CN109762054A - 一种螺旋藻中小分子肽的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及小分子肽提取领域，特别涉及一种螺旋藻中小分子肽的提取方法，包括：破壁、提取、纯化步骤；特别是所述破壁是将螺旋藻真空冷冻至温度为零下20‑零下10℃后，将螺旋藻与硝石、酵母硒按照1:(0.1‑0.3):(0.04‑0.07)的质量比混合研磨至过50‑80目筛，本发明具有得率高、提取时间短、不易失活、纯度高、生物活性优、提取效率高、成本低、操作工艺简单特点。
Description
技术领域
本发明涉及小分子肽提取领域，特别涉及一种螺旋藻中小分子肽的提取方法。
背景技术
螺旋藻属于蓝细菌，是一种丝状多细胞螺旋体的原核藻类生物，具有很高的营养价值，其蛋白质含量高达60-70％，是目前已知食物中最高的，而且含有丰富的氨基酸、维生素、脂肪、类胡萝卜素、多糖以及空物质，安全无毒，具有广阔的开发前景和价值。
生物活性肽是由氨基酸组成的具有生物活性的肽类化合物。小分子的活性肽不仅能够提供基体生长发育所需的营养物质，还具有增强免疫力、抑制细菌、抗氧化等功能。与游离氨基酸和蛋白质相比，肽能够更好、更快地被基体吸收。目前关于螺旋藻制备活性肽的研究较少。如专利号CN201210375126.8提供了一种提取螺旋藻小分子肽的方法，将螺旋藻进行预处理，调整料液比为0.5～8g/L，pH值为5-10，充分混合后进行泡沫分离，泡沫分离螺旋藻得到的泡沫提取液是分子量为5000Da的小分子生物活性肽。该方法获得螺旋藻蛋白的溶解率仅达12.6％，富集比达4.4，其在产率和纯度方面仍不理想；且在柱层析中难以得到高纯度产物，操作较为繁琐、费时间；并且采用传统破壁方法，提取时间长、效率低、且易变性。
发明内容
本发明为了现有技术问题，提供了一种螺旋藻中小分子肽的提取方法。
具体通过以下技术方案实现：
一种螺旋藻中小分子肽的提取方法，包括：破壁、提取、纯化步骤；特别是所述破壁是将螺旋藻真空冷冻至温度为零下20-零下10℃后，将螺旋藻与硝石、酵母硒按照1:(0.1-0.3):(0.04-0.07)的质量比混合研磨至过50-80目筛。
所述提取的方法为：向破壁所得破壁物中加入螺旋藻质量2-2.5倍的磁化去离子水，先用脉冲电场处理，再混合搅拌10-15min。
所述磁化去离子水是将去离子水用强力磁化机进行磁化，在强度为500-650T的磁场下磁化5-7s。
所述脉冲电场的工作条件为：场强25-45kV/cm，频率1-3kHz，脉宽为5-10微秒，脉冲处理个数为15-20。
所述纯化的方法为：
(1)将提取液以10-20mL/min的流速，通过吸附填料进行脱色纯化后洗脱，收集洗脱液；
(2)将洗脱液用中空纤维膜进行超滤。
所述吸附填料为硅胶、氧化铝、改性鸡蛋壳按质量比为1：(0.3-0.6)：(0.05-0.07)。
所述改性鸡蛋壳是将鸡蛋壳研磨至过100目筛后，然后加入羟丙基甲基纤维素钠进行改性；羟丙基甲基纤维素钠的用量为鸡蛋壳质量5-8％。
所述洗脱是用浓度为0.01-0.03mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱。
所述中空纤维膜的截留分子量为100-200KDa。
有益效果：
本发明具有得率高、提取时间短、不易失活、纯度高、生物活性优、提取效率高、成本低、操作工艺简单特点，具体表现在以下几个方面：
(1)利用真空冷冻技术防止了小分子肽变性和损失，保障了有效成分含量和活性，进而有助于有效成分的提取和再利用，并且利用冷冻中晶粒和晶体结构变化，有助于细胞破碎；再进一步结合硝石、酵母硒对细胞浓度改变，以及研磨过程中摩擦热的情况，使得螺旋藻细胞壁得以迅速、充分涨破，进而克服了传统方法周期长、成本高、易损失的缺点；利用酵母硒和硝石，达到了快速、充分破碎细胞，并且防止了有效成分被氧化以及提高了小分子肽活性，使得小分子肽长期储存下不易失活；
(2)在提取过程中利用脉冲电场配合磁化去离子水，有助于小分子肽的溶解，并且确保小分子肽的活性，改善小分子的质量稳定性，同时还具有杀菌作用和缩短提取周期的效果，防止微生物对有效成分含量、活性的改变；
(3)在纯化过程中利用硅胶、氧化铝、改性鸡蛋壳作为吸附材料，具有吸附容量高、稳定性好、价格低廉的特点，不仅降低了纯化成本，还提高了小分子肽与其他成分的分离程度，同时保证了小分子肽的稳定性。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种螺旋藻中小分子肽的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将螺旋藻真空冷冻至温度为零下10℃后，将螺旋藻与硝石、酵母硒按照1:0.3:0.07的质量比混合研磨至过80目筛；
(2)提取：向破壁所得破壁物中加入螺旋藻质量2.5倍的磁化去离子水，先用脉冲电场处理，再混合搅拌15min，得提取液；其中，脉冲电场的工作条件为：场强45kV/cm，频率3kHz，脉宽为10微秒，脉冲处理个数为20；
(3)纯化：将提取液以20mL/min的流速，通过吸附填料进行脱色纯化，用浓度为0.03mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱液，再将洗脱液用截留分子量为200KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述磁化去离子水是将去离子水用强力磁化机进行磁化，在强度为650T的磁场下磁化7s；
所述吸附填料为硅胶、氧化铝、改性鸡蛋壳按质量比为1：0.6：0.07；
所述改性鸡蛋壳是将鸡蛋壳研磨至过100目筛后，然后加入羟丙基甲基纤维素钠进行改性；羟丙基甲基纤维素钠的用量为鸡蛋壳质量8％。
实施例2
一种螺旋藻中小分子肽的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将螺旋藻真空冷冻至温度为零下20℃后，将螺旋藻与硝石、酵母硒按照1:0.1:0.04的质量比混合研磨至过50目筛；
(2)提取：向破壁所得破壁物中加入螺旋藻质量2倍的磁化去离子水，先用脉冲电场处理，再混合搅拌10min，得提取液；其中，脉冲电场的工作条件为：场强25kV/cm，频率1kHz，脉宽为5微秒，脉冲处理个数为15；·进行脱色纯化，用浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱液，再将洗脱液用截留分子量为100KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述磁化去离子水是将去离子水用强力磁化机进行磁化，在强度为500T的磁场下磁化5s；
所述吸附填料为硅胶、氧化铝、改性鸡蛋壳按质量比为1：0.3：0.05；
所述改性鸡蛋壳是将鸡蛋壳研磨至过100目筛后，然后加入羟丙基甲基纤维素钠进行改性；羟丙基甲基纤维素钠的用量为鸡蛋壳质量5％。
实施例3
一种螺旋藻中小分子肽的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将螺旋藻真空冷冻至温度为零下15℃后，将螺旋藻与硝石、酵母硒按照1:0.2:0.05的质量比混合研磨至过75目筛；
(2)提取：向破壁所得破壁物中加入螺旋藻质量2.3倍的磁化去离子水，先用脉冲电场处理，再混合搅拌12min，得提取液；其中，脉冲电场的工作条件为：场强35kV/cm，频率2kHz，脉宽为8微秒，脉冲处理个数为16；
(3)纯化：将提取液以15mL/min的流速，通过吸附填料进行脱色纯化，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱液，再将洗脱液用截留分子量为150KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述磁化去离子水是将去离子水用强力磁化机进行磁化，在强度为580T的磁场下磁化6s；
所述吸附填料为硅胶、氧化铝、改性鸡蛋壳按质量比为1：0.5：0.06；
所述改性鸡蛋壳是将鸡蛋壳研磨至过100目筛后，然后加入羟丙基甲基纤维素钠进行改性；羟丙基甲基纤维素钠的用量为鸡蛋壳质量6％。
实施例4
一种螺旋藻中小分子肽的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将螺旋藻真空冷冻至温度为零下15℃后，将螺旋藻与硝石、酵母硒按照1:0.2:0.05的质量比混合研磨至过75目筛；
(2)提取：向破壁所得破壁物中加入螺旋藻质量2.3倍的磁化去离子水，先用脉冲电场处理，再混合搅拌12min，得提取液；其中，脉冲电场的工作条件为：场强35kV/cm，频率2kHz，脉宽为8微秒，脉冲处理个数为16；
(3)纯化：将提取液以15mL/min的流速，通过吸附填料进行脱色纯化，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱液，再将洗脱液用截留分子量为150KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述磁化去离子水是将去离子水用强力磁化机进行磁化，在强度为580T的磁场下磁化6s；
所述吸附填料为硅胶、氧化铝、改性鸡蛋壳按质量比为1：0.4：0.05；
所述改性鸡蛋壳是将鸡蛋壳研磨至过100目筛后，然后加入羟丙基甲基纤维素钠进行改性；羟丙基甲基纤维素钠的用量为鸡蛋壳质量7％。
对比例1
一种螺旋藻中小分子肽的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将螺旋藻真空冷冻至温度为零下15℃后，将螺旋藻与硝石、酵母硒按照1:0.2:0.05的质量比混合研磨至过75目筛；
(2)提取：向破壁所得破壁物中加入螺旋藻质量2.3倍的去离子水，先用脉冲电场处理，再混合搅拌12min，得提取液；其中，脉冲电场的工作条件为：场强35kV/cm，频率2kHz，脉宽为8微秒，脉冲处理个数为16；
(3)纯化：将提取液以15mL/min的流速，通过吸附填料进行脱色纯化，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱液，再将洗脱液用截留分子量为150KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述磁化去离子水是将去离子水用强力磁化机进行磁化，在强度为580T的磁场下磁化6s；
所述吸附填料为硅胶、氧化铝、改性鸡蛋壳按质量比为1：0.5：0.06；
所述改性鸡蛋壳是将鸡蛋壳研磨至过100目筛后，然后加入羟丙基甲基纤维素钠进行改性；羟丙基甲基纤维素钠的用量为鸡蛋壳质量6％。
对比例2
一种螺旋藻中小分子肽的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将螺旋藻真空冷冻至温度为零下15℃后，将螺旋藻与硝石、酵母硒按照1:0.2:0.05的质量比混合研磨至过75目筛；
(2)提取：向破壁所得破壁物中加入螺旋藻质量2.3倍的磁化去离子水混合搅拌12min，得提取液；
(3)纯化：将提取液以15mL/min的流速，通过吸附填料进行脱色纯化，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱液，再将洗脱液用截留分子量为150KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述磁化去离子水是将去离子水用强力磁化机进行磁化，在强度为580T的磁场下磁化6s；
所述吸附填料为硅胶、氧化铝、改性鸡蛋壳按质量比为1：0.5：0.06；
所述改性鸡蛋壳是将鸡蛋壳研磨至过100目筛后，然后加入羟丙基甲基纤维素钠进行改性；羟丙基甲基纤维素钠的用量为鸡蛋壳质量6％。
对比例3
一种螺旋藻中小分子肽的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将螺旋藻真空冷冻至温度为零下15℃后，将螺旋藻与硝石按照1:0.2:0.05的质量比混合研磨至过75目筛；
(2)提取：向破壁所得破壁物中加入螺旋藻质量2.3倍的磁化去离子水，先用脉冲电场处理，再混合搅拌12min，得提取液；其中，脉冲电场的工作条件为：场强35kV/cm，频率2kHz，脉宽为8微秒，脉冲处理个数为16；
(3)纯化：将提取液以15mL/min的流速，通过吸附填料进行脱色纯化，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱液，再将洗脱液用截留分子量为150KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述磁化去离子水是将去离子水用强力磁化机进行磁化，在强度为580T的磁场下磁化6s；
所述吸附填料为硅胶、氧化铝、改性鸡蛋壳按质量比为1：0.5：0.06；
所述改性鸡蛋壳是将鸡蛋壳研磨至过100目筛后，然后加入羟丙基甲基纤维素钠进行改性；羟丙基甲基纤维素钠的用量为鸡蛋壳质量6％。
对比例4
一种螺旋藻中小分子肽的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将螺旋藻真空冷冻至温度为零下15℃后，将螺旋藻与硝石、酵母硒按照1:0.2:0.05的质量比混合研磨至过75目筛；
(2)提取：向破壁所得破壁物中加入螺旋藻质量2.3倍的磁化去离子水，先用脉冲电场处理，再混合搅拌12min，得提取液；其中，脉冲电场的工作条件为：场强35kV/cm，频率2kHz，脉宽为8微秒，脉冲处理个数为16；
(3)纯化：将提取液以15mL/min的流速，通过吸附填料进行脱色纯化，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱液，再将洗脱液用截留分子量为150KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述磁化去离子水是将去离子水用强力磁化机进行磁化，在强度为580T的磁场下磁化6s；
所述吸附填料为硅胶、氧化铝按质量比为1：0.5。
试验例1
使用考马斯亮蓝法测定小分子肽得率，结果如表1所示：
表1
试验例2
对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
分别取各组实施例和对比例的小分子肽样品0.1g，溶于10mL物质的量浓度的0.02mol/L的氯化钾溶液中，直至沉淀完全溶解，同时设置10mL物质的量浓度的0.02mol/L的氯化钾溶液为空白对照组；
将浓度为106cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌体的液体用生理盐水稀释至105cfu/mL，用移液枪吸取100μL放于准备好的50mL的三角瓶中，然后加入小分子肽溶液，以无菌水代替小分子肽溶液作为空白。缓慢摇匀后，放于37℃大容量恒温振动器中培养6h。将培养后的液体用可见分光光度计于280nm下测吸光度，根据空白对照组的吸光度来判断抑菌效果，结果如表2所示：
表2
Claims (9)
1.一种螺旋藻中小分子肽的提取方法，包括：破壁、提取、纯化步骤；其特征在于，所述破壁是将螺旋藻真空冷冻至温度为零下20-零下10℃后，将螺旋藻与硝石、酵母硒按照1:(0.1-0.3):(0.04-0.07)的质量比混合研磨至过50-80目筛。
2.如权利要求1螺旋藻中小分子肽的提取方法，其特征在于，所述提取的方法为：向破壁所得破壁物中加入螺旋藻质量2-2.5倍的磁化去离子水，先用脉冲电场处理，再混合搅拌10-15min。
3.如权利要求2螺旋藻中小分子肽的提取方法，其特征在于，所述磁化去离子水是将去离子水用强力磁化机进行磁化，在强度为500-650T的磁场下磁化5-7s。
4.如权利要求2螺旋藻中小分子肽的提取方法，其特征在于，所述脉冲电场的工作条件为：场强25-45kV/cm，频率1-3kHz，脉宽为5-10微秒，脉冲处理个数为15-20。
5.如权利要求1螺旋藻中小分子肽的提取方法，其特征在于，所述纯化的方法为：
(1)将提取液以10-20mL/min的流速，通过吸附填料进行脱色纯化后洗脱，收集洗脱液；
(2)将洗脱液用中空纤维膜进行超滤。
6.如权利要求5螺旋藻中小分子肽的提取方法，其特征在于，所述吸附填料为硅胶、氧化铝、改性鸡蛋壳按质量比为1：(0.3-0.6)：(0.05-0.07)。
7.如权利要求5螺旋藻中小分子肽的提取方法，其特征在于，所述改性鸡蛋壳是将鸡蛋壳研磨至过100目筛后，然后加入羟丙基甲基纤维素钠进行改性；羟丙基甲基纤维素钠的用量为鸡蛋壳质量5-8％。
8.如权利要求5螺旋藻中小分子肽的提取方法，其特征在于，所述洗脱是用浓度为0.01-0.03mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱。
9.如权利要求5螺旋藻中小分子肽的提取方法，其特征在于，所述中空纤维膜的截留分子量为100-200KDa。
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