CN109734820A - 一种小分子岩藻多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小分子岩藻多糖的制备方法，采用本发明的制备方法，制得岩藻多糖分子量小于10KDa，其中岩藻多糖的制备步骤为：取海带粉末，加入去离子水，提取液过滤收集滤液，滤液浓缩后用CaCl₂和sevage法除杂质，收集滤液，搅拌下向提取液中加入乙醇至乙醇体积浓度为60％‑90％，静置或离心，收集沉淀烘干，得岩藻多糖。岩藻多糖经DEAE‑52纤维素阴离子交换柱纯化后，透析冻干得各种组分，在浓度为0.01mol/L‑0.2mol/L的HCl水溶液和H₂O₂、氨水下进行水解，透析即得。采用本发明制备的小分子量岩藻多糖为均一多糖，且硫酸根含量保持稳定，多糖水溶性增加。

Description

一种小分子岩藻多糖的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种小分子多糖的制备和分析方法，属于生物分离工程领域和海洋资源综合利用领域。

(二)背景技术

海洋约占地球表面积的71％，占地球总水量的97％，海洋生物的多样性提供了丰富的天然产物。海洋藻类作为一种新的生物活性物质的来源，越来越受到关注。褐藻是海洋藻类中的第二大种群，因其含有绿棕色的藻褐素而得名。褐藻(Phaeophyta)分为25个属，约有1500种。其中海带(Laminaria japonica)、裙带菜(Undaria pinnatifida)是最常见的褐藻。我国海岸线漫长，辽阔的海洋内蕴藏着丰富的藻类资源，并且我国是海藻生产和消费大国。其中海带、裙带菜是我国的传统食物，并且在过去的一千多年中，我国人民把它们当作治疗肾病水肿的传统药物。褐藻中含有的多糖成分，如褐藻胶，岩藻多糖，褐藻淀粉等，均已在医药原料中广泛的应用。

褐藻多糖(fucoidan)是Kylin等1913年从掌状海带中提取得到的，岩藻多糖是一类来源于褐藻和海洋无脊椎动物的硫酸化多糖，包括海带、裙带菜和海参。它们主要含有α(1-3)-或α(1-3)-和α(1-4)-交替连接的L-岩藻糖组分，乙酰基，硫酸盐或主链中存在不同的支链，除了L-岩藻糖外，大多数褐藻多糖的聚合物骨架中还存在少量的其他单糖，如半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖。岩藻依聚糖是无毒的化合物，具有降血糖预防肥胖、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血等生物活性，但这些活性取决于它们的结构特性，如分子量，支链形式，硫酸化方式和单糖组成。目前，日本已将岩藻多糖开发为保健品。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种均一小分子岩藻多糖的水解方法，该方法保持了硫酸根含量稳定。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种均一性小分子岩藻多糖的制备方法，所述方法为：(1)粗岩藻多糖提取：将干海带粉与溶剂混合，在60-100℃浸提1-5h，将浸提液离心(优选5000-10000r/min)，获得提取液；并将提取液减压浓缩至1/2-1/15体积(优选50℃-70℃减压浓缩至1/10)，获得浓缩液；所述溶剂为体积浓度95％乙醇水溶液或去离子水；所述溶剂体积用量以干海带粉质量计为25-50ml/g(优选30ml/g)；然后向浓缩液中加质量浓度1％～4％CaCl₂水溶液，搅拌至无沉淀产生(优选搅拌4h)，离心，取上清液浓缩至1/2～1/3倍体积后，采用sevage法除蛋白直至水层与sevage溶液层中间未出现白色层，取水层旋转蒸发除去残留的氯仿，用14KDa透析袋于去离子水中透析；取截留液加入无水乙醇至乙醇体积浓度为50％-90％，搅拌，在4℃下静置过夜，离心，沉淀干燥，得粗岩藻多糖；(2)粗岩藻多糖纯化：将粗岩藻多糖用去离子水溶解后，上样DEAE-52纤维素阴离子交换柱，分别用去离子水，0.3M NaCl水溶液、0.6M NaCl水溶液、0.9M NaCl水溶液、1.5M NaCl水溶液、2.0M NaCl水溶液进行洗脱，分别收集0.9M NaCl水溶液、1.5M NaCl水溶液、2.0M NaCl水溶液对应的三种流出液，分别用14KDa透析袋于去离子水中透析，取截留液冻干(12-24h)，分别获得三种纯化岩藻多糖；(3)小分子岩藻多糖的制备：将步骤(2)获得的三种纯化岩藻多糖用浓度为0.01～0.2mol/L的HCl水溶液制成质量浓度为0.5～5％的岩藻多糖溶液，于30℃-100℃下搅拌水解10min-2h，反应液调pH为7(优选用1mol/L的NaOH)后，用3.5KDa透析袋于去离子水中透析24h，取截留液浓缩至1/3体积后，加入体积浓度10～30％H₂O₂水溶液溶解，再加入体积浓度5～20％氨水调节pH为8.5，室温(25-30℃)避光放置30min，离心，上清液用3.5KDa透析袋于去离子水中透析，冻干，分别获得三种小分子岩藻多糖，所述小分子岩藻多糖分子量均小于10kDa，优选5-9kDa，最优选获得组成见表1中的Lj3h，Lj4h，Lj5h。

进一步，优选步骤(1)所述溶剂体积用量以干海带粉质量计为40ml/g；所述浸提条件为90℃浸提3h；所述溶剂为去离子水。

进一步，优选步骤(1)浸提重复2次，具体为：将干海带粉与溶剂混合，在60-100℃浸提1-5h，将浸提液离心(优选5000-10000r/min)，沉淀加入等体积溶剂同样条件下浸提1次，合并两次浸提液即获得提取液。

进一步，优选步骤(1)sevage法除蛋白按如下步骤操作：取上清液浓缩至1/2～1/3倍体积后，加入同体积的sevage溶液，800r/min磁力搅拌器下搅拌20min，分液漏斗分成上层水层和下层sevage溶液层，取上层离心，收集上清液；重复上述除蛋白(sevage溶液、分层、离心)操作，直至水层与sevage溶液层中间未出现白色层(优选5-15次，最优选12次)；所述sevage溶液为体积比4:1的氯仿：正丁醇。

进一步，优选步骤(2)粗岩藻多糖用去离子水溶解制成质量浓度为1％-5％的溶液，优选2％。

进一步，优选步骤(3)水解反应温度为60℃，时间为1h。

进一步，优选步骤(3)岩藻多糖用浓度为0.1mol/L的HCl水溶液制成质量浓度为1％的岩藻多糖溶液。

进一步，优选步骤(3)H₂O₂水溶液体积加入量为浓缩后截留液体积的1/2～1/4倍。

本发明提取岩藻多糖的原料可以是人工养殖的海带(Laminaria japonica)，也可以是人工养殖的裙带菜(Undaria pinnatifida Suringar)。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

1)采用本发明方法制备的岩藻多糖的总糖含量≥50％(符合国家标准)，纯化后的岩藻多糖总糖含量均在80％以上。

2)本发明方法分离得到的小分子岩藻多糖分子量均＜10KDa，Lj3、Lj4、Lj5水解后的分子量均减小了30倍以上，且制备的Lj3h、Lj4h、Lj5h均为均一性多糖。

3)采用本发明制备的小分子岩藻多糖硫酸根含量保持稳定，硫酸根含量的变化≤1.5％。

(四)附图说明

图1为DEAE-52阴离子交换树脂洗脱曲线图。

图2为Lj3h(A)，Lj4h(B)，Lj5h(C)，Lj3d(D)示差折光检测器纯度及分子量检测图。

图3岩藻多糖粘度变化曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：水煮法提取岩藻多糖和DEAE-52纯化岩藻多糖

1、岩藻多糖提取

(1)称取40g干海带粉(80目)，加入1200ml去离子水a于90℃浸提3h，将浸提液8000r/min下离心10min，一次过滤，获得一次提取液和一次滤渣；一次滤渣加入1200ml去离子水b同样条件下重新再提取一次，取离心后的二次提取液，合并一次提取液和二次提取液，即为提取液。将提取液体积浓缩至1/10，获得浓缩液。(2)然后向步骤(1)浓缩液中加入质量浓度2％CaCl₂水溶液，搅拌4h至无沉淀产生，离心，取上清液，浓缩1/3倍体积后，加入同体积的sevage溶液(氯仿：正丁醇＝4:1，v/v)，800r/min磁力搅拌器下搅拌20min，分液漏斗分成上层水层和下层sevage溶液层，取上层离心，收集上清液。重复上述除蛋白(sevage溶液、分层、离心)操作12次，直至水层与sevage溶液层中间未出现白色层。取水层旋转蒸发除去残留的氯仿，用14KDa透析袋于去离子水中透析。取截留液加入无水乙醇至乙醇体积浓度为75％，磁力搅拌，在4℃下静置过夜，离心，沉淀烘干，得粗岩藻多糖2.5g，记为粗岩藻多糖La。

2、纯化岩藻多糖

称取步骤1制备的1.0g粗岩藻多糖La，用去离子水配置质量浓度为2％(m/m)的溶液，上样DEAE-52纤维素阴离子交换柱(3.8cm×30cm)，分别用纯水，0.3M NaCl水溶液、0.6MNaCl水溶液、0.9M NaCl水溶液、1.5M NaCl水溶液、2.0M NaCl水溶液进行洗脱，分别得到馏分La1H，馏分Lj1，馏分Lj2，馏分Lj3，馏分Lj4，馏分Lj5，每个馏分用硫酸苯酚法检测，如图1，然后对6个组分浓缩至1/10体积，用14KDa的透析袋于去离子水中透析48h，取截留液冻干，分别得到六种岩藻多糖，记为岩藻多糖La1H，岩藻多糖Lj1，岩藻多糖Lj2，岩藻多糖Lj3，岩藻多糖Lj4，岩藻多糖Lj5。

实施例2：岩藻多糖水解条件优化和小分子多糖制备

(1)岩藻多糖水解条件优化：分别称取18份实施例1制备的岩藻多糖(Lj3，Lj4，Lj5各6份)每份100mg，加入不同浓度的盐酸水溶液(0.01M，0.05M，0.1M)配置为质量浓度1％(m/m)的岩藻多糖溶液，在不同温度下水解，水解条件：0.01M(80℃，100℃)，0.05M(60℃，80℃)，0.1M(60℃，100℃)。TLC法检测其水解程度，黏度法检测其水解速率，确定最佳水解条件，结果见图3。本发明优化的水解条件确定为0.1mol/L HCl、60℃水解1h。

(2)小分子多糖制备：

1)取实施例1制备的1.0g岩藻多糖Lj3，用0.1mol/L HCl配置质量浓度为1％(m/m)的岩藻多糖溶液，在60℃下反应1h，1mol/L NaOH调节pH为7，用3.5KDa透析袋于去离子水中透析24h，取截留液浓缩至1/3体积后，加入1/5倍体积的体积浓度30％H₂O₂水溶液，再加入体积浓度10％氨水调节pH为8.5，室温下避光反应30min，离心，上清液用3.5KDa透析袋于去离子水中透析24h，取截留液冻干12h，得小分子岩藻多糖0.632g，记为小分子岩藻多糖Lj3h，其总糖含量为89.03％，硫酸根含量为7.44％，平均分子量为6.21KDa，中性单糖摩尔组成甘露糖：葡萄糖：半乳糖：岩藻糖＝6.49:5.24:3.54:84.74，总糖含量增加，硫酸根含量变化＜1.5％，分子量减小了40倍。

2)取实施例1制备的1.0g岩藻多糖Lj4，用0.1mol/L HCl配置质量浓度为1％(m/m)的岩藻多糖溶液，在60℃下反应1h，1mol/L NaOH调节pH为7，用3.5KDa透析袋于去离子水中透析24h，取截留液浓缩至1/3体积后，加入1/5倍体积的体积浓度30％H₂O₂水溶液，再加入体积浓度10％氨水调节pH为8.5，室温下避光反应30min，离心，上清液用3.5KDa透析袋于去离子水中透析24h，冻干12h，得小分子岩藻多糖0.598g，记为小分子岩藻多糖Lj4h，其总糖含量为92.13％，硫酸根含量为18.86％，平均分子量为8.07KDa，中性单糖摩尔组成甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：岩藻糖＝0.94:1.34:0.21:35.22:62.29，总糖含量增加，硫酸根含量变化＜1.5％，分子量减小了100倍。

3)取实施例1制备的1.0g岩藻多糖Lj5，用0.1mol/L HCl配置质量浓度为1％(m/m)的岩藻多糖溶液，在60℃下反应1h，1mol/L NaOH调节pH为7，用3.5KDa透析袋于去离子水中透析24h，取截留液浓缩至1/3体积后，加入1/5倍体积的体积浓度30％H₂O₂溶液，再加入体积浓度10％氨水调节pH为8.5，室温下避光反应30min，离心，上清液用3.5KDa透析袋于去离子水中透析24h，冻干12h，得小分子岩藻多糖0.611g，记为小分子岩藻多糖Lj5h，分子量为5.37kDa，总糖含量为93.13％，硫酸根含量为20.22％，平均分子量为5.37KDa，中性单糖摩尔组成半乳糖：岩藻糖＝53.78：46.22，总糖含量增加，硫酸根含量变化＜1.5％，分子量减小了30倍。

4)取实施例1制备的1.0g岩藻多糖Lj3，用0.005mol/L HCl配置质量浓度为1％(m/m)的岩藻多糖溶液，在60℃下反应1h，1mol/L NaOH调节pH为7，用3.5KDa透析袋于去离子水中透析24h，取截留液浓缩至1/3体积后，加入1/5倍体积的体积浓度30％H₂O₂水溶液，再加入体积浓度10％氨水调节pH为8.5，室温下避光反应30min，离心，上清液用3.5KDa透析袋于去离子水中透析24h，取截留液冻干12h，得岩藻多糖Lj3d，示差折光检测器检测如图2(D)。不符合制备小分子均一多糖的要求，分子量降低很少。

实施例3：岩藻多糖的理化性质检测

(1)总糖含量检测：分别称取实施例1和实施例2制备的0.01g岩藻多糖(岩藻多糖Lj3，岩藻多糖Lj4，岩藻多糖Lj5，小分子岩藻多糖Lj3h，小分子岩藻多糖Lj4h，小分子岩藻多糖Lj5h)用去离子水定容至100ml，作为样品溶液。称取0.01g岩藻糖标准品，用去离子水定容至100ml，移取标品溶液0ml、1ml、3ml、5ml、7ml、9ml于10ml容量瓶中，去离子水定容，作为待测标品溶液。分别取1ml上述各个浓度的待测标品溶液和样品溶液于试管中，向其中分别加入体积浓度5％苯酚水溶液1ml，迅速加入5ml浓硫酸(质量浓度98％)，涡旋混合，490nm处测定吸光度，结果见表1。

(2)硫酸根含量检测：称取硫酸钾35mg，用蒸馏水配成100mL标准硫酸钾溶液。分别取标准硫酸钾溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL，加蒸馏水定容至3ml，加0.2M HCl 3.8mL，明胶氯化钡1mL，充分摇匀，室温(25-30℃)放置30min后于500nm处测其吸光度。实施例1和实施例2制备的岩藻多糖(岩藻多糖Lj3，岩藻多糖Lj4，岩藻多糖Lj5，小分子岩藻多糖Lj3h，小分子岩藻多糖Lj4h，小分子岩藻多糖Lj5h)样品用2mol/L HCl水解，取配制的0.1％样品溶液1mL，按上述方法加入HCl和明胶氯化钡，测其吸光度，结果见表1。

(3)样品中性糖成分检测：以甘露糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖等作为标准品，PMP法柱前衍生化，HPLC(流动相：磷酸盐：乙腈＝82:18，流速：1ml/min，254nm处检测)检测实施例1和实施例2制备的岩藻多糖(岩藻多糖Lj3，岩藻多糖Lj4，岩藻多糖Lj5，小分子岩藻多糖Lj3h，小分子岩藻多糖Lj4h，小分子岩藻多糖Lj5h)样品中单糖组分。

(4)分子量和纯度检测：以不同分子量(4.3KDa、1.26KDa、6.06KDa、123.5KDa、420KDa、821.7KDa)的葡聚糖作为标准品，示差折光检测器(流动相：0.2M NaCl，流速：0.5ml/min)检测实施例1和实施例2制备的岩藻多糖(岩藻多糖Lj3，岩藻多糖Lj4，岩藻多糖Lj5，小分子岩藻多糖Lj3h，小分子岩藻多糖Lj4h，小分子岩藻多糖Lj5h)样品的分子量和纯度，如表1和图2。

(5)岩藻多糖的理化性质如表1

表1岩藻多糖理化性质

*未检测出。

Claims (9)

1.一种小分子岩藻多糖的制备方法，其特征在于所述方法为：(1)粗岩藻多糖提取：将干海带粉与溶剂混合，在60-100℃浸提1-5h，将浸提液离心，获得提取液；并将提取液减压浓缩至1/2-1/15体积，获得浓缩液；所述溶剂为体积浓度95％乙醇水溶液或去离子水；所述溶剂体积用量以干海带粉质量计为25-50ml/g；然后向浓缩液中加质量浓度1％～4％CaCl₂水溶液，搅拌至无沉淀产生，离心，取上清液浓缩至1/2～1/3倍体积后，采用sevage法除蛋白，取水层旋转蒸发除去残留的氯仿，用14KDa透析袋于去离子水中透析；取截留液加入无水乙醇至乙醇体积浓度为50％-90％，搅拌，在4℃下静置过夜，离心，沉淀干燥，得粗岩藻多糖；(2)粗岩藻多糖纯化：将粗岩藻多糖用去离子水溶解后，上样DEAE-52纤维素阴离子交换柱，分别用去离子水，0.3M NaCl水溶液、0.6M NaCl水溶液、0.9M NaCl水溶液、1.5M NaCl水溶液、2.0M NaCl水溶液进行洗脱，分别收集0.9M NaCl水溶液、1.5M NaCl水溶液、2.0MNaCl水溶液的流出液，分别用14KDa透析袋于去离子水中透析，取截留液冻干，分别获得三种纯化岩藻多糖；(3)小分子岩藻多糖的制备：将步骤(2)三种纯化岩藻多糖用浓度为0.01～0.2mol/L的HCl水溶液制成质量浓度为0.5～5％的岩藻多糖溶液，于30℃-100℃下搅拌水解10min-2h，反应液调pH为7后，用3.5KDa透析袋于去离子水中透析24h，取截留液浓缩至1/3体积后，加入体积浓度10～30％H₂O₂水溶液，再加入体积浓度5～20％氨水调节pH为8.5，室温避光放置30min，离心，上清液用3.5KDa透析袋于去离子水中透析，取截留液冻干，分别获得小分子岩藻多糖。

2.如权利要求1所述小分子岩藻多糖的制备方法，其特征在于步骤(1)所述溶剂体积用量以干海带粉质量计为40ml/g；所述溶剂为去离子水。

3.如权利要求1所述小分子岩藻多糖的制备方法，其特征在于步骤(1)浸提重复2次，具体为：将干海带粉与溶剂混合，在60-100℃浸提1-5h，将浸提液离心，沉淀加入等体积溶剂同样条件下浸提1次，合并两次浸提液即获得提取液。

4.如权利要求1或3所述小分子岩藻多糖的制备方法，其特征在于步骤(1)所述浸提条件为90℃浸提3h。

5.如权利要求1所述小分子岩藻多糖的制备方法，其特征在于步骤(1)sevage法除蛋白按如下步骤操作：取上清液浓缩至1/2～1/3倍体积后，加入同体积的sevage溶液，800r/min磁力搅拌器下搅拌20min，分液漏斗分成上层水层和下层sevage溶液层，取上层离心，收集上清液；重复上述除蛋白操作，直至水层与sevage溶液层中间未出现白色层；所述sevage溶液为体积比4:1的氯仿：正丁醇。

6.如权利要求1所述小分子岩藻多糖的制备方法，其特征在于步骤(2)粗岩藻多糖用去离子水溶解制成质量浓度为1％-5％的溶液。

7.如权利要求1所述小分子岩藻多糖的制备方法，其特征在于步骤(3)水解反应温度为60℃，时间为1h。

8.如权利要求1所述小分子岩藻多糖的制备方法，其特征在于步骤(3)岩藻多糖用浓度为0.1mol/L的HCl水溶液制成质量浓度为1％的岩藻多糖溶液。

9.如权利要求1所述小分子岩藻多糖的制备方法，其特征在于步骤(3)H₂O₂水溶液体积加入量为浓缩后截留液体积的1/2-1/4倍。