CN107281219B - 一种抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液：所述腹膜透析液中包括电解质和渗透剂，还包括莪术二酮。其中的电解质包括氯化钠、氯化钙、氯化镁中的一种或多种；渗透剂包括葡萄糖、葡聚糖、果糖中的一种或多种，腹膜透析液还可以包括缓冲碱，缓冲碱为乳酸盐和/或碳酸氢盐，莪术二酮的含量为0.03％至2％w/v，莪术二酮对在抗腹膜纤维化中起关键作用，本发明腹膜透析液采用合理配方，能够具有更好的抗腹腊维化和感染作用，提高超滤效率。

Description

一种抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液及其制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液及其制备方法。

背景技术

腹膜透析作为一种治疗终末期肾脏病(end stage renal disease，ESRD)患者的方法，由于其居家治疗，操作简便，减少血源性疾病传播，保护残存肾功能等特殊优点，近年来已得到广泛的应用。其原理是以腹膜为半透膜,以不断更换新鲜透析液来达到清除体内过多的水分及毒素的目的。相比于血液透析的透析膜而言,腹膜的孔径较大,因而可清除大、中、小分子的毒素。

但是，目前市售的腹透液为了保持渗透梯度，常采用高浓度的葡萄糖溶液。然而，临床实践表明高浓度的葡萄糖会刺激腹膜，导致腹膜间皮细胞损伤，释放TGF-β，VEGF等生长因子，使间皮细胞逐渐失去上皮细胞表型，出现成纤维细胞特征，最终发生纤维化并导致腹膜超滤衰竭。腹膜损伤、感染、纤维化、超滤衰竭等问题不断挑战着腹膜透析技术的进一步发展。

通过选择新的成分用于腹膜透析液中，研究合理的配方，以便配制出具有更好的生物相容性和抗腹膜纤维化作用的新型腹膜透析液，这是目前本技术领域亟待解决的技术问题。

ZL201310452564.4，公开日2013年12月25日，公开了一种腹膜透析液，通过向常规腹膜透析液中添加浓度为0.01－5％w/v的吡非尼酮可延缓现有腹膜透析液中高浓度葡萄糖造成的腹膜纤维化进程。

ZL201610665296.8，公开日2017年1月11日，公开了一种腹膜透析液，通过向常规腹膜透析液中添加浓度为0.01－5％w/v的氟非尼酮延缓现有腹膜透析液中高浓度葡萄糖造成的腹膜纤维化进程效果优于吡非尼酮，用药量也比吡非尼酮少。

目前已揭示莪术二酮具有调节免疫，抗肿瘤，抗病原，镇痛等作用，但是目前尚未公开将莪术二酮应用到腹膜透析液中的相关研究。

发明内容

本发明为解决现有技术存在的问题，提供一种抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液，通过选择新的成分用于腹膜透析液中，并筛选出合理的配方，使其具很好的稳定性、抗腹膜纤维化和抗感染作用，提高超滤效率。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一个目的在于提供一种抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液，包括电解质和渗透剂，其创新点在于，所述的腹膜透析液还包括莪术二酮。

所述的电解质包括氯化钠、氯化钙、氯化镁中的至少一种；所述的渗透剂包括葡萄糖、葡聚糖、果糖、木糖醇、山梨糖醇、多聚糖中的至少一种或多种。

所述腹膜透析液还含有缓冲碱，所述缓冲碱为乳酸盐、碳酸氢盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐、苹果酸盐中的至少一种或多种。

所述腹膜透析液还含有醋酸钠，醋酸钠的加入有助于莪术二酮在整个体系中的稳定，而且对抗纤维化和抗感染起协同作用。

优选地，所述腹膜透析液中的主要成分浓度范围如下：

钠离子80-300mEq/L

氯离子80-110mEq/L

钙离子0-4.0mEq/L

镁离子0-4.0mEq/L

缓冲碱30-150mEq/L

葡萄糖0-5％w/v

醋酸钠0.1％-2％w/v

莪术二酮0.03％-2％w/v

腹膜透析液的pH值为6.0－8.0。

优选地，前段述腹膜透析液中的莪术二酮含量为0.05％-1.5％w/v，醋酸钠0.3％-1.5％w/v、腹膜透析液的pH值为6.0－7.0。

本发明的第二个目的在于，制备前段所述抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液的方法，包括如下步骤：

(1)将药学上可接受的无水葡萄糖、氯化钠、氯化钙、氯化镁溶于处方量20％的水中，水的温度为40-60℃,用药用级盐酸溶液调节pH为2.8-3.5，微孔滤芯过滤，冷却至室温待用；

(2)将药学上可接受的醋酸钠、乳酸钠溶于处方量30％的水中，通入CO₂，控制压力为0.05-0.2MPa，至pH为6.0-6.5，水的温度为30-40℃，微孔滤芯过滤，冷却至室温待用；

(3)将莪术二酮加入到步骤(2)冷却至室温的混合液中，以超声频率为30－80KHz进行超声分散，超声分散时间为3－20分钟，待用；

(4)将步骤(1)和步骤(3)得到的溶液进行混合，然后补充水至全量，再以超声频率为40－150KHz进行超声分散，超声分散时间为10－30分钟。

本发明相比现有技术的有益效果是：本发明腹膜透析液加入莪术二酮，采用合理配方和制备方法，使得本发明的腹膜透析液具有更好的抗腹膜纤维化和抗感染作用，提高超滤作用；加入醋酸钠能够使莪术二酮在整个体系中具有更好的稳定性，而且对抗感染起协同作用。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明具体实施例的腹膜透析液配方参见下表1：

制备实施例1-3所述腹膜透析液的方法，包括如下步骤：

(1)将药学上可接受的原料溶于处方量20％的水中，水的温度为40-60℃,用药用级盐酸溶液调节pH为3.2，微孔滤芯过滤，冷却至室温待用；

(2)将药学上可接受的醋酸钠、乳酸钠溶于处方量30％的水中，通入CO₂，控制压力为0.1MPa，至pH为6.5，水的温度为35-40℃，微孔滤芯过滤，冷却至室温待用；

(3)将莪术二酮加入到步骤(2)冷却至室温的混合液中，以超声频率为48-50KHz进行超声分散，超声分散时间为15分钟，待用；

(4)将步骤(1)和步骤(3)得到的溶液进行混合，然后补充水至全量，再以超声频率为110－115KHz进行超声分散，超声分散时间为10－30分钟。

对比例0-3的制备方法根据对比例0-3的原料参照上述方法进行。

实验1 对抗纤维化的评价

一、实验目的

通过对比分析指标：大鼠腹膜厚度和大鼠腹水和血液中TGF-β1浓度，以评价本发明实施例1-4中腹膜透析液的抗腹膜纤维化效果。

二、实验方法

(1)大鼠腹膜厚度的测定

将对比例0和实施例1-4所述的腹膜透析液装入三层共挤输液用膜制袋中，湿热灭菌，灭菌温度115℃，灭菌时间30min。

将雄性SD大鼠90只按随机数字表分为9组，即A组-I组，每组10只，其中，A组作为正常对照组，腹腔注射20ml生理盐水；其余均采用余均采用4.25％葡萄糖透析液+脂多糖致腹膜纤维化模型，B组为模型对照组，腹腔注射20ml常规腹膜透析液(即对比例0所述透析液)，C组-I组，分别腹腔注射20ml实施例1-4,对比例1-3所制得的腹膜透析液，上述各组腹膜注射均为1次/d，观察4周。

上述含葡萄糖透析液+脂多糖致腹膜纤维化模型的造模方法为：每日大鼠腹腔内直接注射4.25％含糖透析液20ml,并在第8、10、12天加入脂多糖75μg。

4周后取大鼠壁层腹膜组织，采用Van Gieson氏法染色即(VG法染色)：切片脱蜡至水，用Weigert氏苏木精染20min，流水冲洗10min，染Van Gieson氏液1min，用体积分数95％乙醇快速分化，无水乙醇脱水，二甲苯透明，封固。光学显微镜观察，镜下测量腹膜胶原厚度。

(2)血液中TGF-β1浓度的测定：

在无菌条件下用一次性无菌注射器抽取腹水，同时经下腔静脉采血。

采用双抗体夹心ELISA法对转化生长因子TGF-β1浓度进行测定，具体方法为：将标准品、待测样品加入到预先包被TGF-β1单克隆抗体透明酶标包被板中，37℃反应90分钟，洗涤除去未结合的成分，再用抗体稀释液稀释的生物素抗大鼠TGF-β1抗体每孔加入0.1ml(1:100)，37℃反应60分钟后，0.01M PBS洗涤除去未结合的成分，然后加入稀释液稀释的亲和素过氧化物酶复合物每孔0.1ml(1:100)，37℃反应30分钟，亲和素和生物素特异性结合，0.01M PBS洗去未结合的酶结合物，TMB显色液0.1ml加入每孔，反应15分钟，底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，加入终止液变黄，颜色的深浅与样品中的TGF-β1浓度呈正相关，用酶标仪在450nm测定OD值，根据标准品的浓度和样品的OD值计算待测转化生长因子β1的浓度。

结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450nm读数，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，生成标准曲线和直线回归方程式，根据公式计算未知样品的浓度，并记录。

三、实验结果

(1)大鼠腹膜厚度的试验结果如下表2(

μm)

注：*P<0.05，与模型对照组B组比较。

从表2可知：与B组-模型对照组相比，C组-I组的腹膜厚度均有所减少或差异不大(G组-对比例1)，其中，与模型对照组B组相比：C组-F组的腹膜增厚降低差异显著，且实验期间SD大鼠的死亡率低；G组未加入莪术二酮腹膜增厚有所降低,但是差异不显著；H组、I组的腹膜增厚降低，且差异显著，说明浓度3-5％w/v的莪术二酮，有效延缓腹膜增厚的效果，但因G-H组浓度过高，实验结束后，致死率达40％-60％。另外，H组、I组同为莪术二酮较高浓度组，H组与I组相比，腹膜增厚无显著性差异(P>0.05)，可以看出当莪术二酮浓度大于2％时，对腹膜厚度影响较小。

(2)大鼠血液中TGF-β1浓度的试验结果如下表3：

注：*表示P<0.05，与模型对照组B组比较。

从表3可知：与B组-模型对照组相比：C组-F组、H组、I组中腹水和血清中的TGF-β1值均有所降低,其中，与模型对照组B组相比：C组-F组、H组、I组的TGF-β1值差异显著，且P<0.05，具有统计学意义；E组与F组比较，无显著性差异(P>0.05)；H组、I组虽TGF-β1值显著降低，但其致死率较高；G组因未加入莪术二酮的，与模型对照组相比，虽然TGF-β1值有所降低，但无显著性差异。

实验2 对超滤的评价

一、灭菌方法：药液装入三层输液用共挤膜所致袋中，湿热灭菌，灭菌温度115℃，灭菌时间30min。

二、试验方法：

将雄性SD大鼠90只按随机数字表分为9组，每组10只：

A组正常对照组腹腔注射20ml生理盐水，B组为模型对照组，腹腔注射20ml常规腹膜透析液(即对比例0所述透析液)，C组-I组，分别腹腔注射20ml实施例1-4,对比例1-3所制得的腹膜透析液，上述各组腹膜注射均为1次/d，观察4周。

三、超滤量的测定：4周后向大鼠腹腔灌注对比例0中的腹透液20ml，2h后处死，准确测量超滤量ml(超滤量＝最后出水量-20ml)。

a组正常对照组、b组模型对照组、c-i组超滤量分别为(4.39±1.41)ml，(-1.18±1.23)ml，(3.81±1.07)ml，(4.06±1.71)ml，(4.11±1.64)ml，(4.27±1.79)ml，(-0.89±1.17)ml，(4.35±1.61)ml，(4.43±1.72)ml；

可见，与a组正常对照组相比，b组的超滤量明显降低；其中，c-f组、h组、i组比b组模型对照组超滤量提高，其中d-f组与g组相比，超滤量明显增加；加入莪术二酮的d-f组与a组超滤量无显著差异，说明莪术二酮可缓解长期透析造成的超滤衰竭，h组、i组说明当莪术二酮浓度从2％继续增加时，超滤效果没有显著差异。

实验3 对稳定性的评价

将对比例0中加入1％莪术二酮作为对照组二，将实施例3的腹膜透析液作为实验组。

试验方法：1、将对照组一、二、实验组的药液装入三层输液用共挤膜所致袋中，湿热灭菌，灭菌温度115℃，灭菌时间30min，每组5袋。

2、将药袋置于40℃±2℃，相对湿度20％±5％条件下，于0、1、2、3、6个月取样检测药袋中药液的pH值、5-羟甲基糠醛、渗透压摩尔浓度、可见异物、失水率、无水葡萄糖、乳酸钠、氯化钙、氯化镁、总钠、总氯含量，各项质量指标在各个考察时间点均符合货架期标准的规定，与对照组1相比均未发生”显著变化”，数据变异性小，产品稳定性良好。

3、针对本发明的莪术二酮在腹膜透析液体系中的稳定性作出的检测结果如下：

可见，加入醋酸钠能够使莪术二酮在整个体系中具有更好的稳定性。

实验4 对抗感染的评价

步骤1、对若干体重为50g±1g的健康小鼠切除肾的大部分来诱发肾衰竭，具体操作为先以苯巴比妥(50mg/kg)腹腔注射麻醉，使小鼠仰卧，下肢交叉固定于手术台上以暴露背部左肾区，从距左脊肋骨1.5cm处做斜向外方切口，然后腹膜取肾，暴露肾脏，分离肾周脂肪后，弧形切除约80％左肾组织，主要切除皮质部分，用明胶海棉压迫止血片刻，再滴加数滴纤维蛋白原和凝血酶溶液，稍等片刻，当切面上不再有活动性出血后复位剩余左肾，缝合。一周后切除约80％右肾。

步骤2、每天用5mL对比例0的腹膜透析液定时注入若干只切除肾大部分的肾衰竭小鼠的腹腔留置，注入4h后取出透析液，15天后，选出感染程度为TNF-α50-60ng/ml，60-70ng/ml，70-80ng/ml的小鼠各3组，共9组每组10只小鼠；

步骤3、再分别用对比例0、对比例1的腹膜透析液继续对TNF-α50-60ng/ml，60-70ng/ml，70-80ng/ml的6组小鼠进行每天腹腔注射留置4h再取出作为对照组，其中对比例0处理的为对照组1-3，对比例1处理的为对照组4-6，另3组TNF-α50-60ng/ml，60-70ng/ml，70-80ng/ml的小鼠作为实验组采用本发明实施例3的腹膜透析液进行每天腹腔注射留置4h再取出透析液处理，如此实验3天后、5天后、10天后测定大鼠腹腔液中TNF-α平均含量(测定方法请参见《肠球菌小鼠腹膜炎模型的建立》吴利先,黄文祥,孙小平，重庆医科大学学报2007年第32卷第1期)，结果如下表所示。

由上表的结果可知，感染后的小鼠发生了急性炎症,急性期细胞因子TNF-α急剧升高,在腹膜透析液未加入莪术二酮的对照组1-3中，小鼠的腹膜炎症越来越严重，而在腹膜透析液加入醋酸钠未加入莪术二酮的对照组4-6，小鼠的腹膜炎症得到一定程度缓解，在加入莪术二酮的实验组1-3中，小鼠的腹膜炎症得到有效缓解；而且，从对照组4-6与实验组1-3的数据可以看出，醋酸钠和莪术二酮对抗感染起协同作用。

上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。

Claims (7)

1.一种抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液，包括电解质和渗透剂，其特征在于，所述的腹膜透析液还包括莪术二酮，所述腹膜透析液中的主要成分浓度范围如下：

钠离子80-150mEq/L

氯离子80-110mEq/L

钙离子0-4.0mEq/L

镁离子0-4.0mEq/L

缓冲碱30-150mEq/L

葡萄糖0-5％w/v

醋酸钠0.1％-2％w/v

莪术二酮0.03％-2％w/v

腹膜透析液的pH值为6.0－8.0。

2.根据权利要求1所述的抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液，其特征在于，所述的电解质包括氯化钠、氯化钙、氯化镁中的至少一种；所述的渗透剂包括葡萄糖、果糖、木糖醇、山梨糖醇、多聚糖中的至少一种或多种。

3.根据权利要求2所述的抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液，其特征在于，所述多聚糖为葡聚糖。

4.根据权利要求2所述的抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液，其特征在于，所述缓冲碱为乳酸盐、碳酸氢盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐、苹果酸盐中的至少一种或多种。

5.根据权利要求4所述的抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液，其特征在于，所述渗透剂为葡萄糖。

6.根据权利要求5所述的抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液，其特征在于，莪术二酮含量为0.05％-1.5％w/v，醋酸钠0.3％-1.5％w/v、腹膜透析液的pH值为6.0－7.0。

7.制备权利要求6所述的抗腹膜纤维化和感染的腹膜透析液的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将药学上可接受的无水葡萄糖、氯化钠、氯化钙、氯化镁溶于处方量20％的水中，水的温度为40-60℃,用药用级盐酸溶液调节pH为2.8-3.5，微孔滤芯过滤，冷却至室温待用；

(2)将药学上可接受的醋酸钠、乳酸钠溶于处方量30％的水中，通入CO₂，控制压力为0.05-0.2MPa，至pH为6.0-6.5，水的温度为30-40℃，微孔滤芯过滤，冷却至室温待用；

(3)将莪术二酮加入到步骤(2)冷却至室温的混合液中，以超声频率为30－80KHz进行超声分散，超声分散时间为3－20分钟，待用；

(4)将步骤(1)和步骤(3)得到的溶液进行混合，然后补充水至全量，再以超声频率为40－150KHz进行超声分散，超声分散时间为10－30分钟。