CN101769872B - 一种虫草制品中虫草酸含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虫草制品中虫草酸含量的检测方法，该方法是先将虫草制品按常规方法制成待检液；然后将待检液制成测试液，用酶标仪检测测试液的吸光度；再将虫草酸配制成5～7个浓度的标准溶液，并测定其吸光度；以标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制虫草酸的标准曲线，并建立相应的虫草酸浓度与吸光度的线性关系方程，再把测试液的吸光度值代入方程获得测试液中虫草酸的含量，然后换算成虫草制品单位质量的百分含量。本发明采用简单的方法和价格低廉的设备实现同时检测大批量虫草制品中虫草酸含量，减少系统误差和偶然误差，检测结果受外界干扰小，稳定性和重现性好，适合作为常规定量分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种虫草制品中虫草酸含量的检测方法。
背景技术
虫草酸(cordycepic acid)，即甘露醇，是冬虫夏草等虫草菌类中药中的主要活性成分之一，具有利尿、降低颅内压和眼内压、祛痰、镇咳平喘和清除自由基等多种功效。就冬虫夏草及其相关制品中的虫草酸含量的检测方法，目前有多种方法包括容量法、紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)以及毛细管区带电泳法(CZE)等。据2005年中国药典，虫草酸的含量是采用容量法来进行定量分析。容量法是基于甘露醇的还原性利用氧化剂高碘酸盐来滴定和计算含量，因冬虫夏草等虫草菌类生药或制品中还原性物质的干扰，测量值偏高，因此容量法仅适用于相对较纯的甘露糖制剂。HPLC、GC与CZE等分析方法需要贵重的设备、样品制备和操作复杂、受外界干扰也大，结果重现性较差，不适合作为常规定量分析方法。紫外可见分光光度法检测虫草酸，方法简单、特异性高，许多含羟基的单糖对其无明显干扰，能代表冬虫夏草等虫草类生药或制品中虫草酸的实际值而成为常规定量分析方法。然而，紫外可见分光光度计一般最多能同时测定3个样品，如果每个检测样品要设置3个重复，则一次只能检测一个样品。因此对批量样品的定量分析因受检测系统和人为因素造成误差，严重影响结果的稳定性和重现性。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种能同时大批量测试样品且受外界干扰也小的虫草制品中虫草酸含量的检测方法。采用简单的方法和价格低廉的设备实现同时对大批量虫草制品中虫草酸含量的检测，且检测结果稳定性和重现性好，适合作为常规定量分析方法。
本发明的技术方案：一种虫草制品中虫草酸含量的检测方法，该方法是先将虫草制品按常规方法制成待检液；然后将待检液制成测试液，用酶标仪检测测试液的吸光度；再将虫草酸配制成5～7个浓度的标准溶液，并测定其吸光度；以标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制虫草酸的标准曲线，并建立相应的虫草酸浓度与吸光度的线性关系方程，再把测试液的吸光度值代入方程获得测试液中虫草酸的含量，然后换算成虫草制品单位质量的百分含量。
上述的虫草制品中虫草酸含量的检测方法中，所述测试液按如下步骤制备：
a、量取0.2mL用虫草制品制备的待检液放入试管中；
b、在测试液中分别加蒸馏水或去离子水稀释至20mL，混匀；取1mL作为A品；
c、在A品中加入1mL高碘酸钾溶液，混匀，在24～26℃放置10分钟，得B品；
d、在B品中加入2mL 0.1％的L-鼠李糖溶液，混匀，得C品；
e、在C品中加入4mL新鲜配制的Nash试剂，53℃反应15分钟使其显色后，快速冷却至室温，得测试液。
f、在按步骤b～e制备的过程中，取与待测液等量的蒸馏水或去离子水制备空白对照组
前述的虫草制品中虫草酸含量的检测方法中，所述吸光度按如下步骤测定：
a、用加样枪取测试液组和空白对照组至酶标板，每组三个复孔，每孔200μL；在412nm波长下，用酶标仪分别测定测试液和空白对照的吸光度，计算三孔测试液的平均吸光度值A测和三孔空白对照的平均吸光度A本底；
b、根据公式A虫＝A测-A本底计算测试液中虫草酸实际吸光度。
前述的虫草制品中虫草酸含量的检测方法中，所述标准溶液按如下步骤制备：
a、准确称量25mg干燥至恒重的虫草酸装入25mL容量瓶中，加蒸馏水或去离子水溶解并稀释至刻度，混匀，配置成质量浓度为1g/L的虫草酸溶液；；
b、量取5～7个间隔为250μL质量浓度为1g/L的虫草酸溶液，分别加入25mL容量瓶中，用蒸馏水或去离子水定容至刻度，分别得5～7个间隔为10mg/L虫草酸含量的标准溶液，备用；
c、再取1mL浓度为10mg/L的标准溶液，按照权利要求1和2的步骤获得10mg/L标准溶液的平均吸光度值；
d、再分别取1mL b步骤获得的标准溶液，按步骤c测定各浓度标准液相应的平均吸光度值。
与现有技术相比，本发明采用酶标仪来进行虫草酸定量分析。首先由于用于酶标仪检测的样品载体酶标板上的孔数可多达数百个，即使一个样品占用三个孔，也可同时检测上百个样品。如果用紫外分光光度计检测上百个样品，要反复操作上百次。而操作上百次，仪器和人为因素将给所测定的数据造成很大的系统误差和偶然误差，精确度和重复性差，无法保证结果的准确性和稳定性。而本法仅需要进行一次测定，还可通过设置多个重复，减少系统误差和偶然误差；第二，酶标板中加入样品时不易产生气泡，液面一致，光程短，具有高灵敏度和低检测限的优点；第三，传统的紫外可见分光光度计是水平光路，而酶标仪是垂直光路，全波长和双波长酶标仪还可通过设定参考波长，有利于减少测定干扰与电路干扰；第四，本法需要样品量少。第五，本法适合其它需要紫外分光光度法检测的化合物。本发明所用的检测方法简单实用，所用设备价格低廉，检测结果受外界干扰小稳定性和重现性好，适合作为常规定量分析方法。
说明书附图
图1是虫草酸的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的虫草制品中虫草酸含量的检测方法作进一步的详细说明，但并不作为对本发明做任何限制的依据。
实施例。一种虫草制品中虫草酸含量的检测方法，该方法是先将一定量的虫草制品按常规方法制成待检液；然后将待检液制成测试液，用酶标仪检测测试液的吸光度；再将虫草酸配制成6个浓度的标准溶液，并测定其吸光度。
以标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标建立虫草酸的标准曲线。6个标准溶液的值10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L分别对应横坐标上的6个点，在纵坐标上是与标准溶液10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L相对应的6个吸光度值的点，这样在坐标上获得6个点，并绘制一条连接这6个点的趋势线，即反映虫草酸浓度与吸光度对应关系的虫草酸标准曲线。
根据获得的虫草酸的标准曲线建立相应的虫草酸浓度与吸光度的线性关系方程：从图1可见，虫草酸的标准曲线趋近于一条直线，所以根据数学原理可以建立一个一元一次方程：方程式如下：
x＝(A虫+0.0005)÷0.007
公式中：A虫表示测试液的吸光度值；
x表示测试液中虫草酸的含量；
公式中的0.0005和0.007由曲线的斜率和截距决定。
再把测试液的吸光度值代入方程获得测试液中虫草酸的含量，最后乘以虫草制品待测液的总量，即获得该一定量虫草制品中虫草酸的总含量，然后换算成虫草制品单位质量的百分含量。
所述的待检液可按如下方法制备，准确称量0.5g干燥至恒重的虫草制品，加入25％(v/v)乙醇水溶液，料液比为1∶30(w/v)，沸水浴浸提2小时，过滤后再浸提1次，合并滤液，获得60mL虫草待测液。上述的待检液制备方法仅是一例，不局限用此方法，不作为对本发明做任何限制的依据。也可以采用其它方法，如用水直接热提取、超声提取或微波提取等方法。
上述的测试液按如下步骤制备：
a、量取0.2mL用虫草制品制备的待检液放入试管中；
b、在测试液中分别加蒸馏水或去离子水稀释至20mL，混匀；取1mL作为A品；
c、在A品中加入1mL高碘酸钾溶液，混匀，在24-26oC放置10分钟，得B品；
d、在B品中加入2mL 0.1％的L-鼠李糖溶液，混匀，得C品；
e、在C品中加入4mL新鲜配制的Nash试剂，53oC反应15分钟使其显色后，快速冷却至室温，得测试液。
f、在按步骤b～e制备的过程中，取与待测液等量的蒸馏水或去离子水制备空白对照液。
前述的吸光度按如下步骤测定：
a、用加样枪取测试液和空白对照组至酶标板，每组3孔，每孔加200μL(本例所用的酶标板有96个孔)；在412nm波长下，用酶标仪分别测定测试液和空白对照组的吸光度，计算3孔测试液的平均吸光度值A测＝0.1306和3孔空白对照的的平均吸光度A本底＝0.0620；
b、根据公式A虫＝A测-A本底计算测试液中虫草酸实际吸光度是0.0686。
前述的标准溶液按如下步骤制备：
a、准确称量25mg干燥至恒重的虫草酸装入25mL容量瓶中，加蒸馏水或去离子水溶解并稀释至刻度，混匀，配置成质量浓度为1g/L的虫草酸溶液；；
b、量取6个间隔为250μL(250、500、750、1000、1250、1500μL)质量浓度为1g/L的虫草酸溶液，分别加入25mL容量瓶中，用蒸馏水或去离子水定容至刻度，分别得6个(10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L)间隔为10mg/L虫草酸含量的标准溶液，备用；
c、再取1mL浓度为10mg/L的标准溶液，按照权利要求1和2的步骤获得10mg/L标准溶液的平均吸光度值；
d、再分别取1mL浓度为20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L的标准溶液，按步骤c测定各浓度标准液相应的平均吸光度值。
以0.5g虫草制品获得60mL待测液为例，测得虫草制品测试液的吸光度是0.0686，根据公式计算虫草酸含量x等于9.8492mg/L，根据0.2mL待测液加蒸馏水至20mL，即稀释了100倍，因此，待测液中的虫草酸含量为984.92mg/L，经计算该虫草制品的虫草酸含量是11.82％(w/w)。
Claims (3)
1. 一种虫草制品中虫草酸含量的检测方法，其特征在于：该方法是先将虫草制品按常规方法制成待检液；然后将待检液制成测试液，用酶标仪检测测试液的吸光度；再将虫草酸配制成5～7个浓度的标准溶液，并测定其吸光度；以标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制虫草酸的标准曲线，并建立相应的虫草酸浓度与吸光度的线性关系方程，再把测试液的吸光度值代入方程获得测试液中虫草酸的含量，然后换算成虫草制品单位质量的百分含量；所述测试液按如下步骤制备：
a、量取0.2mL用虫草制品制备的待检液放入试管中；
b、在测试液中分别加蒸馏水或去离子水稀释至20mL，混匀；取1mL作为A品；
c、在A品中加入1mL高碘酸钾溶液，混匀，在24～26 oC放置10分钟，得B品；
d、在B品中加入2mL 0.1％的L-鼠李糖溶液，混匀，得C品；
e、在C品中加入4mL新鲜配制的Nash试剂,53 oC反应15分钟使其显色后，快速冷却至室温，得测试液；
f、在按步骤b～e制备的过程中，取与待测液等量的蒸馏水或去离子水制备空白对照液。
2.根据权利要求1所述的虫草制品中虫草酸含量的检测方法，其特征在于：所述用酶标仪检测测试液的吸光度按如下步骤测定：
a、取测试液组和空白对照组至酶标板,每组三个复孔，每孔200μL；在412nm波长下，用酶标仪分别测定测试液和空白对照的吸光度，计算三孔测试液的平均吸光度值A测和三孔空白对照的平均吸光度A本底；
b、根据公式A虫=A测-A本底计算测试液中虫草酸实际吸光度。
3.根据权利要求1所述的虫草制品中虫草酸含量的检测方法，其特征在于：所述标准溶液按如下步骤制备：
a、准确称量25mg干燥至恒重的虫草酸装入25mL容量瓶中，加蒸馏水或去离子水溶解并稀释至刻度，混匀，配置成质量浓度为1g/L的虫草酸溶液；
b、量取5～7个间隔为250μL 质量浓度为1g/L的虫草酸溶液，分别加入25mL容量瓶中，用蒸馏水或去离子水定容至刻度，分别得5～7个间隔为10 mg/L虫草酸含量的标准溶液，备用；
c、再取1mL 浓度为10mg/L的标准溶液，按照权利要求1的步骤获得10mg/L标准溶液的吸光度值；
d、再分别取1mL b步骤获得的其它标准溶液，按步骤c测定各浓度标准液相应的吸光度值。
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