CN117343215B - 一种从石花菜中提取琼胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从石花菜中提取琼胶的方法，属于多糖制备技术领域，步骤如下：（1）取干石花菜，清洗，烘干，复水；（2）进行7次冻融循环；（3）将石花菜与去离子水混合，得混合液；（4）将混合液在120℃下处理45 min，得提取液；或：将混合液在800 W、120℃下超声处理45 min，得提取液；（5）提取液过滤，烘干，即得琼胶。本发明的从石花菜中提取琼胶的方法，利用冻融法提取琼胶，可明显提高琼胶的产率和凝胶强度，降低琼胶中的硫含量。本发明将冻融法与超声法相结合，可以大幅度地提高琼胶产率，降低硫酸盐含量，提高凝胶强度。
Description
技术领域
本发明涉及一种从石花菜中提取琼胶的方法，属于多糖制备技术领域。
背景技术
琼胶是一种来源于海洋红藻细胞壁的亲水性天然大分子多糖。琼胶具有优良的凝胶性、稳定性、增稠性和热可逆性，可作为食品、化妆品和医药产品的胶凝剂、稳定剂和抗冻剂。琼胶主要由琼脂糖和琼脂胶构成，其中，琼脂糖是由交替的1，3-连接的β-D-半乳糖和1，4-连接的3，6-脱水-α-L-半乳糖组成的半乳糖多聚体，主要起胶凝作用。琼脂胶与其结构相似，不同的是琼脂胶多糖链上的部分基团被硫酸酯基、甲氧基等所取代，因此，琼脂胶的凝胶性能很差。琼胶的热可逆性机理为：温度降低时，琼胶分子间作用力会逐渐增强，分子逐渐均匀分布，并且由无规卷曲的构象向双螺旋构象转变，形成聚合物。当聚合物浓度足够大时，就会形成三维网络的凝胶结构，而浓度不足则会导致局部凝胶现象。同理，温度逐渐升高时，琼胶的分子间作用力逐渐减弱，分子流动性增强，分子构象由螺旋构象向无规卷曲的构象转变，并最终由凝胶状态转变为溶液状态。琼胶的硫酸盐含量和分子量是决定其凝胶性能的关键指标。在琼胶分子中，硫酸基团的存在会使琼胶在由无规卷曲向螺旋构象转变的过程中形成结节，从而阻碍了凝胶的形成，使其的凝胶强度降低。此外，高温蒸煮是提取琼胶必不可少的一步，但高温可能会造成其分子链降解。琼胶分子量低，分子链短小也难以在形成螺旋构象的过程中形成有效的螺旋构象，造成凝胶强度变差。因此，如何降低琼胶分子中的硫酸盐含量和保护琼胶在提取过程中尽可能减少降解是提升琼胶凝胶性能的关键。
石花菜（Gelidium amansii Lamx.），是石花菜科石花菜属藻类丛生植物，又名海冻菜、红丝、凤尾，是红藻的一种。石花菜是提炼琼脂的主要原料。琼胶的提取方法主要有热水提取法、碱法、酶法等，热水提取法生态效益好，但产量低；碱法提取得到的琼胶往往具有较好的品质，但提取过程中会产生大量废水，污染环境且产率不高。酶法生产成本高，产品杂质较多。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种从石花菜中提取琼胶的方法，属于多糖制备技术领域利用本发明的方法提取的琼脂，提取率高，硫酸盐含量低，凝胶强度高。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种从石花菜中提取琼胶的方法，步骤如下：
（1）取干石花菜，清洗，烘干至恒重；置于过滤纱网中，置于去离子水中浸泡10min，使其复水；
（2）取复水后的石花菜，拧干水分，置于铺好锡纸的泡沫箱中，向石花菜上淋适量的液氮，使其完全冷冻；静置，待石花菜上的液氮完全消耗殆尽时，取出，置于25℃的去离子水中解冻；此冷冻、解冻过程为一次冻融循环，共进行7次冻融循环；
（3）7次冻融循环后，拧干水分，按照1 g石花菜添加30 ml去离子水的比例将石花菜与去离子水混合，得混合液；
（4）将混合液置于高压蒸汽灭菌锅中，在120℃下处理45 min，得提取液；或：将混合液置于超声化学反应釜中，在800 W、120℃下超声处理45 min，得提取液；
（5）提取液过滤，得滤液，60℃烘干，即得琼胶，粉碎，密封干燥保存。
本发明的从石花菜中提取琼胶的方法，利用冻融法提取琼胶，可明显提高琼胶的产率和凝胶强度，降低琼胶中的硫含量。在此基础上，本发明又将冻融法与超声法相结合，惊喜地发现，冻融法与超声法相结合起到了协同增效作用，可以大幅度地提高琼胶产率，降低硫酸盐含量，提高凝胶强度。而且，本发明的方法不产生大量废水，节能、绿色无污染。本发明的从石花菜中提取琼胶的方法，可为琼胶的绿色生产、构建环境友好的提取方法提供理论依据和指导意义。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：不同冻融循环次数对琼胶的提取率的影响，其中，采用字母标注法标注差异结果， 表示不同实验组之间的差异显著性，具相同标记字母的即为差异不显著，具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图2：不同冻融循环次数对琼胶的凝胶强度的影响，其中，采用字母标注法标注差异结果， 表示不同实验组之间的差异显著性，具相同标记字母的即为差异不显著，具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图3：不同提取温度对琼胶的提取率的影响，其中，采用字母标注法标注差异结果，表示不同实验组之间的差异显著性，具相同标记字母的即为差异不显著，具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图4：不同提取温度对琼胶的凝胶强度的影响，其中，采用字母标注法标注差异结果， 表示不同实验组之间的差异显著性，具相同标记字母的即为差异不显著，具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图5：不同提取时间对琼胶的提取率的影响，其中，采用字母标注法标注差异结果，表示不同实验组之间的差异显著性，具相同标记字母的即为差异不显著，具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图6：不同提取时间对琼胶的凝胶强度的影响，其中，采用字母标注法标注差异结果， 表示不同实验组之间的差异显著性，具相同标记字母的即为差异不显著，具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图7：不同料液比对琼胶的提取率的影响，其中，采用字母标注法标注差异结果，表示不同实验组之间的差异显著性，具相同标记字母的即为差异不显著，具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图8：不同料液比对琼胶的凝胶强度的影响，其中，采用字母标注法标注差异结果，表示不同实验组之间的差异显著性，具相同标记字母的即为差异不显著，具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图9：不同冻融循环次数时藻体横截面的电镜照片，其中，A1-A4：0次冻融循环；B1-B4：3次冻融循环；C1-C4：5次冻融循环；D1-D4：7次冻融循环；E1-E4：9次冻融循环。
图10：琼脂的元素分析检测结果示意图，其中，FA表示实验组提取的琼脂，HA表示对照组提取的琼脂。
图11：琼脂的FTIR光谱示意图，其中，FA表示实验组提取的琼脂，HA表示对照组提取的琼脂。
图12：琼胶的产率示意图，其中，热水表示热水法（实施例2）；冻融表示冻融法（实施例1）；超声表示超声法（实施例3）；冻融+超声表示冻融法和超声法的结合（实施例4）。
图13：琼胶的凝胶强度示意图，其中，热水表示热水法（实施例2）；冻融表示冻融法（实施例1）；超声表示超声法（实施例3）；冻融+超声表示冻融法和超声法的结合（实施例4）。
图14：琼胶的硫酸盐含量示意图，其中，热水表示热水法（实施例2）；冻融表示冻融法（实施例1）；超声表示超声法（实施例3）；冻融+超声表示冻融法和超声法结合（实施例4）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
本发明所采用的石花菜，为自然淡干石花菜，购自山东省青岛市农人小店。
实施例1 利用冻融法从石花菜中提取琼胶
（一）采用反复冻融法从石花菜中提取琼胶，步骤如下：
（1）取干石花菜，清洗，烘干至恒重；取3 g烘干后的石花菜，置于过滤纱网中，置于去离子水中浸泡10 min，使其复水；
（2）取复水后的石花菜，拧干水分，置于铺好锡纸的泡沫箱中，向石花菜上淋适量的液氮，使其完全冷冻；静置，待石花菜上的液氮完全消耗殆尽时，取出，置于25℃的去离子水中解冻；此冷冻、解冻过程为一次冻融循环，共进行7次冻融循环；
（3）7次冻融循环后，拧干水分，将石花菜放置于250 mL锥形瓶中，按照1 g石花菜添加30 ml去离子水的比例将石花菜与去离子水混合，得混合液；
（4）将盛有混合液的250 mL锥形瓶置于高压蒸汽灭菌锅中，在120℃下处理45min，得提取液；
（5）用200目纱网对提取液进行过滤，得滤液，将滤液置于塑料平皿上，60℃烘干，即得琼胶，粉碎，密封干燥保存。
（二）以上述提取方法为基础，考察冻融循环次数、提取温度、提取时间、料液比对琼胶的提取率和凝胶强度的影响。提取率和凝胶强度的计算方法均为常规技术，可参考文献An ecofriendly agar extraction strategy using KOH for boiling extractionand MgCl2 for alkali neutralization中的方法。
冻融循环次数对琼胶的提取率和凝胶强度的影响：将步骤（2）中的冻融循环次数分别调整为0次、3次、5次、7次、9次（0次即指跳过步骤2，直接进行步骤3），其它步骤不变。不同冻融循环次数对琼胶的提取率的影响如图1所示，不同冻融循环次数对琼胶的凝胶强度的影响如图2所示。由图可见，随着冻融循环次数的增加，琼胶的产率呈现上升趋势。未经过冻融循环处理提取得到的琼胶的产率仅为20.99%，凝胶强度为724.47g/cm²。经过7次冻融循环之后，琼胶的产量达到最大，为27.89%（p<0.05），显著高于其它组。不同冻融循环对石花菜琼胶的凝胶强度也有显著影响。经过5次或7次冻融循环后，琼胶的凝胶强度最好。但当经过9次冻融循环，琼胶的凝胶强度有所下降，可能是由于冻融循环和高温提取过程中破坏了琼胶的分子结构导致了其凝胶强度的降低。因此，综合产率和凝胶强度，选择冻融循环7次为最佳处理方案。
提取温度对琼胶的提取率和凝胶强度的影响：将步骤（4）中提取温度分别调整为105℃、110℃、115℃、120℃，其它步骤不变。不同提取温度对琼胶的提取率的影响如图3所示，不同提取温度对琼胶的凝胶强度的影响如图4所示。由图可见，在不同的温度下，琼胶的凝胶强度和产率不同，当提取温度为105℃时，琼胶的产率和凝胶强度较差。当提取温度升高至115℃时，琼胶的产率和凝胶强度有显著提高（p<0.05）。当提取温度为120℃时，琼胶的产率和凝胶强度更好。过高的温度（高于120℃）可能会破坏琼胶的结构，使琼胶品质变差。故选择120℃为最佳提取温度。
提取时间对琼胶的提取率和凝胶强度的影响：将步骤（4）中的提取时间分别调整为15 min、30 min、45 min、60 min，其它步骤不变。不同提取时间对琼胶的提取率的影响如图5所示，不同提取时间对琼胶的凝胶强度的影响如图6所示。由图可见，随着提取时间的延长，琼胶的产率和凝胶强度均表现出了先增加后减少的趋势。当提取时间为15 min时，琼胶的产率较低，凝胶强度也较差。但随着提取时间的增加，琼胶的产率增加，凝胶强度增强，这可能是经过冻融循环和高温处理后，硫酸基团被脱除造成的。但长时间的高温处理可能会导致琼胶分子链的降解，因此出现凝胶强度先增加后减少的现象。综合考虑，当提取时间为45 min时，琼胶的产率和凝胶强度最好，为最佳提取时间。
料液比对琼胶的提取率和凝胶强度的影响：将步骤（3）中的料液比分别调整为1:10、1:20、1:30、1:40，其它步骤不变。不同料液比对琼胶的提取率的影响如图7所示，不同料液比对琼胶的凝胶强度的影响如图8所示。由图可见，当料液比为1:10时，琼胶的产率为19%，凝胶强度为790 g/cm²。而随着料液比的增加，琼胶产量逐渐增加，当料液比为1:30时，琼胶的产率最高。琼胶产率的差异可能是由于当料液比过低时，石花菜中的琼胶不能完全溶解，而当料液比过高时，琼胶分子分散在更多的水中，琼胶溶液被稀释，进而在脱水过程中发生损失。因此，综合考虑琼胶产率和凝胶强度，选择1:30为最佳料液比。
通过上述考察，最佳的提取参数是：冻融循环次数为7次，提取温度120℃，提取时间45 min，料液比为1:30。
考察不同冻融循环次数对石花菜结构的破坏作用，不同冻融循环次数时藻体横截面的电镜照片如图9所示。冻融预处理之后，藻体横截面特征表现出了差异。结果表明，未经过冻融循环处理的石花菜藻体紧密、略有细细的裂纹（A1、A2），且裂缝间隙比较平滑（A3、A4）。而经过冻融循环预处理之后，藻体裂纹加深，裂缝间隙也逐渐粗糙，甚至出现裂缝周边出现细小裂纹。经过3次冻融循环预处理时，藻体横截面逐渐出现更多小裂缝，表面也逐渐变得疏松（B1、B2），并且裂缝间隙也变得略微粗糙（B3、B4）。当冻融循环进行到第五次时，藻体表现出了深深的裂痕，并且藻体变得更加疏松多孔（C1、C2），裂缝间隙明显更加粗糙（C3、C4）。在经历7次和9次冻融循环之后，藻体横截面的裂缝更深，疏松多孔现象更加明显 （D2、E2），甚至在裂缝周边也出现了细小的裂纹。
（三）将（一）中的提取参数替换为最佳的提取参数（冻融循环次数为7次，提取温度120℃，提取时间45 min，料液比为1:30），提取琼胶（称为实验组）；以不进行冻融为对照（即冻融循环次数为0次，提取温度120℃，提取时间45 min，料液比为1:30），提取琼胶。
对提取的琼胶进行元素分析和FT-IR光谱分析，结果如图10、图11所示。由图可见，对照组提取的琼脂和实验组提取的琼胶的C元素含量相差无几，分别为40.2%和40%，而H元素却有着明显差异，这可能是由于冻融循环过程中破坏了分子间和分子内氢键导致的，这与FT-IR光谱的检测结果基本一致。此外，N元素也有着明显的差异，可能预示着对照组提取的琼胶含有更多的蛋白质杂质。硫酸盐的含量是决定琼胶品质的关键指标之一，从结果上看，实验组提取的琼胶含有更少的S元素。
实施例2 利用热水法从石花菜中提取琼胶
采用常规的热水法提取琼胶，步骤如下：
（1）取干石花菜，清洗，烘干至恒重；取3 g烘干后的石花菜，置于过滤纱网中，置于去离子水中浸泡10 min，使其复水；
（2）取复水后的石花菜，拧干水分，置于250 mL锥形瓶中，按照1 g石花菜添加30ml去离子水的比例将石花菜与去离子水混合，得混合液；
（3）将盛有混合液的250 mL锥形瓶置于高压蒸汽灭菌锅中，在120℃下处理45min，得提取液；
（4）用200目纱网对提取液进行过滤，得滤液，将滤液置于塑料平皿上，60℃烘干，即得琼胶，粉碎，密封干燥保存。
实施例3 利用超声法从石花菜中提取琼胶
采用常规的超声提取法提取琼胶，步骤如下：
（1）取干石花菜，清洗，烘干至恒重；取3 g烘干后的石花菜，置于过滤纱网中，置于去离子水中浸泡10 min，使其复水；
（2）取复水后的石花菜，拧干水分，置于250 mL锥形瓶中，按照1 g石花菜添加30ml去离子水的比例将石花菜与去离子水混合，得混合液；
（3）将盛有混合液的250 mL锥形瓶置于超声化学反应釜中，在800 W、120℃下超声处理45 min，得提取液；
（4）用200目纱网对提取液进行过滤，得滤液，将滤液置于塑料平皿上，60℃烘干，即得琼胶，粉碎，密封干燥保存。
实施例4 利用冻融法和超声法从石花菜中提取琼胶
实施例1的研究表明，反复冻融提取琼胶，可提高产率、凝胶强度。为探索出更优的提取方法，申请人尝试将冻融法与超声法相结合提取琼胶，步骤如下：
（1）取干石花菜，清洗，烘干至恒重；取3 g烘干后的石花菜，置于过滤纱网中，置于去离子水中浸泡10 min，使其复水；
（2）取复水后的石花菜，拧干水分，置于铺好锡纸的泡沫箱中，向石花菜上淋适量的液氮，使其完全冷冻；静置，待石花菜上的液氮完全消耗殆尽时，取出，置于25℃的去离子水中解冻；此冷冻、解冻过程为一次冻融循环，共进行7次冻融循环；
（3）7次冻融循环后，拧干水分，将石花菜放置于250 mL锥形瓶中，按照1 g石花菜添加30 ml去离子水的比例将石花菜与去离子水混合，得混合液；
（4）将盛有混合液的250 mL锥形瓶置于超声化学反应釜中，在800 W、120℃下超声处理45 min，得提取液；
（5）用200目纱网对提取液进行过滤，得滤液，将滤液置于塑料平皿上，60℃烘干，即得琼胶，粉碎，密封干燥保存。
实验1 琼胶的性能检测
按照实施例1（三）最佳的提取参数提取的琼胶，以及实施例2、实施例3、实施例4提取的琼胶，检测其产率、硫酸盐含量（检测方法为常规技术，可参考文献Preparation,characterization, and modification mechanism of agar treated with hydrogenperoxide at different temperatures中的方法）、凝胶强度，结果如图12、13、14所示。
由图12可见，热水法、冻融法以及超声法的产率分别为20.99%、41.67%、21.11%，而冻融法和超声法结合提取的产率达到了44.99%，差异显著。说明冻融法和超声法结合对细胞结构的破坏更有效，更有利于琼胶溶出，从而提高了琼胶产率。
由图13可见，热水法提取的琼胶硫酸盐含量为1.77%。冻融法提取的琼胶硫酸盐的含量为1.41%，脱硫效率为20.3%，说明冻融处理有脱硫作用（发明人推测，可能是冻融处理促进琼胶分子的物理缠绕，减少其在高温提取过程中的降解，同时脱除了部分硫酸基团）。超声法提取的琼胶硫酸盐的含量为1.55%，脱硫效率为12.4%，说明超声提取有轻微的脱硫作用（发明人推测，可能是超声的空化作用能够帮助琼胶分子更好的脱掉硫酸基团）。冻融法和超声法结合提取的琼胶硫酸盐的含量低至0.82%，脱硫效率高达53.6%，说明冻融法和超声法结合有极为显著的脱硫作用，冻融法与超声法起到了协同增效作用。
由图14可见，热水法提取的琼胶凝胶强度为691 g/cm²。冻融法提取的琼胶凝胶强度为1079 g/cm²，较热水法的凝胶强度提高了56%。超声法提取的琼胶凝胶强度为826 g/cm²，较热水法的凝胶强度提高了20%。而冻融法和超声法结合提取得到的凝胶强度达到了1730 g/cm²，较热水法的凝胶强度提高157%，较冻融法的凝胶强度提高了60%，较超声法的凝胶强度提高了109%。说明冻融法、超声法提取琼胶都有提高凝胶强度的作用，而冻融法和超声法结合有更为显著的提高凝胶强度的作用（发明人推测，这可能与更低的硫酸盐含量有关），冻融法与超声法起到了协同增效作用，提取得到的琼胶的凝胶强度远大于单一冻融法或单一超声法提取得到的琼胶。
完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (1)
1.一种从石花菜中提取琼胶的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）取干石花菜，清洗，烘干至恒重；置于过滤纱网中，置于去离子水中浸泡10 min，使其复水；
（2）取复水后的石花菜，拧干水分，置于铺好锡纸的泡沫箱中，向石花菜上淋液氮，使其完全冷冻；静置，待石花菜上的液氮完全消耗殆尽时，取出，置于25℃的去离子水中解冻；此冷冻、解冻过程为一次冻融循环，共进行7次冻融循环；
（3）7次冻融循环后，拧干水分，按照1 g石花菜添加30 ml去离子水的比例将石花菜与去离子水混合，得混合液；
（4）将混合液置于超声化学反应釜中，在800 W、120℃下超声处理45 min，得提取液；
（5）提取液过滤，得滤液，烘干，即得琼胶。
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