CN107312105A - 一种茶叶多糖‑铬配合物及其制备和应用 - Google Patents

一种茶叶多糖‑铬配合物及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种茶叶多糖‑铬配合物及其制备和应用。该配合物是由纯化后的茶叶多糖与铬在一定条件下配位反应形成配合物，并经分离纯化而成。动物活性实验表明，茶叶多糖‑铬配合物具有显著降低高血糖小鼠的血糖作用，其降血糖作用强于无机铬和茶叶多糖，因而可用于制备抗糖尿病的药物和保健食品中。

Description

一种茶叶多糖-铬配合物及其制备和应用
技术领域
本发明涉及茶叶多糖-铬配合物及其制备和应用，属于医药领域。
背景技术
糖尿病是严重威胁人类生命健康的疾病，全世界都致力于糖尿病新型药物的研究与开发，寻找有效、安全、不良反应小的治疗糖尿病的药物一直是药物研发者的目标，从天然药物中寻找降血糖的有效成分是一条重要的途径。多糖有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等作用。茶叶是药食两用中药，具有良好的降血糖和降血脂功能。茶叶在世界各地都分布较广，其可作饮品,含有多种有益成分，并有保健功效，而且我国茶叶资源丰富，其药用历史久远。在我国和日本民间都有着用老茶叶治疗糖尿病的习惯。有研究证明,茶叶中治疗糖尿病的最主要的有效成分是茶叶多糖。茶叶多糖还有多种的药理作用,如降低血脂、防凝血和防血栓、增强动物机体免疫功能、舒缓心率加速和冠脉流量等作用。研究表明，茶叶多糖能促进胰岛β细胞产生和促进葡萄糖代谢的作用，使葡萄糖负荷后的血糖值有所改善。降低高血糖小鼠的血糖值和改善高血糖模型小鼠糖耐量的作用。
铬是正常碳水化合物和脂类代谢所必需的微量元素，三价铬参与糖代谢, 是维持动物及人体正常的葡萄糖耐量不可缺少的元素, 无论是自然条件还是实验条件下, 缺铬都可使组织对胰岛素的敏感性降低，胰岛素是糖代谢的核心物质, 而胰岛素发挥作用，又必须有铬氧元素参加。过去是采用无机铬盐制剂来补充，但结果不能达到所期待的效果。
有机配体与金属离子形成螯合物后其性能将发发生较大变化，他不但能更好发挥原有配体和金属离子的功能，可能还具有其他的功能，如铬与烟酸螯合后形成的烟酸铬气吸收率大为提高，不但具有补充微量元素和烟酸的作用，而且还具有促进动物生长、提高瘦肉率、提高繁殖性能及增强机体免疫功能。很多的抗癌药物、抗生素与金属螯合以及多糖铁的合成应用也证明了这一点。
鉴于此，如果将茶叶多糖与金属离子螯合，其性能也必将发生很大的改善。由于多糖有丰富的羟基，是很好的配体，而Cr有空3d轨道是很好的中心离子，只要条件合适必将形成稳定的螯合物。本项目用茶叶多糖与Cr螯合形成茶叶多糖—Cr螯合物，研究其配位结构和抗糖尿病的效果，实验表明，茶叶多糖-铬配合物显著降低高血糖小鼠的血糖作用，其降血糖作用强于无机铬和茶叶多糖，因而可用于制备抗糖尿病的药物和保健食品中。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种茶叶多糖-铬配合物及其制备和应用。该茶叶多糖-铬配合物具有显著降低高血糖小鼠的血糖作用，其降血糖作用强于无机铬和茶叶多糖，因而可用于制备抗糖尿病的药物和保健食品中。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种茶叶多糖-铬配合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）茶叶多糖的纯化；
（2）将2g纯化后的茶叶多糖在70℃的水浴条件下溶解于60ml水中，调节其pH为8；然后缓慢加入pH为7~8的CrCl3水溶液至溶液中出现的絮状沉淀不再消失为止，继续在70℃恒温反应3h，然后冷却、离心，取上清液；
（3）将步骤（2）的上清液液经醇沉，离心收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮、乙醚搅拌荡洗沉淀物并冷冻干燥，获得浅绿色茶叶多糖-铬配合物的粗品；
（4）将茶叶多糖-铬配合物的粗品溶于适量水中，用透析袋(截留分子量8～14KDa)透析，透析后浓缩、醇沉、离心、收集沉淀物，洗涤沉淀物、冷冻干燥，得到纯化后的茶叶多糖-铬配合物。
将步骤（4）干燥后的样品溶于水配成1wt%的水溶液进行可见-紫外吸收光谱分析。以佐证茶叶多糖和Cr已配位情况。将无水干燥的样品与KBr混匀、研磨后压片，用红外光谱分析茶叶多糖和茶叶多糖—Cr配合物的结构差异分析茶叶多糖和Cr已配位。并将应用于抗糖尿病的活性试验研究。
对茶叶多糖-铬配合物进行了糖尿病小鼠的降血糖活性的研究，结果显示茶叶多糖-铬配合物显著降低高血糖小鼠的血糖作用，其降血糖作用强于无机铬和茶叶多糖，在一定剂量下还优于格列本脲。
所述的茶叶多糖-铬配合物的制备方法，步骤（1）具体为：
①将10g茶叶粗多糖溶液100ml水中，得到茶叶粗多糖溶液；将茶叶粗多糖溶液和0.25%胰蛋白酶溶液按照1:0.4的体积比混合均匀，置于37℃恒温水浴中恒温加热3h，再往此混合液中加入28ml pH=7.0 10wt%H2O2，反应12h；
②将步骤①的反应液放入沸水中灭活酶10min，置于室温下冷却后经高速离心弃去沉淀，取上清液168ml置于烧杯中，加入42ml sevage溶液，在磁力搅拌仪上剧烈搅拌20分钟，倒入分液漏斗中静置分层，弃去中下两层的蛋白质层和有机相，再取上层溶液并加入42mlsevage溶液，重复以上操作直到中间界面没有蛋白质为止；所述的sevage试剂为体积比为4:1的氯仿-正丁醇混合液；
③将步骤②去蛋白后的多糖滤液用旋转蒸发仪浓缩至滤液体积的1/5，加入三倍的95wt%乙醇溶液进行醇沉，离心分离，将沉淀物按无水乙醇、丙酮、乙醚的顺序搅拌洗净并离心，离心后收集沉淀并冷冻干燥；
④将步骤③干燥后的茶叶多糖溶于适量的纯净水中，并移入透析袋(截留分子量8～14KDa)中透析过夜，透析结束后醇沉，离心收集的沉淀按无水乙醇、丙酮、乙醚的顺序搅拌洗净，将洗涤后的沉淀冷冻干燥后备用。
一种如上所述的制备方法制得的茶叶多糖-铬配合物，Cr元素的含量为16wt%。
一种如上所述的茶叶多糖-铬配合物在制备抗糖尿病的药物和保健食品中的应用。
本发明的有益效果在于：
1、茶叶多糖为天然产物提取物，可药食两用；而铬是正常碳水化合物和脂类代谢所必需的微量元素，三价铬参与糖代谢，是维持动物及人体正常的葡萄糖耐量不可缺少的元素；二者形成螯合物后不但能更好发挥原有配体和金属离子的功能，而且其毒性更小、吸收率更高。与现有抗糖尿病药相比，无毒副小，无不良反应，可长期使用；
2、原料易得，配合物制备工艺简单（反应温度50～70℃，反应时间2～4小时，pH6～9），价廉，生产方便，开发价值高，可为开发系列新型高效、安全、不良反应小的治疗糖尿病的药物奠定基础，为活性多糖——金属螯合物的研究开发奠定基础。
附图说明
图1无机铬盐紫外可见光谱；
图2茶叶多糖-铬配合物紫外可见光谱；
图3茶叶多糖红外吸收谱图；
图4茶叶多糖-铬配合物红外吸收谱图。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
1茶叶粗多糖的提纯
1.1 茶叶多糖的纯化
将茶叶粗多糖溶液10g溶于100ml水中和0.25%胰蛋白酶溶液按照1（茶叶粗多糖溶液）:0.4(胰蛋白酶溶液)的体积例混合均匀，置于37℃的恒温水浴中恒温加热3h，再往此混合液中加入28ml pH=7.0的10wt%H2O2反应12h；
然后将酶解后的茶叶粗多糖溶液放入沸水中灭火酶10min，置于室温下冷却后经高速离心弃去沉淀，取上清液168ml置于烧杯中，加入42ml的sevage溶液，在磁力搅拌仪上剧烈搅拌20分钟，倒入分液漏斗中静置分层，弃去中下两层的蛋白质层和有机相。再取上层溶液并加入42ml sevage溶液，重复以上操作直到中间界面没有蛋白质为止；
将去蛋白后的多糖滤液用旋转蒸发仪浓缩至滤液体积的1/5左右，加入三倍体积量的95wt%乙醇溶液进行醇沉，离心分离，将沉淀物按无水乙醇、丙酮、乙醚的顺序搅拌洗净并离心，离心后收集沉淀并冷冻干燥之。
将上述除过蛋白的茶叶多糖溶于适量的纯净水中，并移入透析袋中透析过夜，透析结束后醇沉，离心收集的沉淀同样按无水乙醇、丙酮、乙醚的顺序搅拌洗净，将洗涤后的沉淀置于冷冻干燥机中干燥，把干燥后的样品装进干燥瓶中并将它放入干燥器里面保存备用。
1.2茶叶多糖铬配合物合成
（1）合成：称取2.0 g纯化干燥后的茶叶多糖，在70℃的温度下溶于60ml 去离子水中。
在70℃的水浴条件下将60mL的茶叶多糖溶液调节pH=8，在沉淀不会不出现的情况下，用两只不同的胶头滴管缓慢滴加预先配制好的CrCl3溶液（注意控制溶液的pH=7-8），一直到溶液中出现絮状沉淀不再消失，再滴几滴CrCl3溶液，然后再保持水浴锅恒温70℃继续反应3h。冷却、离心，取上清液，加入三倍体积量的95wt%乙醇静置至分层后再次离心，收集沉淀，沉淀物按无水乙醇、丙酮、乙醚的顺序搅拌荡洗干净，再次离心收集沉淀物并置于冷冻干燥机中干燥，获得浅绿色茶叶多糖铬配合物的粗品。
（2）纯化：茶叶多糖铬配合物粗品完全溶于去离子水，移入透析袋中流水透析过夜，取出透析袋内的溶液浓缩，加入三倍体积量的95wt%乙醇醇沉后离心，收集沉淀，用无水乙醇、丙酮、乙醚搅拌洗涤，最后冷冻干燥得到纯化后的茶叶多糖铬配合物。
茶叶多糖铬配合物吸收光谱
2.1紫外-可见光吸收光谱分析
通过图1和图2的紫外可见光谱图对比可以发现，无机铬元素有两个特征吸收峰415nm与575nm；从茶叶多糖铬配合物的吸收峰的峰型上来看，这两个吸收峰都发生了不同程度的红移，这是由于三价铬离子的3d轨道受到了茶叶多糖上的羟基作用，发生了电子跃迁，因此产生红移。由此可以推测出三价铬离子与茶叶多糖配位成功形成了配合物。
2.2红外吸收光谱分析
将无水干燥的样品与KBr混匀、研磨后压片，用红外光谱仪分析茶叶多糖、以及茶叶多糖—Cr配合物的结构差异。origin7.5重绘图结果如图3和图4。
通过图3和图4的红外光谱图的对比可以发现，茶叶多糖铬配合物在3434cm-1左右处的羟基伸缩振动的氢键缔合峰强度，相比起相应的茶叶多糖的吸收峰是有所减弱的，并且发生了较大波数的红移（从3416cm-1 红移到3434cm-1 ），这是由于配合物内部的羟基氧原子与三价的铬离子发生了配位反应，使茶叶多糖大分子内部的部分氢键遭到了一定程度的破坏导致羟基形成分子间和分子内的氢键能力的减弱。而且茶叶多糖铬配合物的红外吸收峰与茶叶多糖配位前相比较，骨架特征峰没有发生什么明显的变化，因此可以推测三价的铬离子与茶叶多糖的羟基是形成了配位键的。通过二者的红外光谱图的对比可以发现，茶叶多糖配合物上的糖羟基相比茶叶多糖上的羟基发生了明显的红移，所以可以推测三价的铬离子与茶叶多糖形成了配合物。
3 配合物中铬含量分析
茶叶多糖-铬配合物配合物硝酸和双氧水混合液消解，消解液用ICP-MS测得茶叶多糖-铬配合物中Cr元素的质量比为16%。
4茶叶多糖铬配合物的降血糖活性
4.1造模
柠檬酸缓冲液的配制：
柠檬酸(FW:210.14)2.1g加入双蒸水100mL中配成A液
柠檬酸钠(FW:294.10)2.94g加入双蒸水100mL中配成B液
链脲佐菌素配制液（STZ）：按1:1比例（A液:B液）配制成缓冲液，做注射准备，用锡纸包裹装有柠檬酸缓冲液的试剂瓶，再以1%的浓度溶解STZ，按空腹体重注射相应的STZ。现配现用且需要避光，务必在30分钟内注射完毕。
小白鼠购回后预饲养3d，给予高脂肪饮食按照65 mg/Kg隔天两次腹腔注射(STZ)链脲佐菌素诱导糖尿病模型，3天后禁食12h，尾静脉采血，ACCU-CHEK血糖仪测定空腹血糖，血糖大于11.1mmol·L-1为造模成功。
4.2分组实验
造模成功小鼠均分成7个小组，每组10只，通过食物喂养研究糖尿病小鼠和空白对照组、阳性对照组的差异；对比茶叶多糖铬的机体吸收是不是比单独茶叶多糖和单独无机铬更好。实验分组及处理:见表1。每天灌胃直到15d末次给药后，禁食12h。
表1降血糖各组给药量
4.3茶叶多糖铬配合物对高血糖小鼠体重的影响
开始各组实验前，小鼠分析天平称重，记录数据，实验结束后，小鼠脱颈处死，分析天平测量体重。通过表2的数据对比可以看出小白鼠在注射链脲佐菌素之后，再经过不同的方式喂养一段时间，生理盐水组小白鼠的体重相比起空白组的有了明显的增加，这可以说明造模的成功。而且各个给药组的小白鼠的体重都出现了不同程度的下降趋势，这尤其体现在茶叶多糖铬配合物低、中、高的三个剂量上，小白鼠的体重在给药前后的对比都有着显著地差异(p＜0.05)。但是阳性对照组所使用的格列本脲药物灌胃并没有能够降低高血糖小白鼠的体重。
表2茶叶多糖配合物对高血糖小鼠体重的影响
4.4茶叶多糖及其铬配合物对高血糖小鼠血糖（空腹血糖值）的影响
将检测试纸插入血糖仪，剪短小鼠尾部1cm左右位置，小鼠血液滴在制定测定区域，读数。
通过表3的数据对比可以看出中剂量的茶叶多糖组比机铬给药组的降血糖效果要明显好一些，但是相比起格列本脲的降血糖效果要差一些。而茶叶多糖铬配合物在三个不同的剂量下都有着较为明显的降血糖效果，血糖在给药前后都有着显著地差异(p＜0.05)。并且茶叶多糖铬配合物在低剂量时的降血糖效果表现的尤为明显，效果比阳性对照药物还好。因此可以看出茶叶多糖铬配合物的降血糖的效果要明显好于茶叶多糖和铬。
表3茶叶多糖配合物对高血糖小鼠血糖的影响
5结论
本实验通过使用胰蛋白酶- Sevage法联合除去蛋白质的方法将茶叶多糖粗糖提纯得到中性茶叶多糖。将得到的中性茶叶多糖溶于水，通过控制变量法探究茶叶中性多糖与Cr3+配合物形成的最适条件：在温度为70℃、pH=8的环境下反应3小时。并且通过紫外-可见光谱法、红外光谱法对茶叶中性多糖与叶多糖-铬配合物的谱图进行了对比，验证了茶叶中性多糖与Cr3+配合的成功，用ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）测得茶叶多糖-铬配合物中Cr元素的含量为16%。使用链脲佐菌素诱导健康雄性小白鼠血糖增高并成为糖尿病小鼠，再通过设置格列本脲阳性组，生理盐水阴性组等实验，探究了茶叶多糖-铬配合物降血糖的能力。结果表明，茶叶多糖铬配合物低、中、高的三个剂量都有显著降低高血糖小白鼠的体重(p ＜0.05)，且效果优于阳性对照药物。茶叶多糖铬配合物低、中、高的三个剂量都有显著降低高血糖小白鼠的空腹血糖，且比无机铬、茶叶中性多糖给药组具有更好的降血糖的效果，并且茶叶多铬配合物的中低剂量表现明显，具有统计意义。虽然茶叶多糖铬配合物高、中剂量组的降血糖能力相比格列本脲阳性对照组相对要弱，但低剂量却比格列本脲阳性对照组相对要强。可见本实验结果证明茶叶多铬配合物有较好的降血糖效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种茶叶多糖-铬配合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）茶叶多糖的纯化；
（2）将2g纯化后的茶叶多糖在70℃的水浴条件下溶解于60ml水中，调节其pH为8；然后缓慢加入pH为7~8的CrCl3水溶液至溶液中出现的絮状沉淀不再消失为止，继续在70℃恒温反应3h，然后冷却、离心，取上清液；
（3）将步骤（2）的上清液液经醇沉，离心收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮、乙醚搅拌荡洗沉淀物并冷冻干燥，获得浅绿色茶叶多糖-铬配合物的粗品；
（4）将茶叶多糖-铬配合物的粗品溶于适量水中，用透析袋透析，透析后浓缩、醇沉、离心、收集沉淀物，洗涤沉淀物、冷冻干燥，得到纯化后的茶叶多糖-铬配合物。
2.根据权利要求1所述的茶叶多糖-铬配合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）具体为：
①将10g茶叶粗多糖溶液100ml水中，得到茶叶粗多糖溶液；将茶叶粗多糖溶液和0.25%胰蛋白酶溶液按照1:0.4的体积比混合均匀，置于37℃恒温水浴中恒温加热3h，再往此混合液中加入28ml pH=7.0 10wt%H2O2，反应12h；
②将步骤①的反应液放入沸水中灭活酶10min，置于室温下冷却后经高速离心弃去沉淀，取上清液168ml置于烧杯中，加入42ml sevage溶液，在磁力搅拌仪上剧烈搅拌20分钟，倒入分液漏斗中静置分层，弃去中下两层的蛋白质层和有机相，再取上层溶液并加入42mlsevage溶液，重复以上操作直到中间界面没有蛋白质为止；
③将步骤②去蛋白后的多糖滤液用旋转蒸发仪浓缩至滤液体积的1/5，加入三倍的95wt%乙醇溶液进行醇沉，离心分离，将沉淀物按无水乙醇、丙酮、乙醚的顺序搅拌洗净并离心，离心后收集沉淀并冷冻干燥；
④将步骤③干燥后的茶叶多糖溶于适量的纯净水中，并移入透析袋中透析过夜，透析结束后醇沉，离心收集的沉淀按无水乙醇、丙酮、乙醚的顺序搅拌洗净，将洗涤后的沉淀冷冻干燥后备用。
3.根据权利要求2所述的茶叶多糖-铬配合物的制备方法，其特征在于：步骤④的透析袋的截留分子量为：8～14KDa。
4.根据权利要求1所述的茶叶多糖-铬配合物的制备方法，其特征在于：步骤（4）中透析袋的截留分子量为8～14KDa。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的制备方法制得的茶叶多糖-铬配合物，其特征在于：所述的配合物中Cr元素的含量为16wt%。
6.一种如权利要求5所述的茶叶多糖-铬配合物在制备抗糖尿病毒的药物和保健食品中的应用。
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