CN101624426B

CN101624426B - 一种玉足海参糖胺聚糖的提取方法

Info

Publication number: CN101624426B
Application number: CN2009103053635A
Authority: CN
Inventors: 王志国; 张彦广; 黄继汉; 齐桂芳
Original assignee: Heilongjiang Hongdoushan Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Heilongjiang Hongdoushan Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-08-07
Filing date: 2009-08-07
Publication date: 2011-06-01
Anticipated expiration: 2029-08-07
Also published as: CN101624426A

Abstract

一种玉足海参糖胺聚糖的提取方法，它涉及一种糖胺聚糖的提取方法。本发明解决了目前从玉足海参中提取的玉足海参糖胺聚糖质量纯度低，不能直接用于制成注射剂的问题。方法：一、玉足海参粉与纯化水混合，经酶解和离心后得沉淀A；二、沉淀A与纯化水混合，经加热、和离心后得沉淀B；三、沉淀B与纯化水混合，离心取沉淀用纯化水溶解，经离心和洗涤得沉淀C；四、沉淀C与缓冲液混合，经层析、洗涤、洗脱和离心后得沉淀D；五、沉淀D与生理盐水混合，经离心后得沉淀E；六、沉淀E与注射用水混合，透析或超滤截流后取固相产物，冷冻干燥后即得。本发明提取的玉足海参糖胺聚糖质量纯度高达93％～99％，能够直接用于制备注射剂。

Description

一种玉足海参糖胺聚糖的提取方法

技术领域

本发明涉及一种糖胺聚糖的提取方法。

背景技术

中风病为中医的四大顽症之一，其高发病率、高致残率、高病死率严重危害人类健康。缺血性中风(脑梗死)约占全部脑中风的60％～80％，其发病率为110/10万人口，且呈逐年上升趋势，现代医学对缺血性中风的病因、发病机理的研究进展非常迅速，在治疗方面进展不大；其中，只有溶栓被公认为有确切的疗效，但是，现有溶栓药物在使用中因时间窗(72h内)要求及高出血风险，而限制其广泛应用。

海参含有的多糖主要有两种，一种为海参糖胺聚糖，另一种为海参岩藻多糖；研究表明海参多糖具有抗癌、提高免疫力、抗凝、促进纤溶、降低血粘度、调节血脂、抗病毒等多种生理活性，在抗凝等方面糖胺聚糖较岩藻多糖具有更强的活性。玉足海参糖胺聚糖(Holothuria leucospilota Glycosaminoglycan，HG)，旧称粘多糖、酸性粘多糖或硫酸粘多糖。玉足海参糖胺聚糖具有抗凝、纤溶、降低血粘度、调节血脂等活性，作用于缺血性中风(脑梗死)的各个环节，从而达到治疗缺血性中风的目的。糖胺聚糖是海参中与中风治疗有关的主要药效成份；但是，目前从玉足海参中提取的玉足海参糖胺聚糖为粗品(质量纯度仅为50％～60％)，不能直接用于制成注射剂。

发明内容

本发明为了解决目前从玉足海参中提取的玉足海参糖胺聚糖质量纯度低，不能直接用于制成注射剂的问题，而提供一种玉足海参糖胺聚糖的提取方法。

玉足海参糖胺聚糖的提取方法按以下步骤实现：一、按体积份数比称取1份玉足海参粉、7～9份纯化水、0.01～0.03份碱性蛋白酶、0.001～0.003份复合胰酶和0.6～1份无水乙醇，将玉足海参粉与纯化水混合，然后加入碱性蛋白酶，并在60～70℃下酶解4～5h，再在80～90℃下灭活5～15min，降温至50℃加入复合胰酶并酶解4～5h，然后在98～100℃下灭活5～15min，冷却后离心并调节pH值为2～3，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后取上清液并调节pH值为6～7，再加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心得沉淀A；二、按体积份数比重新称取1份沉淀A、15～25份纯化水、2份可溶性钙盐和0.6～1份无水乙醇，将沉淀A与纯化水混合，加热至80～90℃并调节pH值为8～10，然后加入可溶性钙盐并在90～100℃下保温15～25min，冷却后离心取上清液并调节pH值为10～12，再离心取上清液并调节pH值为5.5～6.5，然后加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心得沉淀B；三、按体积份数比重新称取1份沉淀B和6～12份纯化水，将沉淀B与纯化水混合，然后加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心取沉淀用纯化水溶解，再加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心取沉淀，依次用体积浓度为70％的乙醇和无水乙醇洗涤，得沉淀C；四、按体积份数比重新称取1份沉淀C、40～60份浓度为0.02～0.08mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液和0.8～1.2份无水乙醇，将沉淀C与浓度为0.02～0.08mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，然后用二乙氨乙基纤维素进行层析，再用浓度为0.4mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤，然后用浓度为1.0mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液进行紫外分光光度测试，选取吸收光波长为215nm的洗脱液，然后加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心，得沉淀D；五、按体积份数比重新称取1份沉淀D、15～25份的生理盐水、0.01～0.03份质量浓度为30％的过氧化氢和0.8～1.2份无水乙醇，将沉淀D与生理盐水混合并调节pH值为10～12，然后加入质量浓度为30％的过氧化氢，在60～70℃下保温4～6h，冷却后离心取上清液并调节pH值为6.5～7.5，再加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心，得沉淀E；六、按体积份数比重新称取1份沉淀E和15～25份的注射用生理盐水，将沉淀E与注射用生理盐水混合，然后用透析膜对注射用水透析24h或者用10000分子量渗透膜超滤截流，取固相产物，冷冻干燥后即得玉足海参糖胺聚糖；其中步骤一、二、三、四和五中离心的转速均为4000～5000r/min，时间均为15～20min；步骤四中醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值均为6。

本发明中从玉足海参中提取的玉足海参糖胺聚糖质量纯度高达93％～99％，重均分子量为90000～130000，能够直接用于制备注射剂，制成的注射剂安全、有效，在国家食品药品监督管理局9家临床试验基地中完成的700例临床试验已经得到证实。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式玉足海参糖胺聚糖的提取方法按以下步骤实现：一、按体积份数比称取1份玉足海参粉、7～9份纯化水、0.01～0.03份碱性蛋白酶、0.001～0.003份复合胰酶和0.6～1份无水乙醇，将玉足海参粉与纯化水混合，然后加入碱性蛋白酶，并在60～70℃下酶解4～5h，再在80～90℃下灭活5～15min，降温至50℃加入复合胰酶并酶解4～5h，然后在98～100℃下灭活5～15min，冷却后离心并调节pH值为2～3，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后取上清液并调节pH值为6～7，再加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心得沉淀A；二、按体积份数比重新称取1份沉淀A、15～25份纯化水、2份可溶性钙盐和0.6～1份无水乙醇，将沉淀A与纯化水混合，加热至80～90℃并调节pH值为8～10，然后加入可溶性钙盐并在90～100℃下保温15～25min，冷却后离心取上清液并调节pH值为10～12，再离心取上清液并调节pH值为5.5～6.5，然后加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心得沉淀B；三、按体积份数比重新称取1份沉淀B和6～12份纯化水，将沉淀B与纯化水混合，然后加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心取沉淀用纯化水溶解，再加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心取沉淀，依次用体积浓度为70％的乙醇和无水乙醇洗涤，得沉淀C；四、按体积份数比重新称取1份沉淀C、40～60份浓度为0.02～0.08mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液和0.8～1.2份无水乙醇，将沉淀C与浓度为0.02～0.08mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，然后用二乙氨乙基纤维素进行层析，再用浓度为0.4mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤，然后用浓度为1.0mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液进行紫外分光光度测试，选取吸收光波长为215nm的洗脱液，然后加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心，得沉淀D；五、按体积份数比重新称取1份沉淀D、15～25份的生理盐水、0.01～0.03份质量浓度为30％的过氧化氢和0.8～1.2份无水乙醇，将沉淀D与生理盐水混合并调节pH值为10～12，然后加入质量浓度为30％的过氧化氢，在60～70℃下保温4～6h，冷却后离心取上清液并调节pH值为6.5～7.5，再加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心，得沉淀E；六、按体积份数比重新称取1份沉淀E和15～25份的注射用生理盐水，将沉淀E与注射用生理盐水混合，然后用透析膜对注射用水透析24h或者用10000分子量渗透膜超滤截流，取固相产物，冷冻干燥后即得玉足海参糖胺聚糖；其中步骤一、二、三、四和五中离心的转速均为4000～5000r/min，时间均为15～20min；步骤四中醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值均为6。

本实施方式中可溶性钙盐为现有的各种可溶性钙盐晶体。

本实施方式中钾盐为现有的各种钾盐。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中按体积份数比称取1份玉足海参粉、7份纯化水、0.01份碱性蛋白酶、0.001份复合胰酶和0.6份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中按体积份数比称取1份玉足海参粉、9份纯化水、0.03份碱性蛋白酶、0.003份复合胰酶和1份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中按体积份数比称取1份玉足海参粉、8份纯化水、0.02份碱性蛋白酶、0.002份复合胰酶和0.8份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中按体积份数比称取1份玉足海参粉、8.5份纯化水、0.025份碱性蛋白酶、0.0025份复合胰酶和0.7份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二、三、四或五不同的是步骤二中按体积份数比重新称取1份沉淀A、16～22份纯化水和0.6份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是步骤二中按体积份数比重新称取1份沉淀A、18份纯化水和1份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六不同的是步骤二中按体积份数比重新称取1份沉淀A、20份纯化水和0.8份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式六相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式七或八不同的是步骤三中按体积份数比重新称取1份沉淀B和8～10份纯化水。其它步骤及参数与具体实施方式七或八相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是步骤三中按体积份数比重新称取1份沉淀B和9份纯化水。其它步骤及参数与具体实施方式九相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式九不同的是步骤三中按体积份数比重新称取1份沉淀B和11份纯化水。其它步骤及参数与具体实施方式九相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式十或十一不同的是步骤三和四中洗涤次数均为3～5次。其它步骤及参数与具体实施方式十或十一相同。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式十二不同的是步骤三和四中洗涤次数均为4次。其它步骤及参数与具体实施方式十二相同。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式十三不同的是步骤四中按体积份数比重新称取1份沉淀C、45～55份浓度为0.03～0.07mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液和0.9～1.1份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式十三相同。

具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式十三不同的是步骤四中按体积份数比重新称取1份沉淀C、50份浓度为0.04mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液和1份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式十三相同。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式十三不同的是步骤四中按体积份数比重新称取1份沉淀C、53份浓度为0.05mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液和0.8份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式十三相同。

具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十四、十五或十六不同的是步骤五中按体积份数比重新称取1份沉淀D、16～23份的生理盐水、0.015～0.025份质量浓度为30％的过氧化氢和0.9～1.1份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式十四、十五或十六相同。

具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十七不同的是步骤五中按体积份数比重新称取1份沉淀D、18份的生理盐水、0.01份质量浓度为30％的过氧化氢和0.9份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式十七相同。

具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式十七不同的是步骤五中按体积份数比重新称取1份沉淀D、20份的生理盐水、0.02份质量浓度为30％的过氧化氢和1.2份无水乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式十七相同。

具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式十八或十九不同的是步骤六中按体积份数比重新称取1份沉淀E和16～24份的注射用生理盐水。其它步骤及参数与具体实施方式十八或十九相同。

具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式二十不同的是步骤六中按体积份数比重新称取1份沉淀E和18份的注射用生理盐水。其它步骤及参数与具体实施方式二十相同。

具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式二十不同的是步骤六中按体积份数比重新称取1份沉淀E和22份的注射用生理盐水。其它步骤及参数与具体实施方式二十相同。

具体实施方式二十三：本实施方式玉足海参糖胺聚糖的提取方法按以下步骤实现：一、按体积份数比称取1份玉足海参粉、8份纯化水、0.02份碱性蛋白酶、0.002份复合胰酶和0.8份无水乙醇，将玉足海参粉与纯化水混合，然后加入碱性蛋白酶，并在65℃下酶解5h，再在85℃下灭活10min，降温至50℃加入复合胰酶并酶解5h，然后在95℃下灭活10min，冷却后离心并调节pH值为3，4℃静置15h后取上清液并调节pH值为7，再加入无水乙醇，在温度为4℃的条件下静置15h后离心得沉淀A；二、按体积份数比重新称取1份沉淀A、16份纯化水、2份可溶性钙盐和0.8份无水乙醇，将沉淀A与纯化水混合，加热至85℃并调节pH值为10，然后加入可溶性钙盐并在90℃下保温20min，冷却后离心取上清液并调节pH值为11，再离心取上清液并调节pH值为6，然后加入无水乙醇，在温度为4℃的条件下静置15h后离心得沉淀B；三、按体积份数比重新称取1份沉淀B和8份纯化水，将沉淀B与纯化水混合，然后加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为4℃的条件下静置15h后离心取沉淀用纯化水溶解，再加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为4℃的条件下静置15h后离心取沉淀，依次用体积浓度为70％的乙醇和无水乙醇洗涤，得沉淀C；四、按体积份数比重新称取1份沉淀C、45份浓度为0.04mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液和1份无水乙醇，将沉淀C与浓度为0.04mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，然后用二乙氨乙基纤维素进行层析，再用浓度为0.4mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤，然后用浓度为1.0mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液进行紫外分光光度测试，选取吸收光波长为215nm的洗脱液，然后加入无水乙醇，在温度为4℃的条件下静置15h后离心，得沉淀D；五、按体积份数比重新称取1份沉淀D、18份的生理盐水、0.02份质量浓度为30％的过氧化氢和1份无水乙醇，将沉淀D与生理盐水混合并调节pH值为11，然后加入质量浓度为30％的过氧化氢，在65℃下保温5h，冷却后离心取上清液并调节pH值为7，再加入无水乙醇，在温度为4℃的条件下静置15h后离心，得沉淀E；六、按体积份数比重新称取1份沉淀E和20份的注射用生理盐水，将沉淀E与注射用生理盐水混合，然后用透析膜对注射用水透析24h取固相产物，冷冻干燥后即得玉足海参糖胺聚糖；其中步骤一、二、三、四和五中离心的转速均为4500r/min，时间均为20min；步骤四中醋酸醋酸钠缓冲液的pH值均为6。

本实施方式中所得玉足海参糖胺聚糖，质量纯度为99％，重均分子量为130000，能够用于制备注射剂，制成的注射剂安全、有效。

本实施方式中所得玉足海参糖胺聚糖制备成注射剂，治疗用药量为注射用玉足海参糖胺聚糖20mg，加入质量浓度为0.9％氯化钠注射液或质量浓度为5％葡萄糖250ml中，每日1次，静点，每分钟不超过40滴；连续用药14天为一疗程；药品不良反应发生率低，安全性较好。

本实施方式中所得玉足海参糖胺聚糖制备成注射剂，治疗中风病(脑梗死)症见半身不遂，失语，口舌歪斜，偏身感觉障碍，头晕头痛，面色晦暗，舌质暗，或瘀点或瘀斑，脉象细涩或弦涩(瘀血阻络证)患者，通过试验药物治疗组347例、阳性药物对照组116例临床试验验证，得出试验组用药14天时，能够改善上述中医症状、体征，并能降低中风病(脑梗死)的神经功能缺损评分(NIHSS评分)，同时可使患者的日常生活能力(ADL)明显改善，疗效确切。

具体实施方式二十四：本实施方式玉足海参糖胺聚糖的提取方法按以下步骤实现：一、按体积份数比称取1份玉足海参粉、7份纯化水、0.01份碱性蛋白酶、0.001份复合胰酶和0.6份无水乙醇，将玉足海参粉与纯化水混合，然后加入碱性蛋白酶，并在60℃下酶解4h，再在90℃下灭活5min，降温至50℃加入复合胰酶并酶解4h，然后在98℃下灭活5min，冷却后离心并调节pH值为2，在温度为0℃的条件下静置15h后取上清液并调节pH值为6，再加入无水乙醇，在温度为0℃的条件下静置15h后离心得沉淀A；二、按体积份数比重新称取1份沉淀A、20份纯化水、2份可溶性钙盐和0.6份无水乙醇，将沉淀A与纯化水混合，加热至80℃并调节pH值为8，然后加入可溶性钙盐并在90℃下保温15min，冷却后离心取上清液并调节pH值为10，再离心取上清液并调节pH值为5.5，然后加入无水乙醇，在温度为0℃的条件下静置15h后离心得沉淀B；三、按体积份数比重新称取1份沉淀B和6份纯化水，将沉淀B与纯化水混合，然后加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为0℃的条件下静置15h后离心取沉淀用纯化水溶解，再加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为0～10℃的条件下静置15h后离心取沉淀，依次用体积浓度为70％的乙醇和无水乙醇洗涤，得沉淀C；四、按体积份数比重新称取1份沉淀C、50份浓度为0.05mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液和0.8份无水乙醇，将沉淀C与浓度为0.05mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，然后用二乙氨乙基纤维素进行层析，再用浓度为0.4mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤，然后用浓度为1.0mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液进行紫外分光光度测试，选取吸收光波长为215nm的洗脱液，然后加入无水乙醇，在温度为0℃的条件下静置15h后离心，得沉淀D；五、按体积份数比重新称取1份沉淀D、20份的生理盐水、0.01份质量浓度为30％的过氧化氢和0.8份无水乙醇，将沉淀D与生理盐水混合并调节pH值为10，然后加入质量浓度为30％的过氧化氢，在60℃下保温4～6h，冷却后离心取上清液并调节pH值为6.5，再加入无水乙醇，在温度为0℃的条件下静置15h后离心，得沉淀E；六、按体积份数比重新称取1份沉淀E和20份的注射用生理盐水，将沉淀E与注射用生理盐水混合，然后用透析膜对注射用水透析24h，取固相产物，冷冻干燥后即得玉足海参糖胺聚糖；其中步骤一、二、三、四和五中离心的转速均为4000r/min，时间均为15min；步骤四中醋酸醋酸钠缓冲液的pH值均为6。

本实施方式中所得玉足海参糖胺聚糖，质量纯度为95.58％，重均分子量为90000，能够用于制备注射剂。

具体实施方式二十五：本实施方式玉足海参糖胺聚糖的提取方法按以下步骤实现：一、按体积份数比称取1份玉足海参粉、9份纯化水、0.03份碱性蛋白酶、0.003份复合胰酶和1份无水乙醇，将玉足海参粉与纯化水混合，然后加入碱性蛋白酶，并在70℃下酶解5h，再在90℃下灭活15min，降温至50℃加入复合胰酶并酶解5h，然后在98℃下灭活15min，冷却后离心并调节pH值为3，在温度为10℃的条件下静置20h后取上清液并调节pH值为7，再加入无水乙醇，在温度为10℃的条件下静置20h后离心得沉淀A；二、按体积份数比重新称取1份沉淀A、25份纯化水、2份可溶性钙盐和1份无水乙醇，将沉淀A与纯化水混合，加热至90℃并调节pH值为10，然后加入可溶性钙盐并在100℃下保温25min，冷却后离心取上清液并调节pH值为12，再离心取上清液并调节pH值为6.5，然后加入无水乙醇，在温度为10℃的条件下静置20h后离心得沉淀B；三、按体积份数比重新称取1份沉淀B和12份纯化水，将沉淀B与纯化水混合，然后加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为10℃的条件下静置20h后离心取沉淀用纯化水溶解，再加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为10℃的条件下静置20h后离心取沉淀，依次用体积浓度为70％的乙醇和无水乙醇洗涤，得沉淀C；四、按体积份数比重新称取1份沉淀C、60份浓度为0.08mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液和1.2份无水乙醇，将沉淀C与浓度为0.08mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，然后用二乙氨乙基纤维素进行层析，再用浓度为0.4mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤，然后用浓度为1.0mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液进行紫外分光光度测试，选取吸收光波长为215nm的洗脱液，然后加入无水乙醇，在温度为10℃的条件下静置20h后离心，得沉淀D；五、按体积份数比重新称取1份沉淀D、25份的生理盐水、0.03份质量浓度为30％的过氧化氢和1.2份无水乙醇，将沉淀D与生理盐水混合并调节pH值为12，然后加入质量浓度为30％的过氧化氢，在70℃下保温6h，冷却后离心取上清液并调节pH值为7.5，再加入无水乙醇，在温度为10℃的条件下静置20h后离心，得沉淀E；六、按体积份数比重新称取1份沉淀E和25份的注射用生理盐水，将沉淀E与注射用生理盐水混合，然后用10000分子量渗透膜超滤截流，取固相产物，冷冻干燥后即得玉足海参糖胺聚糖；其中步骤一、二、三、四和五中离心的转速均为5000r/min，时间均为20min；步骤四中醋酸醋酸钠缓冲液的pH值均为6。

本实施方式中所得玉足海参糖胺聚糖，质量纯度为96.31％，重均分子量为100000，能够用于制备注射剂。

Claims

1.一种玉足海参糖胺聚糖的提取方法，其特征在于玉足海参糖胺聚糖的提取方法按以下步骤实现：一、按体积份数比称取1份玉足海参粉、7～9份纯化水、0.01～0.03份碱性蛋白酶、0.001～0.003份复合胰酶和0.6～1份无水乙醇，将玉足海参粉与纯化水混合，然后加入碱性蛋白酶，并在60～70℃下酶解4～5h，再在80～90℃下灭活5～15min，降温至50℃加入复合胰酶并酶解4～5h，然后在98～100℃下灭活5～15min，冷却后离心并调节pH值为2～3，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后取上清液并调节pH值为6～7，再加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心得沉淀A；二、按体积份数比重新称取1份沉淀A、15～25份纯化水、2份可溶性钙盐和0.6～1份无水乙醇，将沉淀A与纯化水混合，加热至80～90℃并调节pH值为8～10，然后加入可溶性钙盐并在90～100℃下保温15～25min，冷却后离心取上清液并调节pH值为10～12，再离心取上清液并调节pH值为5.5～6.5，然后加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心得沉淀B；三、按体积份数比重新称取1份沉淀B和6～12份纯化水，将沉淀B与纯化水混合，然后加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心取沉淀用纯化水溶解，再加入钾盐至钾离子浓度达到2mol/L，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心取沉淀，依次用体积浓度为70%的乙醇和无水乙醇洗涤，得沉淀C；四、按体积份数比重新称取1份沉淀C、40～60份浓度为0.02～0.08mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.8～1.2份无水乙醇，将沉淀C与浓度为0.02～0.08mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，然后用二乙氨乙基纤维素进行层析，再用浓度为0.4mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤，然后用浓度为1.0mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液进行紫外分光光度测试，选取吸收光波长为215nm的洗脱液，然后加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心，得沉淀D；五、按体积份数比重新称取1份沉淀D、15～25份的生理盐水、0.01～0.03份质量浓度为30%的过氧化氢和0.8～1.2份无水乙醇，将沉淀D与生理盐水混合并调节pH值为10～12，然后加入质量浓度为30%的过氧化氢，在60～70℃下保温4～6h，冷却后离心取上清液并调节pH值为6.5～7.5，再加入无水乙醇，在温度为0～10℃的条件下静置15～20h后离心，得沉淀E；六、按体积份数比重新称取1份沉淀E和15～25份的注射用生理盐水，将沉淀E与注射用生理盐水混合，然后用透析膜对沉淀E与注射用生理盐水混合后的溶液透析24h或者用10000分子量渗透膜超滤截流，取固相产物，冷冻干燥后即得玉足海参糖胺聚糖；其中步骤一、二、三、四和五中离心的转速均为4000～5000r/min，时间均为15～20min；步骤四中醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值均为6。

2.根据权利要求1所述的玉足海参糖胺聚糖的提取方法，其特征在于步骤一中按体积份数比称取1份玉足海参粉、8份纯化水、0.02份碱性蛋白酶、0.002份复合胰酶和0.8份无水乙醇。

3.根据权利要求1所述的玉足海参糖胺聚糖的提取方法，其特征在于步骤一中按体积份数比称取1份玉足海参粉、8.5份纯化水、0.025份碱性蛋白酶、0.0025份复合胰酶和0.7份无水乙醇。

4.根据权利要求2或3所述的玉足海参糖胺聚糖的提取方法，其特征在于步骤二中按体积份数比重新称取1份沉淀A、16～22份纯化水和0.6份无水乙醇。

5.根据权利要求4所述的玉足海参糖胺聚糖的提取方法，其特征在于步骤三中按体积份数比重新称取1份沉淀B和8～10份纯化水。

6.根据权利要求5所述的玉足海参糖胺聚糖的提取方法，其特征在于步骤三中按体积份数比重新称取1份沉淀B和9份纯化水。

7.根据权利要求6所述的玉足海参糖胺聚糖的提取方法，其特征在于步骤三和四中洗涤次数均为3～5次。

8.根据权利要求7所述的玉足海参糖胺聚糖的提取方法，其特征在于步骤四中按体积份数比重新称取1份沉淀C、45～55份浓度为0.03～0.07mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.9～1.1份无水乙醇。

9.根据权利要求8所述的玉足海参糖胺聚糖的提取方法，其特征在于步骤五中按体积份数比重新称取1份沉淀D、16～23份的生理盐水、0.015～0.025份质量浓度为30%的过氧化氢和0.9～1.1份无水乙醇。

10.根据权利要求9所述的玉足海参糖胺聚糖的提取方法，其特征在于步骤六中按体积份数比重新称取1份沉淀E和16～24份的注射用生理盐水。