CN107400173A - 一种枸杞多糖‑铬配合物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枸杞多糖‑铬配合物的制备方法及其应用，所述枸杞多糖‑铬配合物中铬的质量分数为5‑7%。由纯化后的枸杞多糖与铬在一定条件下自组装反应形成配合物，并经分离纯化而成。动物活性实验表明，枸杞多糖‑铬配合物显著降低高血糖小鼠的血糖作用，其降血糖作用强于无机铬和枸杞多糖，在一定剂量下还优于格列本脲。因而可用于制备抗糖尿病的药物和保健食品中。

Description

一种枸杞多糖-铬配合物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种枸杞多糖-铬配合物的制备方法及其应用，属于医药领域。
背景技术
糖尿病是严重威胁人类生命健康的疾病，全世界都致力于糖尿病新型药物的研究与开发，寻找有效、安全、不良反应小的治疗糖尿病的药物一直是药物研发者的目标，从天然药物中寻找降血糖的有效成分是一条重要的途径。多糖有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等作用。枸杞是药食两用中药，具有良好的降血糖功能。枸杞多糖是该功能活性成分，枸杞多糖可使糖尿病大鼠视网膜组织中抗坏血酸水平和SOD 活性明显下降，LPO含量明显增加，表明枸杞具有保护糖尿病大鼠视网膜组织氧化损伤的作用。据李长江等研究表明，枸杞多糖能在短时间内降低糖尿病小鼠餐后血糖水平，提高糖尿病小鼠的糖耐量；长期用枸杞多糖治疗糖尿病小鼠能够明显降低小鼠的血糖水平，并且其降血糖作用存在剂量依赖性，高剂量的降糖效果比优于低剂量。
铬是正常碳水化合物和脂类代谢所必需的微量元素，三价铬参与糖代谢，是维持动物及人体正常的葡萄糖耐量不可缺少的元素，无论是自然条件还是实验条件下，缺铬都可使组织对胰岛素的敏感性降低，胰岛素是糖代谢的核心物质，而胰岛素发挥作用，又必须有铬氧元素参加。过去是采用无机铬盐制剂来补充，但结果不能达到所期待的效果。
有机配体与金属离子形成螯合物后其性能将发发生较大变化，他不但能更好发挥原有配体和金属离子的功能，可能还具有其他的功能，如铬与烟酸螯合后形成的烟酸铬气吸收率大为提高，不但具有补充微量元素和烟酸的作用，而且还具有促进动物生长、提高瘦肉率、提高繁殖性能及增强机体免疫功能。很多的抗癌药物、抗生素与金属螯合以及多糖铁的合成应用也证明了这一点。
鉴于此，如果将枸杞多糖与金属离子螯合，其性能也必将发生很大的改善。由于多糖有丰富的羟基，是很好的配体，而Cr有空3d轨道是很好的中心离子，只要条件合适必将形成稳定的螯合物。本项目用枸杞多糖与Cr螯合形成枸杞多糖-Cr螯合物，研究其配位结构和抗糖尿病的效果。实验表明，枸杞多糖-铬配合物显著降低高血糖小鼠的血糖作用，其降血糖作用强于无机铬和枸杞多糖，在一定剂量下还优于格列本脲，因而可用于制备抗糖尿病的药物和保健食品中。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种枸杞多糖-铬配合物的制备方法及其应用。本发明原料易得，配合物制备工艺简单，价廉，生产方便，开发价值高，制得的枸杞多糖-铬配合物能显著降低高血糖小鼠的血糖作用，可用于制备抗糖尿病的药物和保健食品中，为开发系列新型高效、安全、不良反应小的治疗糖尿病的药物以及活性多糖-金属螯合物的研究开发奠定基础。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种枸杞多糖-铬配合物的制备方法，所述枸杞多糖与铬自组装反应形成配合物，配合物中铬所占质量分数为5-7%，制备方法包括如下步骤：
（1）枸杞粗多糖经提纯处理后得到纯化后的枸杞多糖；
（2）将步骤（1）纯化后的枸杞多糖于60℃下溶解于水中，随后在70~90℃水浴条件下将枸杞多糖溶液调节pH=6~9，在不出现沉淀的情况下，用胶头滴管缓慢滴加CrCl3水溶液（浓度为2 mol/L）和NaOH溶液（浓度为2 mol/L），注意维持溶液的pH=6~9；直到溶液中出现絮状沉淀再滴3~5滴CrCl3水溶液，保持70℃～90℃加热3h；
（3）将步骤（2）所得溶液进行离心并取上清液，加入95 wt%乙醇，冷却静置离心收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮和乙醚搅拌振荡洗涤沉淀物并减压干燥，获得浅绿色枸杞多糖-铬配合物粗品；
（4）将步骤（3）所得枸杞多糖-铬配合物粗品溶于水中，并装入预处理后的透析袋中透析过夜，透析后样品浓缩冷冻干燥，得到纯化后的枸杞多糖-铬配合物。
步骤（1）中所述枸杞粗多糖的提纯处理，具体包括以下步骤：
（A）磷酸缓冲液配制：甲液：准确称取3.121 g二水磷酸二氢钠，100 mL容量瓶定容；乙液：准确称取1.764 g十二水合磷酸氢二钠，100 mL容量瓶定容；将39.0 mL甲液与61.0 mL乙液混合后配制成pH=7.0的磷酸缓冲液，备用；
（B）酶溶液的配制：准确称取0.1g胰蛋白酶，磷酸缓冲液10 mL，在37℃水浴锅内溶解，得到10mg/mL的胰蛋白酶溶液，备用；
（C）准确称取5g枸杞粗多糖溶于500mL步骤（A）配制的磷酸缓冲液中，加入2mL步骤（B）配制的胰蛋白酶溶液，置于37℃水浴锅内水浴加热3小时；
（D）将酶解后的粗多糖溶液置于沸水中灭酶10分钟，室温下冷却并离心弃去沉淀，上清液加入2mL的Sevage溶液（氯仿和正丁醇按照体积比为2~4:1混合而成），摇床以100r/min的速率摇10min并静置30min，离心后取上清液，再往上清液中加入2mL Sevage溶液，此过程分别重复3次；然后加入4倍体积95wt%乙醇，冷却静置离心收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮和乙醚搅拌荡洗涤沉淀物，离心收集沉淀并减压干燥，收集枸杞多糖；
（E）将步骤（D）得到的枸杞多糖溶于水中，并装入预处理后的透析袋中透析过夜，透析后样品浓缩冷冻干燥，得到纯化后的枸杞多糖。
上述透析袋的预处理过程为：将透析袋放在2 wt%NaHCO3和1 mmol/L EDTA的混合液中煮沸10min，蒸馏水洗净，再用1mmol/L的EDTA煮沸10min，冷却置于4℃冰箱备用；透析袋处理需要戴手套，处理后保证透析袋浸没于保存液之内。
将上述制得的枸杞多糖--铬配合物应用于抗糖尿病的活性试验研究，通过对糖尿病小鼠的降血糖活性的研究，结果显示枸杞多糖-铬配合物显著降低高血糖小鼠的血糖作用，其降血糖作用强于无机铬和枸杞多糖，在一定剂量下还优于格列本脲。
本发明的有益效果：
（1）枸杞多糖--铬配合物目前尚未有合成和具有抗糖尿病活性的研究报道，本发明可用于制备抗糖尿病的药物和保健食品中，此新型化合物其最大优点是枸杞多糖为天然产物提取物，可药食两用；而铬是正常碳水化合物和脂类代谢所必需的微量元素，三价铬参与糖代谢，是维持动物及人体正常的葡萄糖耐量不可缺少的元素；二者形成螯合物后其性能将发生较大变化，他不但能更好发挥原有配体和金属离子的功能，还具有其他的功能，与现有抗糖尿病药相比，无毒副小，无不良反应，可长期使用；
（2）制得的枸杞多糖-铬配合物可用于制备抗糖尿病的药物，也可用于制备保健食品；
（3）原料易得，配合物制备工艺简单，价廉，生产方便，开发价值高，可为开发系列新型高效、安全、不良反应小的治疗糖尿病的药物以及活性多糖——金属螯合物的研究开发奠定基础。
附图说明
图1枸杞多糖、以及枸杞多糖-Cr配合物的红外光谱；
图2为小鼠喂药前后体重对比图；
图3 小鼠饲喂药枸杞多糖、枸杞多糖-Cr配合物前后血糖对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
1枸杞粗多糖的提纯
（1）磷酸缓冲液配制：
甲液：准确称取3.121g二水磷酸二氢钠，100mL容量瓶定容；
乙液：准确称取1.764g十二水合磷酸氢二钠，100mL容量瓶定容；
缓冲液：甲液39.0mL，乙液61.0ml混合，pH=7.0；
（2）酶溶液的配制：
准确称取0.1g胰蛋白酶，磷酸缓冲液中10mL，在37℃水浴锅内溶解，得到10mg/mL的胰蛋白酶溶液；
（3）透析袋处理：将透析袋放在2wt%NaHCO3和1mmol/L的EDTA(pH=8)混合液中煮沸10min，蒸馏水洗净，再用1mmol/L的EDTA(pH=8)煮沸10min，冷却置于4℃冰箱备用；透析袋处理需要戴手套，处理后保证透析袋浸没于保存液之内；
（4）准确称取5g枸杞粗多糖溶于500mL pH=7的磷酸缓冲液中，加入2mL配制的胰蛋白酶溶液，置于37℃水浴锅内水浴加热3小时；
（5）粗多糖溶液经酶解后，置于沸水中灭酶10分钟，室温下冷却并离心弃去沉淀，上清液加入2mL的Sevage（氯仿:正丁醇=3:1）溶液，摇床以100r/min的速率摇10min并静置30min，3000r/min离心10min后取上清液，再往上清液中加入2mL的Sevage试剂，此过程分别重复3次；加入4倍体积95wt%乙醇，冷却静置离心收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮、乙醚搅拌荡洗沉淀物，离心收集沉淀并减压干燥，收集枸杞多糖；
（6）60℃将枸杞多糖溶于于10mL水中，装入透析袋中夹紧，1L大烧杯加水磁力搅拌透析过夜，透析后样品浓缩冷冻干燥，得到纯化后的枸杞多糖。
2枸杞多糖与Cr+3配合
（1）称取0.6g干燥的纯化后的枸杞多糖，于60℃加热溶解于18mL水中；将CrCl3·6H2O溶于蒸馏水配制2 mol· L-1的CrCl3的水溶液，备用；
（2）在80℃水浴条件下将18mL枸杞多糖溶液调节pH=8，在不出现沉淀的情况下，用胶头滴管缓慢滴加预配制好的CrCl3的水溶液（2 mol· L-1）和NaOH溶液（2 mol· L-1），注意维持溶液的pH=8；直到溶液中出现絮状沉淀再滴4滴CrCl3的水溶液，保持80℃加热3h；3000r/min离心5min取上清液，加入100mL的95wt%乙醇，冷却静置离心收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮、乙醚搅拌荡洗沉淀物，离心收集沉淀并减压干燥，获得浅绿色枸杞多糖铬配合物粗品；
（3）60℃溶解枸杞多糖-铬配合物粗品于10mL水中，装入透析袋中夹紧，1L大烧杯加水磁力搅拌透析过夜，透析后样品浓缩冷冻干燥，得到纯化后的枸杞多糖-Cr配合物。
3枸杞多糖铬配合物红外光谱分析
将枸杞多糖铬配合物的无水干燥的样品与KBr混匀、研磨后压片，用红外光谱仪分析枸杞多糖、以及枸杞多糖-Cr配合物的结构差异，结果如图3所示。
从红外图谱图可以看出枸杞多糖-铬配合物在3444cm-1左右处的羟基伸缩振动的氢键缔合峰强度，比相应的枸杞多糖的吸收峰有所减弱，且发生较大波数红移（从3387cm-1到3444cm-1 ），这是由于铬离子与羟基氧原子发生配位反应，导致羟基形成分子间和分子内氢键能力减弱。并且枸杞多糖铬配合物的红外吸收峰与枸杞多糖配位前相比，骨架特征峰未发生明显变化，因而推测三价铬离子与枸杞多糖的羟基形成了配位键。通过红外光谱曲线的对比发现，枸杞多糖铬配合物上糖羟基比枸杞多糖上羟基明显红移，说明二者形成明显的配合物。
4枸杞多糖铬配合物的降血糖活性
4.1造模
柠檬酸缓冲液的配制：
柠檬酸(FW:210.14) 2.1g加入双蒸水100mL中配成A液
柠檬酸钠(FW:294.10) 2.94g加入双蒸水100mL中配成B液
链脲佐菌素配制液（STZ）：按1：1比例（柠檬酸：柠檬酸钠）配制成缓冲液，调整酸度为4.2-4.5，就是酸性柠檬酸缓冲液。做注射准备，用锡纸包裹装有柠檬酸缓冲液的试剂瓶，再以1%的浓度溶解STZ，按空腹体重注射相应的STZ。现配现用且需要避光，务必在30分钟内注射完毕。
小白鼠购回后预饲养3d，给予高脂肪饮食按照65 mg/Kg隔天两次腹腔注射(STZ)链脲佐菌素诱导糖尿病模型,3天后禁食12h，尾静脉采血，ACCU-CHEK血糖仪测定空腹血糖，血糖大于11.1mmol·L-1为造模成功。
4.2分组实验
造模成功小鼠均分成9个小组，每组8只，通过食物喂养研究糖尿病小鼠和空白对照组、阳性对照组的差异；对比枸杞多糖铬的机体吸收是不是比单独枸杞多糖和单独无机铬更好。实验分组及处理:见表1。每天灌胃直到15d末次给药后，禁食12h。
表1降血糖各组给药量
4.3空腹血糖值
将检测试纸插入血糖仪，剪短小鼠尾部1cm左右位置，小鼠血液滴在制定测定区域，读数。
4.4生长情况
开始各组实验前，小鼠分析天平称重，记录数据，实验结束后，小鼠脱颈处死，分析天平测量体重。
4.5 枸杞多糖及其铬络合物对高血糖小鼠体重的影响
通过图2可以看出，正常空白组的小老鼠在喂养7天后，体重正常增加，而所设置的阳性、阴性对照组的小鼠体重呈现下降的趋势，也进一步说明造模的成功。而各个给药组的小鼠体重都呈现下降趋势，特别是枸杞多糖铬络合物的不同剂量组的小鼠体重，在喂药后与喂药前都有显著差异。然而阳性对照组用格列本脲药物灌胃并不能降低高血糖小鼠的体重。
4.6 枸杞多糖及其铬络合物对高血糖小鼠血糖的影响
通过图3中的数据，可以看出枸杞多糖铬络合物在三个不同剂量组都表现出降血糖效果，与给药前相比，降血糖效果明显更强；枸杞多糖的降血糖效果显著性没有枸杞多糖铬络合物的强。所以枸杞多糖铬络合物的高剂量组的降血糖效果尤为突出，与阳性药物（格列本脲）对照表现出较好的降血糖效果。
5结论
在本实验的配合条件条件下成功合枸杞多糖-铬配合物，然后用红外光谱对配合结果进行鉴定，得出在pH=6～9，70℃～90℃下水浴加热得到的枸杞多糖合铬产率较高，且通过枸杞多糖与枸杞多糖合铬的红外谱图的对比验证了Cr3+配合的成功。使用链脲佐菌素诱导健康雄性小鼠患糖尿病，通过定量灌胃给药探讨枸杞多糖铬的降血糖活性。对比阳性组格列本脲和空白组等等，本实验认定枸杞多糖合铬具有较好的降血糖作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种枸杞多糖-铬配合物的制备方法，其特征在于：所述枸杞多糖与铬自组装反应形成配合物，配合物中铬所占质量分数为5-7%，制备方法包括如下步骤：
（1）枸杞粗多糖经提纯处理后得到纯化后的枸杞多糖；
（2）将步骤（1）纯化后的枸杞多糖于60℃下溶解于水中，随后在70~90℃水浴条件下将枸杞多糖溶液调节pH=6~9，在不出现沉淀的情况下，用胶头滴管缓慢滴加CrCl3水溶液和NaOH溶液，注意维持溶液的pH=6~9；直到溶液中出现絮状沉淀再滴3~5滴CrCl3水溶液，保持70℃～90℃加热3h；
（3）将步骤（2）所得溶液进行离心并取上清液，加入95 wt%乙醇，冷却静置离心收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮和乙醚搅拌振荡洗涤沉淀物并减压干燥，获得浅绿色枸杞多糖-铬配合物粗品；
（4）将步骤（3）所得枸杞多糖-铬配合物粗品溶于水中，并装入预处理后的透析袋中透析过夜，透析后样品浓缩冷冻干燥，得到纯化后的枸杞多糖-铬配合物。
2.根据权利要求1所述的枸杞多糖-铬配合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述枸杞粗多糖的提纯处理，具体包括以下步骤：
（A）磷酸缓冲液配制：甲液：准确称取3.121 g二水磷酸二氢钠，100 mL容量瓶定容；乙液：准确称取1.764 g十二水合磷酸氢二钠，100 mL容量瓶定容；将39.0 mL甲液与61.0 mL乙液混合后配制成pH=7.0的磷酸缓冲液，备用；
（B）酶溶液的配制：准确称取0.1g胰蛋白酶，磷酸缓冲液10 mL，在37℃水浴锅内溶解，得到10mg/mL的胰蛋白酶溶液，备用；
（C）准确称取5g枸杞粗多糖溶于500mL步骤（A）配制的磷酸缓冲液中，加入2mL步骤（B）配制的胰蛋白酶溶液，置于37℃水浴锅内水浴加热3小时；
（D）将酶解后的粗多糖溶液置于沸水中灭酶10分钟，室温下冷却并离心弃去沉淀，上清液加入2mL的Sevage溶液，摇床以100r/min的速率摇10min并静置30min，离心后取上清液，再往上清液中加入2mL Sevage溶液，此过程分别重复3次；然后加入4倍体积95wt%乙醇，冷却静置离心收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮和乙醚搅拌荡洗涤沉淀物，离心收集沉淀并减压干燥，收集枸杞多糖；
（E）将步骤（D）得到的枸杞多糖溶于水中，并装入预处理后的透析袋中透析过夜，透析后样品浓缩冷冻干燥，得到纯化后的枸杞多糖。
3.根据权利要求2所述的枸杞多糖-铬配合物的制备方法，其特征在于：步骤（D）中的Sevage溶液是氯仿和正丁醇按照体积比为2~4:1混合而成。
4.根据权利要求1或2所述的枸杞多糖-铬配合物的制备方法，其特征在于：所述透析袋的预处理过程为：将透析袋放在2 wt%NaHCO3和1 mmol/L EDTA的混合液中煮沸10min，蒸馏水洗净，再用1mmol/L的EDTA煮沸10min，冷却置于4℃冰箱备用；透析袋处理需要戴手套，处理后保证透析袋浸没于保存液之内。
5.根据权利要求1所述的枸杞多糖-铬配合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中CrCl3水溶液和NaOH溶液的浓度均为2 mol/L。
6.一种如权利要求1所述的制备方法制得的枸杞多糖-铬配合物在制备抗糖尿病毒的药物和保健食品中的应用。
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