CN110713626B - 一种具有辅助抗肿瘤作用的石莼寡糖复合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有辅助抗肿瘤作用的石莼寡糖复合物的制备方法,其是从绿藻石莼中提取获得石莼多糖粉末,然后利用过氧化氢及抗坏血酸或异抗坏血酸氧化水解石莼多糖,经纯化后得到高纯度的石莼功能寡糖,再与同时制备的降解石莼活性多糖按比例调配成所述复合物。经动物药效学证实,所得复合物在KM小鼠体内对H22肝癌瘤具有显著的杀伤能力,且无明显副作用,是一种无毒性、副作用小、十分安全的生物活性物质,这不仅为石莼作为海洋药物资源的进一步利用提供了新的途径,也为治疗或预防肿瘤的药物开发提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种具有辅助抗肿瘤作用的石莼寡糖复合物的制备方法。
背景技术
肿瘤作为一种恶性疾病,其致死率较高,患者也深受其附带病痛的困扰,并且其患病率正逐年上升,社会对于抗肿瘤药物的需求也逐年上涨。传统上用于抗肿瘤的药物常伴有各种各样的副作用,或者价格十分昂贵,因而目前市场对于高效、低副作用、低成本、适用性广的新型抗肿瘤药物具有相当大的需求。海藻中的天然高分子化合物如多糖等,具有一定的抗肿瘤作用,但由于多糖的不能直接吸收,存在不确定性,因此作为多糖降解物并且可以直接被人体吸收的寡糖成为了新的研究重点。
石莼又称海白菜、岩头青等,分布广泛,价格低廉,作为食品的应用已有较长历史,且在传统医药记载上具有利水消肿、软坚化痰、清热解毒之功效,虽有关于其药用的研究,但其深入挖掘及广度开发则相对滞后,与其同科属的浒苔则已有较为完善的研究,因此开发石莼的药用潜力是非常有必要的。同时,大量研究资料表明,寡糖具有抗肿瘤生物活性,因此系统地完成石莼寡糖制备及药理活性分析,开发出一种具有抗肿瘤活性且副作用小的石莼寡糖是相当有必要的。
但寡糖的规模化应用受限于寡糖制备技术研究的不足而难以大规模推广。寡糖的自由基氧化法制备是利用过氧化氢及抗坏血酸反应后产生大量自由基的氧化能力拆解多糖内部糖苷键。相比传统的酸法制备,该方法避免了使用强酸,具有操作方便、效率高、无污染的优点。而本法制备的石莼寡糖尚未见相关文献报道。
发明内容
本发明为解决现有技术的不足,提供了一种抗肿瘤活性强、不良反应低的石莼寡糖复合物的制备方法。
为实现以上目的,本发明采用如下技术方案:
一种具有辅助抗肿瘤作用的石莼寡糖复合物的制备方法包括以下步骤:
1)将石莼利用清水浸泡脱盐后干燥并粉碎,然后按20-30mL/g的量向所得石莼干粉中加入体积浓度为60%-80%的乙醇溶液,回流提取1-2小时,回流结束后烘干,得到干燥脱脂的石莼粉末,回收的乙醇可循环使用;
2)按30-40mL/g的量向步骤1)制得的石莼粉末中加入蒸馏水,并在60-70℃的萃取温度下以350-400W超声波辅助提取120分钟,而后于80-90℃热水中浸提2-3小时,提取结束后过滤,将滤渣按上述条件重复提取2-3次,合并滤液,4000-5000rpm离心10-20分钟,所得上清液在65-70℃下减压浓缩至原体积的1/10,再加入体积浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇的体积浓度达80%,然后在4℃静置8-12小时,滤取沉淀,依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,减压干燥,得石莼粗多糖;
3)将步骤2)制备得到的石莼粗多糖按体积比1:100-1:120完全溶解于蒸馏水中,然后加入溶液重量0.1%-0.2%的中性蛋白酶,于40℃下静置2-3小时后,于100℃煮沸20-30分钟,再于4000-5000rpm离心10-15分钟,除去沉淀,得到除去蛋白的粗制多糖溶液;
4)将步骤3)所得粗制多糖溶液经HPD-826大孔吸附树脂填充柱除杂后,按35-50mL洗脱液加入1g非极性吸附剂活性炭吸附去除色素,再以60-80rpm摇床震荡1-2小时,而后以6000-8000rpm离心20-30分钟,收集上清液;
5)利用截留分子量为8000D以上的透析袋透析去除步骤4)所得上清液中的小分子及色素,再将截留液减压浓缩至膏状,并进行真空冷冻干燥,粉碎,得到精制的石莼多糖粉末;
6)将步骤5)所得的石莼多糖粉末按体积比1:80-1:100完全溶解于蒸馏水中,然后加入溶液重量0.05%的过氧化氢及溶液重量0.026%的抗坏血酸或异抗坏血酸,于65-75℃下反应3-4小时,并辅以100-200rpm的搅拌,得到石莼多糖降解液;
7)取步骤6)所得的石莼多糖降解液,加入体积浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇的体积浓度达75%,然后4℃静置8-12小时,再于4000-5000rpm离心10-15分钟,除去沉淀,收集上清液减压浓缩至原体积的1/5-1/4,得粗制石莼寡糖溶液;
8)将步骤7)中所得粗制石莼寡糖溶液采用截留分子量为3000D的透析袋处理,收集透析液及截留液;
9)将步骤8)所得透析液采用截留分子量为800D的透析袋处理,取截留液冷冻干燥,制得石莼活性寡糖;
10)将步骤8)所得截留液冷冻干燥,制得降解的石莼活性多糖。
11)将步骤9)所得的石莼活性多糖及步骤10)所得的石莼活性寡糖按照重量比1:2混合,得到所述复合物。
本发明石莼寡糖复合物具有抗肿瘤活性,可用于制备防治H22肝癌等肿瘤的药物或功能食品。
所述药物是将石莼寡糖复合物与药学上可接受的载体制成片剂、颗粒剂、胶囊剂等剂型。
本发明的显著优点在于:
(1)本发明利用过氧化氢及抗坏血酸或异抗坏血酸氧化水解石莼多糖,具有不会发生副反应、条件温和、环境友好等特点,且目前尚未见通过过氧化氢及抗坏血酸氧化制备绿藻石莼多糖的其他研究报道或专利。
(2)本发明将水解、纯化后得到高纯度石莼功能寡糖,与同时制备的石莼活性多糖按比例调配成具有辅助抗肿瘤作用的药品或功能食品。经动物药效学证实,所得石莼寡糖复合物在KM小鼠体内对H22肝癌瘤具有确切的杀伤能力,且未具有明显副作用。
(3)本发明所提供的石莼寡糖复合物是一种无毒性、副作用小、十分安全的生物活性物质,可以方便和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物,其不仅为石莼作为海洋药物资源的进一步利用提供了新的途径,也为治疗或预防肿瘤的药物开发提供了新的选择。
(4)目前研究尚未有关于相似石莼寡糖复合物及其抗肿瘤活性的报道。
附图说明
图1为给药前后H22肝癌瘤模型小鼠血清中TNF-α含量的对比结果。
图2为模型组(A)和复合糖给药组(B)的肿瘤切片的HE染色镜检图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
实施例1
1)将石莼利用清水浸泡脱盐后干燥并粉碎,然后按20mL/g的量向所得石莼干粉中加入体积浓度为60%的乙醇溶液,回流提取1小时,回流结束后烘干,得到干燥脱脂的石莼粉末,回收的乙醇可循环使用;
2)按30mL/g的量向步骤1)制得的石莼粉末中加入蒸馏水,并在60℃的萃取温度下以350W超声波辅助提取120分钟,而后于80℃热水中浸提2小时,提取结束后过滤,将滤渣按上述条件重复提取2次,合并滤液,4000rpm离心10分钟,所得上清液在65℃下减压浓缩至原体积的1/10,再加入体积浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇的体积浓度达80%,然后在4℃静置8小时,滤取沉淀,依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,减压干燥,得石莼粗多糖;
3)将步骤2)制备得到的石莼粗多糖按体积比1:100完全溶解于蒸馏水中,然后加入溶液重量0.1%的中性蛋白酶,于40℃下静置2小时后,于100℃煮沸20分钟,再于4000rpm离心10分钟,除去沉淀,得到除去蛋白的粗制多糖溶液;
4)将步骤3)所得粗制多糖溶液经HPD-826大孔吸附树脂填充柱除杂后,按35mL洗脱液加入1g非极性吸附剂活性炭吸附去除色素,再以60rpm摇床震荡1小时,而后以6000rpm离心20分钟,收集上清液;
5)利用截留分子量为8000D以上的透析袋透析去除步骤4)所得上清液中的小分子及色素,再将截留液减压浓缩至膏状,并进行真空冷冻干燥,粉碎,得到精制的石莼多糖粉末;
6)将步骤5)所得的石莼多糖粉末按体积比1:80完全溶解于蒸馏水中,然后加入溶液重量0.05%的过氧化氢及溶液重量0.026%的抗坏血酸或异抗坏血酸,于65℃下反应3小时,并辅以100rpm的搅拌,得到石莼多糖降解液;
7)取步骤6)所得的石莼多糖降解液,加入体积浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇的体积浓度达75%,然后4℃静置8小时,再于4000rpm离心10分钟,除去沉淀,收集上清液减压浓缩至原体积的1/4,得粗制石莼寡糖溶液;
8)将步骤7)中所得粗制石莼寡糖溶液采用截留分子量为3000D的透析袋处理,收集透析液及截留液;
9)将步骤8)所得透析液采用截留分子量为800D的透析袋处理,取截留液冷冻干燥,制得石莼活性寡糖;
10)将步骤8)所得截留液冷冻干燥,制得降解的石莼活性多糖。
11)将步骤9)所得的石莼活性多糖及步骤10)所得的石莼活性寡糖按照重量比1:2混合,得到石莼寡糖复合物。
实施例2
1)将石莼利用清水浸泡脱盐后干燥并粉碎,然后按25mL/g的量向所得石莼干粉中加入体积浓度为70%的乙醇溶液,回流提取2小时,回流结束后烘干,得到干燥脱脂的石莼粉末,回收的乙醇可循环使用;
2)按35mL/g的量向步骤1)制得的石莼粉末中加入蒸馏水,并在65℃的萃取温度下以400W超声波辅助提取120分钟,而后于85℃热水中浸提3小时,提取结束后过滤,将滤渣按上述条件重复提取3次,合并滤液,4500rpm离心15分钟,所得上清液在65℃下减压浓缩至原体积的1/10,再加入体积浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇的体积浓度达80%,然后在4℃静置12小时,滤取沉淀,依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,减压干燥,得石莼粗多糖;
3)将步骤2)制备得到的石莼粗多糖按体积比1:120完全溶解于蒸馏水中,然后加入溶液重量0.15%的中性蛋白酶,于40℃下静置3小时后,于100℃煮沸25分钟,再于4500rpm离心15分钟,除去沉淀,得到除去蛋白的粗制多糖溶液;
4)将步骤3)所得粗制多糖溶液经HPD-826大孔吸附树脂填充柱除杂后,按45mL洗脱液加入1g非极性吸附剂活性炭吸附去除色素,再以70rpm摇床震荡2小时,而后以7000rpm离心25分钟,收集上清液;
5)利用截留分子量为8000D以上的透析袋透析去除步骤4)所得上清液中的小分子及色素,再将截留液减压浓缩至膏状,并进行真空冷冻干燥,粉碎,得到精制的石莼多糖粉末;
6)将步骤5)所得的石莼多糖粉末按体积比1:90完全溶解于蒸馏水中,然后加入溶液重量0.05%的过氧化氢及溶液重量0.026%的抗坏血酸或异抗坏血酸,于70℃下反应3小时,并辅以150rpm的搅拌,得到石莼多糖降解液;
7)取步骤6)所得的石莼多糖降解液,加入体积浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇的体积浓度达75%,然后4℃静置10小时,再于4500rpm离心15分钟,除去沉淀,收集上清液减压浓缩至原体积的1/5,得粗制石莼寡糖溶液;
8)将步骤7)中所得粗制石莼寡糖溶液采用截留分子量为3000D的透析袋处理,收集透析液及截留液;
9)将步骤8)所得透析液采用截留分子量为800D的透析袋处理,取截留液冷冻干燥,制得石莼活性寡糖;
10)将步骤8)所得截留液冷冻干燥,制得降解的石莼活性多糖。
11)将步骤9)所得的石莼活性多糖及步骤10)所得的石莼活性寡糖按照重量比1:2混合,得到石莼寡糖复合物。
实施例3
1)将石莼利用清水浸泡脱盐后干燥并粉碎,然后按30mL/g的量向所得石莼干粉中加入体积浓度为80%的乙醇溶液,回流提取2小时,回流结束后烘干,得到干燥脱脂的石莼粉末,回收的乙醇可循环使用;
2)按40mL/g的量向步骤1)制得的石莼粉末中加入蒸馏水,并在70℃的萃取温度下以400W超声波辅助提取120分钟,而后于90℃热水中浸提3小时,提取结束后过滤,将滤渣按上述条件重复提取3次,合并滤液,5000rpm离心20分钟,所得上清液在70℃下减压浓缩至原体积的1/10,再加入体积浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇的体积浓度达80%,然后在4℃静置12小时,滤取沉淀,依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,减压干燥,得石莼粗多糖;
3)将步骤2)制备得到的石莼粗多糖按体积比1:120完全溶解于蒸馏水中,然后加入溶液重量0.2%的中性蛋白酶,于40℃下静置3小时后,于100℃煮沸30分钟,再于5000rpm离心15分钟,除去沉淀,得到除去蛋白的粗制多糖溶液;
4)将步骤3)所得粗制多糖溶液经HPD-826大孔吸附树脂填充柱除杂后,按50mL洗脱液加入1g非极性吸附剂活性炭吸附去除色素,再以80rpm摇床震荡2小时,而后以8000rpm离心30分钟,收集上清液;
5)利用截留分子量为8000D以上的透析袋透析去除步骤4)所得上清液中的小分子及色素,再将截留液减压浓缩至膏状,并进行真空冷冻干燥,粉碎,得到精制的石莼多糖粉末;
6)将步骤5)所得的石莼多糖粉末按体积比1:100完全溶解于蒸馏水中,然后加入溶液重量0.05%的过氧化氢及溶液重量0.026%的抗坏血酸或异抗坏血酸,于75℃下反应4小时,并辅以200rpm的搅拌,得到石莼多糖降解液;
7)取步骤6)所得的石莼多糖降解液,加入体积浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇的体积浓度达75%,然后4℃静置12小时,再于5000rpm离心15分钟,除去沉淀,收集上清液减压浓缩至原体积的1/5,得粗制石莼寡糖溶液;
8)将步骤7)中所得粗制石莼寡糖溶液采用截留分子量为3000D的透析袋处理,收集透析液及截留液;
9)将步骤8)所得透析液采用截留分子量为800D的透析袋处理,取截留液冷冻干燥,制得石莼活性寡糖;
10)将步骤8)所得截留液冷冻干燥,制得降解的石莼活性多糖。
11)将步骤9)所得的石莼活性多糖及步骤10)所得的石莼活性寡糖按照重量比1:2混合,得到石莼寡糖复合物。
实施例4 H22肝癌瘤模型小鼠抗肿瘤试验
用健康成年雄性KM小鼠建立H22肝癌瘤模型。造模前将培养的H22肝癌瘤细胞于1000rpm离心10分钟,以PBS重悬,计数后调整细胞浓度至108/mL,作为接种瘤液。以皮下注射将瘤液注射到小鼠左前腋下,接种量为2×107/mouse,接种体积0.2mL。将接种小鼠随机分为正常组(Normal)、模型组(Model)、阳性组(Control)、复合糖给药组(ULOH)、单寡糖给药组(ULOL)、多糖组(ULP)六组,每组5只,正常组和模型组给予0.3mL生理盐水灌胃,阳性组给予0.3mL 20mg/kg环磷酰胺溶液腹腔注射,复合糖给药组给予0.3mL 150 mg/kg石莼复合物水溶液(采用实施例2所得石莼寡糖复合物配制),单寡糖给药组给予0.3mL 150 mg/kg石莼寡糖水溶液(采用实施例2步骤9制得的石莼活性寡糖配制),多糖给药组给予0.3mL 150mg/kg精制石莼多糖水溶液(采用实施例2步骤10制得的石莼活性寡糖配制),连续给药10天,剥离小鼠身上肿瘤并称重,对比模型组瘤重计算抑瘤率,观察石莼寡糖复合物对H22肝癌瘤模型小鼠抗肿瘤能力的影响,剥取的肿瘤进行石蜡切片并HE染色,观察组织形态。同时,在动物实验的第0天取血,并在给药结束后取血,分离血清,测试血清中肿瘤坏死因子TNF-α的水平,核定其抗肿瘤性质。
结果显示,正常组未发现肿瘤,以模型组的瘤重为基准,并将其抑瘤率(%)设定为0,则环磷酰胺阳性组的抑瘤率(%)为70.08±10.65,复合糖给药组的抑瘤率(%)为81.36±4.18,单寡糖给药组的抑瘤率(%)为71.38±2.79,精制多糖组的抑瘤率(%)为70.32±3.31,相比模型组均有显著差异性(p<0.01),说明石莼寡糖复合物对H22肝癌瘤模型小鼠具有显著的抗肿瘤作用。
图1为给药前后H22肝癌瘤模型小鼠血清中TNF-α含量对比结果。由图中可见,石莼复合物可以显著降低TNF-α的含量,有效抑制肿瘤的成长与扩散,其效果优于单寡糖及单多糖。
图2为模型组(A)和复合糖给药组(B)的肿瘤切片的HE染色镜检图。由图中可见,相比于模型组组织中瘤细胞的无序堆叠及过量增生,给药组肿瘤组织核心区域出现大面积的坏死空洞,是肿瘤细胞被大量杀伤的表现。
经综合分析,本发明石莼多糖复合物的抑瘤能力与传统抗肿瘤药物环磷酰胺接近,并高于任一成分单独使用的效果,且实验过程中无明显毒副作用,未发现小鼠有器官病变、死亡率增高、畸变等现象。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种具有辅助抗肿瘤作用的石莼寡糖复合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将石莼利用清水浸泡脱盐后干燥并粉碎,然后按20-30mL/g的量向所得石莼干粉中加入体积浓度为60%-80%的乙醇溶液,回流提取1-2小时,回流结束后烘干,得到干燥脱脂的石莼粉末;
2)按30-40mL/g的量向步骤1)制得的石莼粉末中加入蒸馏水,并在60-70℃的萃取温度下以350-400W超声波辅助提取120分钟,而后于80-90℃热水中浸提2-3小时,提取结束后过滤,将滤渣按上述条件重复提取2-3次,合并滤液,4000-5000rpm离心10-20分钟,所得上清液在65-70℃下减压浓缩至原体积的1/10,再加入体积浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇的体积浓度达80%,然后在4℃静置8-12小时,滤取沉淀,依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,减压干燥,得石莼粗多糖;
3)将步骤2)制备得到的石莼粗多糖按体积比1:100-1:120完全溶解于蒸馏水中,然后加入溶液重量0.1%-0.2%的中性蛋白酶,于40℃下静置2-3小时后,于100℃煮沸20-30分钟,再于4000-5000rpm离心10-15分钟,除去沉淀,得到除去蛋白的粗制多糖溶液;
4)将步骤3)所得粗制多糖溶液经HPD-826大孔吸附树脂填充柱除杂后,按35-50mL洗脱液加入1g活性炭吸附去除色素,再以60-80rpm摇床震荡1-2小时,而后以6000-8000rpm离心20-30分钟,收集上清液;
5)利用截留分子量为8000D以上的透析袋透析去除步骤4)所得上清液中的小分子及色素,再将截留液减压浓缩至膏状,并进行真空冷冻干燥,粉碎,得到精制的石莼多糖粉末;
6)将步骤5)所得的石莼多糖粉末按体积比1:80-1:100完全溶解于蒸馏水中,然后加入溶液重量0.05%的过氧化氢及溶液重量0.026%的抗坏血酸或异抗坏血酸,于65-75℃下反应3-4小时,并辅以100-200rpm的搅拌,得到石莼多糖降解液;
7)取步骤6)所得的石莼多糖降解液,加入体积浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇的体积浓度达75%,然后4℃静置8-12小时,再于4000-5000rpm离心10-15分钟,除去沉淀,收集上清液减压浓缩至原体积的1/5-1/4,得粗制石莼寡糖溶液;
8)将步骤7)中所得粗制石莼寡糖溶液采用截留分子量为3000D的透析袋处理,收集透析液及截留液;
9)将步骤8)所得透析液采用截留分子量为800D的透析袋处理,取截留液冷冻干燥,制得石莼活性寡糖;
10)将步骤8)所得截留液冷冻干燥,制得降解的石莼活性多糖;
11)将步骤9)所得的石莼活性多糖及步骤10)所得的石莼活性寡糖按照重量比1:2混合,得到所述复合物。
2.一种如权利要求1所述的制备方法制备得到的具有辅助抗肿瘤作用的石莼寡糖复合物在制备防治肿瘤药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述肿瘤为H22肝癌。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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