CN104147040A - 海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞疾病药物中的应用 - Google Patents

海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了海参糖胺聚糖在制药物中的应用，动物试验证明，重均分子量为大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖胺聚糖中的一段或者一段以上，其抗凝活性呈剂量依赖性，与肝素及低分子肝素比较，其随剂量增加凝血作用递增缓和，并且在同一剂量下随着重均分子量增加起效时间延迟的同时药效持续时间增加。天然分子段的海参糖胺聚糖在一定剂量下持续药效时间可达16小时，可用于制备防治动脉血栓栓塞疾病药物。相对肝素类药物以及维生素K拮抗剂类药物更具安全性。临床上用于血栓栓塞疾病治疗视窗宽，安全性高，具有良好的开发研究价值。

Description

海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞疾病药物中的应用
技术领域
本发明涉及海参糖胺聚糖的医药用途，具体涉及重均分子量为大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞性疾病药物中的应用，血栓栓塞疾病包括动脉粥样硬化血栓性疾病、静脉血栓栓塞性疾病、血液高凝状态以及手术后的血栓形成或治疗手术后的血栓。
背景技术
随着社会的发展和人口老龄化的进程，老年人血管老化，血管壁受损，易患高血压、动脉硬化、糖尿病。血管内皮细胞受损后，产生的凝血激酶增多，促进凝血酶形成，凝血黄素A2也增多，同时制造抗凝物质前列环素减少，易诱发血栓形成。如血糖增高时，糖与红血球中的血红蛋白结合，使全身组织缺氧，这时血小板凝集性增强，粘度增大，容易促进血栓形成。因此中老年人血栓栓塞疾病的发病率逐年增加，据世界卫生组织统计，全球每年有1500万人死于血栓性疾病，血栓形成，即局部血液凝块形成，是导致心肌梗死和中风等动脉疾病以及静脉血栓栓塞性疾病(包括深部静脉血栓形成和肺栓塞)发生和患者死亡的主要原因。
防治栓塞形成药物可按作用机制分为抗凝血药物、抗血小板药物、直接溶栓药物等，临床上均能用于预防和治疗血栓性疾病。其中抗凝药物是通过影响凝血因子，从而防止血栓形成或复发。抗凝药物对已经形成的血栓无溶解作用，但可以防止血栓扩展和新血栓形成，有利于促进血栓早期自溶，同时抗凝血药物对静脉血栓形成具有明显预防作用，同时抗凝血药物还可以用于配合体外循环和血液透析中防治血栓的形成使用，旨在防止治疗操控时的血液凝固。
患者出现的血液高凝状态或血栓形成，均涉及到凝血蛋白增高、凝血蛋白激活和血液凝固性增加等诸多因素。临床上对高凝状态的防治原则，除要去除高凝状态的病因外，还须选用减低或具有灭活凝血蛋白的药物，使高凝状态转向正常的方向发展，避免导致血栓倾向进展，使用药物注射的主要有肝素及低分子肝素，口服的主要有华法林、双香豆素、新双香豆素等，降低血粘度防治血栓栓塞的药物主要有低分子右旋糖苷。其中华法林能够抑制某些凝血因子的维生素K依赖性激活，是现处方量最大的抗凝血药物，且至今仍是临床上唯一一个口服有效的维生素K拮抗剂和唯一一个获准长期应用的抗凝血药物。临床研究证实，华法林能够减少心房纤维性颤动患者64%的中风发生率。不过，尽管高度有效，但华法林也会带来严重甚至致死性的出血风险。此外，因药动学的个体差异性大且易受到饮食的影响，药物相互作用又很复杂，故华法林在临床实践中难以最优剂量用药，另外肝素及低分子肝素类药物，临床使用易导致出血，不同体质的人使用监控性强。因此就目前临床使用的抗凝药物来说均具有一定的副作用，鉴于人口的老龄化、血栓性疾病发病率的增加，以及现有抗凝药物在临床用于栓塞性疾病预防和治疗的广泛性以及其安全隐患的严重性。从中药中筛选、分离更具疗效性、安全性防治血栓栓塞性疾病，是预防和治疗血栓栓塞疾病的一种必然趋势。
发明内容
本发明的目的是提供一种海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞疾病药物中的应用，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足临床应用的需要。
动物试验证明，重均分子量为大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖胺聚糖中的一段或者一段以上，其抗凝活性呈剂量依赖性，与肝素及低分子肝素比较，其随剂量增加凝血作用递增缓和，并且在同一剂量下随着重均分子量增加起效时间延迟的同时药效持续时间增加。天然分子段的海参糖胺聚糖在一定剂量下持续药效时间可达16小时。
因此，所述重均分子量为大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖胺聚糖中的一段或者一段以上，可用于制备防治血栓栓塞疾病药物，具体的，所述血栓栓塞疾病包括动脉粥样硬化血栓性疾病、静脉血栓栓塞性疾病、血液高凝状态以及手术后的血栓形成或治疗手术后的血栓。
所述的“重均分子量大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖胺聚糖”指的是，重均分子量大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖任意一重均分子量或天然分子段的海参糖胺聚糖，或者是重均分子量大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖任意一重均分子量或然分子段的海参糖胺聚糖的多段混合物；
优选的：所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为：
54,500Da～57,000Da、57,010Da～62,990Da、63,000Da～67,000Da、67,010Da～72,990Da、73,000Da～77,000Da、77,010Da～82,990Da、83,000Da～87,000Da、87,010Da～92,990Da、93,000Da～97,000Da、97,010Da～102,900Da、103,000Da～107,000Da、107,010Da～112,990Da、113,000Da～117,900Da或118,000Da～122,050Da中的任意一段；
特别优选的，所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为：
54,500Da～57,000Da、58,000Da～62,000Da、63,000Da～67,000Da、68,000Da～72,000Da、73,000Da～77,000Da、78,000Da～82,000Da、83,000Da～87,000Da、88,000Da～92,000Da、93,000Da～97,000Da、98,000Da～102,000Da、103,000Da～107,000、108,000Da～112,000Da、113,000Da～117,000Da、118,000Da～122,000Da中的任意一段；
所述药物，包括治疗有效量的所述的解聚海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体选自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明胶、聚维酮或氯化钠的一段以上，优选甘露醇；
所述的药物为静脉或皮下注射给药的注射液或者是冻干粉针剂；
分子量大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖胺聚糖，皮下注射给药量为大鼠1mg/kg～100mg/kg，优选2mg/kg～80mg/kg；静脉注射给药量为大鼠0.1mg/kg～40mg/kg，优选0.2mg/kg～30mg/kg；
所述药物中，所述解聚海参糖胺聚糖的纯度为90～99.99%，优选92%以上，为了达到更理想的效果更优选94%以上；所述的天然分子段的海参糖胺聚糖的纯度为90～99.99%，优选92%以上，为了达到更理想的效果，更优选95%以上；
所述纯度为重量纯度。
所述的解聚海参糖胺聚糖的多分散度为1～2，优选1～1.6，更优选1～1.4；
所述多分散度指的是本领域常用的衡量聚合物分子量分布的指数，用于表征聚合物分子量分布的宽度。多分散度在本文或其他文献中又被称多分散指数、多分散性或分布宽度指数，是重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)之比，即Mw／Mn。这个比值随分子量分布宽度而变化。在单分散时，Mw／Mn等于1，随着分子量分布变宽，Mw／Mn值逐渐变大。
所述重均分子量的定义如下：重均分子量（Weight-averageMolecularWeight）：所有合成高分子化合物的分子量以及大多数天然高分子化合物的分子量都是不均一的，它们是分子量不同的同系物的混合物。聚合物中用不同分子量的分子重量平均的统计平均分子量。
重均分子量是采用高效液相凝胶色谱法测试的。
所述解聚海参糖胺聚糖可采用商业化产品，如哈尔滨红杉生物制药有限公司生产的海参糖胺聚糖或解聚海参糖胺聚糖，或采用如下的方法制备：
（1）将酶加入绞碎的海参，在进行酶解和沉淀，收集海参糖胺聚糖粗品，对海参糖胺聚糖粗品进行纯化和脱色，收集海参糖胺聚糖；
所述海参选自玉足海参、糙海参、梅花参、二色桌片参或白底辐肛参中的一种以上，优选玉足海参或二色桌片参；
所述的酶为水解蛋白酶和复合胰酶，水解蛋白酶可采用商业化产品，如诺维信（沈阳）生物技术有限公司的Alcalase，复合胰酶可采用商业化产品，如无锡市雪梅酶制剂科技有限公司的雪梅牌复合胰酶，水解蛋白酶的用量为海参重量的2%，复合胰酶的用量为海参重量的2～3%；
（2）将重量浓度为5%醋酸和3%的双氧水加入步骤（1）的产物降解，收集重均分子量为大于54,5000Da的解聚海参糖胺聚糖；
所述药物的制备方法，为制剂领域常规的方法，如《中药制剂手册》记载的方法，获得所述的注射液或冻干粉针剂；
（3）将所需分子量段的海参糖胺聚糖以及解聚海参糖胺聚糖采用凝胶柱收集所需分子量段；
所述的凝胶吸附柱，如Sephadex-G100凝胶吸附柱、Sephadex-G50凝胶吸附柱或Sephadex-G200，所述Sephadex-G100凝胶吸附柱，可以采用美国GE公司的葡聚糖凝胶柱。
本发明的含有解聚海参糖胺聚糖药物可通过皮下或者静脉注射的方法施加于需要治疗的患者，给药剂量由医师根据患者的具体情况（如年龄、体重、性别、患病时间、身体状况等）确定。一般而言，以解聚海参糖胺聚糖计，皮下给药剂量为0.1～50mg/kg，优选0.2～45mg/kg，静脉给药的给药剂量为0.01～30mg/kg，优选0.05～20mg/kg。
海参糖胺聚糖是海参体壁中含有的一种酸性粘多糖是海参所特有的。本发明发现，海参糖胺聚糖具有显著抗凝血、抗血小板聚集、降低血粘度、纤溶、调节血脂等生物活性，可用于治疗血栓性疾病。
海参糖胺聚糖通过进一步解聚成为不同分子量段的解聚海参糖胺聚糖，其呈现不同的抗凝血活性，且随着剂量增加其抗凝血活性递增趋势缓和，相对肝素类药物以及维生素K拮抗剂类药物更具安全性。临床上用于血栓栓塞疾病治疗视窗宽，安全性高，具有良好的开发研究价值。
附图说明
图1海参糖胺聚糖和解聚海参糖胺聚糖的纯度图：
图1-1天然分子段的海参糖胺聚糖的纯度图；
图1-2重均分子量为54,876Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-3重均分子量为60,915Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-4；重均分子量为64,904Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-5重均分子量为71,147Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-6重均分子量为74,844Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-7重均分子量为80,336Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-8重均分子量为84,481Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-9重均分子量为90,919Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-10重均分子量为95,821Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图;
图1-11重均分子量为10,1250Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-12重均分子量为10,3998Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-13重均分子量为10,9161Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-14重均分子量为115,268Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
图1-15重均分子量为121,017Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图。
图2为海参糖胺聚糖和解聚海参糖胺聚糖的分子量测试报告。
图2-1天然分子段的海参糖胺聚糖的分子量测试报告；
图2-2重均分子量为54,876Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-3重均分子量为60,915Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-4重均分子量为64,904Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-5重均分子量为71,147Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-6重均分子量为74,844Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-7重均分子量为80,336Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-8重均分子量为84,481Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-9重均分子量为90,919Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-10重均分子量为95,821Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-11重均分子量为10,1250Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-12重均分子量为10,3998Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-13重均分子量为10,9161Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-14重均分子量为115,268Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
图2-15重均分子量为121,017Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告。
图3为解聚海参糖胺聚糖体外抗凝血剂量与凝血时间的线性关系图。
图3-1DHG-1体外抗凝血实验结果。
图3-2DHG-2体外抗凝血实验结果。
具体实施方式
解聚海参糖胺聚糖的提取方法是指提取自海参的海参糖胺聚糖，经降解和解聚后产生解聚糖胺聚糖，收集所需分子量的解聚海参糖胺聚糖。从海参体壁中提取海参糖胺聚糖的方法是本领域技术人员所熟悉的，如中国专利ZL200910305363.5。
实施例1
海参糖胺聚糖的提取：
称取玉足海参药材4.5kg，水浸16小时。将海参体壁淋干水分，绞碎，称重并补水至36kg，置60℃水浴中，加入6mol/L氢氧化钠调pH至8.2±0.2，加入90ml水解蛋白酶Alcalase（诺维信（沈阳）生物技术有限公司）搅拌，酶解4小时，85℃以上灭活10分钟，降温至49℃±2℃，加入6mol/L氢氧化钠调pH至8.2±0.2，再加9g复合胰酶（无锡市雪梅酶制剂科技有限公司，雪梅牌）搅拌酶解4小时，煮沸15分钟，冷却。5℃离心，收集上清液，加入6mol/L盐酸调pH至2.5±0.2，4℃冷藏2小时，离心，收集上清液，加入6mol/L氢氧化钠调pH至7.5±0.2，加入0.8倍体积的乙醇，4℃静置12h。
离心，收集沉淀称重，加8倍重量的蒸馏水，加热至85℃±2℃，待完全溶解后，加入6mol/L氢氧化钠调pH至9.0±0.2，加入氯化钙至溶液中氯化钙浓度达到3%（w/v），升温至92℃保持15分钟，冷却至室温，4℃离心，收集上清液，用饱和碳酸钠溶液调pH至11.0±0.1，离心，收集上清液，用6mol/L盐酸调pH至6.0±0.1，加1倍体积乙醇，4℃冷藏12h；
冷藏液离心，收集沉淀称重，加2倍体积蒸馏水，加热使其充分溶解，加乙酸钾使其最终浓度为2mol/L，4℃静置12h。离心，收集沉淀称重，加2倍体积蒸馏水，加热使其充分溶解，加乙酸钾使其最终浓度为2mol/L，4℃静置12h。离心，沉淀用冷2mol/L乙酸钾溶液洗涤三次，然后依次用80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇洗涤，待乙醇挥发尽后80℃干燥，称重，得粗品A。
粗品A加0.05mol/L、pH6.0的HAc-NaAc缓冲液溶解制成2%溶液上柱，溶液通过纤维素层析柱后，用1.5倍柱体积的0.4mol/LNaCl的HAc-NaAc缓冲液(pH6.0±0.1)洗涤，再用1mol/LNaCl的HAc-NaAc缓冲液(pH6.0±0.1)洗脱，根据紫外检测仪在220nm处数值的变化速度收集洗脱液，置60℃水浴中，用NaOH调pH至11±0.1，按体积量加入3%双氧水，保持4小时，冷却，离心，收集上清液，用HCl调pH至7.2±0.1，加1倍量乙醇，4℃静置12h。
离心，收集沉淀，依次用80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇洗涤，得粗品B。
粗品B用蒸馏水溶解成5%的溶液，用截留分子量1万的超滤膜浓缩至原体积的1/2，补加水至原体积，再超滤至1/2体积，再加水重复一次，超滤液冷冻干燥，得海参糖胺聚糖，
该实例得到的海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-1），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量128,024Da，D值为1.26（图谱见图2-1）
实施例2
解聚海参糖胺聚糖的制备
实施例2-1
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚4h50min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在54,500Da～57,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-2），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量54,876Da，D值为1.28（图谱见图2-2）
实施例2-2
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚4h20min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在58,000Da～62,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-3），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量60,915Da，D值为1.36（图谱见图2-3）
实施例2-3
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚3h50min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在63,000Da～67,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-4），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量64,904Da，D值为1.34（图谱见图2-4）
实施例2-4
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚3h20min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在68,000Da～72,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-5），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量71,147Da，D值为1.38（图谱见图2-5）
实施例2-5
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚2h55min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在73,000Da～77,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-6），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量74,844Da，D值为1.26（图谱见图2-6）
实施例2-6
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚2h30min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在78,000Da～82,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-7），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量80,336Da，D值为1.33（图谱见图2-7）
实施例2-7
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚2h5min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在83,000Da～87,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-8），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量84,481Da，D值为1.29（图谱见图2-8）
实施例2-8
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚1h40min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在88,000Da～92,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-9），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量90,919Da，D值为1.26（图谱见图2-9）
实施例2-9
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚1h15min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在93,000Da～97,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-10），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量95,821Da，D值为1.27（图谱见图2-10）
实施例2-10
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚55min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在98,000Da～102,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-11），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量101,250Da，D值为1.24（图谱见图2-11）
实施例2-11
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚40min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在103,000Da～107,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-12），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量103,998Da，D值为1.26（图谱见图2-12）
实施例2-12
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚30min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在108,000Da～112,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-13），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量109,161Da，D值为1.22（图谱见图2-13）
实施例2-13
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚20min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在113,000Da～117,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-14），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量115,268Da，D值为1.38（图谱见图2-14）
实施例2-14
将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40℃进行控制解聚10min。将该溶液用0.1mol/l的氢氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0.5mol/l的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在118,000Da～122,000Da，D值＜1.5，纯度为98%以上。
该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A,岛津)可得到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-15），经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgelG4000PWXL,TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量121,017Da，D值为1.36（图谱见图2-15）
实施例3
将以上获得的40.0g海参糖胺聚糖或者解聚海参糖胺聚糖加入80g甘露醇、加入注射用水1000ml溶解，经过超滤、灌装、冻干，得到1000瓶注射用海参糖胺聚糖或者解聚海参糖胺聚糖的冻干粉针剂。
实施例4
海参糖胺聚糖和解聚海参糖胺聚糖的药效学实验
4.1体外抗凝血实验
4.1.1试验材料
供试样品:
名称：解聚海参糖胺聚糖，以下缩写：DHG；DHG-1（实施例2-1）、DHG-2（实施例2-6）；配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度。
试验动物
品系：兔；来源：上海陈行实验用兔有限公司；性别：雄性；体重：1850克；动物合格证号：SCXK（沪）2008-0010。
4.1.2试验仪器
血小板聚集凝血因子分析仪(型号LG-PABER北京世帝科学仪器公司)。
4.1.3实验方法
实验当日，于样品池中分别加入兔血浆80μl、0.9％氯化钠溶液10μl，预热180s后，加入1％氯化钙溶液10μl，立即混匀，避免产生气泡，用血小板聚集凝血因子分析仪开始计算时间，记录各样品池凝结时间，即为空白。
精密量取对照品溶液，用0.9％氯化钠溶液稀释成不同浓度的溶液，即为不同浓度的样品溶液DHG-1（40.0μg/ml～200.0μg/ml）、DHG-2（30.0μg/ml～200.0μg/ml）。
用10μl不同浓度的样品溶液代替10μl0.9％氯化钠溶液，分别测定各浓度的样品溶液的血浆凝结时间。每个浓度平行测定4次，求平均值。
4.1.4实验结果
实验结果显示样品终浓度在DHG-1（40.0μg/ml～200.0μg/ml）、DHG-2（30.0μg/ml～200.0μg/ml）剂量范围内，随剂量增加凝血时间延长，凝血时间延长递增趋势缓和。因此，解聚海参糖胺聚糖组合物用于抗凝血更具安全性，可控性。
表1-1DHG-1体外抗凝血实验结果
DHG-1（μg/ml） 凝血时间（s） 延长率（%）
空白 290.8±10.5
40 345.1±11.3 18.68%
60 437.6±14.2 50.49%
80 512.4±13.4 76.22%
100 582.9±15.6 100.46%
120 656.5±17.1 125.78%
150 749.5±18.4 157.76%
200 928.9±23.3 219.46%
表1-2DHG-2体外抗凝血实验结果
DHG-2（μg/ml） 凝血时间（s） 延长率（%）
空白 277.9±11.7
30 302.2±11.2 8.38%
40 338.6±13.5 20.93%
50 372.5±12.8 32.61%
60 399.1±15.6 41.78%
80 468.2±12.7 65.60%
100 542.6±14.4 91.25%
120 596.8±17.1 109.94%
150 698.1±16.3 144.86%
200 878.2±19.2 206.94%
4.2皮下注射解聚海参糖胺聚糖和天然海参糖胺聚糖对大鼠凝血系统的影响
4.2.1试验材料
供试样品:名称：天然海参糖胺聚糖、低分子海参糖胺聚糖（54,876Da、60,915Da、74,844Da、90,919Da）；配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度。
4.2.2试验动物
品系：SD大鼠；来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司；性别：雄性；体重：180-200克；动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016；饲养：动物饲养于正压净化通风动物房内，室温23±1℃，湿度50～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。
4.2.3试验仪器
自动凝血分析仪SysmexCA-1500
4.2.4实验方法
将SD大鼠每组10只，分为给药组，阴性对照组（皮下注射生理盐水0.5ml），两个剂量组（10、20mg/kg）皮下注射给药，体积0.5ml。皮下注射给药后不同时间段（0.5h、1.0h、2.0h、4h、6h、8h、12h）腹主动脉采血测定凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶时间（TT）数值，参见表2、4。
各组动物在手术前10min用3%速可眠腹腔注射麻醉（0.1ml/100g体重），仰卧固定后腹腔手术，用一次性3.2%柠檬酸钠抗凝真空采血管采血。
4.2.5试验结果
解聚海参糖胺聚糖和天然海参糖胺聚糖10mg/kg和20mg/kg对APTT、TT、PT产生明显影响，不同重均分子量的解聚海参糖胺聚糖随时间递增抗凝血活性递增，抗凝血延长率到达峰值的时间2-8h之间，重均分子量较小的达到峰值时间比重均分子量大的达到峰值时间早。天然分子段的海参糖胺聚糖皮下注射后产生的抗凝血作用10mg/kg剂量下，6h时达到峰值；20mg/kg剂量下，6h时达到峰值。解聚海参糖氨基糖10mg/kg、20mg/kg剂量下不同分子段起效时间以及到达作用峰值的时间不同，皮下注射解聚海参糖胺聚糖对APTT产生的极显著影响使得APTT延长超过了150%—250%的范围，参见表2-1、2-2、2-3、2-4。
表2-1DHG大鼠皮下注射抗凝血实验结果
表2-2DHG大鼠凝血时间延长率
表2-3DHG大鼠皮下注射抗凝血实验结果
表2-4DHG大鼠凝血时间延长率
4.3解聚海参糖胺聚糖对大鼠动静脉导管血栓形成模型的影响
4.3.1试验材料
供试样品：
名称：解聚海参糖胺聚糖（DHG）；配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度。对照样品：名称：肝素；来源：国药集团化学试剂有限公司；批号：F20091029；含量：150U/mg；配制：精密称取后以注射用生理盐水溶解并稀释至所需浓度。
试验动物：品系：SD大鼠；来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司；性别：雄性；体重：180-220克；动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016；饲养：动物饲养于正压净化通风动物房内，室温23±1℃，湿度50～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。
4.3.2试验仪器
BS110s型电子天平，SARTORIUS公司生产，最小称量值0.1mg。
4.3.3试验方法
将SD大鼠每组10只分为不同的给药组，阴性对照组（生理盐水1ml/kg），阳性对照低分子肝素组（2mg/kg）。所有药物均为皮下注射给药，体积0.5ml。
各组动物在手术前10min用12%的水合氯醛腹腔注射麻醉（350～400mg/kg）后，仰卧固定，切开颈部皮肤，分离左侧颈动脉和右侧颈外静脉，以一旁路管连接，管中置一7cm长4号手术丝线。分别在给药2小时后开放血流15分钟，然后取出丝线称重，减去丝线重量，即为血栓湿重。计算出各试验组的血栓湿重平均值及标准差，用t-检验同生理盐水组进行比较。并按下式计算各试验组的血栓湿重抑制率：
4.3.4试验结果
参见表3，阳性药和受试药物在给药后测试都可以显著抑制血栓的形成。受试药物对血栓形成的抑制作用显著。
表3DHG对大鼠动静脉导管血栓形成模型的影响
与阴性组相比较：*P<0.05，**P<0.01
4.4不同分子量段解聚海参糖胺聚糖组合物皮下注射对大鼠凝血系统的影响
4.4.1试验材料
供试样品:
名称：解聚海参糖胺聚糖54,876Da、74,844Da；天然海参糖胺聚糖；来源：上海开润生物医药有限公司；配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度。
4.4.2试验动物
品系：SD大鼠；来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司；性别：雄性；体重：180-220克；动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016；饲养：动物饲养于正压净化通风动物房内，室温23±1℃，湿度50～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。
4.4.3试验仪器
自动凝血分析仪SysmexCA-1500
4.4.4实验方法
将SD大鼠每组10只，分成不同的给药组，阴性对照组（皮下注射生理盐水0.5ml），解聚海参糖胺聚糖不同分子量段（54,876Da、74,844Da），天然海参糖胺聚糖组合物剂量比为1:1（10mg/kg）皮下注射给药，空白注射生理盐水体积0.5ml。皮下注射给药后不同时间段腹主动脉采血测定血浆活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间(TT)数值，参见表5。
各组动物在手术前10min用3%速可眠腹腔注射麻醉（0.1ml/100g体重），仰卧固定后腹腔手术，用一次性3.2%柠檬酸钠抗凝真空采血管采血。
4.4.5试验结果
实验结果显示，不同分子量段的解聚海参糖胺聚糖组合物皮下注射具有显著延长APTT、TT活性，并且可以克服单一分子量段起效时间缓慢或者持续时间短，实验数据参见表4-1、4-2。
表4-1不同分子段DHG大鼠皮下注射抗凝血实验结果
表4-2不同分子段DHG大鼠凝血时间延长率

Claims (9)

1.重均分子量大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖胺聚糖中的一段或者一段以上，在制备防治动脉血栓栓塞疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血栓栓塞疾病包括动脉粥样硬化血栓性疾病、静脉血栓栓塞性疾病、血液高凝状态、手术后形成的血栓或者是预防手术后血栓的形成。
3.根据权利要求1～2任一项所述的应用，其特征在于，所述的重均分子量大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖和天然分子段的海参糖胺聚糖包括重均分子量大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖任意一重均分子量和天然分子段的海参糖胺聚糖，或者是重均分子量大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖任意一重均分子量和天然分子段的海参糖胺聚糖的多段混合物。
4.根据权利要求1～2任一项所述的应用，其特征在于，所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为：
54,500Da～57,000Da、57,010Da～62,990Da、63,000Da～67,000Da、67,010Da～72,990Da、73,000Da～77,000Da、77,010Da～82,990Da、83,000Da～87,000Da、87,010Da～92,990Da、93,000Da～97,000Da、97,010Da～102,900Da、103,000Da～107,000Da、107,010Da～112,990Da、113,000Da～117,900Da或118,000Da～122,050Da中的任意一段。
5.根据权利要求1～2任一项所述的应用，其特征在于，所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为：
54,500Da～57,000Da、58,000Da～62,000Da、63,000Da～67,000Da、68,000Da～72,000Da、73,000Da～77,000Da、78,000Da～82,000Da、83,000Da～87,000Da、88,000Da～92,000Da、93,000Da～97,000Da、98,000Da～102,000Da、103,000Da～107,000、108,000Da～112,000Da、113,000Da～117,000Da、118,000Da～122,000Da中的任意一段。
6.根据权利要求1～2任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗有效量的所述的解聚海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体，为静脉或皮下注射给药的注射液或者是冻干粉针剂。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗有效量的所述的解聚海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体，为静脉或皮下注射给药的注射液或者是冻干粉针剂。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗有效量的权利要求所述的解聚海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体，为静脉或皮下注射给药的注射液或者是冻干粉针剂。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗有效量的所述的解聚海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体，为静脉或皮下注射给药的注射液或者是冻干粉针剂。
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