CN108623700A - 一种沙棘多糖的提取工艺及其应用 - Google Patents

Abstract

通过响应面法优化得到的沙棘多糖制备工艺，微波功率为550~650W，提取时间为4~8min，液料比为5~15:1(mL:g)，提取温度为80~90℃，经过醇沉后测定多糖提取率为0.18~0.32%。实验结果表明微波功率对提取率和抗氧化活性影响显著，功率越高，提取率和抗氧化活性均降低；此工艺下沙棘多糖在3个体外抗氧化体系中抗氧化活性均高于VC，具有很强的抗氧化活性；多糖组成为葡萄糖和甘露糖的比例2:1。

Description

一种沙棘多糖的提取工艺及其应用

技术领域

本发明涉及沙棘多糖提取工艺，属医药技术领域，是一种沙棘抗氧化活性提取物及其制备工艺。

背景技术

1956年，英国人Harman提出“自由基学说”，该学说认为自由基攻击生命大分子造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤恶性疾病的重大原因。随着人们对自由基研究的深入，这一学说也被越来越多的人接受。自由基是指“任何包含一个未成对电子的原子或原子团”，对人体健康影响极大。在生理情况下，氧处于较低水平，其产生和清除处于动态平衡，但在某些病理情况下，自由基过剩，导致机体损伤。自由基除本身对生物大分子（蛋白质、DNA）有损伤作用外，还会造成多不饱和脂肪酸的脂质过氧化（LPO），而LPO反应的终产物是丙二醛（MDA），从而使蛋白质、核酸、脑磷脂发生交联并丧失其活性。大量研究表明，与老化相关的疾病和基因的突变，如癌症、心血管疾病、风湿性关节炎、糖尿病、神经性疾病、衰老等都由基导致的损伤相关，清除了体内多余的自由基就能预防衰老和疾病。因此寻求利用人体易吸收的、能清除体内过量自由基的外源抗氧化剂成为一个新的研究热点。然而，随着合成抗氧化剂日益突出的潜在独行和致癌作用被人们排斥，从植物中寻找天然、高效、低毒的抗氧化剂就成为了目前抗氧化剂发展的一个必然趋势，同时也为现代医学和保健行业指明了方向。

沙棘又名醋柳、黄酸刺、酸刺柳、黑刺和酸刺等，属胡颓子科沙棘属落叶灌木或小乔木。其耐旱，抗风沙，可以在盐碱化土地上生存，因此被广泛用于水土保持，具有很高的生态价值。沙棘果实中维生素C含量高，素有维生素C之王的美称。沙棘为药食同源植物，其根、茎、叶、花和果，特别是沙棘果实含有丰富的营养物质和生物活性物质。沙棘果实入药具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效。现代医学研究，沙棘可降低胆固醇，缓解心绞痛发作，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用。沙棘多糖（Polysaccharides fromHippophae rhamnoides）为沙棘中的重要化学成分，近年来对多糖的研究已经深入到各个应用领域，但对于沙棘多糖的提取研究还处于相对浅显阶段，目前国内外尚无高效制取具有抗氧化活性的沙棘多糖的技术手段，有专家们预言称21世纪将是多糖的时代，所以针对沙棘多糖的进一步开发将会具有非凡的价值和意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种纯度高，抗氧化活性好的沙棘多糖的提取工艺。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：

第一步脱脂，取适量的沙棘鲜果去除梗，然后用水洗去杂质，再将处理后的鲜果倒入研钵中，将其研碎，再将研碎的沙棘鲜果倒入大烧杯中，向烧杯中加入适量的石油醚进行脱脂，脱脂过程中需要不断搅拌，一般脱脂时间为12~16 h，脱脂完成后，将石油醚倒出，回收。处理后的沙棘汁及果渣用保鲜膜封口，作为实验用样品。

第二步微波提取，取捣碎的沙棘汁及果渣，以蒸馏水为溶剂，使用超声—微波协同萃取仪进行提取，提取参数为：微波功率550W~650 W，提取时间4~8min，液料比5:1~15:1(mL:g)，提取温度80℃~90℃。提取后的沙棘汁及果渣使用滤布过滤，去除果渣。滤出的沙棘汁倒入圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪将提取液浓缩至原体积的1/4~1/5。

第三步醇沉，采用醇沉工艺原理对多糖进行醇沉，多糖是多羟基的醛或酮，可溶于水，但是多糖水溶液中加入乙醇会破坏其中的氢键，从而降低多糖在水中的溶解度，使多糖以沉淀的形式析出。利用多糖溶于水而不溶于高浓度的乙醇，可使多糖沉淀出来。向浓缩加入4~6倍量的无水乙醇至溶液终浓度75%以上，置于4℃环境冷藏12h~24h，进行醇析。

第四步烘干，取第三步醇沉溶液，3000~4500r/min离心，取沉淀物在65℃~75℃烘干，得沙棘粗多糖。

第五步计算粗多糖提取率，取0.1g沙棘粗多糖，定容至100 mL，作为含量测定用的原液。用移液管从原液中移除1 mL放入小烧杯中，然后向小烧杯中加入4 mL蒸馏水，摇匀，即将原液稀释5倍。取稀释液1 mL加入到试管中，再加入1 mL新配制的5%的苯酚溶液，然后立即加入5 mL浓硫酸，摇匀，每个样品做三个平行，放于40℃的水浴锅中，水浴30min，取出冷却至室温。在490 nm下测定吸光度，测定出沙棘多糖含量（mg/mL）。

本发明可以开拓农林产品的综合利用，带动林区经济的繁荣，本发明对沙棘粗多糖进行研究为对沙棘更好地开发利用，为其临床疗效的奠定基础。

第六步采用总还原力、清除羟基自由基能力和清除DPPH自由基能力的测定试验测定沙棘多糖抗氧化活性，包括单因素微波功率实验中功率及最优条件多糖的抗氧化作用。

第七部采用最优工艺条件下的多糖进行气相色谱分析，鉴定多糖的组成。

附图说明：

图1是微波功率与提取时间对提取率的等高线，图2是微波功率与提取时间对提取率的响应面图，图3是微波功率与液料比对提取率的等高线，图4是微波功率与液料比对提取率的响应面图，图5是微波功率与提取温度对提取率的等高线，图6是微波功率与提取温度对提取率的响应面图，图7是提取时间与液料比对提取率的等高线，图8提取时间与液料比对提取率的响应面图，图9提取时间与提取温度对提取率的等高线，图10提取时间与提取温度对提取率的响应面图，图11提取温度与液料比对提取率的等高线，图12提取温度与液料比对提取率的响应面图，图13沙棘粗多糖和Vc的还原能力，图14沙棘粗多糖和Vc对羟基自由基的清除，图15是沙棘粗多糖和Vc对DPPH的清除，图16是沙棘粗多糖的气相色谱图。

具体实施方式：

以下结合具体实例进一步说明本发明。

实施例1：沙棘粗多糖的制备方法

（1）将10 g沙棘鲜果洗净除梗，将其置研钵研碎，再将研碎的沙棘鲜果倒入大烧杯中，向烧杯中加入适量的石油醚进行脱脂12h。

（2）使用超声—微波协同萃取仪进行提取，提取参数采用单因素实验进行考察，分别为，微波功率600 W、提取时间6 min、液料比10:1 (mL:g)、提取温度85℃。提取后的沙棘汁及果渣使用滤布过滤，去除果渣。滤出的沙棘汁倒入圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪将提取液浓缩至20 mL。

（3）利用多糖溶于水而不溶于高浓度的乙醇，可使多糖沉淀出来。将浓缩液置于150 mL烧杯中，加入4倍量的75%的乙醇，进行醇析。用保鲜膜封口置于4℃的冰箱中12 h。

（4）烘干，取第三步醇沉溶液，4000r/min离心，取沉淀物在70℃烘干，得沙棘粗多糖。

（5）取0.1g沙棘粗多糖，测定出沙棘多糖含量（mg/mL），测得沙棘多糖提取率为0.2275%。

实施例2：沙棘粗多糖提取的工艺优化

进行单因素实验考察最佳提取参数：

(1)微波功率对沙棘粗多糖的提取效果的影响。改变提取的微波功率，其余条件不变，选取5组提取功率，分别为500 W、550 W、600 W、650 W、700 W，提取时间6min，液料比10:1(mL:g)，提取温度85℃。使用超声-微波协同萃取仪进行提取，滤出的沙棘汁倒入圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪将提取液浓缩至20 mL 左右，将浓缩液倒入150 mL 烧杯中，向烧杯中加入4倍量的的乙醇，至终浓度大于75%，进行醇沉10h，使用高速冷冻离心机4000r /min离心10min，倒出上清液，乙醇回收，将沉淀用水冲洗，转移到100mL 容量瓶中，定容，含量测定得出结论，微波功率在600 W时，提取率达到最大值。

(2)提取时间对沙棘粗多糖的提取效果的影响。改变提取的时间，其余条件不变，进行单因素实验。选取5组提取时间，分别为4 min、6 min、8 min、10 min、12 min，微波功率600 W，液料比10:1，提取温度85℃。以后的提取步骤与上相同，结论得出当提取时间达到6min时，得出来的吸光度最大。

(3)液料比对沙棘粗多糖的提取效果的影响。改变提取的液料比，其余条件不变，进行单因素实验。选取5组液料比，分别为5:1、10:1、15:1、20:1、25:1，微波功率600 W，提取时间6 min，提取温度85℃。结论得出当液料比在10:1时，沙棘粗多糖的提取率最大以后的提取步骤与上相同，结论得出当液料比在10:1时，沙棘粗多糖的提取率最大。

(4)提取温度对沙棘粗多糖的提取效果的影响。改变提取的温度，其余条件不变，进行单因素实验。选取5组提取温度，分别为70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，微波功率600 W，提取时间6 min，液料比10:1。以后的提取步骤与上相同，结论得出当温度达到85℃时，吸光度出现最大值。

响应面优化实验：

(1)采用响应面分析法优化沙棘果粗多糖提取工艺，根据单因素实验结果，最终确定在微波功率600 W、提取时间6 min、液料比10:1（mL: g）、提取温度85℃的条件下，沙棘粗多糖提取效果最好，此时的提取率最大。响应面试验中选取微波功率A、提取时间B、液料比C、提取温度D 四个因素作为自变量，以沙棘粗多糖的提取率为响应值，采用响应面分析法，对沙棘粗多糖微波辅助提取工艺参数进行优化，实验因素及水平见下表1。

表1实验因素与水平

利用实验设计软件Design-Expert,根据Box-Behnken Design，设计得到的四因素三水平的响应面分析实验方案及结果见下表2。

表2响应面分析实验方案及结果

试验号	A	B	C	D	多糖提取率（％）（%）
						１	0	0	0	0	0.2310
2	-1	0	0	-1	0.1670
						3	-1	0	-1	0	0.1375
4	-1	0	1	0	0.1505
						5	0	-1	0	1	0.2145
6	-1	1	0	0	0.1635
						7	1	-1	0	0	0.2590
8	-1	-1	0	0	0.1810
						9	0	0	0	0	0.2510
10	0	0	1	1	0.1700
						11	0	1	0	1	0.1940
12	1	0	0	1	0.1755
						13	0	-1	-1	0	0.1505
14	0	0	-1	1	0.1810
						15	0	-1	0	-1	0.1525
16	0	0	1	-1	0.1705
						17	0	0	0	0	0.2610
18	0	1	-1	0	0.1315
						19	-1	0	0	1	0.1460
20	0	-1	1	0	0.1785
						21	1	0	1	0	0.1770
22	1	0	0	-1	0.1475
						23	1	0	-1	0	0.1660
24	0	0	0	0	0.2530
						25	0	0	-1	-1	0.1765
26	0	1	0	-1	0.1870
						27	0	0	0	0	0.2470
28	1	1	0	0	0.1560
						29	0	1	1	0	0.1590

本实验中，1、9、17、24、27组为中心实验，其余均为析因实验，29个试验点总共分为析因点和零点，其中析因点是与自变量A、B、C、D所对应的三维顶点，零点实验重复5次，用以估计实验误差。

使用Design-Expert8.0.5软件BB设计，定义提取率为Y，经多元回归拟合，得出沙棘粗多糖提取率的预测值对A、B、C、D编码值的二次回归模型方程： Y=0.25+0.011A-0.012B+5.208x10^-3C+6.667x10^-3D-0.021AB-5.000x10^-4AC+0.012AD-1.250x10^-4BC-0.014BD-1.250x10^-3CD-0.041A²-0.029B²-0.051C²-0.035D²(-1≤A≤1，-1≤B≤1，-1≤C≤1，-1≤D≤1)。回归模型方差分析结果见下表3。

表3回归模型方差分析结果

注：*代表显著；**代表极显著。

由表3中的方差分析结果可见 , 实验因子与响应值间存在的不是简单的线性关系。整体模型的P = 0.0029<0.05，表明该二次模型具有显著性。二次项因子中A、B、C、D显著，而一次项因子，交互项不显著。根据模型的确定系数r2 = 0.8284可知，模型的可靠性较好，可以用来解释82.84%的数据。失拟项P = 0.0579 > 0.05，表明该模型失拟检验不显著，说明模型与实际实验拟合较好。所以，从以上数据来看，该模型适用于沙棘果粗多糖的提取结果的分析和预测。

(2)沙棘果粗多糖提取率的响应面分析

响应面的图形分析是特定的响应值与对应的自变量构成的三维空间图，可直观反映各因素对响应值的影响，通过对图形的分析，找到各因素在反应过程中的相互作用，为工业化生产或以后的研究，奠定一定的基础。优化响应曲面图分别见说明书附图1~图2

根据说明书附图1~图2可知，在保持液料比10:1，提取温度85℃时，微波功率和提取时间对沙棘粗多糖提取率的交互影响效应不太显著，微波功率升高，有助于沙棘粗多糖的提取，表现为曲线较陡，当响应值达到极值后，随着微波功率的增大，沙棘粗多糖得率下降，说明过高过低的微波功率均不利于提取。提取时间的影响不是太显著，但是在图中也表现为曲线较为陡峭，时间过长或过短对沙棘粗多糖的提取也造成一定的影响。

根据说明书附图3~图4可看出，当提取时间为最佳值（6 min），提取温度为最佳值（85℃）时，微波功率和液料比对沙棘粗多糖提取率的交互作用。随着微波功率的增加，液料比的增加多糖提取率均呈现先上升后下降的趋势。微波功率和液料比分别在600 ~ 650 W和10:1 ~ 15:1的范围内，沙棘多糖提取率可达到本次试验的最大值。

根据附图说明书图5~图6可知，当提取时间为最佳值（6min），液料比为最佳值（10:1）时，微波功率和提取温度对多糖提取率的交互作用。提取温度在75℃ ~ 85℃之间时，曲面较陡，呈上升趋势，表明温度的上升，促进多糖的提取率；在85℃ ~ 95℃之间，曲面变化趋于平滑，呈下降趋势，表明随着温度的继续增加，多糖提取率改变不大，且有降低的趋势。

根据附图说明书图7~图8可知，当提取时间为最佳值（6 min），微波功率为最佳值(600 W)时，提取时间和液料比对多糖提取率的交互作用。液料比在5:1 ~ 10:1(mL:g)时，曲面表现较陡，且呈上升趋势，表明随着液料比的增加，提取率增加；在10:1 ~ 15:1(mL:g)时，曲线表现平缓，呈下降趋势，表明，在增加蒸馏水的体积时，多糖浓度被稀释，提取率不再上升，反而下降。

根据附图说明书图9~图10可知，当液料比为最佳值/10:1(mL:g)，微波功率为最佳值(600 W)时，提取时间和提取温度对多糖提取率的交互作用。提取时间在4 ~ 6 min时，曲面表现较陡，且呈上升趋势，在6 ~ 8min时，曲线表现平缓，呈下降趋势；表明，沙棘粗多糖的提取率在4 ~ 6 min时，随着提取时间的增加，提取率增加；超过6 min时，沙棘粗多糖的提取量有所降低。但变化不是太明显。

根据说明书附图11~12可知，当微波功率为最佳值（600 W）提取时间为最佳值（6min）时，提取温度和液料比对多糖提取率的交互作用。随着提取温度增加和液料比的增加呈现先升高后降低的趋势。提取温度在85 ~ 90℃范围，料液比在10:1 ~ 15:1范围时有较高的多糖提取率。

综合说明书附图的前12幅图形，反映出各因素交互作用对响应值的影响，等高线的形状反映交互效应的强弱，等高线越趋于圆形交互作用越不显著，趋于椭圆形则正好相反。从上图中可以知道图1、图5、图7、图9，等高线趋于椭圆，则交互作用更接近显著，而图3、图11，等高线趋于圆形，则交互作用不显著。对于响应面图来说，从总体看，若因素对多糖产率影响显著，则表现为曲面更陡峭。

(3)响应面验证试验

经过多次的线性拟合和响应面分析，最终Design-Expert.8.0.5软件给出最佳提取参数（编码制下提取参数：0.259、-0.355、0.047、0.212），即微波功率612.95 W，提取时间5.29min，液料比10.23:1(mL:g)，提取温度86.06℃，在最佳提取条件下，得到理论多糖提取率为0.2530%。

为了验证模型预测的准确性，又考虑到超声-微波协同萃取仪的要求，修正最佳提取参数：微波功率613 W、提取时间5.3 min、液料比10.23:1、提取温度86℃，在最佳提取条件下重复进行三次实验，分别得到沙棘粗多糖的提取率为0.2513%、0.2520%、0.2508%。3次实验所得多糖提取率的平均值为0.2514%，相对误差为0.64%。可见，实验实际值与实验预测值基本一致，表明，该模型能较好的预测沙棘粗多糖的实际提取情况，对以后沙棘果粗多糖的提取与研究奠定一定的基础，为以后的工业化生产提供一定的指导。

实施例3：沙棘多糖总还原力的测定试验

采用实施例1所制得沙棘粗多糖进行活性试验。

沙棘多糖浓度采用0.05 mg/mL，并稀释成不同的浓度梯度（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL）,各取10μL上述浓度的多糖溶液，加入pH 6.6的磷酸盐缓冲液25μL、1%铁氰化钾25μL，混合均匀后放于50℃恒温培养箱中保温20 min，冷却后加入10%三氯乙酸25 μL，加蒸馏水85μL和三氯化铁17μL。常温反应后用酶标仪在700 nm处测定吸光值，平行3次，取平均值。吸光值越高，说明这种反应混合物的还原性越强。用VC作对照，蒸馏水配制。

实验结果如表4、说明书附图图13所示:

表4沙棘粗多糖及VC的总还原力吸光度

	沙棘粗多糖吸光度	VC吸光度
			0.01mg/mL	0.089±0.0093	0.082±0.0042
0.02mg/mL	0.114±0.0159	0.114±0.0110
			0.03mg/mL	0.182±0.0117	0.143±0.0067
0.04mg/mL	0.209±0.0070	0.193±0.0156
			0.05mg/mL	0.202±0.0130	0.193±0.0032

如图说明书附图13，总还原力的测定图形显示，在同一浓度下，随着浓度的增加，沙棘粗多糖和VC的吸光度都呈现上升趋势，还原能力逐渐增强。

实施例4:沙棘多糖清除羟基自由基能力的测定试验

采用实施例1所制得沙棘粗多糖进行活性试验。

用移液枪精确移取2.0 mmoL/L邻二氮菲40 μL，依次加入PBS（pH = 7.40）40 μL，蒸馏水20 μL，充分混匀后，加入0.75 mmoL/L硫酸亚铁20 μL，混匀，加质量分数为0.12%的过氧化氢20 μL，37℃下保温60 min。用酶标仪在505 nm处测定其吸光度，即为Ap值。

以上添加试剂种类与量不变，加入过程不变。只将0.12%的过氧化氢用蒸馏水代替，测定其吸光度，即为Ab值。

使用0.05 mg/mL的沙棘多糖作为样品，将其稀释成5个浓度梯度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL,以上实验步骤不变，只是将Ap中的蒸馏水换成不同浓度的多糖，用酶标仪在505 nm处测定其吸光度，即为As值。以抗坏血酸作为标准抗氧化剂，各管分设三个平行管。用平均值按下式计算羟基自由基清除率。

实验数据如表5、说明书附图14所示:

表5沙棘粗多糖及VC对羟基自由基的清除率

	沙棘粗多糖清除率%	VC清除率%
			0.01mg/mL	36.6±3.049	11.59±0.610
0.02mg/mL	56.1±2.199	18.90±0.352
			0.03mg/mL	77.4±1.829	30.49±2.439
0.04mg/mL	98.2±1.220	35.37±0.610
			0.05mg/mL	104.3±1.220	57.32±3.659

根据实验数据所得，沙棘粗多糖清除羟基自由基能力的IC₅₀=0.015 mg/mL，VC的IC₅₀=0.05 mg/mL。根据IC₅₀的值可以得到沙棘多糖在清除羟基自由基方面表现良好，要强于VC。

实施例5:沙棘多糖清除DPPH自由基能力的测定试验

采用实施例1所制得沙棘粗多糖进行活性试验。取0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL的沙棘粗多糖溶液100 μL，加入等体积,浓度为0.5 mmoL/L的DPPH溶液（用无水乙醇配制），混匀后在室温下避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度Ai。取上述浓度梯度的沙棘粗多糖溶液100μL加上等体积无水乙醇，在517 nm处测定吸光度Aj，平行测定3次取平均值。空白对照组为100 μL DPPH溶液加上等体积无水乙醇，在517 nm处测定吸光值为Ao。并用0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL的VC代替沙棘多糖溶液作阳性对照。

实验结果如表6、图15所示：

表6沙棘粗多糖及VC对DPPH自由基的清除率

	沙棘粗多糖清除率%	VC清除率%
			0.01mg/mL	46.53±0.088	37.10±3.743
0.02mg/mL	55.57±2.732	43.97±2.399
			0.03mg/mL	59.69±5.027	48.55±1.594
0.04mg/mL	70.38±6.578	54.35±2.568
			0.05mg/mL	76.03±5.400	56.03±3.743

沙棘粗多糖和VC在0.01～0.05 mg/mL范围内清除DPPH自由基有较好的量效关系，二者均随浓度的增加清除率增强。沙棘粗多糖的IC₅₀=0.014 mg/mL，VC的IC₅₀=0.031 mg/mL。由IC₅₀值明显看出沙棘多糖有明显的清除羟基自由基的能力且强于VC。

实施例6：微波功率对抗氧化活性的影响

根据微波作用原理可知，物质的加热过程与物质内部分子的极化有着密切的关系，所以，微波功率的改变可能影响着沙棘果多糖的结构，从而，沙棘多糖可能会失去抗氧化活性或抗氧化活性降低，所以要单独研究微波功率对沙棘果粗多糖抗氧化活性的影响。

(1)总还原力的测定：实验选取三个微波功率下的沙棘粗多糖进行研究，分别为550 W、600 W、650 W，用VC作为对照。

表7总还原力数据

	550 W多糖	600 W多糖	650 W多糖	VC
					吸光度A	0.184±0.0193	0.270±0.0252	0.190±0.0071	0.211±0.0157

由以上表7可知，沙棘粗多糖在微波功率达到600 W时，吸光度最大，表现为总还原力最强，VC的吸光度略低于600 W下多糖的吸光度，在总还原力方面要好于VC；微波功率在550 W和650 W时，吸光度都低于VC，表明在总还原力上，550 W下的多糖和650W下的多糖，总还原力不如VC好。由以上数据和分析可知，微波功率在550 W下不利于沙棘提取，微波功率在650W下，虽然微波功率增加，但可能破坏了沙棘多糖的结构，导致抗氧化活性降低。

(2)清除羟基自由基能力的测定：实验选取三个微波功率下的沙棘粗多糖进行研究，分别为550 W、600 W、650 W，用VC作为对照。实验步骤按照“沙棘多糖对羟基自由基的清除能力测定”的步骤进行操作，实验所得数据如下表,根据清除率计算公式，分别计算出不同微波下多糖的清除率。

表8不同微波下多糖及VC的清除率

	550W多糖	600W多糖	650W多糖	VC
					清除率%	42.68±1.829	109.15±2.439	62.80±2.533	45.73±1.220

由以上表8显示，不同的微波功率影响沙棘粗多糖对羟基自由基的清除，由柱状图可看出微波功率在600 W下清除率最大，要比550 W，650 W下的多糖清除效果好。再与VC作比较可看出，600 W下的多糖清除羟基自由基的能力比VC要好。

(3)清除DPPH自由基能力的测定：实验选取三个微波功率下的沙棘粗多糖进行研究，分别为550 W、600 W、650 W，用VC作为对照。实验数据如下表。

表9不同功率下多糖及VC的清除率

	550 W多糖	600 W多糖	650 W多糖	VC
					清除率%	45.03±1.296	53.90±1.340	38.91±0.374	52.21±0.153

由以上表9可得到，600 W下的多糖在清除DPPH自由基方面比550 W，650 W下的多糖效果要好，这表明，微波功率影响了沙棘粗多糖的抗氧化活性，所以，寻找一个好的微波功率有利于沙棘多糖更好的发挥抗氧化性能。用VC对比600 W下的沙棘粗多糖，可以看出在600W下沙棘粗多糖对DPPH自由基的清除能力与VC接近，且略高于VC，表明了沙棘粗多糖在清除DPPH自由基方面优于VC。

实施例七：气相色谱测定多糖的条件

(1)标准糖乙酰化：取D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-木糖和D-甘露糖各10mg，分别加入盐酸羟胺12mg，吡啶0.5 mL，密闭，90 ℃水浴振荡30 min。待反应冷却后，加入乙酸酐0.5 mL，90 ℃水浴振荡30 min。反应后真空干燥箱中蒸干，用3mL氯仿溶解，加入0.2mL水萃取，萃取两次，取下层用微孔滤膜过滤。将8个样进行气相分析。

(2)三氟乙酸水解：准确称取沙棘粗多糖20mg于50 mL反应釜中，加入2 mol/L三氟乙酸4 mL，110 ℃反应12 h，将反应液倒入蒸发皿中，加入5 mL甲醇反复洗三次，置于真空干燥箱中烘干，除尽三氟乙酸（发生酯化反应），烘干温度设定为40℃。

(3)多糖乙酰化：向烘干的沙棘多糖粉末中，加入12mg盐酸羟胺和0.6 mL的吡啶于90 ℃水浴30 min并不时振荡（密闭）。待反应冷却后，加入乙酸酐（进攻羟基氧）0.6 mL再在90 ℃水浴下反应30 min，反应后于真空干燥箱中烘干（温度为40℃），用2 mL氯仿溶解，加少量水萃取，微孔滤膜过滤，将样品进行气相分析。

(4)GC分析条件：毛细管色谱柱Rtx-1（30 m×0.32 mm×0.25 μm），高纯氮作载气，柱流量1.50 mL/min。程序升温：气化室温度280℃，柱初温60 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升至100℃，再以6 ℃/min升至200 ℃，最后以1 0℃/min 升至290 ℃，保持10 min，进样量为0.2 μL，分流比为1:50，FID检测器，检测器温度为290.0 ℃。

根据说明书附图16可知，沙棘多糖中含有葡萄糖：甘露糖为2：1。

Claims (6)

1.本发明是一种响应面优化微波辅助提取沙棘多糖及其抗氧化作用的方法，具体提取工艺条件为：微波功率为550~650W, 提取时间为4~8min，液料比为5~15:1(mL:g)，提取温度为80~90℃，提取液浓缩至1/4~1/5，加无水乙醇醇沉浓度约75%，得多糖提取率为0.18~0.32%，多糖组成葡萄糖和甘露糖的比例为2:1，最佳工艺条件下，沙棘多糖的抗氧化活性高于VC，制备的沙棘多糖具有很强抗氧化能力。

2.根据权利要求1所述的不同的微波辅助功率的抗氧化活性不同，且微波功率越高活性越低，最佳微波功率为550~650W。

3.根据权利要求1所述的沙棘多糖提取方法中，提取时间为4~8min。

4.根据权利要求1所述的沙棘多糖提取方法中，提取温度为80~90℃。

5.根据权利要求1所述的沙棘多糖提取方法中，液料比为5~15:1(mL:g)。

6.根据权利要求1所述的沙棘多糖提取方法中，葡萄糖和甘露糖的比例为2:1。