CN109734761A

CN109734761A - 一种浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN109734761A
Application number: CN201910149482.XA
Authority: CN
Inventors: 赵超; 钟汝婷; 万旭志; 王莹; 刘丹; 李姗姗
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-05-10

Abstract

本发明涉及一种绿藻浒苔寡糖制备同时络合铬与钒的工艺方法，该方法以浒苔作为原料，采用热水超声法提取浒苔细粉，醇沉、脱蛋白、透析制得浒苔多糖，再用硫酸酸解，调节至中性，醇沉、去杂、透析、浓缩制得浒苔寡糖；再将浒苔寡糖与钒酸盐、铬盐和稀碱在溶液体系中反应，形成带有金属钒与三价铬的寡糖分子。用所述方法制备的浒苔寡糖络合物与小球藻提取物、螺旋藻提取物、灵芝提取物、灰树花提取物等药食同源活性成分复配，制备具有调节血糖功效的口服液、胶囊、片剂、冲剂以及固体饮料的不同剂型的营养功能性食品，具有良好的工业化生产前景。

Description

一种浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有降血糖功能的化合物，具体地说，是涉及一种绿藻浒苔寡糖络合物的制备方法及其在降血糖方面的应用。

背景技术

糖尿病是由于胰岛素的分泌缺陷及（或）胰岛素生物学作用障碍而导致以慢性糖代谢障碍、高血糖为特征的一组慢性代谢性疾病。目前，全世界的糖尿病发病率和患病率正在急剧增加。国际糖尿病联合会估计全球糖尿病患者人数超过4.25亿；到2045年，估计达到约6.29亿。2型糖尿病（T2DM）会引起长期血管损伤和各种功能障碍，如视力丧失，视网膜病变，肾病导致肾功能衰竭，糖尿病坏疽和心脑血管疾病，随着人们生活水平的提高和物质丰富极大化，糖尿病并被认为是一个主要的社会非传染性流行疾病。

目前临床治疗2型的药物除胰岛素外，主要是口服降糖药，大致分为磺脲类、双胍类、中药制剂、其他降糖药及辅助用药。磺脲类降糖药物（SU）是最主要的糖尿病治疗药物。能使肝糖原合成增多，再通过对细胞受体或受体后的作用，使周围组织对胰岛素的敏感性增强，对葡萄糖的摄取增多，从而达到降低血糖的作用；双胍类降糖药物（BG）双胍类降糖药主要通过抑制肠壁细胞吸收葡萄糖，促进外周组织无氧糖酵解，而增加对葡萄糖的摄取和利用，促进胰岛素与胰岛素受体结合，降低血浆中胰高血糖素水平，并不通过刺激β细胞使胰岛素分泌增加，故有利于缓解高胰岛素血症。α-糖苷酶抑制剂类降糖药物（CIGE）通过抑制小肠粘膜刷状缘α-葡萄糖苷酶的活性，减少低聚糖分解为单糖后再被吸收。因此可延缓餐后糖分的吸收，抑制饭后血糖高峰。以上药物虽对2型糖尿病患者有一定的治疗效果，但缺乏稳定性，不能从根本上驱除病因及防止发证，且常常伴随一定程度的毒副作用，口服时常有一定的不良症状及反应。因此，研究和开发新型药物仍是临床上的迫切需要。

海洋藻类多糖有不同程度的降血糖作用，但由于这些多糖的作用靶点不明确，且存在口服吸收差、生物利用度低等缺点限制了其在临床上的应用。如对这些多糖类化合物进行适当的降解得到低聚糖或寡糖化合物，并进行适当的分子修饰，将会大大提高糖类化合物的降糖效果。寡糖降血糖的作用机制主要有：增强胰岛β细胞的分泌，提高机体胰岛素水平；保护和修复胰岛β细胞，增加血液中胰岛素的水平；抑制糖异生，促进外周组织对糖的吸收；抑制糖醛还原酶；抑制α-葡萄糖苷酶活性等，有望成为一类新型的抗糖尿病药物。

钒是组织细胞生长存活必需的微量元素之一。有研究表明钒对多种疾病如哮喘、皮肤病、过敏、肿瘤、糖尿病、心血管疾病等均有治疗效果，并且在糖尿病动物模型治疗中发现钒具有降血糖的作用，可能的作用是钒起类胰岛素样作用，能够缓解胰岛素抵抗。三价的铬是人体必须的微量元素，六价铬则有毒性，三价铬的复合物在人体中称为葡萄糖耐量因子，由4分子水、2分子烟酸和三价铬配价形成，其中铬有很高的活性。铬在人体内不但可通过三羧酸循环促进琥珀酸氧化，提高葡萄糖的利用率和降低血糖，还可降低血甘油三酯和胆固醇的水平。

经检索，在浒苔降血糖的领域已有杜昱光的“一种具有降血糖功能的浒苔低聚糖及其制备方法和应用”（专利申请号201711454376.X），提供了一种具有降血糖作用的浒苔低聚糖混合物，用于缓解I型糖尿病的药物制剂或保健食品；赵超的“一种具有辅助降血糖作用的浒苔寡糖及其制备方法”（专利申请号 201610110626.7），提供了一种具有辅助降血糖作用的浒苔寡糖的制备方法，可以显著降低高血糖模型小鼠血糖值。绿藻浒苔是一种具有显著降血糖的功效，但目前尚未有相关专利和研究报导浒苔寡糖络合物的降血糖功能，同时也没有浒苔寡糖络合物制作工艺的相关专利以及其在2型糖尿病中的治疗应用。本发明公开一种浒苔寡糖铬络合物的制备方法，具有显著的降血糖活性，有广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于海洋的绿藻浒苔寡糖铬络合的制备方法，它是一种具有良好降糖活性的海洋寡糖络合物，可以防治因胰岛素抵抗而导致的2型糖尿病。

一种浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将浒苔用蒸馏水清洗2-3次，除去样品表面附着的生物及盐分，55-60°C烘干后粉碎，过60-80目筛，保存于干燥容器中备用；

（2）将步骤（1）中制备的浒苔粉末，按重量与体积比g/mL为1:30-40的料水比加水进行加热，在50-60℃，40-50KHZ，200-300W下超声辅助提取1-2 h，重复2-3次，离心过滤，合并滤液并进行真空浓缩，浓缩液经80%-95% v/v乙醇醇沉，取沉淀进行冷冻干燥，得浒苔粗多糖；

（3）将步骤（2）中制备的浒苔粗多糖进行脱蛋白：将制得的浒苔多糖溶液与Sevage试剂按体积比2:1混合复溶，震荡；混合液分为三层，上层为水层，中间为蛋白质，下层为有机物质，寡糖分子在上层的上清液里，用分液漏斗收集上清液，除去变性蛋白，重复5-8次直至交界处无变性蛋白，冷冻干燥；

（4）将步骤（3）脱蛋白后的浒苔粗多糖用蒸馏水进行溶解，浓度为4-10wt%，超声波降解30min，用10 mmol的NaOH或柠檬酸溶液调节pH至5.0-7.0，加入终浓度为40,000 -50,000IU/mL的木聚糖酶，置于50℃、80r/min的水浴摇床酶解5h后取出，升温至90-100℃灭酶活，冷却至室温；

（5）将步骤（4）得到的酶解液调节至中性后，经80-95% v/v乙醇醇沉，取上清液用8000D-14000D透析48h后冷冻浓缩获得浒苔多糖;

（6）将步骤（5）的浒苔多糖按质量体积比1:90-100溶于蒸馏水中加入98% v/v的浓硫酸于100℃酸解1.5h，冷却后用NaOH调节至中性；

（7）向步骤（6）溶液中加入95% v/v乙醇，收集上清液，分别用2000D和200D的透析袋去除大分子和小分子，保留200-2000分子量之间的寡糖溶液；

（8）将步骤（7）得到的浒苔寡糖溶液调节pH至8-10，30℃水浴下搅拌30-50min，加热温度至40-80℃条件下，逐滴加入三价铬盐溶液、VOSO₄·5H₂O和稀碱溶液，之后保温反应4-5h，过滤，滤液用2-5倍体积的无水乙醇沉淀，静置，离心，收集沉淀，用有机溶剂洗涤、脱水，减压干燥即得。

步骤（3）所述Sevage试剂是氯仿和正丁醇按照体积比4:1配成的混合液。

步骤（6）所述溶液中浓硫酸的终浓度为0.05 mol/L。

步骤（8）所述三价铬盐包括氯化铬、醋酸铬、磷酸铬中的一种或多种；其中铬盐和寡糖的重量体积比为1:100-1:50 g/mL。

步骤（8）所述稀碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中的一种或多种。

步骤（8）所述VOSO₄·5H₂O和稀碱溶液在寡糖溶液中的终浓度分别为：0.036 mol/L和0.05 mol/L。

步骤（8）所述有机溶剂为无水乙醇或丙酮中的一种。

一种复配混合物，含有浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法制备得到的浒苔岩藻寡糖络合物；包括以下成分中的一种或多种：小球藻提取物，螺旋藻提取物，灵芝提取物，灰树花提取物，浒苔寡糖络合物，山梨糖醇，大枣，柠檬酸，木糖醇，甘草，黄芪，当归，川芎，和β-环状糊精。

所述小球藻提取物、螺旋藻提取物、灵芝提取物、灰树花提取物的制备方法如下：先用体积分数85%-95%乙醇提取，然后将乙醇提取剩余物再用体积分数55%-65%乙醇提取，最后将第二次乙醇提取剩余物水提，经离心、过滤、减压浓缩、干燥分别制备85%-95%乙醇提取物、55%-65%乙醇提取物、水提取物，按照质量比1:2:2复配成所述提取物。

根据需要，将所述的复配混合物应用于制备口服液、胶囊、片剂、冲剂以及固体饮料营养功能性食品中。

本发明的优点在于：

（1）本发明制备得到的浒苔寡糖络合物具有高效的辅助降血糖活性，可以防治因胰岛素抵抗而导致的2型糖尿病。

（2）本发明浒苔寡糖络合物对小鼠具有显著的降血糖作用，相比单一浒苔寡糖组以及络合单一钒酸盐和铬盐，浒苔寡糖复合络合物降血糖效果更为显著，与传统降血糖药物接近，并且其副作用低，未发现小鼠有器官病变或其他明显不适现象。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步具体说明，为进一步公开而不是限制本发明。

实施例1

以海洋绿藻浒苔为原料，通过提取浒苔多糖后，通过酶降解得到寡糖，再将其与VOSO₄·5H₂O、无机三价铬盐和稀碱在溶液体系中反应，形成带有金属钒与三价铬的寡糖分子。即：浒苔寡糖锌钒铬复合络合物；具体按下列步骤制作：

（1）浒苔用蒸馏水清洗3次，除去样品表面的附生物及盐分，60°C烘干后粉碎，过80目筛，保存于干燥容器中备用。

（2）将步骤（1）中制备的浒苔粉末，按重量与体积比（g/mL）为1:30的料水比加水进行加热，在60℃，50KHZ， 300W下超声辅助提取2 h，重复3次，离心过滤，合并滤液并进行真空浓缩，浓缩液经80%-95%v/v乙醇醇沉，取沉淀进行冷冻干燥，得浒苔粗多糖。

（3）将步骤（2）中制备的浒苔粗多糖进行脱蛋白，具体方法是将制得的浒苔多糖溶液与Sevage试剂（氯仿：正丁醇=4:1（V:V））2:1混合，进行复溶，震荡，通过分液漏斗除去变性蛋白，重复5次直至交界处无变性蛋白，冷冻干燥。

（4）将步骤（3）脱蛋白后的浒苔粗多糖用蒸馏水进行溶解，浓度为4wt%，超声波降解30min，用10mmol柠檬酸调节pH至5.0，加入木聚糖酶，置于50℃、80r/min的水浴摇床酶解5h后取出，升温至100℃灭酶活，冷却至室温。

（5）将步骤（4）得到的酶解液调节至中性后，经95% v/v乙醇醇沉，取上清液用8000D-14000D透析48h后冷冻浓缩获得浒苔多糖;（6）将步骤（5）的浒苔多糖按质量体积比1:90溶于蒸馏水中加入98% v/v的浓硫酸于100℃酸解1.5h，溶液中浓硫酸的终浓度为0.05mol/L，冷却后用NaOH调节至中性；

（7）向步骤（6）酶解液中加入等体积95%乙醇，收集上清液，分别用2000D和200D的分子筛去除大分子和小分子，得浒苔寡糖溶液。

（8）将步骤（7）得到的浒苔寡糖溶液调节pH至8，30℃水浴下搅拌30min，加热温度至40℃条件下，逐滴加入氯化铬溶液、VOSO₄·5H₂O和碳酸钠溶液，氯化铬和寡糖的重量体积比为1:100 g/mL；VOSO₄·5H₂O和碳酸钠溶液在寡糖溶液中的终浓度分别为：0.036 mol/L和0.05 mol/L；之后保温反应4h，过滤，滤液用2倍体积的无水乙醇沉淀，静置，离心，收集沉淀，用有机溶剂洗涤、脱水，减压干燥即得。

应用例1

取实施例1所制得的浒苔寡糖络合物与灰树花提取物、灵芝提取物、山梨糖醇、柠檬酸、木糖醇、甘草和β-环状糊精复配，制得一种降血糖的浒苔寡糖络合物口服液；所述保健口服液的原料组成按重量份数计为：浒苔寡糖络合物15份、灰树花提取物6份、灵芝提取物5份、山梨糖醇5份、柠檬酸5份、木糖醇2份、甘草2份和β-环状糊精5份。

实施例2

（2）将步骤（1）中制备的浒苔粉末，按重量与体积比（g/mL）为1:30的料水比加水进行加热，在50℃，40KHZ， 200W下超声辅助提取2 h，重复3次，离心过滤，合并滤液并进行真空浓缩，浓缩液经80%-95%v/v乙醇醇沉，取沉淀进行冷冻干燥，得浒苔粗多糖。

（3）将步骤（2）中制备的浒苔粗多糖进行脱蛋白，具体方法是将制得的浒苔多糖溶液与Sevage试剂（氯仿：正丁醇=4:1（V:V））2:1混合，进行复溶，震荡，通过分液漏斗除去变性蛋白，重复6次直至交界处无变性蛋白，冷冻干燥。

（4）将步骤（3）脱蛋白后的浒苔粗多糖用蒸馏水进行溶解，浓度为4-10%，超声波降解30min，用10mmol柠檬酸调节pH至5.0，加入木聚糖酶，置于50℃、80r/min的水浴摇床酶解5h后取出，升温至100℃灭酶活，冷却至室温。

（5）将步骤（4）得到的酶解液调节至中性后，经95% v/v乙醇醇沉，取上清液用8000D-14000D透析48h后冷冻浓缩获得浒苔多糖;

（6）将步骤（5）的浒苔多糖按质量体积比1:100溶于蒸馏水中加入98% v/v的浓硫酸于100℃酸解1.5h，溶液中浓硫酸的终浓度为0.05 mol/L，冷却后用NaOH调节至中性；

（8）将步骤（7）得到的浒苔寡糖溶液调节pH至9，30℃水浴下搅拌40min，加热温度至60℃条件下，逐滴加入醋酸铬溶液、VOSO₄·5H₂O和碳酸氢钠溶液，氯化铬和寡糖的重量体积比为1:100 g/mL；VOSO₄·5H₂O和碳酸氢钠溶液在寡糖溶液中的终浓度分别为：0.036mol/L和0.05 mol/L；之后保温反应5h，过滤，滤液用4倍体积的乙醇沉淀，静置，离心，收集沉淀，用有机溶剂洗涤、脱水，减压干燥即得。

应用例2

取实施例2所制得的浒苔寡糖络合物与灰树花提取物、灵芝提取物、大枣、柠檬酸、木糖醇、甘草和β-环状糊精复配，制得一种降血糖的浒苔寡糖络合物口服液；所述保健口服液的原料组成按重量份数计为：浒苔寡糖络合物18份、灰树花提取物4份、灵芝提取物7份、大枣3份、柠檬酸6份、木糖醇3份、甘草1份和β-环状糊精5份。

实施例3

（2）将步骤（1）中制备的浒苔粉末，按重量与体积比（g/mL）为1:40的料水比加水进行加热，在60℃，50KHZ， 300W下超声辅助提取2 h，重复3次，离心过滤，合并滤液并进行真空浓缩，浓缩液经80%-95%v/v乙醇醇沉，取沉淀进行冷冻干燥，得浒苔粗多糖。

（3）将步骤（2）中制备的浒苔粗多糖进行脱蛋白，具体方法是将制得的浒苔多糖溶液与Sevage试剂（氯仿：正丁醇=4:1（V:V））2:1混合，进行复溶，震荡，通过分液漏斗除去变性蛋白，重复8次直至交界处无变性蛋白，冷冻干燥。

（4）将步骤（3）脱蛋白后的浒苔粗多糖用蒸馏水进行溶解，浓度为10%，超声波降解30min，用10mmol柠檬酸调节pH至5.0，加入木聚糖酶，置于50℃、80r/min的水浴摇床酶解5h后取出，升温至100℃灭酶活，冷却至室温。

（8）将步骤（7）得到的浒苔寡糖溶液调节pH至10，30℃水浴下搅拌50min，加热温度至80℃条件下，逐滴加入磷酸铬溶液、VOSO₄·5H₂O和碳酸氢钾溶液，氯化铬和寡糖的重量体积比为1:100 g/mL；VOSO₄·5H₂O和碳酸氢钾在寡糖溶液中的终浓度分别为：0.036 mol/L和0.05 mol/L；之后保温反应5h，过滤，滤液用5倍体积的乙醇沉淀，静置，离心，收集沉淀，用有机溶剂洗涤、脱水，减压干燥即得。

应用例3

取实施例3所制得的浒苔寡糖络合物与灰树花提取物、灵芝提取物、大枣、黄芪、当归、甘草和川芎复配，制得一种降血糖的浒苔寡糖络合物胶囊；所述保健口服液的原料组成按重量份数计为：浒苔寡糖络合物17份、灰树花提取物6份、灵芝提取物5份、大枣3份、黄芪6份、当归3份、甘草1份和川芎4份。以上所述仅为本发明较佳的实验例，凡依据本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述Sevage试剂是氯仿和正丁醇按照体积比4:1配成的混合液。

3.根据权利要求1所述的一种浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法，其特征在于，步骤（6）所述溶液中浓硫酸的终浓度为0.05 mol/L。

4.根据权利要求1所述的一种浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法，其特征在于，步骤（8）所述三价铬盐包括氯化铬、醋酸铬、磷酸铬中的一种或多种；其中铬盐和寡糖的重量体积比为1:100-1:50 g/mL。

5.根据权利要求1所述的一种浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法，其特征在于，步骤（8）所述稀碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的一种浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法，其特征在于，步骤（8）所述VOSO₄·5H₂O和稀碱溶液在寡糖溶液中的终浓度分别为：0.036 mol/L和0.05 mol/L。

7.根据权利要求1所述的一种浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法，其特征在于，步骤（8）所述有机溶剂为无水乙醇或丙酮中的一种。

8.一种复配混合物，其特征在于，含有权利要求1-7任一所述的浒苔岩藻寡糖络合物的制备方法制备得到的浒苔岩藻寡糖络合物；包括以下成分中的一种或多种：小球藻提取物，螺旋藻提取物，灵芝提取物，灰树花提取物，浒苔寡糖络合物，山梨糖醇，大枣，柠檬酸，木糖醇，甘草，黄芪，当归，川芎，和β-环状糊精。

9.根据权利要求8所述的一种复配混合物，其特征在于，所述小球藻提取物、螺旋藻提取物、灵芝提取物、灰树花提取物的制备方法如下：先用体积分数85%-95%乙醇提取，然后将乙醇提取剩余物再用体积分数55%-65%乙醇提取，最后将第二次乙醇提取剩余物水提，经离心、过滤、减压浓缩、干燥分别制备85%-95%乙醇提取物、55%-65%乙醇提取物、水提取物，按照质量比1:2:2复配成所述提取物。

10.一种如权利要求8-9任一所述的复配混合物在制备口服液、胶囊、片剂、冲剂以及固体饮料营养功能性食品中的应用。