CN101691410A

CN101691410A - 一种具有防治胰岛素抵抗作用的海洋寡糖铬配合物

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Publication number: CN101691410A
Application number: CN200910177711A
Authority: CN
Inventors: 于广利; 赵峡; 管华诗; 郝杰杰; 郝翠; 李广生
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2009-09-18
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2010-04-07
Anticipated expiration: 2029-09-18
Also published as: CN101691410B

Abstract

一种寡聚糖金属配合物，其特征是它的糖残基之间均由α-1，4-L-古罗糖醛酸组成，它的重均分子量≤12kD，其分子通式为(C₆H₇O₆)_nCr_m，其中，n＝1～54，m＝1～27，三价铬质量百分含量为0.1～12％。制备时将寡聚古罗糖醛酸水溶液在pH＝5～10和温度40～80℃条件下，缓慢加入三价铬盐和稀碱水溶液，当停止加入稀碱和铬盐水溶液后，继续保温反应1～3h，过滤，滤液用3～5倍体积的乙醇沉淀，静置，离心，收集沉淀，沉淀经无水乙醇洗涤、干燥即得。本发明的产品原料来源于海洋天然产物，具有资源丰富、易于产业化、安全性高、结构独特且口服吸收好，尤其融合了海洋寡糖和三价铬的优点，不仅具有防治胰岛素抵抗、调节糖和脂代谢紊乱作用，尤其在II型糖尿病的防治方面，具有广阔的市场和应用前景。

Description

一种具有防治胰岛素抵抗作用的海洋寡糖铬配合物

技术领域

本发明涉及一种糖金属配合物及其制备方法与应用，具体地说涉及一种寡聚α-L-古罗糖醛酸铬配合物及其制备方法和在防治胰岛素抵抗以及改善糖脂代谢紊乱中的应用。属于生物技术领域。

背景技术

糖尿病是一种受多种因素影响的复杂代谢性病症，源于环境因素和遗传易感性之间的相互作用，该疾病可诱发一系列并发症，如肥胖症、心脑血管疾病、高血压、高脂血症、神经系统病变、肾衰竭和肿瘤等。糖尿病分为I型和II型，大约95％以上的糖尿病患者属于2型糖尿病，其根本病因之一是胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗贯穿于II型糖尿病的全过程。

研究表明，II型糖尿病人线粒体代谢，包括肌肉和脂肪细胞中的糖和脂肪酸代谢明显受损(Lowell B et al，Science，2005，307：384-387)。线粒体作为细胞的动力工厂，具有控制能量代谢、调控蛋白质和脂肪酸代谢等多种功能。线粒体的氧化磷酸化是依靠线粒体DNA(mtDNA)编码并在线粒体内表达，尤其线粒体有一套独立的转录和翻译体系，是半自主性细胞器。因此，mtDNA及其编码基因的状况直接影响线粒体的功能。线粒体的代谢受细胞核的调控，如过氧化物增殖物激活受体-γ辅因子-1α(PGC-1α)是调控线粒体生成的主要转录因子(WilsonF et al，Mol Cell Biol，2003，23：1085-1094)，以及线粒体转录因子A(mtTFA)、核呼吸因子(Nrf1)等(Goffart S et al，Exp Physiol，2003，88(1)：33-40)。目前用于治疗糖尿病的噻唑烷二酮类等有效药物，如比格列酮可显著上调PGC-1a的表达和线粒体DNA的拷贝，促进脂肪和骨骼肌组织的氧化磷酸化并增加胰岛素的敏感性(Wilson F et al，J Clin Invest，2004，114：1281-1289；Pagel L，et al，J BiolChem，2008，33：22464-22472)。胰岛素抵抗是指一定量的胰岛素与其特异性受体结合后生物效应低于正常，即生理浓度的胰岛素没有达到预期的效应，主要表现为胰岛素抑制肝脏释放葡萄糖的能力及促进周围组织(主要是骨骼肌和脂肪)摄取和利用葡萄糖的能力下降。骨骼肌是葡萄糖代谢的重要组织，约80％的胰岛素刺激的葡萄糖摄取是由骨骼肌完成的。骨骼肌细胞胰岛素敏感性降低是机体胰岛素抵抗的主要原因，同时骨骼肌又是糖尿病损害的主要靶位，正因为骨骼肌在能量代谢中发挥着主要调节作用，使其成为防治II型糖尿病的关键靶组织。由于线粒体功能紊乱和线粒体生成障碍是参与胰岛素抵抗的重要因素。因此，增加线粒体的生成是预防和改善胰岛素抵抗，防治II型糖尿病的关键(McCartyMF，Med Hypothesis，2005，64：399-407)。

古罗糖醛酸是褐藻胶分子主要成分之一，聚古罗糖醛酸分子之间通过α1→4糖苷键链接，分子内羧基能和各种金属离子进行络合配位。三价铬离子(Cr³⁺)是人体维持正常血糖(Mertz et al，J Am Coll Nutr，1988，17：544-547)以及脂肪代谢(Abraham et al，Metabolism，1992，41：768-771)必须的微量元素，是公认的糖耐量因子。研究发现，II型糖尿病人不仅存在胰岛素抵抗而且体内铬含量低于正常人，补充三价铬，加速糖氧化、促进糖代谢并改善胰岛素抵抗是防治II型糖尿病的有效方法。由于无机铬生物利用度低，为了提高其生物利用度，国内外学者已经合成了许多具有降血糖活性的有机铬络合物，如小分子烟酸铬、吡啶甲酸铬、葡萄糖酸铬(公开号：CN1162590)、氨基葡萄糖酸铬(申请号：200610039938.X)等，但还没有从事海洋酸性寡糖铬络合物的制备及其应用。古罗糖醛酸是褐藻胶分子中特殊的结构单元，通过与三价铬配位反应，可将其制备成寡聚古罗糖醛酸铬配合物(LGCr)，该络合物不仅水溶性好、吸收快、而且安全性高，在较低剂量下具有明显的增加线粒体功能并改善胰岛素抵抗作用。虽然专利ZL031097510中公开了一种海藻酸铬的制备方法，但采用其专利方法所得产品为不溶于水的高分子量化合物，由于其不溶于水，不容易被人体吸收利用。本发明提供的LGCr为水溶性寡聚糖金属配合物，其制备方法及其在防治胰岛素抵抗和II型糖尿病方面的应用尚未见报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种寡聚古罗糖醛酸铬配合物及其制备方法，把它用作防治胰岛素抵抗剂，能防治因胰岛素抵抗所致的II型糖尿病。

一种寡聚古罗糖醛酸铬配合物，其特征是它的糖残基之间均由α-1，4-L-古罗糖醛酸组成，它的重均分子量≤12kD，其分子式可表述为(C₆H₇O₆)_nCr_m，其中，n＝1～54，m＝1～27。三价铬质量百分含量为0.1～12％。

一种寡聚古罗糖醛酸铬配合物的制备方法，其特征是将寡聚古罗糖醛酸水溶液在pH＝5～10和温度40～80℃条件下，缓慢加入三价铬和稀碱水溶液，当停止加入稀碱和铬盐水溶液后，继续保温反应1～3h，过滤，滤液用3～5倍体积的乙醇沉淀，静置，离心，收集沉淀，沉淀经无水乙醇洗涤、干燥即得。

本发明所述的三价铬盐是指氯化铬、醋酸铬、硝酸铬；所述的稀碱是指稀氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钠、碳酸钾。

寡聚古罗糖醛酸铬配合物用于防治胰岛素抵抗。

寡聚古罗糖醛酸铬配合物用于改善糖代谢和脂肪代谢紊乱。

寡聚古罗糖醛酸铬配合物用于II型糖尿病防治。

本发明以具有L-构型的寡糖古罗糖醛酸为原料，利用其特有的羧基将其与三价铬离子配位络合，得到了一种具有显著改善胰岛素抵抗和防治II型糖尿病活性的水溶性海洋寡糖化合物。本发明产品来源于海洋天然产物，具有资源丰富易于产业化、安全性高，结构独特、口服吸收好，尤其融合了海洋酸性寡糖和三价铬的优点，不仅具有防治胰岛素抵抗、调节糖脂代谢作用，尤其在II型糖尿病的防治方面具有广阔的的市场应用前景。

附图说明

图1寡聚古罗糖醛酸铬红外光谱图

从图1可知，3384.3cm^-1为羟基O-H伸缩振动峰；2932.5cm^-1为糖环C-H的伸缩振动峰；1616.2和1415.6cm^-1分别为糖醛酸羧基-COO^-非对称和对称伸缩振动峰；1326.6cm^-1为羧基中C-O伸缩振动吸收峰；1028.3cm^-1为糖环C-OH中C-O的伸缩振动；1092.5cm^-1为糖环内醚的C-O-C伸缩振动，1124.4cm^-1为相邻糖残基间C-O-C伸缩振动；947.6cm^-1为α-吡喃糖残基非伸缩振动峰；811.5cm^-1为寡糖L-古罗糖醛酸特征吸收峰；559.0cm^-1为Cr-O离子键特征吸收峰。这些特征表明所制备化合物为寡聚α-L-古罗糖醛酸铬配合物(LGCr)。

具体实施方式

下面结合实施例以及实验结果对本发明做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照常规方法中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明，且文中所述的较佳实施方法仅作示范之用。

根据本实验室已有专利(ZL 01107952.5)技术，采用氧化酸降解法从褐藻胶中分离获得不同分子量寡聚古罗糖醛酸(LG)，并用它们作为制备寡聚古罗糖醛酸铬配合物(LGCr)的原料。

实施例1

称取5g寡聚古罗糖醛酸(重均分子量为3.7kD)溶于200ml纯水中，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH＝8，在70℃水浴中搅拌下逐滴定量加入2mol/L三氯化铬溶液，在滴加铬溶液中不断用2mol/L氢氧化钠维持其pH在8左右，停止加入氢氧化钠和氯化铬后，继续保温2h。取出反应液，过滤，加入3.5倍体积的95％乙醇，沉淀，静置，收集沉淀，用无水乙醇脱水，在45℃下减压干燥得到寡聚古罗糖醛酸铬配合物，实测铬含量4.1％(W/W，下同)。

实施例2

称取6g寡聚古罗糖醛酸(重均分子量为1.2kD)溶于200ml纯水中，用1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH＝5，在80℃水浴中搅拌下逐滴加入2mol/L三氯化铬水溶液，并用2mol/L氢氧化钠维持其pH在5左右，当溶液中刚出现绿色絮状沉淀时，停止加入氢氧化钠和氯化铬，继续保温1h。取出反应液，过滤，加入5倍体积的95％乙醇，沉淀，静置，收集沉淀，用无水乙醇脱水，在45℃下减压干燥得到寡聚古罗糖醛酸铬配合物，实测铬含量12.4％。

实施例3

称取10g寡聚古罗糖醛酸(重均分子量为9.7kD)溶于500ml纯水中，用2mol/L氢氧化钠水溶液调节pH＝10，在60℃水浴中搅拌下逐滴加入2mol/L三氯化铬溶液，并用2mol/L氢氧化钠维持其pH在10左右，当溶液中刚出现绿色絮状沉淀时，停止加入氢氧化钠和氯化铬，继续保温2h。取出反应液，过滤，加入3倍体积的95％乙醇，沉淀，静置，收集沉淀，用无水乙醇脱水，在45℃下减压干燥得到聚古罗糖醛酸铬配合物，实测铬含量9.2％。

实施例4

称取4g寡聚古罗糖醛酸(重均分子量为5.5kD)溶于200ml纯水中，用2mol/L氢氧化钠水溶液调节pH＝9，在50℃水浴中搅拌下逐滴定量加入2mol/L三氯化铬(CrCl₃.6H₂O)溶液，并用2mol/L氢氧化钠维持其pH在9左右，停止加入氢氧化钠和氯化铬，继续保温3h。取出反应液，过滤，加入4倍体积的95％乙醇，沉淀，静置，收集沉淀，用无水乙醇脱水，在45℃下减压干燥得到寡聚古罗糖醛酸铬配合物，实测铬含量2.3％。

实施例5

称取8g寡聚古罗糖醛酸(重均分子量为7.3kD)溶于400ml纯水中，用2mol/L氢氧化钠水溶液调节pH＝6，在40℃水浴中搅拌下逐滴定量加入50％硝酸铬(Cr(NO₃)₃.9H₂O)水溶液4.7毫升，并用2mol/L氢氧化钠维持其pH在6左右，停止加入氢氧化钠和氯化铬，继续保温3h。取出反应液，过滤，加入4倍体积的95％乙醇，沉淀，静置，收集沉淀，用无水乙醇脱水，在45℃下减压干燥得到聚古罗糖醛酸铬配合物，实测铬含量3.6％。

实施例6

称取10g寡聚古罗糖醛酸(重均分子量为11.4kD)溶于500ml纯水中，用2mol/L氢氧化钠水溶液调节pH＝7，在75℃水浴中搅拌下逐滴加入10％醋酸铬(Cr(Ac)₃)水溶液2.2毫升，并用2mol/L氢氧化钠维持其pH在7左右，停止加入氢氧化钠和醋酸铬后，继续保温3h。取出反应液，趁热过滤，冷却后，加入3倍体积的95％乙醇，静置，离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，在45℃下减压干燥，得到聚古罗糖醛酸铬配合物，实测铬含量0.45％。

实施例7

称取10g寡聚古罗糖醛酸(重均分子量为1.5kD)溶于250ml纯水中，用1.5mol/L氢氧化钠水溶液调节pH＝4，在55℃水浴中搅拌下逐滴加入1％醋酸铬(CH₃COO)₃Cr水溶液2.8毫升，并用1.5mol/L氢氧化钠维持其pH在4左右，停止加入氢氧化钠和醋酸铬后，继续保温2h。取出反应液，趁热过滤，冷却后，加入5倍体积的95％乙醇，静置，离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，在45℃下减压干燥，得到聚古罗糖醛酸铬配合物，实测铬含量0.06％。

寡聚古罗糖醛酸铬配合物的生物活性评价

用本发明的产品按国际公认的方法，评价了它对骨骼肌细胞胰岛素敏感性影响、对调控线粒体代谢的关键转录因子PGC-1α、mtTFA、NRF1表达影响、对线粒体DNA拷贝数目的影响、对骨骼肌细胞内线粒体电子传递链活性的影响、对调控脂肪代谢的关键蛋白PPAR-α和CPT-1表达影响，显示出显著的防治胰岛素抵抗活性、改善糖代谢和脂代谢活性，以及防治II型糖尿病活性。实验结果如下。

1LGCr对骨骼肌细胞胰岛素敏感性促进作用

运用骨骼肌细胞构建胰岛素抵抗模型，通过与环格列酮比较并测定葡萄糖转运效率评价LGCr的作用。从表1可知，LGCr呈浓度依赖性的增强胰岛素敏感性，表明LPCr在10～100umol/L内具有改善骨骼肌细胞对葡萄糖的转运能力。从表2可知，分化后的骨骼肌细胞应用50umol/L LGCr或20umol/L环格列酮作用8小时后，再用palmitiae刺激48小时后，测定胰岛素刺激后葡萄糖转运效率，表明均能够提高胰岛素敏感性，改善糖代谢，提示其具有防治II型糖尿病活性。

表1不同浓度LGCr对骨骼肌细胞胰岛素敏感性的促进作用

*p＜0.05，与对照组(未加palmitate)相比；#p＜0.05，与模型组(加palmitate)相比；(n＝5；X±SD)

表2LGCr和环格列酮对骨骼肌细胞胰岛素敏感性的作用

2LGCr对PGC-1α的促进作用

骨骼肌细胞用50μmol/L LGCr作用8小时，再应用palmitate刺激48小时，经免疫蛋白印迹分析表明(表3)，骨骼肌细胞中PGC1-α的表达量极显著增加(p＜0.01)，表明LGCr对PGC1-α有显著的促进作用，表明其能增加线粒体的生成，具有改善糖代谢和脂代谢紊乱和防治II型糖尿病活性。

表3LGCr对骨骼肌细胞PGC1-α的促进作用

**p＜0.01，与对照组(未加palmitate)相比；##p＜0.01，与模型组(加palmitate)相比；(n＝5；X±SD)

3LGCr对骨骼肌细胞线粒体功能的影响

骨骼肌细胞经50μmol/L LGCr处理后，分析NRF1和mtTFA的mRNA表达以及线粒体DNA的拷贝情况。表4结果表明，与模型组比较，LGCr有明显促进NRF1mRNA表达(P＜0.05)，并极显著(p＜0.01)地促进mtTFA mRNA表达和线粒体DNA拷贝数，进一步表明LGCr具有提高线粒体生成作用，提示其具有防治II型糖尿病活性。

表4LGCr促进骨骼肌细胞mRNA表达及促进线粒体DNA拷贝数情况

**p＜0.01，与对照组相比；#p＜0.05和##p＜0.01与模型组相比；(n＝5；X±SD)

表5结果显示，分化后的骨骼肌细胞应用50umol/L LGCr作用8小时，再应用palmitate刺激48小时后，能显著(p＜0.01)提高线粒体电子传递链复合物I以及复合物III蛋白的活性，表明其能增加骨骼肌线粒体功能作用，具有防止II型糖尿病活性。

表5LGCr促进骨骼肌细胞线粒体电子传递链复合物的活性

**p＜0.01，与对照组相比；##p＜0.01与模型组相比；(n＝5；X±SD)

4LGCr对骨骼肌细胞PPAR-α以及CPT-1的mRNA水平影响

从表6数据可以看出，LGCr能明显提高骨骼肌细胞过氧化物增殖物激活受体-α(PPAR-α)和肉碱脂酰转移酶-1(CPT-1)的mRNA水平的表达。表明其具有促进脂肪氧化代谢功能，具有防止II型糖尿病活性。

表6LGCr对骨骼肌细胞PPAR-和CPT-1mRNA影响

*p＜0.05，与对照组相比；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组相比；(n＝5；X±SD)

经过发明人长期的研究，首次揭示了寡聚LGCr对于促进胰岛素敏感性和防治胰岛素抵抗的显著效果。具体地说，本发明人以游离脂肪酸(palmitate)诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗作为研究模型，发现了LGCr可显著修复线粒体传递链复合体的酶活性；同时LGCr可显著增加骨骼肌细胞模型的线粒体DNA拷贝数量，这些变化伴随着调控线粒体生成的关键转录因子过氧化物增殖物激活受体-γ辅因子-1a(PGC-1α)、线粒体转录因子A(mtTFA)和核呼吸因子1(NRF1)的表达升高，表明LGCr可以显著促进骨骼肌胰岛素抵抗细胞模型中线粒体生成和线粒体功能；并且LGCr通过逆转游离脂肪酸所抑制的与脂肪酸氧化利用相关的过氧化物增殖物激活受体-a(PPAR-α)和肉碱脂酰转移酶-1(CPT-1)的表达，促进脂肪酸β-氧化，从而改善脂质代谢，同时促进了胰岛素刺激的骨骼肌细胞葡萄糖转运，增加了骨骼肌细胞对胰岛素的敏感性。

本发明的产品产品成本低廉，安全性高，在10～100umol/L下可发挥良好的防治胰岛素抵抗和改善糖脂代谢紊乱活性，为该类药物的开发提供了新的途径。

Claims

1.一种寡聚古罗糖醛酸铬配合物，其特征是它的糖残基之间均由α-1，4-L-古罗糖醛酸组成，它的重均分子量≤12kD，其分子式可表述为(C₆H₇O₆)_nCr_m，其中n＝1～54，m＝1～27。三价铬质量百分含量为0.1～12％。

2.一种寡聚古罗糖醛酸铬配合物的制备方法，其特征是将寡聚古罗糖醛酸水溶液在pH＝5～10和温度40～80℃条件下，缓慢加入三价铬和稀碱水溶液，当停止加入稀碱和铬盐水溶液后，继续保温反应1～3h，过滤，滤液用3～5倍体积的乙醇沉淀，静置，离心，收集沉淀，沉淀经无水乙醇洗涤、干燥即得。

3.权利要求2所述的三价铬盐是指氯化铬、醋酸铬、硝酸铬。

4.权利要求2所述的稀碱是稀氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钠、碳酸钾。

5.一种寡聚古罗糖醛酸铬配合物，其特征是用于防治胰岛素抵抗。

6.一种寡聚古罗糖醛酸铬配合物，其特征是用于改善糖代谢和脂肪代谢紊乱。

7.一种寡聚古罗糖醛酸铬配合物，其特征是用于II型糖尿病防治。