CN110106163A - 岩藻多糖及其水解寡糖在制备益生菌保护剂中的应用及方法 - Google Patents

岩藻多糖及其水解寡糖在制备益生菌保护剂中的应用及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了岩藻多糖及其水解寡糖在制备益生菌保护剂中的应用及方法，本发明首次将岩藻多糖及其水解寡糖包埋益生菌，然后模拟在胃酸和小肠液中的存活情况，结果显示，使用岩藻多糖及其水解寡糖包埋的益生菌存活时间延长，且水解寡糖包埋的效果优于岩藻多糖，为延长益生菌在胃肠环境高活性奠定了基础。

Description

岩藻多糖及其水解寡糖在制备益生菌保护剂中的应用及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种利用发酵法生产的岩藻多糖及其水解寡糖用于益生菌包埋和保护的方法。
背景技术
岩藻多糖是一种含有稀有糖岩藻糖(Fucose)结构的多糖，主要的获取来源包括植物提取法和微生物发酵法。植物提取法主要从褐藻和一些海洋无脊椎动物中提取，具有独特的结合有硫酸基团的水溶性多糖，也称褐藻多糖硫酸酯褐藻糖胶；微生物发酵法主要通过一些肠杆菌属的菌种发酵制备。现有研究表明，岩藻多糖具有双向调节免疫力，清除自由基，抗衰老，抗凝血和抗血栓，抗肿瘤和HIV病毒，消除胃肠系统紊乱，抗过敏，增强肝功能，降低高血脂和高血压，稳定血糖水平，并具有促进肌肤再生、皮肤保湿等功效。但是岩藻多糖及其水解寡糖包埋益生菌是否具有保护作用未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖在制备益生菌保护剂中的应用；本发明的目的之二在于提供岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖保护益生菌的方法；本发明的目的之三在于提供由所述方法制得的单层或多层包埋益生菌。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖在制备益生菌保护剂中的应用。
优选的，所述水解寡糖由岩藻多糖水解、醇沉制得；或所述水解寡糖由岩藻多糖水解、去蛋白和醇沉制得。
优选的，所述水解寡糖水解方法如下：所述水解为将岩藻多糖发酵液用硫酸调pH＝2.0～5.0后，在60～90℃条件下水解4～8小时，沉淀硫酸钙，收集上清，再洗涤去除杂质，获得水解产物；所述醇沉为将水解产物浓缩，离心去除沉淀后用加入乙醇沉淀；所述去蛋白为将水解产物加入Sevag试剂脱蛋白，收集岩藻寡糖溶液，除去残留的有机试剂，浓缩，然后加入乙醇沉淀。
优选的，所述收集上清为使用孔径为0.22μm的过滤设备过滤；所述乙醇沉淀为加入相当于浓缩液2倍体积的乙醇沉淀；所述脱蛋白中按水解产物与Sevag试剂的体积比为4：1加入Sevag试剂。
优选的，所述益生菌为枯草芽孢杆菌、马克斯鲁维酵母或丁酸梭菌中的一种或多种。
2、岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖保护益生菌的方法，将益生菌用岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖包埋，获得单层或多层包埋益生菌。
优选的，所述单层包埋益生菌的方法如下：将益生菌与岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖混合，旋转，制成单层包埋益生菌；
所述多层包埋益生菌的方法如下：将益生菌与岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖混合，旋转，重复加入岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖和旋转步骤，获得多层包埋益生菌。
优选的，所述岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖的浓度为20～40g/L。
优选的，所述益生菌菌液与岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖的体积比为1：5。
3、由所述方法制得的单层或多层包埋益生菌。
本发明的有益效果在于：本发明公开了岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖在制备益生菌保护剂中的应用，利用岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖包埋益生菌，包埋后的益生菌获得更加良好的抗逆性，通过口服进入消化道后有更大几率进入预定部位实现定植，提高益生菌的生存率，对提高益生菌的生物功效具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为寡糖1包埋在模拟胃酸中存活情况。
图2为寡糖1包埋在模拟小肠液中存活情况。
图3为寡糖1包埋在重复模拟胃酸中存活情况。
图4为寡糖1包埋在重复模拟胃酸中存活情况。
图5为寡糖1包埋在重复模拟小肠液中存活情况。
图6为寡糖1包埋在重复模拟小肠液中存活情况。
图7为寡糖2包埋在模拟胃酸中存活情况。
图8为寡糖2包埋在模拟小肠液中存活情况。
图9为寡糖2包埋在重复模拟胃酸中存活情况。
图10为寡糖2包埋在重复模拟胃酸中存活情况。
图11为寡糖2包埋在重复模拟小肠液中存活情况。
图12为寡糖2包埋在重复模拟小肠液中存活情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中，岩藻多糖的制备方法如下：
岩藻多糖的发酵生产过程：取甘油管冻存保藏菌株Kosakonia sp.CCTCCM2018092，活化培养后接种培养种子液。
发酵罐发酵培养：种子液按5～15％的接种量接入装有30～40L发酵培养基的发酵罐中培养，培养温度28～32℃、罐压0.03～0.06MPa、通气量1.0～2.0m3/h，培养转速300～600r/min，培养3～4d，得到岩藻多糖发酵液。
其中活化培养基：不加琼脂粉SDA培养基。种子培养基(g/L)：葡萄糖：20～30；酵母粉：4～8；轻质碳酸钙：4～8，调pH 6.2～8.2，118℃灭菌30min。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖：20～30；酵母粉：30～50；轻质碳酸钙：2～5；消泡剂：0.1％。调pH 6.2～8.2，121℃，灭菌30min；其中葡萄糖分消，118℃，30min。
将岩藻多糖发酵液稀释数倍后使用过滤孔径为0.22μm无机陶瓷膜过滤设备过滤，并添加纯水洗涤以便去除掉发酵液中色素等杂质。将洗涤后的截留液收集后于50～60℃烘干、粉碎即得到岩藻多糖。
本发明中，寡糖1和寡糖2的制备方法如下：
a)取12L岩藻多糖发酵液用硫酸调pH＝2.0～5.0后，在60～90℃条件下水解4～8小时后室温(18～25℃)下放置过夜，使硫酸钙沉淀下来。随后将上清液使用过滤孔径为0.22μm无机陶瓷膜过滤设备过滤，收集滤出液并使用纯水顶滤共得到滤出液50L。
b)将上述50L滤出液使用截留量为10000Da多功能膜分离设备过滤洗涤以便除去色素等小分子杂质。收集膜截留液并用纯水滤洗收集，共得到50L含有岩藻寡糖的滤液。随后将上述滤液在70℃条件下真空旋转蒸发浓缩2.5L；
c)将上述2.5L浓缩液在4000rpm/min条件下离心15min，去掉沉淀后取250ml浓缩液加入两倍体积的乙醇醇沉得到寡糖1。
d)将c)步骤中剩余的岩藻多糖浓缩液再次使用真空旋转蒸发仪浓缩至1.4L，将1.4L浓缩液使用Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)除去浓缩液中的蛋白质，其步骤如下：将岩藻寡糖浓缩液和Sevag试剂以4：1的体积比混合后充分振荡30min，然后用分液漏斗静置分层收集上层岩藻寡糖溶液。重复脱蛋白操作五次后，将岩藻寡糖溶液真空旋转蒸发除去残留的有机试剂，期间加入少量纯水。最终得到含有岩藻寡糖的浓缩液1L。
e)取d)得到的岩藻寡糖浓缩液200ml，加入400ml乙醇醇沉后烘干即得到寡糖2。
实施例1、包埋寡糖1对枯草芽孢杆菌生长的影响
益生菌处理：将枯草芽孢杆菌发酵液在4℃、4000×g条件下离心10min，用PBS反复洗涤两次，沉淀细胞使用同样的PBS(pH7.0)悬均匀后，于4℃条件下保存备用。
未包埋组：将2ml浓缩枯草芽孢杆菌液与10ml、pH＝7的NaCl溶液旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
岩藻多糖包埋制备：将2mL浓缩枯草芽孢杆菌液(20～70*107CFU)与10mL浓度为20g/L的岩藻多糖混合，旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
寡糖1包埋制备：将2mL浓缩枯草芽孢杆菌液与10mL、20g/L的寡糖1混合，旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
将未包埋组，岩藻多糖包埋组和寡糖1包埋组，在模拟胃酸(pH2.0、37℃处理2h)和模拟小肠液(磷酸二氢钾0.68g，加水50ml，用氢氧化钠溶液调pH至6.8；另称胰蛋白酶1g加水溶解，两液混合，加水至100ml，37℃处理2h)下处理，然后检测枯草芽孢菌存活情况，结果如图1和图2所示。
由图1可知，在模拟胃液(pH2.0，37℃，2h)条件培养，未包埋时，枯草芽孢杆菌菌体存活数减少到0，岩藻多糖单层包埋菌体存活数减少到2LG(cfu/ml)，寡糖1单层包埋减少到4LG(cfu/ml)，表明岩藻多糖和寡糖1包埋均有保护枯草芽孢杆菌的效果，且寡糖1的保护效果好于岩藻多糖。
由图2可知，在模拟小肠液条件培养，未包埋时，枯草芽孢杆菌菌体存活数减少到0，岩藻多糖单层包埋菌体存活数减少到2LG(cfu/ml)，寡糖单层包埋减少到4LG(cfu/ml)。说明寡糖1和岩藻多糖包埋均有保护枯草芽孢杆菌的效果，且寡糖1的保护效果好于岩藻多糖。
按照上述相同的方法，重复在模拟胃酸(pH2.0，37℃)条件下处理2h，再检测枯草芽孢菌存活情况，结果如图3和4所示。结果显示，寡糖1和岩藻多糖包埋对枯草芽孢杆菌的保护效果重复性好。
按照上述相同的方法，重复在模拟小肠液((磷酸二氢钾0.68g，加水50ml，用氢氧化钠溶液调pH至6.8；另称胰蛋白酶1g加水溶解，两液混合，加水至100mL定容)37℃条件下处理2h，再检测枯草芽孢菌存活情况，结果如图5和6所示。结果显示，在模拟小肠液条件下培养2h，未包埋时，枯草芽孢杆菌菌体存活数减少到0，岩藻多糖单层包埋菌体存活数减少到3LG(cfu/ml)，寡糖1单层包埋减少到4LG(cfu/ml)，说明寡糖1的保护效果好于岩藻多糖，且寡糖1和岩藻多糖包埋对枯草芽孢杆菌的保护效果重复性好。
实施例2、包埋寡糖2对枯草芽孢杆菌生长的影响
益生菌处理：枯草芽孢杆菌发酵液4℃、4000×g离心10min，用PBS反复洗涤两次，沉淀细胞使用同样的PBS(pH7.0)悬均匀后，于4℃条件下保存备用。
未包埋组：将2ml浓缩枯草芽孢杆菌液与10ml pH7NaCl溶液旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
岩藻多糖包埋制备：将2ml浓缩枯草芽孢杆菌液与10mL 40g/L的岩藻多糖混合，旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
寡糖2包埋制备：将2ml浓缩枯草芽孢杆菌液与10mL40g/L的寡糖1混合，旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
将未包埋组，岩藻多糖包埋组和寡糖2包埋组，在模拟胃酸(pH2.0、37℃)处理2h，模拟小肠液(磷酸二氢钾0.68g，加水50ml，用氢氧化钠溶液调pH至6.8；另称胰蛋白酶1g加水溶解，两液混合，加水至100mL定容)37℃处理2h，然后检测枯草芽孢菌存活情况，结果如图7和图8所示。
由图7可知，在模拟胃液(pH2.0，37℃)条件培养2h，未包埋时，枯草芽孢杆菌菌体存活数减少到0，岩藻多糖单层包埋菌体存活数减少到2LG(cfu/ml)，寡糖2单层包埋减少到3LG(cfu/ml)。说明岩藻多糖和寡糖2对枯草芽孢杆菌均有保护作用，且寡糖2的保护效果好于岩藻多糖。
由图8可知，在模拟小肠液(pH7.0，37℃)条件培养2h，未包埋时，枯草芽孢杆菌菌体存活数减少到0，岩藻多糖单层包埋菌体存活数减少到3LG(cfu/ml)，寡糖单层包埋减少到4LG(cfu/ml)。说明岩藻多糖和寡糖2对枯草芽孢杆菌均有保护作用，且寡糖2的保护效果好于岩藻多糖。
按照上述相同的方法，重复在模拟胃酸(pH2.0，37℃)条件下处理2h，再检测枯草芽孢菌存活情况，结果如图9和10所示。图9显示，在模拟胃液(pH2.0，37℃)条件培养2h，未包埋时，枯草芽孢杆菌菌体存活数减少到0，岩藻多糖单层包埋菌体存活数减少到2LG(cfu/ml)，寡糖2单层包埋减少到3LG(cfu/ml)，说明寡糖2的保护效果优于岩藻多糖。图10显示，在模拟胃液(pH2.0，37℃)条件培养2h，未包埋时，枯草芽孢杆菌菌体存活数减少到0，岩藻多糖单层包埋菌体存活数减少到2LG(cfu/ml)，寡糖2单层包埋减少到3LG(cfu/ml)，说明寡糖2的保护效果优于岩藻多糖。
按照上述相同的方法，重复在模拟小肠液(磷酸二氢钾0.68g，加水50ml，用氢氧化钠溶液调pH至6.8；另称胰蛋白酶1g加水溶解，两液混合，加水至100mL定容)37℃条件下处理2h，再检测枯草芽孢菌存活情况，结果如图11和12所示。图11显示，在模拟小肠液(pH7.0，37℃)条件培养2h，未包埋时，枯草芽孢杆菌菌体存活数减少到0，岩藻多糖单层包埋菌体存活数减少到3LG(cfu/ml)，寡糖单层包埋减少到3LG(cfu/ml)；说明寡糖2的保护与岩藻多糖保护效果相当。图12显示，在模拟小肠液(pH7.0，37℃)条件培养2h，未包埋时，枯草芽孢杆菌菌体存活数减少到0，岩藻多糖单层包埋菌体存活数减少到3LG(cfu/ml)，寡糖2单层包埋减少到4LG(cfu/ml)，说明寡糖2的保护效果好于岩藻多糖。
实施例3、单层包埋寡糖1对马克斯鲁维酵母生长的影响
益生菌处理：马克斯鲁维酵母发酵液4℃、4000×g离心10min，用PBS反复洗涤两次，沉淀细胞使用同样的PBS(pH7.0)悬均匀后，于4℃条件下保存备用。
未包埋组：将2ml浓缩马克斯鲁维酵母菌液与10ml pH7NaCl溶液旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
岩藻多糖包埋制备：将2ml浓缩马克斯鲁维酵母与10mL 40g/L的岩藻多糖混合，旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
寡糖1包埋制备：将2ml浓缩马克斯鲁维酵母菌液与10mL 40g/L的寡糖1混合，旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
将未包埋组，岩藻多糖包埋组和寡糖1包埋组，在模拟胃酸(pH2.0、37℃)处理2h，模拟小肠液(磷酸二氢钾0.68g，加水50ml，用氢氧化钠溶液调pH至6.8；另称胰蛋白酶1g加水溶解，两液混合，加水至100mL定容)37℃处理2h，然后检测马克斯鲁维酵母菌液存活情况。结果表明，岩藻多糖单层包埋菌体存活数减少到2.5LG(cfu/ml)，寡糖1单层包埋减少到4LG(cfu/ml)。说明岩藻多糖和寡糖1对马克斯鲁维酵母均有保护作用，且寡糖1的保护效果好于岩藻多糖。
实施例4、双层包埋寡糖1对马克斯鲁维酵母生长的影响
益生菌处理：马克斯鲁维酵母发酵液4℃、4000×g离心10min，用PBS反复洗涤两次，沉淀细胞使用同样的PBS(pH7.0)悬均匀后，于4℃条件下保存备用。
未包埋组：将2ml浓缩马克斯鲁维酵母菌液与10ml pH7NaCl溶液旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
岩藻多糖双层包埋制备：将2ml浓缩马克斯鲁维酵母与10mL 40g/L的岩藻多糖混合，旋转30min，再加入10ml 40g/L的岩藻多糖混合，旋转30min；制成双层包埋组。
寡糖1双层包埋制备：将2ml浓缩马克斯鲁维酵母菌液与10mL 40g/L的寡糖1混合，旋转30min，再加入10ml 40g/L的寡糖1混合，旋转30min；制成双层包埋组。
将未包埋组，岩藻多糖双层包埋组和寡糖1双层包埋组，在模拟胃酸(pH2.0、37℃)处理2h，模拟小肠液(磷酸二氢钾0.68g，加水50ml，用氢氧化钠溶液调pH至6.8；另称胰蛋白酶1g加水溶解，两液混合，加水至100mL定容)37℃处理2h，然后检测马克斯鲁维酵母菌液存活情况。结果表明，岩藻多糖双层包埋菌体存活数减少到5LG(cfu/ml)，寡糖1双层包埋减少到8LG(cfu/ml)，说明双层包埋效果优于单层效果。
实施例5、单层包埋寡糖1对丁酸梭菌生长的影响
益生菌处理：丁酸梭菌发酵液4℃、4000×g离心10min，用PBS反复洗涤两次，沉淀细胞使用同样的PBS(pH7.0)悬均匀后，于4℃条件下保存备用。
未包埋组：将2ml浓缩丁酸梭菌液与10ml pH7NaCl溶液旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
岩藻多糖包埋制备：将2ml浓缩丁酸梭菌与10mL 30g/L的岩藻多糖混合，旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
寡糖1包埋制备：将2ml浓缩丁酸梭菌菌液与10mL 30g/L的寡糖1混合，旋转30min，制成单层包埋组(简单混合)。
将未包埋组，岩藻多糖包埋组和寡糖1包埋组，在模拟胃酸(pH2.0、37℃)处理2h，模拟小肠液((磷酸二氢钾0.68g，加水50ml，用氢氧化钠溶液调pH至6.8；另称胰蛋白酶1g加水溶解，两液混合，加水至100mL定容)37℃处理2h，然后检测丁酸梭菌菌液存活情况。结果表明，岩藻多糖单层包埋菌体存活数减少到2LG(cfu/ml)，寡糖1单层包埋减少到4LG(cfu/ml)。说明岩藻多糖和寡糖1对丁酸梭菌均有保护作用，且寡糖1的保护效果好于岩藻多糖。
从上述结果可以看出，岩藻多糖及岩藻多糖水解得到的寡糖，可以提高对益生菌的保护，提高益生菌的穿过胃肠道的生存能力。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖在制备益生菌保护剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述水解寡糖由岩藻多糖水解、醇沉制得；或所述水解寡糖由岩藻多糖水解、去蛋白和醇沉制得。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述水解寡糖水解方法如下：所述水解为将岩藻多糖发酵液用硫酸调pH＝2.0～5.0后，在60～90℃条件下水解4～8小时，沉淀硫酸钙，收集上清，再洗涤去除杂质，获得水解产物；所述醇沉为将水解产物浓缩，离心去除沉淀后用加入乙醇沉淀；所述去蛋白为将水解产物加入Sevag试剂脱蛋白，收集岩藻寡糖溶液，除去残留的有机试剂，浓缩，然后加入乙醇沉淀。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述收集上清为使用孔径为0.22μm的过滤设备过滤；所述乙醇沉淀为加入相当于浓缩液2倍体积的乙醇沉淀；所述脱蛋白中按水解产物与Sevag试剂的体积比为4：1加入Sevag试剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述益生菌为枯草芽孢杆菌、马克斯鲁维酵母或丁酸梭菌中的一种或多种。
6.岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖保护益生菌的方法，其特征在于：将益生菌用岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖包埋，获得单层或多层包埋益生菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述单层包埋益生菌的方法如下：将益生菌与岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖混合，旋转，制成单层包埋益生菌；
所述多层包埋益生菌的方法如下：将益生菌与岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖混合，旋转，重复加入岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖和旋转步骤，获得多层包埋益生菌。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖的浓度为20～40g/L。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述益生菌菌液与岩藻多糖或岩藻多糖水解寡糖的体积比为1：5。
10.由权利要求6～9任一项所述方法制得的单层或多层包埋益生菌。
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