CN112481323A - 一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法 - Google Patents

一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，包括如下步骤：(1)壶瓶碎米荠提取物的制备，(2)壶瓶碎米荠提取物的脱色，(3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化，(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解，(5)水解蛋白纯化与冻干。本发明的从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法可以明显改善壶瓶碎米荠提取物色泽及纯度，本发明的方法先进、科学、操作方便，壶瓶碎米中的硒蛋氨酸具有较好的抗氧化活性，可以实现在制备具有抗氧化、抗衰老作用保健品的应用中，为壶瓶碎米荠的市场应用提供了有利的技术手段和使用价值，经济社会效益巨大。

Description

一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法
技术领域
本发明涉及植物提取物技术领域，尤其涉及一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法。
背景技术
壶瓶碎米荠是一种富硒能力极强的十字花科植物，壶瓶碎米荠经过培育含硒量可达1000mg/kg以上，其中有机硒含量约占 93.30％，做为补硒保健产品的添加成分具有安全性高、吸收好的特点， 有很大的应用空间。
目前壶瓶碎米荠水提喷雾干燥产物为深棕褐色，其应用的范围受到限制，因此，必须该提取物进行脱色。经过活性炭脱色的提取液，颜色状态好，为后续的硒蛋氨酸的提纯提供了有利的条件。终产物硒蛋氨酸经C18反相色谱柱纯化后，产物纯度高，收率好。
发明内容
在本发明提供了一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法。
本发明采用如下技术方案：
本发明的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法的具体步骤如下：
(1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡60-120min，料液比为1:10-50，然后开始加热，在50-90 ℃下超声提取40-80min，超声频率40Hz,待滤液温度降低至40-50℃，然后进行过滤，滤液调节pH至3-8，加入一定比例的乳酸菌进行发酵，发酵时间3h-6h，过滤减压低温干燥，得到壶瓶碎米荠粗蛋白粉末；
(2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为5-15:200-800g/ml，加入0.5-2%的活性炭，500-2000r/min速度搅拌10-30分钟，然后过滤调壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置10-15h，然后在2-6℃，5000-7000r/min下离心8-12min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
(3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，使用Sephadex G-50、75、100、150凝胶柱层析中的一种或多种和DEAE-FF阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化所含的初级蛋白。
(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用C18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。
步骤(1)中，优选干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过80目筛。
步骤(1)中，优选往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡60min， 料液比为1:40。
步骤(1)中，优选在80℃下超声提取60min。
步骤(1)中，优选进行100目过滤，滤液进行减压低温干燥。
步骤(2)中，优选壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为15:350g/ml。
步骤(2)中，用硫酸铵调节壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点(pH＝5.3)，静置10h，然后在3℃，5000r/min下离心8min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白。
步骤(3)中，优选Sephadex G-75分级条件为：26mm×780mm层析 柱，用缓冲液洗脱，上样浓度200mg/mL，上样体积3mL，泵流速 5BV/min，洗脱的溶液用部分收集器分步收集，每管收集2.0mL，将同一组分收集合并，进行透析36h后，浓缩冷冻干燥，将得到的硒含量高的组分作为进一步纯化样品上纤维素DEAE-FF柱。
步骤(3)中，DEAE-FF分级条件为：以0-1mol/L NaCl梯度洗脱，上样浓度10 mg/mL，上样体积3mL，泵流速5 BV/min，每管收集 1.5mL，将同一组分收集合并，得到蛋白分离组分，透析36h，浓缩冷冻干燥，得到初级硒蛋白。
(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用C18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。
本发明的积极效果如下：
(1)终产物硒蛋氨酸纯度高，色泽好。
(2)纯化步骤少，产物抗氧化性好。
(3)提取和纯化过程中，几乎没有环境污染。
附图说明
图1为硒蛋白酶解产物光谱图。
图2为冻干后硒蛋氨酸光谱图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例1
(1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡80min，料液比为1:23，然后开始加热，在60 ℃下超声提取40min，超声频率40Hz,待滤液温度降低至40℃，然后进行过滤，滤液调节pH至6.5，加入一定比例的乳酸菌进行发酵，发酵时间4.3h，过滤减压低温干燥，得到壶瓶碎米荠粗蛋白粉末；
(2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为10:300-g/ml，加入0.5%的活性炭，1300r/min速度搅拌17分钟，然后过滤调壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置13h，然后在4℃，5500r/min下离心10min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
(3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，使用Sephadex G-50凝胶柱层析和DEAE-FF阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化所含的初级蛋白。
(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用C18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。
实施例2
(1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡60min，料液比为1:30，然后开始加热，在75 ℃下超声提取60min，超声频率40Hz,待滤液温度降低至45℃，然后进行过滤，滤液调节pH至5.3，加入一定比例的乳酸菌进行发酵，发酵时间4h，过滤减压低温干燥，得到壶瓶碎米荠粗蛋白粉末；
(2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为13:500g/ml，加入1.5%的活性炭，900r/min速度搅拌15分钟，然后过滤调壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置12h，然后在3℃，6500r/min下离心9min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
(3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，使用Sephadex G-75凝胶柱层析和DEAE-FF阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化所含的初级蛋白。
(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用C18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。
实施例3
(1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡100min，料液比为1:16，然后开始加热，在75 ℃下超声提取55min，超声频率40Hz,待滤液温度降低至45℃，然后进行过滤，滤液调节pH至5.2，加入一定比例的乳酸菌进行发酵，发酵时间4h，过滤减压低温干燥，得到壶瓶碎米荠粗蛋白粉末；
(2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为11:650g/ml，加入0.8%的活性炭，900r/min速度搅拌25分钟，然后过滤调壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置13h，然后在4℃，5900r/min下离心11min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
(3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，使用Sephadex G-150凝胶柱层析中的一种或多种和DEAE-FF阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化所含的初级蛋白。
(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用C18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。

Claims (11)

1.一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于： 所述方法的具体步骤如下：
(1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡60-120min，料液比为1:10-50，然后开始加热，在50-90 ℃下超声提取40-80min，超声频率40Hz,待滤液温度降低至40-50℃，然后进行过滤，滤液调节pH至3-8，加入一定比例的乳酸菌进行发酵，发酵时间3h-6h，过滤减压低温干燥，得到壶瓶碎米荠粗蛋白粉末；
(2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为5-15:200-800g/ml，加入0.5-2%的活性炭，500-2000r/min速度搅拌10-30分钟，然后过滤调壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置10-15h，然后在2-6℃，5000-7000r/min下离心8-12min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
(3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，使用Sephadex G-50、75、100、150凝胶柱层析中的一种或多种和DEAE-FF阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化所含的初级蛋白。
2.(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用C18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
3.(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。
4.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过20-80目筛。
5.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡60-120min， 料液比为1:10-50。
6.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，在50-90 ℃下超声提取40-80min。
7.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，进行100目过滤，滤液进行减压低温干燥。
8.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为5-15:200-800g/ml。
9.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，用氯化铵调节壶瓶碎米荠提取物溶液pH 值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置10-15h，然后在2-6℃，5000-7000r/min下离心8-12min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白。
10.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，Sephadex G-50、75、100、150凝胶柱层析中的一种或多种，分级条件为：26mm×780mm层析柱，用缓冲液洗脱，上样浓度200mg/mL，上样体积2-5mL，泵流速5BV/min，洗脱的溶液用部分收集器分步收集，每管收集2.0mL，将 同一组分收集合并，进行透析24-48h后，浓缩冷冻干燥，将得到的硒含量高的组分作为进一步纯化样品上纤维素DEAE-FF柱。
11.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，DEAE-FF分级条件为：以0-1mol/L NaCl 梯度洗脱，上样浓度10mg/mL，上样体积2-5mL，泵流速5BV/min，每管收集1.5mL，将同一组分收集合并，得到蛋白分离组分，透析24-48h，浓缩冷冻干燥，得到初级硒蛋白。
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