CN112048012A - 一种菜籽napin蛋白的制备方法 - Google Patents

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鞠兴荣
潘蒙蒙
王立峰
徐斐然
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Abstract

本发明提供一种菜籽napin蛋白的制备方法，属于食品生物技术领域。该方法，包括如下步骤：将0.5‑1.5 mg/mL的水溶性菜籽蛋白溶液与0.5‑1.5 mg/mL卡拉胶溶液按照体积比为5‑10:1混合，调节pH为1.8~3.0，离心取上清，去除卡拉胶，得到菜籽napin蛋白。本发明制备方法简单，耗时短，能够高效获得色浅、高纯度的菜籽napin蛋白。

Description

一种菜籽napin蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于食品生物技术领域具体涉及一种菜籽napin蛋白的制备方法。
背景技术
油菜是世界上最重要的作物之一，由于其种植范围广、有效性强，被认为是一种很有前途的植物蛋白替代源。此外，菜籽蛋白由于其氨基酸组成合理，含有足够的碱性氨基酸（赖氨酸）和含硫氨基酸（蛋氨酸和半胱氨酸），具有很高的营养价值。油菜种子中主要含有两种贮藏蛋白，即Cruciferin（12S）和Napin（2S），分别占成熟种子总蛋白含量的65％和45％，其中菜籽的napin蛋白是一类低相对分子质量蛋白质，其相对分子质量为5-17 KDa，具有出色的溶解性和乳化性，可广泛用于食品工业。现有技术中，制备菜籽napin蛋白方法通常采用膜分离法，但是该方法过程复杂，耗时长，不适用于食品工业的应用。
发明内容
本发明的目的：针对现有技术中存在的问题，提供了一种菜籽napin蛋白的制备方法，该方法简单，耗时短，能够高效获得色浅、高纯度的菜籽napin蛋白。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种制备菜籽napin蛋白的方法，包括如下步骤：将0.5-1.5 mg/mL的水溶性菜籽蛋白溶液与0.5-1.5 mg/mL卡拉胶溶液按照体积比为5-10:1混合，调节pH为1.8~3.0，离心取上清，去除卡拉胶，得到菜籽napin蛋白。
在本发明中，所述水溶性菜籽蛋白是将菜籽脱脂后粉碎，然后加入水进行提取所得。
优选的技术方案中，所述水溶性菜籽蛋白溶液的浓度为0.8-1.2mg/mL，所述卡拉胶溶液的浓度为0.8-1.2 mg/mL.
优选的技术方案中，采用超滤方法去除卡拉胶。
优选的技术方案中，通过滴加盐酸的方法调节pH。
优选的技术方案中，去除卡拉胶后，冷冻干燥，得到菜籽napin蛋白。
本发明具有如下有益效果：菜籽napin蛋白氨基酸组成合理，且具有良好的溶解性，可以作为一种功能性食品和膳食补充剂，具有良好的乳化性，可以作为食品加工中的乳化剂，提高了菜籽饼粕的利用价值。本发明菜籽napin蛋白的制备方法，简单，耗时短，能够高效获得获得色浅、高纯度的菜籽napin蛋白，而且所用的多糖为食品级I-卡拉胶，对人体无不良影响。
附图说明
图1 是水溶性菜籽蛋白溶液与卡拉胶溶液不同体积比采用酸和碱滴至不同pH后的吸光度值的变化。
图2水溶性菜籽蛋白溶液与卡拉胶溶液不同体积比制备所得蛋白提取物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，电泳图各泳道最上面的比例为各蛋白提取物制备过程中，水溶性菜籽蛋白溶液与卡拉胶溶液的体积比。
图3是菜籽napin蛋白分子量的液相色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为220nm下的吸光度。
具体实施方式
实施例1制备菜籽napin蛋白
将菜籽（Brassica napus L.，Fort Saskatchewan Canada, Bunge Canada）采用常规方法脱脂处理，得到菜籽饼粕，然后粉碎过筛，得到菜籽粉。将菜籽粉与蒸馏水按1:10的质量比混合，室温下置于磁力搅拌器上持续搅拌2 h，然后在8000×g高速离心30 min，取上清，得到水溶性菜籽蛋白溶液，冷冻干燥后得到水溶性菜籽蛋白粉，并于-20℃保存。
将水溶性菜籽蛋白粉溶于超纯水，配置成1 mg/mL的水溶性菜籽蛋白溶液。将I-卡拉胶（相对分子量≥200 KDa，购于爱必信（上海）生物科技有限公司，货号：abs42030901）溶于水，室温搅拌1 h，配置成1 mg/mL的卡拉胶溶液。将水溶性菜籽蛋白溶液与卡拉胶溶液按体积比为10:1混合并搅拌1h至体系均匀。通过1 mol/L 和0.1 mol/L的NaoH水溶液、1 mol/L 和0.1 mol/L的盐酸分别向碱性和酸性方向滴定，以0.2 pH为单位，分别滴定pH至pH 2和pH 12，并利用紫外分光光度计测各pH溶液在波长为600 nm下的吸光度值，以测定吸光度值。从图1可以看出，当pH为2.8时，溶液的吸光度值最大。
由上述前期探索，得到制备菜籽napin蛋白的方法一，包括如下步骤：将水溶性菜籽蛋白粉溶于超纯水，配置成1 mg/mL的水溶性菜籽蛋白溶液。将I-卡拉胶（相对分子量≥200 KDa，购于爱必信（上海）生物科技有限公司，货号：abs42030901）溶于水，室温搅拌1 h，配置成1 mg/mL的卡拉胶溶液。将水溶性菜籽蛋白溶液与卡拉胶溶液按体积比为10:1混合并搅拌1h至体系均匀。用1 mol/L 和0.1 mol/L的盐酸逐滴滴至上述均匀的溶液中，直至体系的pH为2.8，此时溶液OD600 nm为0.287，在4℃条件下，4000×g离心20 min，将上清液通过超滤法去除I-卡拉胶，冷冻干燥，得到蛋白提取物A。蛋白提取物A占水溶性菜籽蛋白粉总质量的5%。超滤法中使用的超滤膜的可截留分子量为30 KDa。
将蛋白A采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。结果如图2所示，蛋白提取物A中的蛋白分子量范围在10-17 KDa之间，由于菜籽napin蛋白的分子量主要在5 KD-17 KD之间，因此该组分主要为菜籽napin蛋白，通过凯氏定氮方法计算可知，蛋白提取物A中菜籽napin蛋白的质量百分含量为80%。
将蛋白提取物A采用液相色谱进行鉴定，液相色谱条件如下：流动相为乙腈:超纯水:三氟乙酸=45:55:0.1（体积比），洗脱流速：0.5 ml/min，紫外检测波长：220 nm，柱温：30℃，进样量：10 μL。由图3可见，蛋白提取物A中主要成分为分子量为12.59 KD和6607 Da的蛋白。
前期探索发现，将1 mg/mL的水溶性菜籽蛋白溶液与1 mg/mL的卡拉胶（相对分子量≥200 KDa，购于爱必信（上海）生物科技有限公司，货号：abs42030901）溶液按体积比为5:1混合并搅拌1h至体系均匀，通过分别向碱性和酸性方向滴定，当pH为2.0时，600 nm下的吸光度值最大。因此，寻找到制备菜籽napin蛋白的方法二，包括如下步骤：将水溶性菜籽蛋白粉溶于超纯水，配置成1 mg/mL的水溶性菜籽蛋白溶液。将I-卡拉胶（相对分子量≥200KDa，购于爱必信（上海）生物科技有限公司，货号：abs42030901）溶于水，室温搅拌1 h，配置成1 mg/mL的卡拉胶溶液。将水溶性菜籽蛋白溶液与卡拉胶溶液按体积比为5:1混合并搅拌1h至体系均匀。用1 mol/L 和0.1 mol/L的盐酸逐滴滴至上述均匀的溶液中，直至体系的pH为2.0，此时溶液OD600 nm为0.25，在4℃条件下，4000×g离心20 min，将上清液通过超滤法去除I-卡拉胶，冷冻干燥，得到蛋白提取物B。超滤法中使用的超滤膜的可截留分子量为30KDa。蛋白提取物B占水溶性菜籽蛋白粉总质量的2%。蛋白提取物B采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定，结果如图2。可以看到，蛋白提取物B的主要成分是分子量范围在10-17 KDa之间的蛋白。
实施例2制备对照蛋白提取物
对照方法1：将水溶性菜籽蛋白粉（制备方法同实施例1）溶于超纯水，配置成1 mg/mL的水溶性菜籽蛋白溶液。将I-卡拉胶（相对分子量≥200 KDa，购于爱必信（上海）生物科技有限公司，货号：abs42030901）溶于水，室温搅拌1 h，配置成1 mg/mL的卡拉胶溶液。将水溶性菜籽蛋白溶液与卡拉胶溶液按体积比为100:1混合均匀后搅拌1 h，通过浓度为1 mol/L 和0.1 mol/L的 NaoH水溶液以及1 mol/L 和0.1 mol/L盐酸分别向碱性和酸性方向滴定，以0.2 pH为单位，分别滴定pH至pH 2和pH 12，并利用紫外分光光度计在600 nm处测定吸光度值。选取吸光度值最大的pH条件（pH=4.6）制备蛋白，滴定结束后，在4℃、4000×g条件下离心20min，将上清液通过超滤法去除I-卡拉胶，冷冻干燥后得到对照蛋白提取物1。
对照方法2：将水溶性菜籽蛋白粉溶于超纯水配置成1 mg/mL的溶液。将I-卡拉胶（相对分子量≥200 KDa，购于爱必信（上海）生物科技有限公司，货号：abs42030901）溶于水，室温搅拌1 h，配置成1 mg/mL的溶液。将水溶性菜籽蛋白溶液与卡拉胶溶液按体积比例50:1混合，搅拌1h至体系均匀，通过浓度为1 mol/L和0.1 mol/L的NaoH水溶液以及1 mol/L和0.1 mol/L的盐酸分别向碱性和酸性方向滴定，以0.2 pH为单位，分别滴定pH至pH 2和pH12，并利用紫外分光光度计在600 nm处测定吸光度值。选取吸光度值最大的pH条件（pH=4.4）制备蛋白，滴定结束后，在4℃、4000×g条件下离心后，将上清液通过超滤法去除I-卡拉胶，冷冻干燥，得到对照蛋白提取物2。
对照方法3：将水溶性菜籽蛋白粉溶于超纯水配置成1 mg/mL的溶液。将I-卡拉胶（相对分子量≥200 KDa，购于爱必信（上海）生物科技有限公司，货号：abs42030901）溶于水，室温搅拌1 h，配置成1 mg/mL的溶液。将水溶性菜籽蛋白溶液与卡拉胶溶液按体积比例20:1混合均匀后搅拌1 h，通过浓度为1 mol/L和0.1 mol/L的NaoH水溶液和以及1 mol/L和0.1 mol/L的盐酸分别向碱性和酸性方向滴定，以0.2 pH为单位，分别滴定pH至pH 2和pH12，并利用紫外分光光度计在吸光度值为600 nm处测定吸光度值。选取吸光度值最大的pH条件（pH=4.2）制备蛋白，滴定结束后，在4℃、4000×g条件下离心后，将上清液通过超滤法去除I-卡拉胶，冷冻干燥，得到对照蛋白提取物3。
对照方法4：将水溶性菜籽蛋白粉溶于超纯水配置成1 mg/mL的溶液。将I-卡拉胶（相对分子量≥200 KDa，购于爱必信（上海）生物科技有限公司，货号：abs42030901）溶于水，室温搅拌1 h，配置成1 mg/mL的溶液。将水溶性菜籽蛋白溶液与卡拉胶溶液按体积比例15:1混合均匀后搅拌1h，通过浓度为1 mol/L和0.1 mol/L的NaoH水溶液和以及1 mol/L和0.1 mol/L的盐酸分别向碱性和酸性方向滴定，以0.2 pH为单位，分别滴定pH至pH 2和pH12，并利用紫外分光光度计在吸光度值为600 nm处测定吸光度值。选取吸光度值最大的pH条件（pH=3.8）制备蛋白，滴定结束后，在4℃、4000×g条件下离心后，将上清液通过超滤法去除I-卡拉胶，冷冻干燥，得到对照蛋白提取物4。
将对照蛋白提取物1-4采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定，结果如图2，可以看到，对照蛋白提取物1-4中含有大量分子量≥17 KDa的蛋白，表明这些对照物蛋白提取物中含有很多大分子量的Cruciferin蛋白。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种制备菜籽napin蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：将0.5-1.5 mg/mL的水溶性菜籽蛋白溶液与0.5-1.5 mg/mL卡拉胶溶液按照体积比为5-10:1混合，调节pH为1.8~3.0，离心取上清，去除卡拉胶，得到菜籽napin蛋白。
2.根据权利要求1所述制备菜籽napin蛋白的方法，其特征在于所述水溶性菜籽蛋白是将菜籽脱脂后粉碎，然后加入水进行提取所得。
3.根据权利要求1或2所述制备菜籽napin蛋白的方法，其特征在于所述水溶性菜籽蛋白溶液的浓度为0.8-1.2mg/mL，所述卡拉胶溶液的浓度为0.8-1.2 mg/mL。
4.根据权利要求3所述制备菜籽napin蛋白的方法，其特征在于采用超滤方法去除卡拉胶。
5.根据权利要求4所述制备菜籽napin蛋白的方法，其特征在于通过滴加盐酸的方法调节pH。
6.根据权利要求5所述制备菜籽napin蛋白的方法，其特征在于去除卡拉胶后，冷冻干燥，得到菜籽napin蛋白。
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