。沉淀用4000mL水溶解，反复冻融8次，再采用Sevag法(即V多糖溶液︰V氯仿︰V正丁醇＝20︰4︰1混合振荡半小时，离心，静置分层，取水层)除蛋白，反复2次，离心，弃去沉淀。将水溶液减压浓缩后置于冻干机上冻干；然后用样品重量1500倍的30％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度80℃，回流3h。将以上得到的水溶液用截流分子量8000Da的透析膜，对水透析48小时除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至1500mL。将浓缩液10000g离心10分钟后，上DEAE-sephadex A-25(100cm×5cm,i.d.)柱，用水以流速1.5mL/min洗脱20000mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集30000mL 1.0mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至400mL。浓缩液10000g离心10分钟后，分4次上Sephadex G-100(120cm×5cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速1.0mL/min洗脱，前1000mL洗脱液弃去，之后的洗脱液进行收集，共收集2000mL(分子量小于20kD的组分)，减压浓缩；冷冻干燥，得到蛴螬多糖组分52.1g。
实施例2
称取1kg干燥蛴螬药材，粉碎为粗粉；用8000mL 95％乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，药渣挥干乙醇，50℃干燥后，用8000mL 0.1mol/L的NaOH水溶液回流提取3次，每次3h。合并水提液，65℃旋转蒸发仪减压浓缩至800mL，冷却至室温后加入2倍体积无水乙醇，4℃静置18小时后，3500g离心15分钟，收集沉淀。沉淀用300mL水溶解，反复冻融10次后，离心，弃去沉淀；然后用样品重量1000倍的30％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度85℃，回流2h。水溶液用截流分子量8000Da的透析膜，对蒸馏水透析24h除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，65℃旋转蒸发仪减压浓缩至120mL。将浓缩液8000g离心15分钟后，上DEAE-sephadex A-25(80cm×3.5cm,i.d.)柱，用水以流速2.0mL/min洗脱2000mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；换用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集2500mL1.0mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至50mL。浓缩液10000g离心10分钟后，上Sephacryl S-400(100cm×4cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速1.0mL/min洗脱，前500mL洗脱液弃去，之后的洗脱液进行收集，共收集1000mL(分子量小于20kD的组分)，减压浓缩至25mL，冷冻干燥，得到蛴螬多糖组分5.83g。
实施例3
称取500g干燥蛴螬药材，粉碎为细粉；置于索氏提取器中用1000mL石油醚回流提取5小时，残渣挥干石油醚，40℃干燥后，用3000mL 0.2mol/L的KOH水溶液回流提取3次，每次2h。合并水提液，65℃旋转蒸发仪减压浓缩至500mL，冷却至室温后加入2倍体积丙酮，4℃静置6小时后，3000g离心10分钟，收集沉淀。沉淀用250mL水溶解，采用Sevag法(即V多糖溶液︰V氯仿︰V正丁醇＝20︰4︰1混合振荡半小时，离心，静置分层，取水层)除蛋白，反复5次，离心弃去沉淀；水溶液反复冻融2次，离心，弃去沉淀。将水溶液减压浓缩后置于冻干机上冻干；然后用样品重量800倍的30％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度80℃，回流3h。水溶液用截流分子量2000Da的透析膜，对蒸馏水透析24小时除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，65℃旋转蒸发仪减压浓缩至30mL。将浓缩液10000g离心12分钟后，上DEAE-纤维素(60cm×3.5cm,i.d.)柱，用水以流速2mL/min洗脱800mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/LNaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集1500mL 0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至30mL。浓缩液8000g离心15分钟后，上Sephrose CL-6B(80cm×3.5cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速0.8mL/min洗脱，前300mL洗脱液弃去，之后的洗脱液进行收集，共收集500mL(分子量小于20kD的组分)，减压浓缩至20mL；冷冻干燥，得到蛴螬多糖2.98g。
实施例4
称取1kg蛴螬，粉碎为粗粉；用2000mL乙醇润湿；用10000ml乙醇进行渗漉，药渣挥干乙醇，40℃干燥后，用6000mL 0.5mol/L的NaOH水溶液回流提取2次，每次3h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至1000mL，冷却至室温后加入3倍体积丙酮，4℃静置8小时后，3000g离心10分钟，收集沉淀。沉淀用500mL水溶解，反复冻融8次，离心，弃去沉淀。水溶液上D101大孔吸附树脂除色素，水洗脱溶液用截流分子量5000Da的透析膜，对水透析48小时除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，65℃旋转蒸发仪减压浓缩至150mL。将浓缩液10000g离心10分钟后，上DEAE-sephadex A-25(100cm×3.5cm,i.d.)柱，用水以流速1.0mL/min洗脱1500mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集2500mL 0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至80mL。浓缩液8000g离心10分钟后，上Sephadex G-100(100cm×5cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速1.0mL/min洗脱，前600mL洗脱液弃去，之后的洗脱液进行收集，共收集1200mL(分子量小于20kD的组分)，减压浓缩至100mL；冷冻干燥，得到蛴螬多糖组分5.64g。
实施例5
称取1kg干燥蛴螬药材，粉碎为中粉；用5000mL石油醚回流提取2小时，药渣挥干石油醚，室温干燥后，用6000mL 0.5mol/L的NaOH水溶液回流提取，共3次，每次2h。合并水提液，65℃旋转蒸发仪减压浓缩至800mL，冷却至室温后加入3倍体积无水乙醇，4℃静置16小时后，3000g离心15分钟，收集沉淀。沉淀用400mL水溶解，反复冻融3次后，离心，弃去沉淀；采用Sevag法(即V多糖溶液︰V氯仿︰V正丁醇＝20︰4︰1混合振荡半小时，离心，静置分层，取水层)除蛋白，反复4次，离心弃去沉淀。将水溶液减压浓缩后置于冻干机上冻干；然后用活性碳进行脱色，脱色后的水溶液用截流分子量6000Da的透析膜，对水透析48h除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，65℃旋转蒸发仪减压浓缩至100mL。将浓缩液8000g离心20分钟后，上DEAE-sephadex A-25(80cm×3.5cm,i.d.)柱，用水以流速2.0mL/min洗脱2500mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；换用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集4500mL1.0mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至50mL。浓缩液8000g离心15分钟后，上Sephadex G-100(100cm×5cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速1.0mL/min洗脱，前600mL洗脱液弃去，之后的洗脱液进行收集，共收集1000mL(分子量小于20kD的组分)，减压浓缩；冷冻干燥，得到蛴螬多糖组分5.39g。
实施例6
称取5kg干燥蛴螬药材，粉碎为粗粉；用15000mL乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，把蛴螬药渣按上述方法再处理1次，滤出乙醇提取液，残渣挥干乙醇，50℃干燥后，用25000mL 0.1mol/L的NaOH水溶液回流提取3次，每次3h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至4000mL，冷却至室温后加入2.5倍体积无水乙醇，4℃静置12小时后，3500g离心10分钟，收集沉淀。沉淀用2000mL水溶解，反复冻融8次，离心，弃去沉淀；采用Sevag法(即V多糖溶液︰V氯仿︰V正丁醇＝20︰4︰1混合振荡半小时，离心，静置分层，取水层)除蛋白，反复2次，离心弃去沉淀。将水溶液减压浓缩后置于冻干机上冻干；然后用样品重量1500倍的30％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度80℃，回流3h。将以上得到的水溶液用截流分子量6000Da的透析膜，对水透析48小时除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，70℃旋转蒸发仪减压浓缩至800mL。将浓缩液10000g离心10分钟后，上DEAE-sephadex A-25(80cm×8cm,i.d.)柱，用水以流速1.5mL/min洗脱10000mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至150mL。浓缩液8000g离心10分钟后，上Sephadex G-75(150cm×7.5cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速1.0mL/min洗脱，前1200mL洗脱液弃去，之后的洗脱液进行收集，共收集3000mL(分子量小于20kD的组分)，减压浓缩；冷冻干燥，得到蛴螬多糖组分26.1g。
以下通过试验例来进一步阐明本发明所述蛴螬多糖组分的物理化学性质和对疾病的治疗效果。
试验例1：蛴螬多糖组分的纯度及重均分子量的测定
色谱柱：Shodex sb-803HQ和sb-804HQ串联柱；流动相：0.1mol/L硫酸钠水溶液；流速：0.5mL/min；柱温：室温；仪器：Waters 2690高效液相色谱仪及工作站，Waters 2414示差折光检测器。标准葡聚糖Dextran T-410、T-150、T-50、T-12和T-5分别用流动相临用前配制成10mg/mL的溶液，高速离心，上清液进样量10μL，分别求得洗脱体积Ve；蓝色葡聚糖2000000及葡萄糖同法上样，分别求得柱的空体积V0和总体积Vt。根据公式Kav＝(Ve-Vo)/(Vt-Vo)计算各标准葡聚糖的分配系数(Kav)值，以Kav为横坐标，lg M为纵坐标，得到分子量测定标准曲线。
分别称取实施例1、2、3、4、5和6得到的多糖组分同上法制备，进样，均为单一对称峰，可见上述实施例得到的蛴螬多糖组分均为均一性多糖，计算可得重均分子量分别为8.08×103Da、8.97×103Da、9.22×103Da、7.92×103Da、7.33×103Da、9.85×103Da。
试验例2：蛴螬多糖组分的总糖、蛋白、糖醛酸、硫酸基和氨基含量的测定
总糖含量测定：以浓度为0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mg/mL的葡萄糖为标准制作标准曲线。准确称取实施例1～6得到的多糖，配制100mg/L的样品水溶液。精密吸取样品液2.0mL于试管中，加入6％苯酚溶液2.0mL及浓硫酸6.0mL，混匀，室温放置20分钟后于490nm波长处测吸光度值，以标准曲线计算总糖含量分别为47.21％、42.68％、40.77％、41.24％、43.39％和52.85％。
蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，以浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的牛血清白蛋白为标准制作标准曲线。准确称取实施例1～6得到的蛴螬多糖，配制500mg/L的样品水溶液。精密吸取样品液0.5mL于试管中，然后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0mL，混匀，于595nm波长处测吸光度值，以标准曲线计算蛋白质含量为11.47％、12.98％、14.53％、18.66％、12.18％和12.03％
糖醛酸含量测定：采用硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量，以浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.125mg/mL的半乳糖醛酸为标准制作标准曲线。准确称取实施例1～6得到的蛴螬多糖，配制500mg/L的样品水溶液。精密吸取样品液1.0mL于试管中，在冰水浴中向各管加入6mL浓硫酸，摇匀后，在沸水浴中准确加热10分钟，取出后冷至室温。各管加0.15％咔唑试剂0.5mL，充分混合，在室温下放置30分钟，以0mg/L半乳糖醛酸标准溶液管为空白，在530nm波长下测定吸光度，以标准曲线计算糖醛酸含量为28.16％、34.38％、31.22％、36.03％、32.81％和30.07％。
硫酸基含量测定：采用硫酸钡比浊法测定硫酸基的含量，以浓度为0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.70、0.80、0.90、1.0mg/mL的硫酸钾为标准制作标准曲线。准确称取实施例1～6得到的蛴螬多糖，配制500mg/L的样品水溶液。精密吸取样品液0.2mL于试管中，各加入3.8mL三氯乙酸和1mL氯化钡明胶，充分摇匀，静置15min，于紫外分光光度计360nm波长处测其吸光度A1，用1mL的明胶溶液代替氯化钡明胶溶液操作，测得吸光度A2。以标准曲线计算硫酸基含量为8.23％、8.66％、9.79％、10.12％、9.08％和8.76％。
试验例3：蛴螬多糖组分的单糖组成分析
多糖水解：分别精密称取实施例1～6的蛴螬样品20mg，置于50mL圆底烧瓶中，加入2mol/L的TFA 4mL，充氮气封管，110℃水解4h，冷却至室温，减压蒸干。加入1.5mL的甲醇溶解，减压蒸干，以上步骤重复3次，以除去多余的TFA，得到完全酸水解样品。
单糖衍生物的制备：将得到的完全酸水解样品，加入2mL蒸馏水溶解，分别加入30mg的硼氢化钠(NaBH4)和2mL蒸馏水振荡混匀，室温下还原4h，滴入醋酸分解过量的NaBH4直至无气泡产生。溶液在60℃以下减压蒸干，加入0.1％(v∶v)盐酸甲醇溶液5mL，充分振荡，旋转蒸发至干，以上步骤重复4次以除去硼酸根。剩余物置105℃烘箱15min，除去多余的水分。产物加入5mL醋酸酐，充氮气封管，110℃油浴1h，再加入2～3mL甲醇减压蒸干，重复操作3次，以完全除去乙酸酐。将以上得到的产物加入同等体积的氯仿和蒸馏水，充分混匀，静置。将有机层收集，水层用氯仿重复萃取2次。合并所有的氯仿层，并加入5g无水硫酸钠，室温放置30min，除去水分。将以上溶液过滤，减压蒸干，密封干燥器中保存备用。
GC分析方法：采用ISQ 110953GC-MS(Thermo Fisher Corp,USA)。色谱柱为HP-5毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)；FID检测器；载气：氦气；柱温：160℃(10min)～210℃(2min)(程序升温2℃/min)；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；分流比：50∶1；流速：0.8mL/min。
根据单糖的保留时间及峰面积确定实施例1～6得到的蛴螬多糖组分中中性单糖组成及其摩尔比分别为：
实施例1，鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1.0∶3.3∶12.1∶12.7；
实施例2，鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1.0∶3.2∶11.8∶12.9；
实施例3，鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1.0∶3.3∶12.4∶12.8；
实施例4，鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1.0∶3.1∶12.2∶13.0；
实施例5，鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1.0∶3.0∶12.3∶12.9；
实施例6，鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1.0∶2.9∶11.7∶12.8。
试验例4：蛴螬多糖组分对C57BL/6小鼠黑色素瘤B16的抗肿瘤作用及对免疫脏器的影响
实验动物：C57BL/6小鼠，体重18～22g，雌雄不拘，由第四军医大学实验动物中心提供。
瘤株：小鼠黑色素瘤B16购自陕西省中医药研究院实验动物中心。
实验分组：小鼠随机分为3组，即模型组、实施例1得到的蛴螬多糖(20mg/kg和50mg/kg)组。
对B16黑色素瘤的抑制作用：取对数生长期的B16细胞，用无菌生理盐水调细胞浓度为5×106/mL，备用。取C57BL/6小鼠24只，每只小鼠右后背部皮下接种细胞悬液0.2mL，24小时后将接种细胞的小鼠随机分3组，每组各8只，每日小鼠称重后，20mg/kg和50mg/kg蛴螬多糖组分别按体重腹腔注射给药1次，模型组给予生理盐水做对照。14天后小鼠称重，处死，取瘤块、胸腺、脾脏称重，按公式计算抑瘤率和脾脏指数、胸腺指数：
肿瘤抑瘤率/％＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％；
脏器指数＝脏器重量/体重
统计学处理：实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验进行分析，P<0.05表示有显著性差异。
结果：连续蛴螬多糖组分给药14天后，各组动物的瘤重、抑瘤率、免疫脏器指数见表1。蛴螬多糖两个剂量组小鼠的一般状态比模型组好，20mg/kg和50mg/kg蛴螬多糖组的抑瘤率分别为23.3％和48.1％；同时，蛴螬多糖组分可增加荷瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数。
表1蛴螬多糖对小鼠B16黑色素瘤的抑制作用及对免疫器官的影响(n＝8)
*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)。
试验例5：蛴螬多糖组分抑制肿瘤血管转移的作用
切片：取试验例4中模型组、20mg/kg和50mg/kg蛴螬多糖组14天给药后皮下肿瘤组织，用4％中性甲醛溶液将小鼠肿瘤组织固定后，进行石蜡包埋，用切片机切为4μm薄片。
微血管密度测定：采用免疫组织化学法测定。应用Envision试剂盒(DAKO)，血管内皮标志物CD34免疫组化染色按说明书进行：组织切片经微波法修复抗原后，CD34一抗4℃孵育过夜，PBS漂洗3次后，二抗37℃孵育1h，PBS漂洗后，二氨基联苯胺(DAB)底物显色和苏木精衬染。细胞浆或细胞膜呈棕黄色为阳性。移植瘤微血管密度(microvessel density，MVD)按Weidner法进行计数，在低倍镜(×100)下观察全片，找到血管最密处，再在高倍镜下(×400)拍照，每张片拍5个视野，将每个视野内的微血管数进行计数，取平均值，MVD值即为上述平均值。
蛴螬多糖对体外微管形成的影响：取新生婴儿脐带，找到脐静脉，在静脉中注入无菌PBS直至另一端流出无色清亮液体。在脐静脉中注入0.1％Ⅰ型胶原酶至下端酶溶液流出，用止血钳夹闭下端静脉，继续向静脉内注入胶原酶至充盈，再将脐带浸于装有1％双抗PBS的灭菌烧杯中，将脐静脉上端用止血钳夹闭，置37℃、5％CO2孵育箱内消化35min。待消化结束后，收集静脉冲洗液；用培养液冲洗脐静脉管腔1-2次，将冲洗液收集并与胶原酶混合，1000r/min离心5min，弃上清，细胞重悬于LONZA EGM-2(含10％胎牛血清)培养液，接种于培养瓶中，置37℃、5％CO2孵育箱中培养24h，更换培养基并将未贴壁的细胞除去。每隔2～3d更换1次培养基直至长成单层人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。将Matrigel人工基质胶加入96孔板中，固化1h。将HUVECs用含不同浓度的蛴螬多糖的培养液调整细胞密度后接种于96孔板中，并设对照组，于37℃孵育8h。然后用倒置显微镜观察，拍照。随机选择5个视野进行图像获取，对微观样结构进行计数。
统计学处理：实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验进行分析，P<0.05表示有显著性差异。
结果：从切片检查发现，对照组肿瘤细胞生长旺盛(图1)；蛴螬多糖的肿瘤组织中出现大面积坏死，细胞融合，结构不清(图2和图3)；检测血管内皮标记物CD34的表达，经微血管密度测定，模型组微血管为13.8/视野(图1)，20mg/kg蛴螬多糖组的微血管为7.7/视野(见图2)，50mg/kg蛴螬多糖组的微血管为4.1/视野(图3)。因此蛴螬多糖显著抑制肿瘤微血管生成。
从体外微管形成实验结果可见：对照组微管样结构明显，相互之间连接形成复杂的网状结构。20mg/kg和50mg/kg蛴螬多糖组形成的管腔状结构明显减少，抑制率分别为33.2％和50.7％。
试验例6：蛴螬多糖组分抗衰老、抗氧化的作用
实验动物：昆明种小鼠，雄性，体重18～22g；由第四军医大学实验动物中心提供。
实验材料：蛴螬多糖，按实施例1方法制备；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
实验分组：小鼠32只，随机分为4组，即正常对照组、衰老模型组、实施例1得到的蛴螬多糖100mg/kg和200mg/kg组，每组8只。
实验方法：小鼠适应喂养5天后，随机分组，除正常对照组外，各鼠每天在皮下注射D-半乳糖(1200mg/kg)，普通饲料常规喂养建立D-半乳糖衰老模型。45天后，给药组每日蛴螬多糖灌胃给药30天。给药结束后，进行小鼠水迷宫试验，测定小鼠定位航行和空间探索能力。水迷宫试验结束后，颈椎脱臼处死小鼠，摘除小鼠眼球，取眼眶血，置于抗凝离心管内3000r/min离心10min，取上清，备用；迅速取出脑组织用预冷的生理盐水洗去残留血，滤纸拭干，称重。按质量体积比为1g组织：9mL生理盐水制成10％组织匀浆液，备用。用试剂盒测定MDA含量，SOD、GSH-PX的活性。蛋白质含量用BCA法测定。
统计学处理：实验数据以均数±标准差表示，组间采用方差分析进行比较，P<0.05表示有显著性差异。
结果：蛴螬多糖对小鼠学习能力以及记忆能力影响的比较见表2。由表2可见，模型组小鼠的定位航行和空间探索中找到站台区域的时间明显高于正常组小鼠，60s内成功穿越站台的次数也明显减少，表明衰老动物学习能力以及记忆力明显下降。蛴螬多糖治疗后，各剂量组小鼠的定位航行和第一次穿越站台区域的时间明显缩短(P<0.05)，60s内穿越站台区域的次数显著增加(P<0.05)，且有明显的剂量依赖性。说明蛴螬多糖对提高小鼠的学习能力以及记忆力有一定的作用，具有抗衰老作用。
此外，蛴螬多糖对血清多种氧化酶的含量和活性测定结果见表3。由表3可见，正常组小鼠MDA含量，SOD及GSH-PX的活性分别为8.6±0.95nmol/mL、70.5±8.23U/mL和201.3±10.5U/mL，而衰老模型组的以上三种指标分别为15.7±3.35nmol/mL、57.3±7.34U/mL和166.7±13.9U/mL，有明显变化。经过30天蛴螬多糖的治疗，100mg/kg和200mg/kg蛴螬多糖组的血浆MDA含量分别为8.4±1.79nmol/mL和5.1±1.02nmol/mL，明显低于衰老模型组(P<0.05)，且呈剂量依赖性；而血清中SOD活性分别为75.6±10.1U/mL和89.8±9.97U/mL，明显高于衰老模型组(P<0.05)；GSH-PX活性分别为218.5±18.7U/mL和267.9±19.3U/mL，也显著性高于衰老模型组(P<0.05)。表明蛴螬多糖具有显著的抗衰老活性。
同时，从蛴螬多糖对脑组织MDA含量，SOD、GSH-PX及CAT活性的测定结果可见(表4)：与正常组比较，衰老组小鼠脑组织中SOD、GSH-PX和CAT活性显著降低(P＜0.01)，表明D-半乳糖对小鼠体内SOD等活性具有明显破坏作用，衰老模型构建成功。与衰老组相比，蛴螬多糖小鼠脑组织中SOD、GSH-PX及CAT活力显著上升，且呈剂量依赖关系；而MDA含量明显下降(P＜0.01)。此结果进一步表明蛴螬多糖可通过抗氧化产生显著的抗衰老活性。
表2蛴螬多糖对小鼠学习能力以及记忆能力的影响(n＝8)
*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)。
表3蛴螬多糖对小鼠血清MDA含量，SOD及GSH-PX活性的影响(n＝8)
*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)
表4蛴螬多糖对小鼠脑组织MDA含量，SOD、GSH-PX及CAT活性的影响(n＝8)
*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)
试验例7：蛴螬多糖组分降血糖的作用
实验动物：Balb/c小鼠，雄性，体重18～22g；由第四军医大学实验动物中心提供。
实验方法：小鼠适应喂养5天，禁食12h后，模型组和治疗组动物注射链脲佐菌素150mg/kg(用pH 4.5的柠檬酸钠溶液配制)，正常对照组注射相同体积柠檬酸钠溶液。72h后，尾部动脉取血测定血糖，血糖大于11.1mmol/L认为造模成功。选取造膜成功的小鼠24只，随机分3组，即模型组、实施例1得到的蛴螬多糖100mg/kg和200mg/kg治疗组；另设正常对照组(8只小鼠)。试验中采用给受试动物灌胃的给药方法，每2天给药一次。正常组和模型组给予生理盐水作对照。自由进食、饮水。实验周期4周，每周尾静脉采血，测空腹血糖。实验第4周末，小鼠腹主动脉采血，测定血清胰岛素水平。
统计学处理：实验数据以均数±标准差表示，组间采用方差分析进行比较，P<0.05表示有显著性差异。
结果：蛴螬多糖对糖尿病小鼠的血糖影响结果见表5。糖尿病小鼠的血糖含量明显高于正常组小鼠的血糖含量；同时，在整个治疗过程中，糖尿病小鼠的血糖含量明显增加。与模型对照组比较，蛴螬多糖给药后，各剂量组大鼠的血压均有不同程度的降低，降压效果有明显的剂量依赖性。4周时，模型组糖尿病小鼠的血糖含量是正常小鼠的4.5倍(P＜0.05)，蛴螬多糖治疗后的糖尿病小鼠的血糖含量显著降低，200mg/kg蛴螬多糖组降低至12.2±1.9mmol/L，降糖效果显著(P<0.05)。
此外，正常小鼠血清胰岛素含量为52.7±6.7mIU/L，糖尿病小鼠的血清胰岛素含量明显减少，仅为21.2±2.3mIU/L，经过4周的蛴螬多糖治疗，100mg/kg和200mg/kg蛴螬多糖组的血清胰岛素含量分别为40.3±4.5mIU/L和29.9±3.7mIU/L，明显高于糖尿病小鼠的血清胰岛素含量(P<0.05)。
表5蛴螬多糖对糖尿病小鼠血糖含量的影响(n＝8)
*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)
试验例8：蛴螬多糖组分降血压的作用
实验动物：自发高血压大鼠(SHR)，雄性，清洁级，体重180～220g；试验用SD大鼠，雄性，体重180～220g，由第四军医大学实验动物中心提供。
实验分组：SHR 15只，根据基础血压值随机分3组，即对照组、实施例1得到的蛴螬多糖20mg/kg和50mg/kg组。SD大鼠5只，为普通动物对照组。
实验方法：大鼠适应喂养5天后，对受试动物采用智能无创鼠尾血压计进行多次血压测量。根据实验大鼠的基础血压值随机分组。试验中采用给受试动物腹腔注射的给药方法，每2天给药一次。试验期间每周用药后2h测量血压、心率和体重各1次。正常组和模型组给予生理盐水作对照。给药连续4周后停止，继续观察一周。
统计学处理：实验数据以均数±标准差表示，组间采用方差分析进行比较，P<0.05表示有显著性差异。
结果：在实验过程中，各组动物生长良好，蛴螬多糖对实验大鼠体重增加无明显影响。蛴螬多糖对实验大鼠血压的影响结果见表6。与模型对照组比较，蛴螬多糖给药后，各剂量组大鼠的血压均有不同程度的降低，降压效果有明显的剂量依赖性。50mg/kg蛴螬多糖组大鼠的血压自第2周开始显著降低，至第4周从194.9±6.8mmHg降低至177.7±16.6mmHg，降压效果显著(P<0.05)，达到8.8％。
表6蛴螬多糖对大鼠收缩压的影响(n＝5)
*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)。

Claims (7)

1.一种蛴螬多糖组分，其特征在于，具有以下特征：单糖的组成及其摩尔比为：鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1∶2.8～3.4∶11.6～12.5∶12.6～13.1；重均分子量为7×103～10×103Da；总糖含量为40％～55％；蛋白质含量为10％～20％；糖醛酸含量为25％～37％；硫酸基含量为8％～11％。
2.一种权利要求1所述的蛴螬多糖组分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脱脂：将蛴螬粉碎，用有机溶剂回流、浸渍或渗漉法脱脂，脱脂后的蛴螬药渣干燥；
(2)碱水提取：将上述干燥药渣用相当于其重量4～12倍的碱水在80～100℃回流2～6小时，提取2～4次，合并水提液，将其减压浓缩至相当于原体积1/5～1/50的提取浓缩液，冷却至室温；
(3)沉淀析出：搅拌下向上述提取浓缩液加入2～4倍体积的甲醇、无水乙醇或丙酮，0～30℃静置4～24小时后，析出沉淀，离心，沉淀备用；
(4)除蛋白：将上述沉淀采用反复冻融法、Sevag法或两种方法合用除去大部分蛋白，离心除去沉淀，保留水相，浓缩干燥，得到浓缩干燥物；
(5)除色素：将上述浓缩干燥物用双氧水法、大孔吸附树脂法、活性碳法或多种方法合用除色素，水溶液备用；
(6)小分子杂质的去除：用截流分子量2000-8000Da的透析膜对上述水溶液进行水透析除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，将其减压浓缩至相当于原体积1/5～1/100的浓缩液，备用；
(7)分离：将上述浓缩液离心，取上清，上DEAE-sephadex A-25或DEAE-纤维素柱，用水溶液洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L氯化钠水溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集0.5mol/L氯化钠水溶液洗脱液，将其减压浓缩至相当于原体积1/2～1/200的洗脱浓缩液；
(8)纯化：将上述洗脱浓缩液离心后，上Sephadex G-100、Sephadex G-75、SephacrylS-400或Sephrose CL-6B凝胶柱，用水洗脱，收集分子量20kD以下组分的洗脱液，浓缩干燥，即得所述蛴螬多糖组分。
3.根据权利2所述的蛴螬多糖组分的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙醚、石油醚、苯或氯仿；
步骤(2)中，所述碱水为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸钾水溶液、氨水中的一种或多种的混合物；
步骤(5)中，所述除色素方法为双氧水法，即取所述浓缩干燥物，用相当于其重量100～3000倍的30％过氧化氢水溶液60～90℃回流1～5小时。
4.根据权利要求3所述的蛴螬多糖组分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脱脂：将蛴螬干燥药材粉碎，用相当于蛴螬重量2～8倍的乙醇在80～100℃加热回流提取2～4小时，共提取2～3次进行脱脂处理，弃提取液，脱脂后的蛴螬药渣干燥；
(2)碱水提取：将上述干燥药渣用相当于其重量5～8倍的0.05～0.3mol/L的氢氧化钠水溶液80～100℃回流2～3小时，提取2～3次，合并水提液，将其减压浓缩至相当于原体积1/5～1/30的提取浓缩液，冷却至室温；
(3)沉淀析出：搅拌下向上述提取浓缩液加入2～3倍体积的无水乙醇，0～30℃静置6～12小时后，析出沉淀，离心，沉淀备用；
(4)除蛋白：将上述沉淀反复冻融3～10次，再采用Sevag法除蛋白2～5次，离心除去沉淀，保留水相，浓缩干燥，得到浓缩干燥物；
(5)除色素：将上述浓缩干燥物用双氧水法除色素，脱色条件为样品重量100～3000倍的30％过氧化氢水溶液60～90℃回流1～5小时；水溶液备用；
(6)小分子杂质的去除：用截流分子量5000-8000Da的透析膜对上述水溶液进行水透析除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，将其减压浓缩至相当于原体积1/10～1/60的浓缩液，备用；
(7)分离：将上述浓缩液离心，取上清，上DEAE-sephadex A-25柱，用水溶液洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L的氯化钠水溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集0.5mol/L氯化钠水溶液洗脱液，将其减压浓缩至相当于原体积1/10～1/150的洗脱浓缩液；
(8)纯化：将上述洗脱浓缩液离心后，上Sephadex G-100或Sephacryl S-400凝胶柱，用水洗脱，收集分子量20kD以下组分的洗脱液，浓缩干燥，即得所述蛴螬多糖组分。
5.权利要求1所述的蛴螬多糖组分、权利要求2～4的制备方法制备的蛴螬多糖组分在制备抗肿瘤、降血糖、降血压、抗氧化、抗衰老或增强免疫的药物或者保健品中的用途。
6.权利要求1所述的蛴螬多糖组分、权利要求2～4的制备方法制备的蛴螬多糖组分在制备肿瘤血管生成抑制剂的药物中的用途。
7.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括卵巢癌、宫颈癌、肝细胞癌、甲状腺癌和神经内分泌癌。
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