CN101575383B - 从白扁豆中分离多糖的制备方法 - Google Patents
从白扁豆中分离多糖的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及从白扁豆中分离多糖的制备方法，有效解决从白扁豆中分离多糖的问题，其方法是，取白扁豆，粉碎后每次加白扁豆6～12倍重量体积的质量浓度为30～50％乙醇，超声提取2次，或回流提取2次，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，浓缩液加白扁豆10～15倍重量体积的蒸馏水搅拌、溶解，溶解液经3000转/分离心10min后，上清液通过大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱再用白扁豆2～4倍重量体积的蒸馏水冲洗，冲洗液和流出液合并，减压浓缩至白扁豆重量体积的2倍，再边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，使浓缩液中含醇量为70～80％，静置过夜，滤取底部沉淀物，用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤后，置玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，干燥即得白扁豆多糖。
Description
一、技术领域
本发明涉及植物成分分离，特别是一种从白扁豆中分离多糖的制备方法。
二、背景技术
白扁豆为豆科扁豆Dolichos lablab L.的干燥成熟种子，是一味食药兼用的中药，具有健脾化湿，和中消暑的功效，用于脾胃虚弱，食欲不振，大便溏泻，白带过多，暑湿吐泻，胸闷腹胀等。白扁豆含有脂肪油、蛋白质、尼克酸、氨基酸、维生素、磷脂、糖类，以及微量元素及钙、磷、铁等。但有关白扁豆有效成分深入的化学研究及其药理活性研究极少，尤其是其中多糖的提取分离工艺未见报道，白扁豆多糖具有很好的抗氧化和增强免疫的作用，由于白扁豆多糖来自纯天然的食药兼用药材，因此，能够以食品添加剂、颗粒冲剂、口服液、胶囊、滴丸、软胶囊等形式制备成保健品或药品，用于抗衰老和提高人体抗病能力，且白扁豆原料价廉易得，国内种植广泛，如能研制出有效分离白扁豆中多糖成分的方法，将造福广大人民和社会。
三、发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种从白扁豆中分离多糖的制备方法，可有效解决从白扁豆中分离多糖的问题，其解决的技术方案是，取白扁豆，粉碎后每次加白扁豆6～12倍重量体积的质量浓度为30～50％乙醇，超声提取2次，每次30min，或回流提取2次，每次2h～4h，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至无醇味，浓缩液加白扁豆10～15倍重量体积的50-80℃蒸馏水搅拌、溶解，得溶解液，溶解液经3000转/分离心10min后，得上清液，上清液通过大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱再用白扁豆2～4倍重量体积的蒸馏水冲洗，冲洗液和流出液合并，减压浓缩至白扁豆重量体积的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，使浓缩液中含醇量为70～80％，静置过夜(12小时)，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，20-30℃进行干燥，即得白扁豆多糖；所说的重量体积是指固体(药物)用g计，液体(乙醇和蒸馏水 等)用ml计(以下同)。本发明方法简单，操作方便，成本低，为白扁豆的深加工、提高产品附加值、增加农民收入提供了经济实惠的方法。
四、附图说明
图1为本发明的白扁豆多糖对羟基自由基的清除作用的曲线图。
五、具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
由技术方案给出，本发明还可由以下方法进行提取分离：
实施例1
取白扁豆50g，粉碎，置圆底烧瓶中，加质量浓度为50％的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量400ml，每次回流提取时间2h，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，加55℃的蒸馏水500ml搅拌、溶解，再经3000转/分离心10min，离心得的上清液通过D101型大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱以100ml蒸馏水冲洗，合并流出液和冲洗液，减压浓缩至约100ml，边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，调含醇量为70％，静置12小时，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，20℃干燥，即得白扁豆多糖。
实施例2
取白扁豆50g，粉碎，置圆底烧瓶中，加质量浓度为30％的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量500ml，每次回流提取时间3h，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，加70℃的蒸馏水700ml搅拌、溶解，再经3000转/分离心10min，离心得的上清液通过AB-8型大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱以150ml蒸馏水冲洗，合并流出液和冲洗液，减压浓缩至约100ml，边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，调含醇量为80％，静置12小时，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂， 25℃干燥，即得白扁豆多糖。
实施例3
取白扁豆50g，粉碎，置三角烧瓶中，加质量浓度为40％的乙醇超声提取2次，每次乙醇用量300ml，每次超声提取时间每次30min，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，加60℃的蒸馏水600ml搅拌、溶解，再经3000转/分速度离心10min，离心得的上清液通过AB-8型大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱以200ml蒸馏水冲洗，合并流出液和冲洗液，减压浓缩至约100ml，边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，调含醇量为75％，静置12小时，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，30℃干燥，即得白扁豆多糖。
实施例4：
取白扁豆50g，粉碎，置圆底烧瓶中，加质量浓度为35％的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量350ml，每次回流提取时间2.5h，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，加65℃的蒸馏水550ml搅拌、溶解，再经3000转/分离心10min，离心得的上清液通过D101型大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱以125ml蒸馏水冲洗，合并流出液和冲洗液，减压浓缩至约100ml，边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，调含醇量为73％，静置12小时，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，23℃干燥，即得白扁豆多糖。
实施例5：
取白扁豆50g，粉碎，置圆底烧瓶中，加质量浓度为35％的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量450ml，每次回流提取时间3.5h，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，加75℃的蒸馏水650ml搅拌、溶解，再经3000转/分离心10min，离心得的上清液通过D101型大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱以175ml蒸馏 水冲洗，合并流出液和冲洗液，减压浓缩至约100ml，边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，调含醇量为78％，静置12小时，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，28℃干燥，即得白扁豆多糖。
白扁豆多糖的抗氧化及免疫增强实验
1.白扁豆多糖的体外抗氧化作用-对羟自由基(-OH)的抑制作用，试验情况是：
采用邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系，通过Fenton反应生成羟自由基，促使邻二氮菲-Fe2+被氧化为邻二氮菲-Fe3+，造成其水溶液在波长510nm处最大吸收消失，来测算其清除率。试剂：pH7.4、0.2mol/L的磷酸缓冲液；7.5mmol/L邻二氮菲(以蒸馏水将50mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液稀释)；体积分数为0.1％的H2O2溶液；7.5mmol/LFeSO4溶液；白扁豆多糖的浓度依次为200μg/ml，400μg/ml，600μg/ml，800μg/ml，1000μg/ml。
操作方法：取试管，按照按表1的顺序和体积向试管中加各种试剂和样品，摇匀，并置于恒温水槽中，37℃保温60min，置于波长510nm处，测吸光度(A)，按下式计算羟自由基清除率，结果见图1。
表1 邻二氮菲-Fe2+-H2O2体系加样表：单位(ml)
清除率＝[(A2-A1)/(A0-A1)]×100％；A0为未损伤管的吸光值；A1为损伤管的吸光值；A2为样品管的吸光值。
由此得出，白扁豆多糖对-OH自由基具有明显的清除作用，并且随着多糖质量浓度的增加，清除能力增强，表明白扁豆多糖对-OH自由基的清除能力与多糖浓度有明显的量效关系，其中白扁豆多糖浓度约为700μg/ml时，羟基自由基的清除率是50％。
2.白扁豆多糖体内抗氧化试验情况如下：
取体重18-22g的昆明种小鼠40只，适应性饲养1周后，随机分成4组，每组10只。分别为空白对照组，多糖低剂量组(200mg·kg-1)，多糖中剂量组(300mg·kg-1)，多糖高剂量组(400mg·kg-1)。每天灌胃给药一次(0.2ml/10g)，连续15天口服给药(空白对照组给等量蒸馏水)。末次给药后24h，眼球取血，离心得小鼠血清，按照SOD、GSH-Px试剂盒的操作过程，测定白扁豆多糖对小鼠血清中的SOD及GSH-Px的影响，结果见表2。
表2白扁豆多糖对小鼠血清中SOD、GSH-Px的影响
*表示与空白组相比P＜0.05，**表示与空白组比P＜0.01
从表2中可以看出，与空白组相比，白扁豆多糖可显著地提高小鼠血清中SOD和GSH-Px活力，中剂量和大剂量组的作用具有极显著性(P＜0.01)，显示出白扁豆多糖具有较好的抗氧化作用。
3.白扁豆多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响的试验如下：
取小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服大、中、小剂量的白扁豆水溶液(200mg·kg-1，300mg·kg-1，400mg·kg-1；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(200mg·kg-1；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水。每天给药1次，连续给药10天。于10天早上各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml，于第10天灌胃给药后2h，给鸡红细胞后4h，脱颈椎处死小鼠。腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部，然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀，吸取少许腹腔液滴 于载玻片上，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数，结果见表3。
4.白扁豆多糖对正常小鼠溶血素形成的影响试验如下：
取小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服大、中、小剂量的白扁豆多糖水溶液(200mg·kg-1，300mg·kg-1，400mg·kg-1；0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(200mg·kg-1，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药12天。于给药第1天各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清。用生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀，37℃孵育30min，冰水中终止反应。另设不加补体的空白管作对照，吸取各管上清液于UV-2000型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况，结果见表3。
表3白扁豆多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和小鼠血清溶血素形成的影响
**表示与空白组比P＜0.01
从表3可以看出，与空白对照组比，大、中、小剂量组能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率(P＜0.01)，可显著提高腹腔巨噬细胞的吞噬指数(P＜0.01)，以大剂量组作用为强。从表3还可以看出，与空白对照组比，白扁豆多糖大、中、小剂量组溶血素OD值均显著升高(P＜0.01)，其中以中剂量组作用为最优。由此得出，白扁豆多糖可显著提高腹腔巨噬细胞的吞噬指数和吞噬百分率(P＜0.01)，可显著促进溶血素的形成，具有较好的增强免疫的作用。
本发明适用于对任何量的白扁豆进行多糖的分离，以稀乙醇为提取溶剂，减少淀粉、蛋白质类杂质的溶出，并采用大孔吸附树脂脱色，有效解决了从白扁豆中多糖的提取分离的技术难题，本发明操作简单，方法简单，成本较低，为制备抗衰老和提高免疫功能从而增强人体抗病力的保健品或药品提供了原料，是中药提取物上的一大创造，经济和社会效益巨大。
Claims (6)
1.一种从白扁豆中分离多糖的制备方法，其特征在于，取白扁豆，粉碎后每次加白扁豆6～12倍重量体积的质量浓度为30～50％乙醇，超声提取2次，每次30min，或回流提取2次，每次2h～4h，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至无醇味，浓缩液加白扁豆10～15倍重量体积的50-80℃蒸馏水搅拌、溶解，得溶解液，溶解液经3000转/分离心10min后，得上清液，上清液通过大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱再用白扁豆2～4倍重量体积的蒸馏水冲洗，冲洗液和流出液合并，减压浓缩至白扁豆重量体积的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，使浓缩液中含醇量为70～80％，静置过夜，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，20-30℃下进行干燥，即得白扁豆多糖；所说的重量体积是指固体用g计，液体用ml计。
2.一种从白扁豆中分离多糖的制备方法，其特征在于，取白扁豆50g，粉碎，置圆底烧瓶中，加质量浓度为50％的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量400ml，每次回流提取时间2h，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，加55℃的蒸馏水500ml搅拌、溶解，再经3000转/分离心10min，离心得的上清液通过D101型大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱以100ml蒸馏水冲洗，合并流出液和冲洗液，减压浓缩至100ml，边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，调含醇量为70％，静置12小时，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，20℃干燥，即得白扁豆多糖。
3.一种从白扁豆中分离多糖的制备方法，其特征在于，取白扁豆50g，粉碎，置圆底烧瓶中，加质量浓度为30％的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量500ml，每次回流提取时间3h，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，加70℃的蒸馏水700ml搅拌、溶解，再经3000转/分离心10min，离心得的上清液通过AB-8型大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱以150ml蒸馏水冲洗，合并流出液和冲洗液，减压浓缩至100ml，边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，调含醇量为80％，静置12小时，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，25℃干燥，即得白扁豆多糖。
4.一种从白扁豆中分离多糖的制备方法，其特征在于，取白扁豆50g，粉碎，置三角烧瓶中，加质量浓度为40％的乙醇超声提取2次，每次乙醇用量300ml，每次超声提取时间30min，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，加60℃的蒸馏水600ml搅拌、溶解，再经3000转/分速度离心10min，离心得的上清液通过AB-8型大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱以200ml蒸馏水冲洗，合并流出液和冲洗液，减压浓缩至100ml，边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，调含醇量为75％，静置12小时，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，30℃干燥，即得白扁豆多糖。
5.一种从白扁豆中分离多糖的制备方法，其特征在于，取白扁豆50g，粉碎，置圆底烧瓶中，加质量浓度为35％的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量350ml，每次回流提取时间2.5h，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，加65℃的蒸馏水550ml搅拌、溶解，再经3000转/分离心10min，离心得的上清液通过D101型大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱以125ml蒸馏水冲洗，合并流出液和冲洗液，减压浓缩至100ml，边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，调含醇量为73％，静置12小时，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，23℃干燥，即得白扁豆多糖。
6.一种从白扁豆中分离多糖的制备方法，其特征在于，取白扁豆50g，粉碎，置圆底烧瓶中，加质量浓度为35％的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量450ml，每次回流提取时间3.5h，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，加75℃的蒸馏水650ml搅拌、溶解，再经3000转/分离心10min，离心得的上清液通过D101型大孔吸附树脂柱，收集流出液，树脂柱以175ml蒸馏水冲洗，合并流出液和冲洗液，减压浓缩至100ml，边搅拌边加质量浓度为95％乙醇，调含醇量为78％，静置12小时，滤取底部沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗涤后，置于玻璃真空干燥器内，以五氧化二磷为干燥剂，28℃干燥，即得白扁豆多糖。
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