CN112083083A - 一种海参糖胺聚糖含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，是将示差折光检测器与高效液相色谱联用，利用分子尺寸排阻色谱柱‑HPLC分离样品，示差折光检测器检测目标物信号，然后进行定量分析。本发明适用于海参糖胺聚糖和解聚海参糖胺聚糖的含量检测，方法线性范围宽，精密度、准确度以及耐用性均能符合方法学要求。
Description
技术领域
本发明涉及医药成分检测技术领域，具体涉及海参糖胺聚糖含量的测定方法。
背景技术
海参糖胺聚糖(Holothurian glycosaminoglycan,简称HG)，是从海参中提取的一种含岩藻糖支链的硫酸糖胺聚糖，其结构与肝素(Heparin)这种最为人所熟知的糖胺聚糖近似。HG(包括低分子的解聚海参糖胺聚糖，Depolymerized holothurianglycosaminoglycan,简称DHG)的重复组成单元包括氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖以及它们的硫酸酯基。现代研究证实，HG与DHG具有抗凝抗栓作用，能抑制肿瘤的发生和转移，应用前景广阔。
传统的糖胺聚糖含量的测定方法有3.5-二硝基水杨酸法(简称DNS法)、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法以及色谱法等。蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法，都需要将糖胺聚糖样品在浓硫酸作用下进行水解和脱水，然后再与蒽酮或者苯酚结合形成有色的化合物，于最大吸收波长处测定其吸光度。这两种方法的缺陷在于：样品处理比较麻烦，并且试剂稳定性较差，结果重复性差。DNS法也是需要将糖胺聚糖样品先进行水解，然后再与3.5-二硝基水杨酸生成棕红色的氨基化合物，通过比色法测定样品中的糖胺聚糖含量，该检测方法需对水解时间严格控制，否则会影响结果的准确性。色谱法主要包括测气相色谱法和液相色谱分析方法。气相色谱法一般需要先将糖胺聚糖进行水解，然后用衍生物法增加多糖样品的挥发性，样品处理过程复杂。
液相色谱分析方法已经成为多糖分析的常规分析方法，常用于对多糖和单糖进行常规的分子量分布分析和定性分析。常用的检测器有示差折光检测器(Differentialrefractometers，RID)、蒸发光检测器(Evaporative lightscattering detector，ELSD)、荧光检测器(Fluorescence detector，FLD)、电化学检测器(Electrochemical detector，ED)和紫外检测器(Ultraviolet detector,UV)。其中示差折光检测器和蒸发光检测器检测器在检测样品时，无需衍生化，具有稳定性高，操作简单等特点，而其他检测器则往往需要糖样品进行衍生化，操作复杂，重复性和稳定性差。
示差折光检测器的是一种连续检测样品流路与参比流路间液体折光系数差值的检测器，是根据折射原理设计的，检测池有参比和测量两个池室。当被测试的样品溶液流过测量池时，引起折射率变化使照在双光电阻上的光束发生偏转，使双光敏电阻阻值发生变化，此时由电桥输出讯号，即反映了样品浓度的变化情况。示差折光检测器是一种通用型检测器，其优点是能够对糖类进行检测，并且稳定性好，易于操作。与蒸发光检测器相比，示差折光检测器具有响应稳定，适用范围广，更适合于定量分析等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其采用带示差折光检测器的分子尺寸排阻—高效液相色谱仪，方法简单、准确性高和重复性好。
为实现上述目的，所采用的技术方案如下：一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，示差折光检测器与分子尺寸排阻—高效液相色谱仪联用，利用分子尺寸排阻凝胶色谱柱分离样品，示差折光检测器检测目标物信号，包括以下步骤：
一、标准曲线工作溶液配制：称取对照品，用高效液相色谱流动相配制成对照品储备液，再量取对照品储备液，用高效液相色谱流动相稀释成若干梯度浓度的标准曲线工作溶液，标准曲线工作溶液的浓度范围为0.1-30mg/mL；
二、供试品溶液配置：称取供试品，用高效液相色谱流动相配制成供试品溶液，供试品溶液浓度范围为0.1-30mg/mL；
三、仪器条件：采用一根或一根以上串联的分子尺寸排阻凝胶色谱柱；高效液相色谱流动相选自0.01mol/L至0.3mol/L的乙酸盐水溶液、0.01mol/L至0.5mol/L的硫酸盐水溶液、0.1mol/L至1mol/L的硝酸盐水溶液；高效液相色谱流动相流速0.1mL/min-2mL/min；示差折光检测器检测池与参比池温度、以及柱温箱温度均保持在25℃至50℃；
四、分析计算：将由对照品配置的标准曲线工作溶液按浓度由低到高的顺序注入分析，以标准曲线工作溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；在相同分析条件下，将供试品溶液注入分析，得到相应的峰面积，依据标准曲线采用外标法得到供试品溶液中海参糖胺聚糖的浓度，该浓度与配制的供试品浓度的比值即为供试品中海参糖胺聚糖的含量。
进一步地，前述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其中，乙酸盐水溶液优选为乙酸铵水溶液，乙酸铵水溶液浓度优选为0.1mol/L；硫酸盐水溶液优选为硫酸钠水溶液，硫酸钠水溶液浓度优选为0.2mol/L；硝酸盐水溶液优选为硝酸锂水溶液，硝酸锂水溶液浓度优选为0.5mol/L。
进一步地，前述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其中，供试品溶液浓度范围优选为1-10mg/mL。
进一步地，前述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其中，示差折光检测器检测池与参比池温度以及柱温箱温度优选为25℃至40℃。
进一步地，前述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其中，高效液相色谱流动相流速优选为0.4mL/min-1mL/min。
进一步地，前述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其中，分子尺寸排阻凝胶色谱柱，包括：TSKgel Guard Column SWXL，TSKgel G4000SWXL，TSKgel G3000SWXL和TSKgelG2000SWXL。
进一步地，前述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其中，所述的供试品包括：海参糖胺聚糖、解聚海参糖胺聚糖，海参糖胺聚糖衍生物也可参照该方法。
本发明的优点在于：一、示差折光检测器与分子尺寸排阻—高效液相色谱仪联用，利用分子尺寸排阻凝胶色谱柱分离样品，示差折光检测器检测目标物信号，这样供试品不需要进行预处理，即可用于高效液相色谱仪分析，简单快速准确高效。二、发明所述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，线性范围宽，标准曲线线性关系良好，检测结果的重复性和精密度高，检测限、定量限和耐用性均符合方法学要求，适用于海参糖胺聚糖、解聚海参糖胺聚糖，也适用于其他种类糖胺聚糖的定量分析。
附图说明
图1为实施例1中解聚海参糖胺聚糖对照品浓度与色谱峰面积相关性示意图。
图2为实施例1中解聚海参糖胺聚糖对照品高效液相色谱示意图。
图3为实施例3中海参糖胺聚糖对照品浓度与色谱峰面积相关性示意图。
图4为实施例3中海参糖胺聚糖对照品高效液相色谱示意图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明所述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法作进一步详细说明。
实施例1。
设备与试剂：
设备：Agilent 1100高效液相色谱仪，Agilent G1362A示差折光检测器，电子天平。
解聚海参糖胺聚糖对照品：苏州融析生物科技有限公司企业内控标准品。
试剂：无水乙酸铵(国药，AR)，水采用超纯水。
检测条件与结果：
按照高效液相色谱分析方法，选用TSKgel Guard Column SWXL，TSKgelG3000SWXL和TSKgel G2000SWXL色谱柱串联，以示差折光检测器进行检测，检测条件为：
高效液相色谱流动相：0.1M乙酸铵溶液，0.02％叠氮化钠；
流速：0.5mL/min；
柱温：30℃；
(示差折光检测器)参比池与检测池温度：30℃；
进样量：20μL
高效液相色谱流动相配制：称取7.7g无水乙酸铵，置于1L容量瓶，700mL超纯水溶解后调节pH至6.5，超纯水稀释至刻度，加入2mL的质量分数为10％叠氮化钠溶液，进行0.22μm微孔滤膜过滤。
解聚海参糖胺聚糖标准曲线工作溶液配制：准确称取100mg干燥的解聚海参糖胺聚糖对照品，置于5mL容量瓶，加入高效液相色谱流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。以高效液相色谱流动相为稀释液，分别配制呈对照品浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的解聚海参糖胺聚糖标准曲线工作溶液。
解聚海参糖胺聚糖供试品溶液配制：准确称取100mg解聚海参糖胺聚糖供试品，置于20mL容量瓶，加入高效液相色谱流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。供试品溶液配制6份。
按照以上检测条件对解聚海参糖胺聚糖对照品溶液和供试品溶液进行分析，进行方法学考察：
(1)检测限和定量限考察：
检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量，对于能显示基线信噪比的分析方法，一般以信噪比为3∶1或2∶1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限(中国药典2015年版四部指导原则9101)。定量限系指试样中被测物能被定量测定的最低量，对于能显示基线信噪比的分析方法，一般以信噪比为10∶1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限(中国药典2015年版四部指导原则9101)。按照实施例1配制对照品浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL和0.6mg/mL的对照品溶液，按照实施例1检测条件进行分析，记录信噪比数据，见表1。
表1不同浓度对照品溶液信噪比数据
| 对照品溶液测试编号 | 对照品浓度(mg/mL) | 信噪比 |
| 对照品溶液1 | 0.1 | 1∶1 |
| 对照品溶液2 | 0.2 | 2∶1 |
| 对照品溶液3 | 0.3 | 3∶1 |
| 对照品溶液4 | 0.4 | 4∶1 |
| 对照品溶液5 | 0.5 | 9∶1 |
| 对照品溶液6 | 0.6 | 10∶1 |
| 对照品溶液7 | 1 | 21∶1 |
对照品溶液浓度为0.3mg/mL，信噪比为3∶1；对照品溶液浓度为0.6mg/mL，信噪比为10∶1。
方法学要求：信噪比为3∶1或2∶1时相应浓度或注入仪器的量为检测限，信噪比为10∶1时相应浓度或注入仪器的量为定量限。
结论：示差折光检测器对解聚海参糖胺聚糖的检测限为0.3mg/mL，示差折光检测器对解聚海参糖胺聚糖的定量限为0.6mg/mL。
(2)线性和范围：
线性系指在设计的范围内，响应值与试样中被测物浓度呈比例关系的程度。范围系指分析方法能达到一定精密度准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间(中国药典2015年版四部指导原则9101)。按照实施例1步骤配制对照品浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、15mg/mL和20mg/mL对照品溶液，按照实施例1检测条件进行分析，记录不同对照品浓度对应的色谱峰面积，具体见表2。以对照品浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制曲线，如图1所示。图2给出了解聚海参糖胺聚糖对照品的高效液相色谱图。
表2对照品浓度与色谱峰面积数据
| 对照品测试编号 | 峰面积(nRIU*s) | 对照品浓度(mg/mL) |
| 对照品溶液7 | 245200 | 1 |
| 对照品溶液8 | 538629 | 2 |
| 对照品溶液9 | 870651 | 3 |
| 对照品溶液10 | 1507440 | 5 |
| 对照品溶液11 | 2960790 | 10 |
| 对照品溶液12 | 4395830 | 15 |
| 对照品溶液13 | 5924140 | 20 |
线性回归方程为Y＝297932X-29737，R＝0.999。对照品在1mg/mL至20mg/mL浓度范围内线性良好。
方法学要求：相关系数R≥0.99，线性范围至少在测试浓度的80％-120％的范围内。
结论：解聚海参糖胺聚糖对照品的线性范围为1mg/mL至20mg/mL，此范围内相关系数为0.999，符合线性方法学要求。
(3)精密度(重复性)：
精密度系指在规定的条件下，取同一浓度的供试品，在相同条件下由同一个分析人员测定的精密度称为重复性，用至少测定6份的结果进行评估(中国药典2015年版四部指导原则9101)。按照实施例1配制6份5mg/mL解聚海参糖胺聚糖供试品溶液，按照实施例1检测条件进行分析，记录6份解聚海参糖胺聚糖供试品溶液对应的色谱峰面积，根据对照品线性曲线计算出解聚海参糖胺聚糖供试品中解聚海参糖胺聚糖含量，具体见表3。
表3解聚海参糖胺聚糖供试品的含量数据
6份解聚海参糖胺聚糖供试品中解聚海参糖胺聚糖含量在100％-103％之间，RSD为1％。
方法学要求：RSD≤2％。
结论：RSD为1％，符合精密度方法学要求。
(4)准确度(回收率)
准确度系指，采用该方法的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(％)表示，需在线性范围内，取同一浓度供试品，用至少测定6份的结果进行评价(中国药典2015年版四部指导原则9101)。按照实施例1配制的6份解聚海参糖胺聚糖供试品溶液，按照实施例1检测条件进行分析，记录6份解聚海参糖胺聚糖供试品溶液对应的色谱峰面积，根据对照品线性曲线计算出解聚海参糖胺聚糖供试品中解聚海参糖胺聚糖含量，具体见表3。
6份解聚海参糖胺聚糖供试品中解聚海参糖胺聚糖含量(回收率)在100％-103％之间。
方法学要求：回收率在92％-105％范围内。
结论：回收率在100％-103％之间，符合准确度方法学要求。
(5)耐用性
耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于日常校验提供依据(中国药典2015年版四部指导原则9101)。按照实施例1配制的2份解聚海参糖胺聚糖供试品溶液，更换TSK公司TSKgel Guard Column SWXL，TSKgelG3000SWXL和TSKgel G2000SWXL不同批次的色谱柱串联，按照实施例1检测条件进行分析，记录不同批次色谱柱测定供试品溶液对应的色谱峰面积，根据对照品线性曲线计算出解聚海参糖胺聚糖供试品中解聚海参糖胺聚糖含量，具体见表4。
表4不同批次色谱柱测定解聚海参糖胺聚糖供试品的含量数据
不同批次分析柱测试供试样品的回收率在99％-101％之间。
方法学要求：回收率在92％-105％范围内。
结论：不同批次的分析柱测试供试样品的回收率在99％-101％之间，符合耐用性方法学要求。
实施例2。
对三批解聚海参糖胺聚糖中解聚海参糖胺聚糖含量进行了测定，每批供试品溶液按照实施例1步骤配制，每批供试品配制两份测试溶液，按照实施例1中色谱条件进行供试品溶液色谱峰面积测定，基于标准曲线计算解聚海参糖胺聚糖中解聚海参糖胺聚糖的含量。图3给出了检测的解聚海参糖胺聚糖供试溶液的高效液相色谱图。具体数据见表5。
表5三批次解聚海参糖胺聚糖的含量数据
三批次解聚海参糖胺聚糖供试品中解聚海参糖胺聚糖含量分别为99.9％、100.1％和98.1％。
实施例3。
设备与试剂：
设备：Agilent 1100高效液相色谱仪，Agilent G1362A示差折光检测器，电子天平。
海参糖胺聚糖对照品：苏州融析生物科技有限公司企业内控标准品。
试剂：无水硫酸钠(国药，AR)，水采用超纯水。
检测条件与结果：
按照高效液相色谱分析方法，选用TSKgel Guard Column SWXL，TSKgelG4000SWXL和TSKgel G3000SWXL色谱柱串联，以示差折光检测器进行检测，检测条件为：
高效液相色谱流动相：0.2M硫酸钠溶液，0.02％叠氮化钠；
流速：0.5mL/min；
柱温：35℃；
(示差折光检测器)参比池与检测池温度：35℃；
进样量：20μL
高效液相色谱流动相配制：称取28.4g无水硫酸钠，置于1L容量瓶，700mL超纯水溶解后调节pH至6.5，超纯水稀释至刻度，加入2mL的质量分数为10％叠氮化钠溶液，进行0.22μm微孔滤膜过滤。
海参糖胺聚糖标准曲线工作溶液配制：准确称取100mg干燥的海参糖胺聚糖对照品，置于5mL容量瓶，加入高效液相色谱流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。以高效液相色谱流动相为稀释液，分别配制呈对照品浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的海参糖胺聚糖标准曲线工作溶液。
海参糖胺聚糖供试品溶液配制：准确称取100mg海参糖胺聚糖供试品，置于20mL容量瓶，加入高效液相色谱流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。供试品溶液配制6份。
按照以上检测条件对海参糖胺聚糖对照品溶液和供试品溶液进行分析，进行方法学考察：
(1)检测限和定量限考察：
按照前述配制对照品浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL和1mg/mL的对照品溶液，按照前述检测条件进行分析，记录信噪比数据，见表6。
表6不同浓度对照品溶液信噪比数据
| 对照品溶液测试编号 | 对照品浓度(mg/mL) | 信噪比 |
| 对照品溶液1 | 0.1 | 1:1 |
| 对照品溶液2 | 0.2 | 2:1 |
| 对照品溶液3 | 0.3 | 3:1 |
| 对照品溶液4 | 0.4 | 5:1 |
| 对照品溶液5 | 0.5 | 9:1 |
| 对照品溶液6 | 0.6 | 10:1 |
| 对照品溶液7 | 1.0 | 36:1 |
对照品溶液浓度为0.3mg/mL，信噪比为3:1；对照品溶液浓度为0.6mg/mL，信噪比为10:1。
方法学要求：信噪比为3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量为检测限，信噪比为10:1时相应浓度或注入仪器的量为定量限。
结论：示差折光检测器对海参糖胺聚糖的检测限为0.3mg/mL，示差折光检测器对海参糖胺聚糖的定量限为0.6mg/mL。
(2)线性和范围：
按照前述步骤配制对照品浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、15mg/mL和20mg/mL对照品溶液，按照前述检测条件进行分析，记录不同对照品浓度对应的色谱峰面积，具体见表7。以对照品浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制曲线，如图3所示。图4给出了海参糖胺聚糖对照品的高效液相色谱图示意图。
表7对照品浓度与色谱峰面积数据
| 对照品测试编号 | 峰面积(nRIU*s) | 对照品浓度(mg/mL) |
| 对照品溶液7 | 318760 | 1 |
| 对照品溶液8 | 473455 | 2 |
| 对照品溶液9 | 772267 | 3 |
| 对照品溶液10 | 1326547 | 5 |
| 对照品溶液11 | 2575887 | 10 |
| 对照品溶液12 | 3890310 | 15 |
| 对照品溶液13 | 5189547 | 20 |
线性回归方程为Y＝258688X+8604.8，R＝0.999。对照品在1mg/mL至20mg/mL浓度范围内线性良好。
方法学要求：相关系数R≥0.99，线性范围至少在测试浓度的80％-120％的范围内。
结论：海参糖胺聚糖对照品的线性范围为1mg/mL至20mg/mL，此范围内相关系数为0.999，符合线性方法学要求。
(3)精密度(重复性)：
按照前述配制6份5mg/mL海参糖胺聚糖供试品溶液，按照前述检测条件进行分析，记录6份海参糖胺聚糖供试品溶液对应的色谱峰面积，根据对照品线性曲线计算出海参糖胺聚糖供试品中海参糖胺聚糖含量，具体见表8。
表8海参糖胺聚糖供试品的含量数据
6份海参糖胺聚糖供试品中海参糖胺聚糖含量在99％-103％之间，RSD为1％。
方法学要求：RSD≤2％。
结论：RSD为1％，符合精密度方法学要求。
(4)准确度(回收率)
按照前述配制的6份解聚海参糖胺聚糖供试品溶液，按照前述检测条件进行分析，记录6份海参糖胺聚糖供试品溶液对应的色谱峰面积，根据对照品线性曲线计算出海参糖胺聚糖供试品中海参糖胺聚糖含量，具体见表8。
6份海参糖胺聚糖供试品中海参糖胺聚糖含量(回收率)在99％-103％之间。
方法学要求：回收率在92％-105％范围内。
结论：回收率在99％-103％之间，符合准确度方法学要求。
(5)耐用性
按照前述配制的2份海参糖胺聚糖供试品溶液，更换TSK公司TSKgel GuardColumn SWXL，TSKgel G4000SWXL和TSKgel G3000SWXL不同批次的色谱柱串联，按照前述检测条件进行分析，记录不同批次色谱柱测定供试品溶液对应的色谱峰面积，根据对照品线性曲线计算出海参糖胺聚糖供试品中海参糖胺聚糖含量，具体见表9。
表9不同批次色谱柱测定海参糖胺聚糖供试品中含量数据
不同批次分析柱测试供试样品的回收率在99％-103％之间。
方法学要求：回收率在92％-105％范围内。
结论：不同批次的分析柱测试供试样品的回收率在99％-103％之间，符合耐用性方法学要求。
实施例4。
对三批次海参糖胺聚糖供试品中海参糖胺聚糖含量进行了测定，供试品溶液按照实施例3步骤配制，供试品配制两份测试溶液，按照实施例3中色谱条件进行供试品溶液色谱峰面积测定，基于标准曲线计算海参糖胺聚糖供试品中海参糖胺聚糖的含量。具体数据见表10。
表10三批次海参糖胺聚糖供试品中解聚海参糖胺聚糖含量数据
三批次海参糖胺聚糖供试品中海参糖胺聚糖含量分别为100.7％、101.6％和99.6％。
上述实施例得到：本发明所述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，线性范围宽，标准曲线线性关系良好，检测结果的重复性和精密度高，检测限、定量限和耐用性均符合方法学要求，本发明发法适用于海参糖胺聚糖、解聚海参糖胺聚糖，也适用于其他种类糖胺聚糖的定量分析。
上述实施例是本方法的优选实例，并非对实施方式的限定，在不脱离本发明方法原理的基础上，可以对本发明方法进行其他形式的变化和变动，这些显而易见的变化和变动仍属于本发明方法的保护范围内。
Claims (7)
1.一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其特征在于：示差折光检测器与分子尺寸排阻—高效液相色谱仪联用，利用分子尺寸排阻凝胶色谱柱分离样品，示差折光检测器检测目标物信号，包括以下步骤：
一、标准曲线工作溶液配制：称取对照品，用高效液相色谱流动相配制成对照品储备液，再量取对照品储备液，用高效液相色谱流动相稀释成若干梯度浓度的标准曲线工作溶液，标准曲线工作溶液的浓度范围为0.1-30mg/mL；
二、供试品溶液配置：称取供试品，用高效液相色谱流动相配制成供试品溶液，供试品溶液浓度范围为0.1-30mg/mL；
三、仪器条件：采用一根或一根以上串联的分子尺寸排阻凝胶色谱柱；高效液相色谱流动相选自0.01 mol/L至0.3 mol/L的乙酸盐水溶液、0.01 mol/L至0.5 mol/L的硫酸盐水溶液、0.1 mol/L至1 mol/L的硝酸盐水溶液；高效液相色谱流动相流速0.1 mL/min -2 mL/min；示差折光检测器检测池与参比池温度、以及柱温箱温度均保持在25℃至50℃；
四、分析计算：将由对照品配置的标准曲线工作溶液按浓度由低到高的顺序注入分析，以对标准曲线工作溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；在相同分析条件下，将供试品溶液注入分析，得到相应的峰面积，依据标准曲线采用外标法得到供试品溶液中海参糖胺聚糖的浓度，该浓度与配制的供试品浓度的比值即为供试品中海参糖胺聚糖的含量。
2.根据权利要求1所述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其特征在于：乙酸盐水溶液优选为乙酸铵水溶液，乙酸铵水溶液浓度优选为0.1 mol/L；硫酸盐水溶液优选为硫酸钠水溶液，硫酸钠水溶液浓度优选为0.2 mol/L；硝酸盐水溶液优选为硝酸锂水溶液，硝酸锂水溶液浓度优选为0.5 mol/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其特征在于：供试品溶液浓度范围优选为1-10mg/mL。
4.根据权利要求1或2所述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其特征在于：示差折光检测器检测池与参比池温度以及柱温箱温度优选为25℃至40℃。
5.根据权利要求1或2所述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其特征在于：高效液相色谱流动相流速优选为0.4 mL/min -1 mL/min。
6.根据权利要求1或2所述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其特征在于：分子尺寸排阻凝胶色谱柱，包括：TSKgel Guard Column SWXL，TSKgel G4000SWXL，TSKgelG3000SWXL和TSKgel G2000SWXL。
7.根据权利要求1或2所述的一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其特征在于：所述的供试品包括：海参糖胺聚糖以及解聚海参糖胺聚糖。
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