CN103417565B - 解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用，所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为55000Da～96000Da中的一种以上。经大量实验研究表明，所述的解聚海参糖胺聚糖，能安全、有效的用于血栓性疾病的预防和治疗。

Description

解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及解聚海参糖胺聚糖的医药用途，具体涉及一种分子量为55000Da至96000Da的解聚海参糖胺聚糖组合物的医药用途。

背景技术

血栓性疾病，如缺血性脑卒中，是一种严重威胁人类特别是中老年人健康的常见的心血管疾病，临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征。即使在目前最先进、最完善的治疗条件下，仍有50％以上的脑卒中幸存者生活不能完全自理。缺血性脑卒中具有“高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率、多并发症”的特点，约占全部脑卒中的70%。急性缺血性脑卒中的治疗目的是降低致残率，提高病人生活质量。据不完全统计，中国脑卒中患者已经超过亿人。因此积极开发预防和治疗该疾病的药物迫在眉睫。

据2010在《中华神经科杂志》发表的“中国缺血性脑卒中防治指南”及2006年美国国立卒中学会发布的“短暂性脑缺血发作治疗指南”诊治指南指出急性缺血性脑卒中的急性期特异性治疗方法包括：溶栓、抗血小板、抗凝、降纤、扩容、扩张血管等。其中抗血小板聚集是除溶栓治疗外，对于不符合溶栓适应症患者及溶栓治疗患者均为最高级别的Ⅰ级推荐使用。详细说明如下：

（1）不符合溶栓适应症且无禁忌证得缺血性脑卒中患者应在发病后尽早给予口服阿司匹林150-300mg/d(Ⅰ级推介，A级证据)。急性期后可改为预防剂量（50-150mg/d）。

（2）溶栓治疗者，阿司匹林等抗血小板药物应在溶栓24h后开始使用（Ⅰ级推介，B级证据）

（3）对不能耐受阿司匹林者，可考虑选用氯吡格雷等抗血小板治疗（Ⅲ级推介，C级证据）

目前，临床中用于抗血小板聚集的药物主要有以下几类：

1.阿司匹林

阿司匹林是迄今为止应用最为广发的抗血小板药物，它是评价新药疗效的参考标准。阿斯匹林是环氧合酶（COX）的不可逆性抑制剂，对COX-1有高度选择性，大剂量使用可以同时抑制COX-2。阿司匹林对COX-1的抑制呈剂量依赖性，它能使花生四烯酸合成的血栓素A₂减少。阿司匹林抗血小板作用相对较弱，因为它仅抑制多种血小板活化途径中的一种。阿司匹林可防治多种心血管疾病，但主要用于缺血事件的一级和二级预防。研究表明健康人和动脉粥样硬化的高危人群用阿司匹林进行心血管疾病的一级预防可以降低心血管事件发生率，但同时大出血的发生率有轻度升高。阿司匹林的二级预防效果显著，可使主要心血管事件的总体发生率降低23%。副作用1）长期口服导致消化道出血；2）容易发生凝血障碍；3）大量服用也可以产生水杨酸过量反应；4）有时可以产生变态反应。

2．噻吩并吡啶类药物

噻氯匹定和氯吡格雷属于噻吩并吡啶类药物，其作用机制为抑制二磷酸腺苷（ADP）诱导的血小板聚集及GPⅡb/Ⅲa受体结构的变化；另外，它们也可以阻止凝血酶、胶原以及剪切力等诱导的血小板聚集。

噻氯匹定用于防治由于血小板聚集增高所导致的心脑和其他脏器动脉血管的障碍性疾病，例如缺血性脑卒中、短暂性脑缺血发作、冠心病、心绞痛、急性心肌梗死、下肢闭塞性动脉炎等。噻氯匹定的副作用很严重，如中性粒细胞减少、血栓性血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血以及胰腺炎。

氯吡格雷用于防治因血小板所致的心脑血管性疾病和循环障碍等，如心绞痛、心肌梗死、急性脑卒中发作和确诊后的阻塞性外周血管疾病等。其副作用包括了中性粒细胞和白细胞减少、血小板减少、吐血、鼻出血、紫癜等。

3．阿昔单抗

阿昔单抗是一种血小板膜糖蛋白GPⅡb、Ⅲ受体拮抗剂，是通过基因工程技术制备的重组小动物-人嵌合体，能特异性地作用于血小板膜糖蛋白GPⅡb、Ⅲ受体，而发挥血小板聚集的抑制作用。该药更适合用于急性心肌梗死（AMI）和其采取经皮冠状动脉介入治疗前后的患者。不良反应主要有过敏及出血。

4．埃替非巴肽

埃替非巴肽通过拮抗血小板膜糖蛋白GPⅡb、Ⅲ受体发挥作用，可逆性较好，也可以通过阻断纤维蛋白原见到的血小板交互联结，并抑制血小板的聚集。该药主要用于急性冠脉综合症，包括不稳性心绞痛、非Q波性心肌梗死，以及实施经皮冠状动脉介入的前后治疗等。不良反应主要有过敏及出血。

5．替罗非班

替罗非班是血小板膜糖蛋白GPⅡb、Ⅲ受体拮抗剂，能与糖蛋白GPⅡb、Ⅲ受体发生高度特异性结合，可以快速可逆性的抑制血小板聚集。主要用于治疗不稳定性心绞痛、非Q波性心肌梗死，以及冠状动脉介入处理的患者。不良反应主要包括头痛、呕吐、头痛出血和血小板减少，通常这些不良反应轻微，不需要特殊处理，停药后即可回复。

6．曲可芦丁

曲可芦丁是芦丁类制剂，能抑制血小板聚集，既可以防止血栓形成，也能对抗5-羟色胺、缓激肽引起的血管损伤，增加毛细血管抵抗力、降低毛细血管通透性、减轻脑水肿、故对急性缺血性脑损伤有一定的保护作用。主要用于脑血栓形成和脑栓塞引起的偏瘫、失语，可用于防治中心性视网膜炎、静脉曲张、血栓性静脉炎等。副作用主要有轻度过敏、恶心和便秘等。

7．沙格雷酯

沙格雷酯可选择性的拮抗血小板和血管5-羟色胺受体，从而抑制血小板聚集，舒缓血管的紧张性，并且改善血液循环。该药用于改善由慢性动脉闭塞引发的溃疡、抑或治疗和缓解组织缺血的疼痛症状。不良反应包括皮疹、头痛、恶心、胃部不适等。

以上所述药物具有抗血小板聚集作用用于预防治疗脑卒中均具有一定的不安全性，部分甚至具有严重副作用。因此从天然产物中分离新的、更具安全性以及较轻毒副作用的防治脑卒中是新的研究方向。

海参不仅是一种美食，还是一种名贵的中药材。在中国所产海参约有20余种可供食用，主要有刺参、方刺参、梅花参、乌参、黄玉参等。我国传统中医理论认为，海参具有“补肾精、益精髓、消痰涎、摄小便、壮阳疗痿、杀疮虫”等多种功能。现代医学研究认为，海参具有防治动脉血栓形成、防治动脉硬化、增强免疫力以及抗肿瘤等作用。

海参糖胺聚糖是海参体壁中含有的一种糖胺聚糖是海参所特有的，是海参的主要活性物质基础。海参糖胺聚糖具有显著的抗血小板聚集以及抗凝作用。

解聚海参糖胺聚糖（deploymeriedholothurianglycosaminoglycan）是一种对海参糖胺聚糖降解所获得的产物，因此，也称为解聚海参糖胺聚糖。

试验证明，所述的解聚海参糖胺聚糖,不同的分子量，具有不同的生物活性，可用于防治不同的疾病。寻求在一定剂量下(0.4～1.0mg/kg)，既具有显著抑制血小板聚集活性，同时不具有明显抗凝活性的解聚海参糖胺聚糖，以满足临床上防治缺血性脑卒中，是人们所十分期望的。

发明内容

本发明的目的是提供一种解聚海参糖胺聚糖在制备防治防治血栓性疾病药物中的应用，以克服现有技术存在的缺陷。

动物试验证明，重均分子量为55000Da至96000Da之间的解聚海参糖胺聚糖中的一种以上，在一定剂量下，既具有显著抑制血小板聚集活性，同时不具有明显抗凝活性。

对解聚海参糖胺聚糖的抗凝活性进一步研究，实验结果显示，解聚海参糖胺聚糖的抗凝活性呈剂量依赖性，与肝素及低分子肝素比较，其随剂量增加凝血作用递增缓和，尤其在一定剂量下(0.4～1.0mg/kg)抗凝血可以忽略不计，却具有显著抗血小板聚集作用。

因此，所述的重均分子量为55000Da至96000Da之间的解聚海参糖胺聚糖中的一种以上，可以用于制备防治血栓性疾病药物；

所述血栓性疾病包括缺血性脑卒中、阻塞性外周血管疾病，短暂性脑缺血发作疾病、冠心病、心绞痛、急性心肌梗死或下肢闭塞性动脉炎疾病等；

优选的，解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为58000Da～94000Da中的一种以上，更优选为60000Da～92000Da中的一种以上；

所述的“重均分子量为55000Da至96000Da之间的解聚海参糖胺聚糖中的一种以上”指的是，可以是重均分子量为55000Da至96000Da之间的解聚海参糖胺聚糖中的一个，也可以是重均分子量为55000Da至96000Da之间的解聚海参糖胺聚糖各种分子量的组合，为一种组合物。

要获得符合分子量要求的解聚海参糖胺聚糖组合物，可以将海参糖胺聚糖进行不同程度的降解来实现；

本发明还涉及一种药物组合物，包括解聚海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体；

所述解聚海参糖胺聚糖为重均分子量为55000Da至96000Da之间的解聚海参糖胺聚糖中的一种以上；

所述药物组合物为冻干粉针剂时，所述解聚海参糖胺聚糖的重量含量为14%，优选的重量含量为1.2-3%；

所述药学上可接受的载体选自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明胶、聚维酮和氯化钠中的一种或几种，优选甘露醇；

本发明所述的解聚海参糖胺聚糖，还可以用于防治动脉血栓形成、稳定性和不稳定性心绞痛、心肌梗死前、经皮PCI和周围血管闭塞症等疾病；

以解聚海参糖胺聚糖计，给药剂量为0.3～4mg/kg患者体重/天，优选0.5-3mg/kg患者体重/天；具体可根据患者的年龄、病情等由医师决定；

给药形式是静脉滴注，给药速度控制在100ml/h以内。在100ml/h静脉滴注给药速度下，解聚海参糖胺聚糖具有显著抑制血小板聚集作用，且无明显抗凝作用不易引发出血，用于缺血性脑卒中更为有效和安全；

所述的重均分子量为55000Da至96000Da之间的解聚海参糖胺聚糖的制备方法，包括如下步骤：

（1）降解提取出的海参糖胺聚糖；

将海参糖胺聚糖与重量浓度为1～3%的醋酸溶液混合，其中，所述的海参糖胺聚糖的重量含量为1～2%，加入重量浓度为20～30%的双氧水，使溶液中，重量浓度20～30%的双氧水的终浓度为5～6%，55～65℃解聚20～25小时，然后将获得的溶液用氢氧化钠中和至pH为6.9～7.1，再加入3～5倍量体积（v/v）的乙醇沉淀，静置、离心得到解聚海参糖胺聚糖的粗品；

（2）将步骤（1）的解聚海参糖胺聚糖的粗品，在35～40℃下干燥至无乙醇，溶于4～6倍解聚海参糖胺聚糖的粗品重量的水中，上吸附柱，然后用0.05～0.1mol/l氯化钠水溶液洗脱3～8个柱体积，收集55000Da～96000Da分子量段的洗脱液，采用截留分子量5000Da滤膜（杭州庆升净化技术有限公司）超滤，-38～-45℃冷冻干燥，获得所述的解聚海参糖胺聚糖，分子量为55000Da～96000Da，多分散度小于2，优选小于1.5，更优选小于1.4，纯度可达到98%以上；

所述多分散度的定义如下：是本领域常用的衡量聚合物分子量分布的指数，用于表征聚合物分子量分布的宽度。多分散度在本文或其他文献中又被称多分散指数、多分散性或分布宽度指数，是重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)之比，即Mw／Mn。这个比值随分子量分布宽度而变化。在单分散时，Mw／Mn等于1，随着分子量分布变宽，Mw／Mn值逐渐变大。

所述重均分子量的定义如下：重均分子量（Weight-averageMolecularWeight）：所有合成高分子化合物的分子量以及大多数天然高分子化合物的分子量都是不均一的，它们是分子量不同的同系物的混合物。聚合物中用不同分子量的分子重量平均的统计平均分子量。

所述纯度为重量纯度。

所述的吸附柱选自凝胶吸附柱，如Sephadex-G100凝胶吸附柱、Sephadex-G50凝胶吸附柱或Sephadex-G200，所述Sephadex-G100凝胶吸附柱，可以采用美国GE公司的葡聚糖凝胶柱。

所述的海参糖胺聚糖，从海参体壁中提取的，提取海参糖胺聚糖的方法是本领域技术人员所熟悉的，如专利号为ZL200910305363.5公开的“一种玉足海参糖胺聚糖的提取方法”中报导的方法，本发明不再赘述；

本发明采用现代科学技术将传统中药优势进一步发挥，获得了一种含有重均分子量介于55000Da至96000Da之间解聚海参糖胺聚糖的制剂。经大量实验研究表明，所述制剂，能安全、有效的用于防治血栓性疾病如脑卒中的预防和治疗。其预防和治疗心血管疾病，是与其抗血小板聚集、抑制血小板和内皮细胞的粘附相关。解聚海参糖胺聚糖组合物在一定剂量下静脉滴注具有显著抑制血小板聚集作用，并且不具有明显抗凝血作用，可以用于防治脑卒中。

附图说明

图1本发明的解聚海参糖胺聚糖组合物纯度图。

图2本发明的解聚海参糖胺聚糖组合物的分子量分布图谱。

其中：图2－1为色谱图，图2－2为分子量分布，图2－3为分子量累积重量分布曲线。

具体实施方式

实施例1

1．海参糖胺聚糖的提取

称取玉足海参药材2kg，水浸过夜。将海参体壁淋干水分，绞碎，称重并补水至20Kg，置60℃水浴中，pH调至8.0±0.2，加入投料重量（3kg）2%的水解蛋白酶Alcalase60ml（诺维信（沈阳）生物技术有限公司）搅拌，酶解4小时，85℃以上灭活5分钟，降温至50℃±2℃，加入氢氧化钠调pH至8.0±0.2，再加投料重量0.2%的复合胰酶6g（无锡市雪梅酶制剂科技有限公司，雪梅牌）搅拌酶解4小时，煮沸5分钟，冷却。4℃离心，收集上清液，加入盐酸调pH至2.5±0.2，4℃冷藏2小时，离心，收集上清液，加入氢氧化钠调pH至7.0±0.2，加0.8倍（v/v）乙醇，4℃静置过夜；离心，收集沉淀称重，加沉淀物重量10倍的（v/w）蒸馏水，加热至85℃±2℃，待完全溶解后，加入氢氧化钠pH调至9.0±0.2，加入氯化钙至溶液中，氯化钙最终重量浓度达到2%（w/w），升温至90℃保持15分钟，冷却至室温，4℃离心，收集上清液，用饱和碳酸钠溶液调pH至11.0±0.2，离心，收集上清液，用6mol/LHCl溶液调pH至6.0±0.2，加上清液0.8倍重量的乙醇，4℃冷藏过夜；

冷藏液离心，收集沉淀称重，加2倍体积蒸馏水（v/w）加热使其充分溶解，加乙酸钾使其最终浓度为2mol/L，4℃静置过夜。离心，收集沉淀称重，加2倍体积蒸馏水（v/w），加热使其充分溶解，加乙酸钾使其最终浓度为2mol/L，4℃静置过夜。离心，沉淀用冷2mol/L乙酸钾溶液洗涤三次，然后依次用80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇洗涤，待乙醇挥发尽后80℃干燥，称重，得糖胺聚糖粗品。

糖胺聚糖粗品50g加0.05mol/L、pH6.0的HAc-NaAc缓冲液溶解，获得糖胺聚糖粗品的重量浓度为2%的溶液上柱，溶液通过纤维素层析柱后，用1.5倍柱体积的0.4mol/LNaCl的HAc-NaAc缓冲液(pH6.0±0.2)洗涤，再用1mol/LNaCl的HAc-NaAc缓冲液(pH6.0±0.2)洗脱，根据紫外检测仪在220nm处数值的变化速度收集洗脱液，置60℃水浴中，用NaOH调pH至11±0.2，按体积的3%加入30％双氧水，保持4小时，冷却至室温，离心，收集上清液，用HCl溶液调pH至7.0±0.5，加1倍量乙醇，10℃以下静置8小时以上。10℃以下离心，收集沉淀得粗品。

粗品用注射用水溶解成5%的溶液（按湿品计），用截留分子量1万的超滤膜浓缩至原体积的1/2，补加水至原体积，再超滤至1/2体积，再加水重复二次，收集浓缩液，置于冻干盘中，液位高度0.5-0.8cm，进冻干箱，冻干得到海参糖胺聚糖精品

2．解聚海参糖胺聚糖的制备

将上述的海参糖胺聚糖精品，用重量浓度为2%的醋酸配成2%的溶液，加入重量浓度为30%的双氧水，使溶液中双氧水的重量浓度为6%，60℃解聚20小时；

将解聚溶液用氢氧化钠中和至中性，加入解聚溶液4倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，收集沉淀，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品；

将粗品干燥，溶于粗品5倍重量的水中，过sephadex-G100柱，用0.05mol/l的氯化钠洗脱5个柱体积，收集55000Da～96000Da分子量段的洗脱液，截留分子量5000Da滤膜（杭州庆升净化技术有限公司）超滤，-38～-45℃冷冻干燥，获得28g解聚海参糖胺聚糖。

经示差折光检测器（RID-10A,岛津）分析，纯度为100.0%的纯品（见图1）。

经凝胶柱（TSKgelG4000PWXL）色谱分析，重均分子量78503，多分散度值为1.28（见图2）。

实施例2

海参糖胺聚糖的提取同实施例1。

解聚海参糖胺聚糖的制备方法如下：

将上述的海参糖胺聚糖精品，用重量浓度为3%的醋酸配成2%的溶液，加入重量浓度为30%的双氧水，使溶液中双氧水的重量浓度为6%，60℃解聚25小时；

将解聚溶液用氢氧化钠中和至中性，加入解聚溶液4倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，收集沉淀，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品；

将粗品干燥，溶于粗品5倍重量的水中，过sephadex-G100柱，用0.05mol/l的氯化钠洗脱5个柱体积，收集55000Da～72000Da分子量段的洗脱液，截留分子量5000Da滤膜（杭州庆升净化技术有限公司）超滤，-40～-45℃冷冻干燥，获得10g解聚海参糖胺聚糖。

经示差折光检测器（RID-10A,岛津）分析，纯度为100.0%的纯品。

经凝胶柱（TSKgelG4000PWXL）色谱分析，重均分子量650000Da，多分散度值为1.24。

实施例3

海参糖胺聚糖的提取同实施例1。

解聚海参糖胺聚糖的制备方法如下：

将上述的海参糖胺聚糖精品，用重量浓度为2%的醋酸配成2%的溶液，加入重量浓度为30%的双氧水，使溶液中双氧水的重量浓度为6%，58℃解聚22小时；

将解聚溶液用氢氧化钠中和至中性，加入解聚溶液4倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，收集沉淀，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品；

将粗品干燥，溶于粗品5倍重量的水中，过sephadex-G100柱，用0.05mol/l的氯化钠洗脱5个柱体积，收集73000Da～95000Da分子量段的洗脱液，截留分子量5000Da滤膜（杭州庆升净化技术有限公司）超滤，-40～-45℃冷冻干燥，获得12g解聚海参糖胺聚糖。

经示差折光检测器（RID-10A,岛津）分析，纯度为100.0%的纯品。

经凝胶柱（TSKgelG4000PWXL）色谱分析，重均分子量820000Da，多分散度值为1.26。

实施例4

注射用含有解聚海参糖胺聚糖的药物组合物的制备

将12.0g实施例1的解聚海参糖胺聚糖与24g甘露醇混合，加入注射用水1000ml溶解，经过超滤、灌装、冻干，得到1000瓶注射用解聚海参糖胺聚糖的冻干粉针剂。

实施例5

将5g实施例2的解聚海参糖胺聚糖，5g实施例3的解聚海参糖胺聚糖与20g甘露醇混合，加入注射用水1000ml溶解，经过超滤、灌装、冻干，得到1000瓶注射用解聚海参糖胺聚糖的冻干粉针剂。

实施例6

解聚海参糖胺聚糖的药效学实验

体外抗血小板实验

1试验目的：观察解聚海参糖胺聚糖抗血小板聚集活性。

2试验材料：

2.1供试样品：

名称：实施例1的解聚海参糖胺聚糖，重均分子量78503，多分散度值为1.28；

配制：精密吸取后，以注射用生理盐水稀释至所需浓度；

2.2试验动物：

品系：SD大鼠；来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司；性别：雄性

体重：150-170克；动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016

2.3试验仪器：

QX-200全血血小板聚集仪，上海医大仪器有限公司。

FA1004A型电子天平，上海精天仪器有限公司，最小称量值0.1mg

3测定方法：

采血：取体重150～170g的雄性SD大鼠5只，采血前禁食、禁水1天，用3％戊巴比妥钠麻醉（剂量0.1ml/100g）后，经腹主动脉取血，按体积比1：10（肝素溶液：全血）加入200U/ml肝素溶液抗凝。将5只大鼠全血混匀后于20℃静置1小时后测定，测定须在血液离体后1～4小时内完成。

供试品溶液制备：取供试品适量，加专用稀释缓冲液溶解制成含解聚海参糖胺聚糖0.25mg/ml的溶液。

测定方法：取0.5ml制备的大鼠全血于测试管中，加入0.25mg/ml的供试品溶液10μl，混匀，20℃孵放15min，加0.5ml专用稀释缓冲液，加入5μl的1mmol/LADP，于QX-200全血血小板聚集仪测定，测定温度37℃，记录5min内最大电阻值（Ω）；以专用稀释缓冲液代替供试品溶液作为空白对照，每个样品重复测定5次，用平均值按下式计算血小板聚集抑制率。

4实验结果：

实验结果可见表1，解聚海参糖胺聚糖具有显著抑制血小板聚集作用100μg/ml时抑制率达到57.76%，超过50%，并且随着剂量增加对血小板聚集的抑制率增加。

表1DHG抗血小板聚集活性

实施例7

采用与实施例6相同的方法，其中，供试样品为实施例2的解聚海参糖胺聚糖和实施例3的解聚海参糖胺聚糖的混合物，质量比为1∶1。试验结果见表1－1：

解聚海参糖胺聚糖具有显著抑制血小板聚集作用100μg/ml时，抑制率达到58.44%，超过50%，并且随着剂量增加对血小板聚集的抑制率增加。

表1－1DHG混合物抗血小板聚集活性

实施例8

解聚海参糖胺聚糖对ADP诱导血小板聚集的影响

1试验目的：观察静脉注射解聚海参糖胺聚糖对ADP诱导大鼠血小板聚集的影响。

2试验材料

2.1供试样品：

名称：实施例1的解聚海参糖胺聚糖，重均分子量78503，多分散度值为1.28；

配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度。

2.2对照样品：

名称：肝素；来源：国药集团化学试剂有限公司；批号：F20091029；含量：

150U/mg；配制：精密称取后以注射用生理盐水溶解并稀释至所需浓度

2.3试验动物

品系：SD大鼠；来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司；性别：雄性；体重：250-300克；动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016；饲养：动物饲养于正压净化通风动物房内，室温23±1℃；湿度：50～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。

2.4试验仪器

80－2型离心机，上海手术器械厂生产。MK4/HC血小板计数仪，美国BakerInstruments公司生产。血小板聚集仪，CHRONO-LOGCorporation公司生产。

2.5其它试剂

ADP，批号：109K7019，Sigma公司生产，用pH7.4磷酸缓冲液配成1mM浓度溶液备用。放－20℃冰箱保存备用。

3实验方法

将SD大鼠42只，分成4组，阴性对照组（生理盐水1ml/kg），DHG低、中、高三个剂量组（1、2mg/kg），阳性对照组肝素（6mg/kg），而各组又分给药后10分钟，30分钟，1小时三个时间点。舌下静脉注射给药，体积均为5ml/kg。

分别于给药10分钟，30分钟，1小时后以12%的水合氯醛腹腔注射麻醉（350～400mg/kg），仰卧固定，切开腹部皮肤，分离腹主动脉动脉并插管，放出血液后用50u/ml肝素按1：9比例抗凝，以500rpm离心5分钟，取上部血浆即为富血小板血浆（PRP），余下部分再次以3500rpm离心15分钟，上清液为贫血小板血浆（PPP），用血小板计数仪计数PRP血小板数，用PPP调整PRP的血小板数至6×105个/mm3左右。在反应杯中加入PRP5001并加入编号为#311的磁棒放于温育孔，温育5分钟，另用一PPP管放入反应杯，不需加磁棒，温育5分钟，调节记录仪至零点，再加入ADP5l，使ADP终浓度为10M，记录加入ADP后的最大聚集率。

计算出各试验组的平均最大聚集率及标准差，用t-检验同溶剂组进行比较。并按下式计算各试验组的聚集抑制率：

4实验结果：

表2结果显示，DHG2个剂量组（1mg/kg、2mg/kg）对ADP诱导的大鼠血小板聚集均有抑制作用，1mg/kg、2mg/kg剂量组对ADP诱导的大鼠血小板聚集具有非常显著抑制作用（P<0.01）；受试药物对血小板聚集抑制作用与给药剂量呈正比。阳性对照肝素组对ADP诱导的大鼠血小板聚集无明显抑制作用，与阴性对照生理盐水组相比没有明显差异（P>0.05）。

表2.DHG对ADP诱导的大鼠血小板聚集的影响

**P<0.01与NS组比较

实施例9

采用与实施例8相同的方法，其中，供试样品为实施例2的解聚海参糖胺聚糖和实施例3的解聚海参糖胺聚糖的混合物，质量比为1∶1。试验结果见表2－1：

表2-1结果显示，DHG混合物2个剂量组（1.5mg/kg、3mg/kg）对ADP诱导的大鼠血小板聚集均有抑制作用，1.5mg/kg、3mg/kg剂量组对ADP诱导的大鼠血小板聚集具有非常显著抑制作用（P<0.01）；受试药物对血小板聚集抑制作用与给药剂量呈正比。阳性对照肝素组对ADP诱导的大鼠血小板聚集无明显抑制作用，与阴性对照生理盐水组相比没有明显差异（P>0.05）。

表2－1DHG混合物对ADP诱导的大鼠血小板聚集的影响

**P<0.01与NS组比较.

实施例10

体内抗凝血实验

1试验目的：观察静脉滴注解聚海参糖胺聚糖对beagle犬凝血系统的影响。

2试验材料：

2.1供试样品：

名称：实施例1的解聚海参糖胺聚糖，重均分子量78503，多分散度值为1.28；配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度。

2.2试验动物

品系：beagle犬；来源：甲干宠物基地；性别：雄性；体重：11-12kg；动物合格证号：SCXK（沪）2010-0028；

2.3试验仪器

自动凝血分析仪SysmexCA-1500

3实验方法

Beagle犬6只，分为静脉滴注DHG1mg/kg组、2mg/kg组，生理盐水对照组，每组2只。静脉滴注体积100ml，滴注速度100ml/1h。

Beagle犬用3%速可眠静脉注射麻醉（1ml/1kg体重），静脉滴注前0min、给药中30min、60min，滴注结束后10min、30min、60min采血测定各剂量给药beagle犬PT、APTT、TT数值。

Beagle犬轮换剂量组给药采血测定，试验3次，计算各剂量组PT、APTT、TT数值平均值及自身凝血时间延长率。

4实验结果

实验结果见表3和表4，DHG静脉滴注beagle犬在1mg/kg、2mg/kg剂量，100ml/1h滴注速度上APTT、PT、TT均未发现有明显的变化。

表3犬静脉滴注DHG对凝血系统的影响

表4犬静脉滴注凝血时间延长率

实施例11

采用与实施例10相同的方法，其中，供试样品为实施例2的解聚海参糖胺聚糖和实施例3的解聚海参糖胺聚糖的混合物，质量比为1∶1。试验结果见表3－1，表4－1。

DHG静脉滴注beagle犬在1mg/kg、2mg/kg剂量，100ml/1h滴注速度上APTT、PT、TT均未发现有明显的变化。

表3－1犬静脉滴注DHG混合物对凝血系统的影响

表4－1犬静脉滴注凝血时间延长率

实施例12

解聚海参糖胺聚糖对大鼠脑梗死的保护作用

1试验目的：观察静脉注射解聚海参糖胺聚糖后对大鼠脑梗死的保护作用。

2实验材料

2.1供试样品：

名称：实施例1的解聚海参糖胺聚糖，重均分子量78503，多分散度值为1.28；配制：精密称取后以注射用生理盐水溶解并稀释至所需浓度。

2.2实验动物

品系：SD大鼠；来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司；性别：雄性；体重：220-250克；动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016；饲养：动物饲养于正压净化通风动物房内，室温23±1℃，湿度50～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。

3实验方法

3.1大鼠局灶性脑缺血模型的制备

参照Longa法制作右侧大脑动脉梗死(Middlecerebral，areryocclusion，MCAO)模型。大鼠称重，腹腔注射3％的戊巴比妥钠溶液(1ml/kg)麻醉，仰卧固定于恒温手术台上，温度(37.0±0.5)℃。颈部皮肤用碘酒消毒后，作正中皮肤切口，钝性分离皮下组织和肌肉，避免损伤甲状腺和甲状旁腺。分离右侧颈总动脉及其分支颈外动脉和颈内动脉，并穿线备用，沿颈内动脉继续颅内方向分离至翼腭动脉分叉处，结扎翼腭动脉、颈外动脉和颈总动脉。在颈总动脉分叉处剪一小口，沿颈内动脉向颅内插入一直径约为0.3mm尼龙线，至大脑前动脉，插入深度约17～20mm，将尼龙线与颈内动脉一并结扎。缝合皮下筋膜及皮肤，即为大脑中动脉梗死模型。假手术组除了不插尼龙线外，其余步骤相同.DHG1mg/kg,2mg/kg,静脉注射。每天一次，连续5d，末次给药后1h进行MCAO手术。

3.2神经症状评分

大鼠清醒后，观察其行为学变化，神经症状按Longa5分制评分，评分标准：无神经损伤症状，0分：不能完全伸展左侧前爪；1分：向左侧转圈；2分：行走时向左侧倾倒；3分：不能自发行走；4分：意识昏迷。

3.3TTC染色及脑梗死体积的测定

TTC染色原理：氯化一2，3，5一三苯基四氮唑(2，3，5一TriphenyltrazoliumChloride，TTC)有原型和氧化型两种状态，还原型呈红色，氧化型无色。正常脑组织内含有还原型尼克酰胺腺苷二核苷酸(NADPH)，能将无色的氧化型TIC还原成红色还原型的TIC。脑缺血后，梗死区域的神经细胞缺血坏死，NADPH丧失，不能将TTC还原，该区域脑组织呈灰白色，而正常脑组织内NADPH还存在，将氧化型，TTC还原为还原型，该区域呈现红色，从而可区分梗死区与正常区。

TTC染色方法：大鼠缺血24h后，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，-20℃冷冻10min，冠状切面，切成5～6片。脑片置于2%TIC液中，37℃染色20min，10％甲醛固定，24h后拍照。脑梗死体积测定：TTC染色20min后，脑片用生理盐水冲洗2次，以梗死组织重量占大脑重量的百分比作为梗死体积。

4统计学处理

实验数据以均数±标准差(mean±s)表示，t检验进行组间差异比较，P<0.05为差异显著标准。

5实验结果：

从表5可见，模型组大鼠MCAO后脑梗死体积和神经功能症状评分明显高于伪手术组。预先给予DHG可明显减少MCAO后脑梗死体积，改善神经功能症状。

表5MCAO后大鼠在DHG保护效应下的综合脑侵害（mean±s）

注：伪手术组vs模型组^★P＜0.05，^★★P＜0.01;给药组vs模型组^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

实施例13

采用与实施例12相同的方法，其中，供试样品为实施例2的解聚海参糖胺聚糖和实施例3的解聚海参糖胺聚糖的混合物，质量比为1∶1。试验结果见表5－1。

从表5-1可见，模型组大鼠MCAO后脑梗死体积和神经功能症状评分明显高于伪手术组。预先给予DHG可明显减少MCAO后脑梗死体积，改善神经功能症状。

表5－1MCAO后大鼠在DHG混合物保护效应下的综合脑侵害（mean±s）

注：伪手术组vs模型组^★P＜0.05，^★★P＜0.01;给药组vs模型组^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

实施例14

解聚海参糖胺聚糖对大鼠动静脉导管血栓形成模型的影响

1实验目的：观察静脉注射解聚海参糖胺聚糖后对大鼠动静脉导管血栓模型血栓质量的影响。

2试验材料

2.1供试样品:

名称：实施例1的解聚海参糖胺聚糖，重均分子量78503，多分散度值为1.28；配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度

2.2对照样品：

名称：肝素;来源：国药集团化学试剂有限公司;批号：F20091029；含量：150U/mg；配制：精密称取后以注射用生理盐水溶解并稀释至所需浓度

2.3试验动物

品系：SD大鼠；来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司；性别：雄性；体重：250-300克；动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016；饲养：动物饲养于正压净化通风动物房内，室温23±1℃，湿度50～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。

2.4试验仪器

BS110s型电子天平，SARTORIUS公司生产，最小称量值0.1mg。

3试验方法

将SD大鼠34只，分成4个不同的给药组，阴性对照组（生理盐水1ml/kg），DHG两个剂量组（1、2mg/kg），阳性对照肝素组（0.1mg/kg）。所有药物均为舌下静脉注射给药，体积5ml/kg。

各组动物在手术前10min用12%的水合氯醛腹腔注射麻醉（350～400mg/kg）后，仰卧固定，切开颈部皮肤，分离左侧颈动脉和右侧颈外静脉，以一旁路管连接，管中置一7cm长4号手术丝线。分别在给药20分钟后开放血流15分钟，然后取出丝线称重，减去丝线重量，即为血栓湿重。计算出各试验组的血栓湿重平均值及标准差，用t-检验同生理盐水组进行比较。并按下式计算各试验组的血栓湿重抑制率：

4.4试验结果

试验结果见表6。可以看到，阳性药和受试药物在给药20分钟后测试都可以显著抑制血栓的形成。受试药物对血栓形成的抑制作用与给药剂量呈正比。与同等剂量的受试药物比较，阳性药物作用强于受试药物。

表6DHG对大鼠动静脉导管血栓形成模型的影响

与阴性组相比较：*P<0.05，**P<0.01

实施例15

采用与实施例14相同的方法，其中，供试样品为实施例2的解聚海参糖胺聚糖和实施例3的解聚海参糖胺聚糖的混合物，质量比为1∶1。试验结果见表6－1。

可以看到，阳性药和受试药物在给药20分钟后测试都可以显著抑制血栓的形成。受试药物对血栓形成的抑制作用与给药剂量呈正比。与同等剂量的受试药物比较，阳性药物作用强于受试药物。

表6－1DHG混合物对大鼠动静脉导管血栓形成模型的影响

与阴性组相比较：*P<0.05，**P<0.01。

Claims (6)

1.解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用，所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为55000Da～96000Da；

所述的海参糖胺聚糖是从玉足海参中提取的；

所述的重均分子量为55000Da～96000Da的解聚海参糖胺聚糖中的一种以上的制备方法，包括如下步骤：

(1)降解提取出的海参糖胺聚糖；

将海参糖胺聚糖与重量浓度为1～3％的醋酸溶液混合，其中，所述的海参糖胺聚糖的重量含量为1～2％，加入重量浓度为20～30％的双氧水，使溶液中，重量浓度20～30％的双氧水的终浓度为5～6％，55～65℃解聚20～25小时，然后将获得的溶液用氢氧化钠中和至pH为6.9～7.1，再加入3～5倍量体积(v/v)的乙醇沉淀，静置、离心得到解聚海参糖胺聚糖的粗品；

(2)将步骤(1)的解聚海参糖胺聚糖的粗品，在35～40℃下干燥至无乙醇，溶于4～6倍解聚海参糖胺聚糖的粗品重量的水中，上吸附柱，然后用0.05～0.1mol/l氯化钠水溶液洗脱3～8个柱体积，收集55000Da～96000Da分子量段的洗脱液，采用截留分子量5000Da滤膜超滤，-38～-45℃冷冻干燥，获得所述的解聚海参糖胺聚糖；

所述的吸附柱选自凝胶吸附柱。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为60000Da～92000Da。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血栓性疾病为缺血性脑卒中、阻塞性外周血管疾病或冠心病。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述血栓性疾病为缺血性脑卒中、阻塞性外周血管疾病或冠心病。

5.权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，以解聚海参糖胺聚糖计，给药剂量为0.3～4mg/kg患者体重/天。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，给药形式是静脉滴注，给药速度控制在100ml/h以内。