CN115925795B - 一种高抗氧化活性富硒肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质技术领域，涉及一种高抗氧化活性富硒肽及其制备方法和应用，该活性肽的氨基酸序列为SELRSPKC(SeC)，分子量为976.487Da。该富硒肽通过氢键、疏水作用、盐桥三种形式和Keap1蛋白上氨基酸残基相互结合，二者可以自发稳定结合，使Nrf2从Keap1上释放并转移至细胞核，提升细胞内GSH系统和抗氧化能力从而缓解氧氧化损伤。本发明还提供了该富硒肽的制备方法及其应用。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质技术领域，尤其涉及一种高抗氧化活性富硒肽及其制备方法和应用。
背景技术
过度的氧化损伤会破坏机体代谢平衡，造成严重的氧化损伤，从而导致疾病的发生。研究发现，高温会对线粒体膜完整性以及电子传递链产生不利影响，从而诱导ROS的产生。ROS会破坏细胞膜，使内毒素和病原体泄漏到血液循环中，造成全身性的氧化应激和炎症反应。同时，产生的ROS和一系列炎性因子会破坏脂质，蛋白质等生物大分子，损伤细胞结构，还会造成组织坏死。细胞氧化衰老可以通过提前补充抗氧化剂来预防。
硒是机体所必需的微量元素，是硒酶GSH-Px的关键组分。GSH-Px在细胞质和线粒体中表达，可以增强机体的抗氧化能力，保护细胞的结构和功能。硒以无机和有机形式存在。无机形式主要包括硒酸盐和亚硒酸盐，有机形式主要包括硒氨基酸、硒肽和硒蛋白。硒具有解毒，抗氧化，增强免疫等多种生物功能，其摄入量不足已被证明与人类许多疾病有关。综合生物利用度和毒性来看，有机形式的硒比无机形式的硒更能满足人类的膳食需求。
大豆蛋白由于营养价值高深受消费者热爱，市场上出现了大量的大豆产品，其功能成分也逐渐成为研究的热点。更重要的是大豆具有很强的富硒能力，大豆富集的硒75％以上与蛋白结合，其中多达82％的硒是以SeCys和SeMet为主的高分子量形态存在。另一方面大豆蛋白的硒生物利用度可高达86-96％。国内外学者研究发现大豆蛋白及其酶解后得到的肽具有抗氧化，抑制炎症等生物活性。因此，用大豆肽作为新的硒载体以解决缺硒和硒毒性相关的潜在问题具有较大的实际应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高抗氧化活性的富硒肽，其制备方法、组合物和应用，该富硒肽可以有效提升细胞抗氧化能力，缓解氧化损伤。
本发明的目的及其技术问题的解决，可以通过以下技术方案来实现。
一方面，本发明提供了一种高抗氧化活性富硒肽，该富硒肽的氨基酸序列为Ser-Glu-Leu-Arg-Ser-Pro-Lys-SeCys，或者以SELRSPKC(SeC)表示，分子量为976.487Da。
在本发明的实施方案中，该高抗氧化活性富硒肽够通过氢键、疏水作用、盐桥这三种形式与Keap1蛋白上的以下氨基酸残基相互作用：HIS552、ARG553、THR576、LEU578、ASP579、GLU593和ARG596，时限与Keap1 Kelch结构域自发稳定结合。这种结合影响Keap1和Nrf2的结合，从而引发Nrf2信号通路的激活，进而提高GST、GCL和GSH-Px活力，最终提高GSH含量，缓解氧化损伤。
在本发明的实施方案中，该高抗氧化活性富硒肽中的亮氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸在提升抗氧化能力方面起重要作用，并且精氨酸被认为是抵抗氧化损伤的关键氨基酸。
另一方面，本发明提供了制备上述高抗氧化活性富硒肽的方法，包括以下步骤：
1)将富硒大豆清洗、烘干、粉碎、过筛，得到富硒大豆粉；
2)采用碱提酸沉法提取所述富硒大豆粉中的富硒大豆蛋白；
3)将所述富硒大豆蛋白用复合酶进行酶解，得到富硒大豆蛋白酶解产物；
4)采用不同分子量的超滤膜分离所述富硒大豆蛋白酶解产物，收集分离的各组分；
5)对步骤4)中分子量<3000Da的组分进行凝胶色谱分离并测定各组分对Caco-2细胞抗氧化能力的影响，得到对Caco-2细胞抗氧化能力提升最强的组分，即Ser-Glu-Leu-Arg-Ser-Pro-Lys-SeCys。
在本发明的实施方案中，在步骤1)中，可以通过例如过80目筛得到富硒大豆粉。
在本发明的实施方案中，碱提酸沉法是本领域技术人员众所周知的。在本发明的具体实施方案中，步骤2)可以包括：用有机溶剂例如正己烷浸提富硒大豆粉，得到脱脂富硒大豆粉；将脱脂富硒大豆粉用纯水复溶，用碱例如NaOH调节pH至8进行提取、离心，并收集上清液；将上清液用酸例如盐酸调节pH至4.5，离心并收集沉淀；将沉淀用纯水复溶，再用酸例如盐酸和碱例如NaOH调节pH至中性，用透析膜透析，将透析后样品冷冻干燥，得到富硒大豆蛋白。
在本发明的实施方案中，步骤3)中的复合酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶的混合物，其重量比为2:1:1～2:1:3。在本发明的实施方案中，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶分别来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、菠萝(Ananas spp.)。在本发明的具体实施方案中，复合酶中碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶在本发明的具体实施方案中，复合酶中碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的重量比可以为2:1:1、2:1:1.5、2:1:2、2:1:2.5、2:1:3，优选2:1:2。
在本发明的实施方案中，复合酶的添加量按质量计为富硒大豆蛋白的0.1-0.4％。在具体实施方案中，复合酶的添加量按质量计可以为富硒大豆蛋白的0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％以及任意上述两个数值之间的数值，例如0.11％、0.18％、0.26％、0.32％等，优选0.2％。
在本发明的实施方案中，步骤3)中酶解时间为3-5h，酶解温度为50-60℃、pH 7.5，酶解结束后在95℃水浴15min使酶灭活。在本发明的实施方案中，在步骤3)中，最终水解度可以达到68.53％。在本发明的具体具体实施方案中，在步骤3)中，最终水解度可以达到68.53％。在本发明的具体具体实施方案中，酶解温度可以为50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60℃，优选55℃，酶解时间可以为3h、3.5h、4h、4.5h、5h，优选4h。
在本发明的实施方案中，在步骤4)中，可以依次使用3kDa、10kDa超滤膜进行过滤，根据分子量大小，将所述富硒大豆蛋白酶解产物分离为<3kDa、3-10kDa、>10kDa的各组分。
在本发明的实施方案中，在步骤5)中，可以对步骤4)中分子量<3000Da的组分进行凝胶色谱分离并测定各组分对Caco-2细胞抗氧化能力的影响，从而得到对Caco-2细胞抗氧化能力提升最强的组分，对该组分进行氨基酸序列分析，发现其氨基酸序列为Ser-Glu-Leu-Arg-Ser-Pro-Lys-SeCys。
在本发明的第三方面，本发明提供了抗氧化和/或防治氧化损伤的组合物，该组合物包含上述高抗氧化活性富硒肽。
在本发明的第四方面，本发明提供了上述高抗氧化活性富硒肽在制备以下产品中的应用：1)保健品；2)食品；3)药品；或者4)抗氧化剂。
在本发明的第五方面，本发明提供了上述高抗氧化活性富硒肽在制备与Keap1蛋白上的氨基酸残基HIS552、ARG553、THR576、LEU578、ASP579、GLU593、ARG596相互作用的抗氧化剂中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于，本发明提供了一种高抗氧化活性富硒肽，具有良好的抗氧化活性。本发明的活性肽通过氢键、疏水作用、盐桥三种作用方式与Keap1蛋白上氨基酸残基相互结合，从而影响Keap1和Nrf2的相互作用，激活Nrf2信号通路，使下游的GST、GCL、GSH-Px活性升高，增加GSH含量，提升细胞的抗氧化能力，从而缓解氧化损伤。本发明还提供了一种高抗氧化活性富硒肽的制备方法，先自富硒大豆中提取富硒大豆蛋白，再将富硒大豆蛋白经水解、超滤、以及色谱分离纯化等过程后制备得到，原料来源广泛，制备过程易于操作实现。本发明还提供了一种高抗氧化活性富硒肽的应用，可将其作为抗氧化剂，用于保健品、食品或者药品中，通过提升抗氧化能力预防机体氧化造成的损伤与疾病。
附图说明
图1蛋白纯化系统分离纯化色谱图；
图2为蛋白纯化分离各组分对Caco-2细胞活力的影响图
图3为蛋白纯化分离各组分对Caco-2细胞抗氧化能力的影响图；
图4为高抗氧化活性富硒肽的二级质谱图；
图5为SELRSPKC(SeC)对Caco-2细胞活力的影响图；
图6为SELRSPKC(SeC)对Caco-2细胞内ROS释放的影响图；
图7为SELRSPKC(SeC)对Caco-2细胞内GSH系统的影响图；
图8为SELRSPKC(SeC)对Caco-2细胞内蛋白表达的影响图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明实施例以及实验例中的Caco-2细胞来自中国医学科学院基础医学研究所，其培养条件如下：完全培养基：MEM+20％FBS+1％NEAA+1％PS；冻存液：MEM+20％FBS+8％DMSO；培养条件：37℃，5％CO2/95％空气；传代：细胞密度为80％时以1:3比例使用0.25％TE传代。
Caco-2细胞分组处理情况如下：
1.空白组：不含FBS的MEM处理24h后置于37℃培养。
2.模型组：不含FBS的MEM处理24h后置于40℃培养箱处理24h。
3.SELRSPKC(SeC)组：含有500μg/mL的SELRSPKC(SeC)不含FBS的MEM处理24h后置于40℃培养箱处理24h。
实施例1
本实施例提供了高抗氧化活性富硒肽，其氨基酸序列序列为Ser-Glu-Leu-Arg-Ser-Pro-Lys-SeCys，分子量为976.487Da。上述高抗氧化活性富硒肽的制备过程如下：
(1)取富硒大豆清洗烘干后利用超微粉碎机粉碎并过80目筛得到富硒大豆粉；
(2)富硒大豆粉用正己烷以质量体积比(M:V)1:10混合均匀，40℃浸提4h，抽滤。滤渣用正己烷以质量体积比(M:V)1:5二次浸提2h，收集滤渣，通风过夜出去正己烷，干燥后得到脱脂富硒大豆粉。将脱脂富硒大豆粉用纯水复溶，富硒大豆粉与纯水的比例为1:20，用1MNaOH调节pH至8，40℃搅拌提取2h后，在4℃下，4500r/min离心20min，收集上清。将离心后的沉淀进行二次浸提，步骤与一次浸提相同，提取2h后离心，将两次上清液合并。调节上清液pH至4.5，随后在4℃下，4500r/min离心20min，收集沉淀，并用纯水复溶，再用1M HCl和1MNaOH调节pH至中性。采用3.5kDa透析膜在4℃下进行透析，每2h换水。将透析后样品冷冻干燥48h，得到富硒大豆蛋白；
(3)将步骤(2)提取的富硒大豆蛋白用复合酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶，比例为2:1:2)进行酶解，复合酶的量按质量分数计为富硒大豆蛋白的0.2％，酶解时间为4h，酶解条件为：酶解温度为55℃、pH 7.5；酶解结束后在95℃水浴15min灭酶。待酶解液冷却至室温后，在4℃，4500r/min离心30min，取上清液冷冻干燥，得到富硒大豆蛋白酶解物，-20℃保存备用；
(4)使用3kDa、10kDa超滤膜(美国Millipore公司)将步骤(3)的富硒大豆酶解产物进行分离，酶解产物根据分子量分成<3kDa、3-10kDa、>10kDa的组分；
(5)取步骤(4)中<3kDa的组分经0.22μm滤膜过滤后，用AKTAPure蛋白纯化系统(美国Millipore公司)进一步分离纯化，采用1mL注射器通过上样环进行上样，凝胶色谱柱为SuperdexPeptide10/300GL，流动相为去离子水，洗脱方式为等度洗脱，流速为0.5mL/min，检测波长为220nm，超滤组分样品浓度为10mg/mL，进样量为500μL，样品主要分为5个组分(F1、F2、F3、F4、F5，按收集时间排序)，对每个组分进行收集并冷冻干燥，最后测定各组分对Caco-2细胞抗氧化能力的影响。
凝胶色谱分离色谱图如图1，在检测波长220nm下，根据出峰时间及峰形，共分离得到5个色谱峰。将这5个组分(F1-F5，按收集时间排序)分别收集，冷冻干燥后测定。通过细胞实验测定F1-F5的抗氧化活性。使用CCK-8法(参见Zhang,J.,Zhang,Q.,Li,H.,Chen,X.,Liu,W.,&Liu,X.(2021).Antioxidant activity of SSeCAHK in HepG2 cells:aselenopeptide identified from selenium-enriched soybean proteinhydrolysates.RSC Advances,11(54),33872-33882)测定不同F1-F5浓度(125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、4000μg/mL)对Caco-2细胞活力的影响，结果如图2所示，为了排除细胞毒性作用，选用不影响Caco-2细胞活力的最大浓度，即500μg/mL，进行后续实验。将Caco-2细胞接于6孔板中，过夜贴壁后，用F1-F5组分处理Caco-2细胞24h。将Caco-2细胞放置40℃培养24h建立Caco-2细胞热损伤模型。氧化损伤结束之后测定SOD、MDA、GSH，结果如图3所示。结果发现，F3和F4在提升SOD活力方面效果最为显著，F3在抑制MDA产生和提升GSH含量方面效果最显著。因此选择F3作为最优组分进行后续鉴定。
F3组分氨基酸序列分析：将凝胶分离组分F3溶于超纯水，于50μg样品中加入二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)溶液使其终浓度为10mmol/L，56℃水浴还原1h，加入碘乙酰胺(2-Iodoacetamide IAA)溶液使其终浓度为50mmol/L，避光反应40min。最后使用脱盐柱进行脱盐，于45℃真空离心浓缩仪上挥干溶剂。
毛细管液相色谱条件：分析柱：(AcclaimPepMap RPLC C18，150μmx150mm，1.9μm)；流动相A：0.1％甲酸；流动相B：0.1％甲酸，80％ACN；流速600nL/min；分析时间：120min；分离程序：0-3minB：4-8％，3-89minB：8-28％，89-109minB：28-40％，109-110minB：40-95％，110-120minB：95％。质谱条件：一级质谱的分辨率：70000；自动增益控制目标(AGCtarget)：3e6；最大IT：100ms；扫描范围：100-1500m/z；二级质谱的分辨率：17500；自动增益控制目标(AGCtarget)：1e5；最大IT：50ms；TopN：20；NCE/steppedNCE：28
采用De Novo的方法对质谱结果进行分析，将质谱结果在PEAKS Studio 8.5软件进行分析，参数设置如下：蛋白修饰为氨基甲基化(C)(固定)、氧化(M)(可变)；酶切位点设置为非特异性；遗漏酶切位点限制为3；质谱误差设置为±20ppm。选择置信度高的肽段进行肽段鉴定。
高活性组分F3中共鉴定得到13条含硒肽段，序列信息如表1所示，SELRSPKC(SeC)主要是含有多种关键氨基酸(疏水性氨基酸、碱性氨基酸、酸性氨基酸)，且含有精氨酸。精氨酸被认为是抗氧化的关键氨基酸。疏水性氨基酸残基可以提高肽在脂质相中的溶解度，促进肽与自由基的相互作用，从而提高抑制脂质过氧化的能力。疏水性氨基酸可以增强生物膜中多肽与脂肪酸多不饱和脂肪酸链的接触。酸性氨基酸和碱性氨基酸可以通过带电荷的侧链基团与金属离子形成络合物，从而螯合金属离子。因此，选择疏水性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸，特别是含有精氨酸，作为肽段筛选的关键氨基酸。因此，重点研究了一条具有精氨酸、疏水性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸并且得分靠前的肽段。图4为序列SELRSPKC(SeC)的二级质谱图。
表1 F3组分中的含硒肽段
实验例1
首先使用CCK-8的方法(参见Zhang,J.,Zhang,Q.,Li,H.,Chen,X.,Liu,W.,&Liu,X.(2021).Antioxidant activity ofSSeCAHK in HepG2 cells:a selenopeptideidentified from selenium-enriched soybean protein hydrolysates.RSC Advances,11(54),33872-33882)测定不同SELRSPKC(SeC)的浓度(125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、4000μg/mL)对Caco-2细胞活力的影响，如图5所示。选取不影响Caco-2细胞活力的最大浓度，即500μg/mL，进行后续细胞实验。将立Caco-2细胞接于6孔板中，过夜贴壁后，用500μg/mL的SELRSPKC(SeC)处理24h。然后将Caco-2细胞放置40℃培养24h建立Caco-2细胞热损伤模型，氧化损伤结束之后测定细胞中ROS的释放情况。用无血清培养液按照1:1000稀释DCFH-DA，向六孔板每孔中加入1mL稀释好的DCFH-DA，37℃细胞培养箱内孵育40min，然后用无血清细胞培养液洗涤立Caco-2细胞三次，以充分除去未进入立Caco-2细胞内的DCFH-DA。使用荧光显微镜观察，拍照。最后使用荧光酶标仪在488nm激发波长，525nm发射波长下检测荧光的强弱。
实验结果如图6所示，氧化损伤会增加细胞ROS的释放，其荧光强度大约是空白组的三倍。SELRSPKC(SeC)预处理的立Caco-2细胞内ROS水平显著下降。
实验例2
根据南京建成生物工程研究所GST、GCL、GSH-Px和GSH试剂盒说明书测定Caco-2细胞中GST、GCL、GSH-Px活力和GSH含量。结果如图7所示，氧化损伤使GST、GCL、GSH-Px的活力下降，导致GSH含量下降，无法有效的清除立Caco-2细胞内的ROS，造成立Caco-2细胞氧化损伤。SELRSPKC(SeC)可以显著提升GST、GCL、GSH-Px活力和GSH含量。GCL和GST这两种酶在GSH合成和发挥抗氧化作用中起重要作用。SELRSPKC(SeC)中的SeCys可以作为合成GSH-Px的原料，使GSH-Px活力增高。在整个氧化还原循环中，较高的GSH-Px活力可以促进更多的GSH参与细胞反应发挥抗氧化作用，促进GSH的再生。因此，SELRSPKC(SeC)是通过促进GSH合成和再生从而提升细胞抗氧化能力。
实验例3
将Caco-2细胞接于6孔板中，过夜贴壁后，加入SELRSPKC(SeC)处理24h。然后将Caco-2细胞放置40℃培养24h建立Caco-2细胞热损伤模型。向六孔板每孔中加入100μL的裂解液，置于冰上裂解40min，每5min晃动一次六孔板使其充分裂解。BCA测定裂解液中蛋白浓度，加入稀释液统一所有样品蛋白浓度，再加入5×上样缓冲液，放入100℃水浴锅中加热变性5min，冷却，9184g下离心2min，取上清进行测定。蛋白在10％SDS-PAGE中分离并转移到PVDF膜上，孵育一抗(Nrf2抗体和Keap1抗体，1:1000)4℃过夜，洗掉一抗、二抗(抗兔IgG(H+L)，1:1000)室温孵育1h，用GAPDH对蛋白表达进行标准化，ECL化学发光显示。使用Image J软件测量条带强度。
Nrf2和Keap1蛋白表达情况如图8所示。正常情况下，Nrf2与Keap1结合位于Caco-2细胞质中，氧化损伤后Caco-2细胞内产生过量的ROS能够共价修饰Keap1的半胱氨酸残基，导致Keap1构象发生变化，造成Nrf2从Keap1上是放下来转移至细胞核，Nrf2蛋白表达增加，Keap1蛋白表达降低。SELRSPKC(SeC)预处理更进一步的激活了Nrf2蛋白的表达。因此，SELRSPKC(SeC)是通过激活Nrf2信号通路提高GST，GCL和GSH-Px活力，最终提高GSH含量，缓解氧化损伤。
实验例4
基于分子对接技术研究高抗氧化活性富硒肽的作用机理：从PDB数据库中选择Keap1的Kelch结构域的晶体结构(PDB ID:2FLU)。SELRSPKC(SeC)多肽的结构通过ChemDraw和Chem 3D进行结构模拟，选取能量最低的结构进行对接，对接前使用AutoDockTools将Keap上的水分子删掉并添加上电荷和氢原子，在X、Y、Z三个尺寸上设置的对接盒子大小为间距为/>蛋白位于对接盒子中心，对接模拟使用AutoDockVina进行计算，并根据打分结果判断对接效果最佳的结构，随后利用Pymol软件绘制AutoDockVina的结果。
本实验例通过分子对接研究活性肽SELRSPKC(SeC)与Keap1蛋白的相互作用，从分子水平阐明该活性肽的作用机理。肽段SELRSPKC(SeC)与Keap1的对接结果显示它们之间对接的结合能为-4.4kcal/mol，表明肽段与Keap1之间的结合是自发的。SELRSPKC(SeC)和Keap1的作用位点包括：HIS552、ARG553、THR576、LEU578、ASP579、GLU593、ARG596。SELRSPKC(SeC)主要通过氢键，疏水作用和盐桥与Keap1相互作用。这些结果表明活性肽的抗氧化特性可能是由于肽段与Keap1的相互作用，导致Keap1构象发生变化，影响了Keap1和Nrf2的结合，从而引发Nrf2信号通路的激活。
富硒肽作为一种营养全面的硒补充剂正逐渐走进人们的生活中，本发明通过蛋白酶解纯化的方法制备得到高抗氧化活性富硒肽SELRSPKC(SeC)，发现其激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用的机理，分子对接结果显示肽段与Keap1蛋白上的残基HIS552、ARG553、THR576、LEU578、ASP579、GLU593、ARG596相互结合。为富硒大豆高抗氧化活性肽在相关食品、保健品和药品中的使用提供理论支持。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (11)
1.一种高抗氧化活性富硒肽，其特征在于，所述富硒肽的氨基酸序列为Ser-Glu-Leu-Arg-Ser-Pro-Lys-SeCys，其中所述Cys含有Se，且所述富硒肽的分子量为976.487 Da。
2.制备权利要求1所述高抗氧化活性富硒肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1) 将富硒大豆清洗、烘干、粉碎、过筛，得到富硒大豆粉；
2) 采用碱提酸沉法提取所述富硒大豆粉中的富硒大豆蛋白；
3) 将所述富硒大豆蛋白用复合酶进行酶解，得到富硒大豆蛋白酶解产物；
4) 采用不同分子量的超滤膜分离所述富硒大豆蛋白酶解产物，收集分离的各组分；
5) 对步骤4)中分子量< 3000Da的组分进行凝胶色谱分离并测定各组分对Caco-2细胞抗氧化能力的影响，得到对Caco-2细胞抗氧化能力提升最强的组分，即得所述富硒肽Ser-Glu-Leu-Arg-Ser-Pro-Lys-SeCys，
其中，所述复合酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶的混合物。
3.根据权利要求2所述的制备高抗氧化活性富硒肽对方法，其特征在于，在步骤1)中，过80目筛得到富硒大豆粉。
4.根据权利要求2所述的制备高抗氧化活性富硒肽的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶的重量比为2:1:1~2:1:3，所述复合酶添加量以质量计为所述富硒大豆蛋白的0.1-0.4%。
5.根据权利要求4所述的制备抗热应激活性富硒肽的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶的重量比为2:1:1，所述复合酶添加量以质量计为所述富硒大豆蛋白的0.2%。
6. 根据权利要求2所述的制备高抗氧化活性富硒肽的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶分别来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、菠萝(Ananas spp.)。
7. 根据权利要求2所述的制备高抗氧化活性富硒肽的方法，其特征在于，所述酶解时间为3-5 h，酶解温度为50-60℃、pH 7.5。
8. 根据权利要求2所述的制备高抗氧化活性富硒肽的方法，其特征在于，所述酶解结束后在95℃水浴15 min使酶灭活。
9. 根据权利要求2的制备高抗氧化活性富硒肽的方法，其特征在于，在步骤4)中依次使用3 kDa、10 kDa超滤膜进行过滤，以将所述富硒大豆蛋白酶解产物分离为分子量小于3kDa、为3-10 kDa、大于10 kDa的各组分。
10.抗氧化和/或防治氧化损伤的组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的高抗氧化活性富硒肽。
11.权利要求1所述的高抗氧化活性富硒肽在制备抗氧化剂产品中的应用。
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