CN1976595B - 卡诺拉分离蛋白的制备和在水产养殖中的用途 - Google Patents

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Abstract

一种通过以下程序制得的用于水产养殖的卡诺拉分离蛋白：浸提卡诺拉油籽粕，以导致所述卡诺拉油籽粕中的蛋白质溶解，形成蛋白质含量为约5至约40g/L和pH约5至约6.8的蛋白质水溶液。使蛋白质水溶液与残余卡诺拉油籽粕分离后，使用选择性膜技术，将所述蛋白质水溶液的蛋白质浓度提高至至少约50g/L，同时保持离子强度基本不变。干燥浓缩蛋白质溶液，以提供蛋白质含量为至少约90wt％(Nx6.25)d.b.的卡诺拉分离蛋白。

Description

卡诺拉分离蛋白的制备和在水产养殖中的用途
相关申请的交叉引用
本申请依据35USC 119(e)要求2004年2月17日提交的美国临时专利申请第60/544,346号的优先权。
发明领域
本发明涉及卡诺拉(canola)分离蛋白的制备及其在水产养殖中的用途。
发明背景
卡诺拉分离蛋白可从卡诺拉油籽粕制得。在2002年5月3日提交的共同待审美国专利申请第10/137,391号和相应的PCT出版物WO 02/089597中(所述专利申请转让至其受让人，其公开内容通过引用结合到本文中)，描述了从卡诺拉油籽粕制备卡诺拉分离蛋白的方法，这种分离蛋白的蛋白质含量为至少100wt％(N x 6.25)。所述方法涉及多步骤方法：用盐溶液浸提卡诺拉油籽粕；使所得蛋白质水溶液与残余油籽粕分离；使用选择性膜技术，将所述水溶液的蛋白质浓度提高至至少约200g/L，同时保持离子强度基本不变；将所得浓缩蛋白质溶液稀释至冷水中，以促使形成蛋白质胶束；让蛋白质胶束沉析形成无定形、粘稠、凝胶状的面筋样蛋白质胶束团(PMM)；和从上清液中回收蛋白质胶束团，所述蛋白质胶束团经凯氏定氮法测定蛋白质含量为至少约100wt％(Nx 6.25)。本文所用的蛋白质含量以干重计。可干燥回收的PMM。
在上述方法的一个实施方案中和在第10/137,391号申请的具体描述中，对PMM沉析步骤所得上清液进行加工，以从湿PMM和上清液中回收含干燥蛋白的分离蛋白。可首先用超滤膜浓缩上清波，然后将湿PMM与浓缩上清夜混合并将混合物干燥，来实现这个程序。所得卡诺拉分离蛋白具有高纯度，蛋白质含量为至少约90wt％(Nx 6.25)，优选至少约100wt％(Nx 6.25)。
在上述方法的另一个实施方案中和在第10/137,391号申请的具体描述中，对PMM沉析步骤所得上清液进行加工，以从上清液中回收蛋白质。可首先用超滤膜浓缩上清液，然后将浓缩物干燥来实现这个程序。所得卡诺拉分离蛋白具有高纯度，蛋白质含量为至少约90wt％(N x 6.25)，优选至少约100wt％(N x 6.25)。
上述美国专利申请所述的程序基本上是分批程序。在2002年11月19日提交的共同待审美国专利申请第10/298,678号和相应PCT出版物WO 03/043439中(所述专利申请转让至其受让人，其公开内容通过引用结合到本文中)，描述了制备卡诺拉分离蛋白的连续方法。根据所述方法，将卡诺拉油籽粕与盐溶液连续混合，通过管道输送所得混合物，同时使蛋白质从卡诺拉油籽粕中浸提出来，形成蛋白质水溶液，使所述蛋白质水溶液连续从残余卡诺拉油籽粕中分离，将所述蛋白质水溶液连续输送通过选择性膜操作，使所述蛋白质水溶液的蛋白质含量提高至至少约200g/L，同时保持离子强度基本不变，将所得浓缩蛋白质溶液与冷水连续混合，以促使形成蛋白质胶束，让所述蛋白质胶束连续沉析，同时连续溢出上清液，直到在沉析槽中积累了所需量的PMM。从沉析槽中回收PMM，且可加以干燥。经凯氏定氮法测定，所述PMM的蛋白质含量为至少约90wt％(Nx 6.25)，优选至少约100wt％(N x 6.25)。
可如上述美国专利申请第10/137,391号中所述，对溢出的上清液进行加工，以从中回收卡诺拉分离蛋白。
已知卡诺拉种子含有约10至约30wt％的蛋白质，且已鉴定出几种不同的蛋白质成分。这些蛋白质通过不同的沉降系数(S)相区别。这些已知且已鉴定的蛋白质包括12S球蛋白(称为十字花科蛋白)和2S储存蛋白质(称油菜籽蛋白)。
如2003年4月15日提交的共同待审美国专利申请第10/413,371号和相应的PCT出版物WO 03/088760中所述(所述专利申请转让至其受让人，其公开内容通过引用结合到本文中)，PMM衍生的卡诺拉分离蛋白主要由7S蛋白质和一些12S蛋白质组成，而上清液衍生的卡诺拉分离蛋白主要由2S蛋白质组成。
在这种现有方法中，通过沉析PMM使卡诺拉分离蛋白单独衍自浓缩卡诺拉蛋白质溶液，并单独加工上清液以获得额外数量的卡诺拉蛋白质溶液。
卡诺拉也称油菜(rapeseed或oil seed rape)。
发明概述
在本发明中，蛋白质浓缩步骤所得浓缩蛋白质溶液直接进行干燥，而不是经加工产生PMM并单独加工上清液。本方法简化卡诺拉分离蛋白的生产，所述卡诺拉分离蛋白具有广谱的12S、7S和2S蛋白质。由于方法步骤较少，分离蛋白以更经济的方式制得。
因此，本发明的一个方面提供制备卡诺拉分离蛋白的方法，所述方法包括(a)浸提卡诺拉油籽粕，以导致所述卡诺拉油籽粕中的蛋白质溶解，形成蛋白质含量为约5至约40g/L和pH约5至约6.8的蛋白质水溶液；(b)使蛋白质水溶液与残余卡诺拉油籽粕分离；(c)使用选择性膜技术，将所述蛋白质水溶液的蛋白质浓度提高至至少约50g/L，同时保持离子强度基本不变，以提供浓缩蛋白质溶液；和(d)干燥浓缩蛋白质溶液，以提供以干重计蛋白质含量为至少约90wt％(N x 6.25)的卡诺拉分离蛋白。
根据本发明生产的卡诺拉分离蛋白的卡诺拉蛋白质分布为约25至约55wt％的2S卡诺拉蛋白质、约45至约75wt％的7S卡诺拉蛋白质和约0至约15wt％的12S卡诺拉蛋白质，优选约40至约50wt％的2S卡诺拉蛋白质、约50至约60wt％的7S卡诺拉蛋白质和约1至约5wt％的12S卡诺拉蛋白质。
根据本文方法生产的卡诺拉分离蛋白可用于分离蛋白的常规应用中，例如加工食品的蛋白质强化、油类的乳化、培烤食品的成型剂和气体包载制品中的发泡剂。另外，卡诺拉分离蛋白可制成蛋白质纤维用于人造肉，可在以蛋清作为粘合剂的食物中用作蛋清代用品或补充剂。卡诺拉分离蛋白可用作营养补充剂。卡诺拉分离蛋白的其它用途是在宠物食品、动物饲料、水产养殖中和在工业和美容业的应用及个人护理产品。
由于通过本发明方法制得的分离蛋白与通过上述美国专利申请所述程序获得的分离蛋白相比纯度通常较低，特别是盐含量较高，优选它们用于非人类应用中。如下文所更详细地描述，分离蛋白的一个具体用途是在水产养殖中用作饲料。然而，可通过任何合适程序，例如通过透析或渗滤加工分离蛋白，以减少残余盐含量。
本发明的另一个方面提供水产养殖用饲料组合物，所述饲料组合物包含按本文所提供方法生产的卡诺拉分离蛋白。可特别配制饲料组合物，用于饲养鲑科鱼类(salmonid)，包括大麻哈鱼(salmon)和鳟鱼(trout)。
附图简述
图1A-1C是用以生产卡诺拉分离蛋白的台式(bench)浸提程序所得样品的HPLC色谱图；
图2A-2B是在中试工厂规模浸提程序产生的卡诺拉分离蛋白的HPLC色谱图。
发明详述
如上述美国专利申请所详述，卡诺拉分离蛋白可通过分批方法或连续方法或半连续方法从卡诺拉油籽粕分离制得。
提供卡诺拉分离蛋白的方法的起始步骤涉及使卡诺拉油籽粕中的蛋白质类物质溶解出来。从卡诺拉籽粕回收得到的蛋白质类物质可能是卡诺拉籽或其它油籽中天然存在的蛋白质，或者所述蛋白质类物质可能是经遗传操作改良但仍具有天然蛋白质的特有疏水性质和极性性质的蛋白质。卡诺拉粕可以是卡诺拉油籽除去卡诺拉油后得到的任何卡诺拉粕，由于例如使用热己烷浸出方法或者冷油挤出方法，其中含有的非变性蛋白质水平有所变动。从卡诺拉油籽除去卡诺拉油通常是通过与本文描述的分离蛋白回收程序分开的操作过程来实现的。
蛋白质溶解通过使用食品级盐溶液来实现最为有效，因为盐的存在增强了可溶性蛋白质从油籽粕中除去。在预期卡诺拉分离蛋白作非食品用途的情况下，例如在水产养殖中，可使用非食品级化学品。盐通常是氯化钠，但也可使用其他盐，如氯化钾。盐溶液的离子强度为至少约0.05，优选至少约0.10，以使相当数量的蛋白质的溶解得以实现。随着盐溶液的离子强度提高，油籽粕中的蛋白质的溶解程度开始上升，直至达到最大值。随后离子强度的任何提高都不会增加溶解的总蛋白质。引起最大蛋白质溶解的食品级盐溶液离子强度随所用的盐和所选择的油籽粕而有所变化。
通常优选采用的离子强度值小于约0.8，更优选离子强度值为约0.1至约0.6。
在分批方法中，蛋白质的盐溶解在至少约5℃的温度下，优选在最高达约35℃下实现，优选同时进行搅拌，以减少溶解时间，所述时间通常为约10分钟至约60分钟。优选所实现的溶解作用要能从油籽粕中充分浸提出尽可能多的蛋白质，以获得总体上的高产物得率。
温度下限选定为约5℃，是因为低于此温度时溶解作用慢得无法进行，而优选的温度上限选定为约35℃，是因为在分批模式下，温度更高时所述方法会变得不经济。
在连续方法中，从卡诺拉油籽粕浸提蛋白质是通过适合实现从卡诺拉油籽粕连续浸提蛋白质的任何方式来进行的。在一个实施方案中，卡诺拉油籽粕与食品级盐溶液连续混合，所得混合物通过具有一定长度的管道或者导管输送，输送流速达成的停留时间足以实现期望依照本文所述参数进行的浸提作用。在这种连续程序中，盐溶解步骤在最长为约10分钟的时间内快速完成，优选所实现的溶解作用从卡诺拉油籽粕中充分浸提出尽可能多的蛋白质。连续程序中的溶解过程优选在高温下实现，优选约35℃以上，通常最高达约65℃。
食品级盐水溶液和卡诺拉油籽粕的天然pH约5至约6.8，优选pH值约5.3至约6.2。
可按需使用任何合适的酸(通常是盐酸)或者碱(通常是氢氧化钠)，将盐溶液的pH调至约5至约6.8范围的任何期望值。
在溶解步骤进行过程中，食品级盐溶液中的油籽粕浓度可能变化很大。典型的浓度值为约5至约15％w/v。
用盐水溶液进行的蛋白质浸提步骤具有溶解卡诺拉粕中可能存在的脂类的额外效果，这会导致水相中存在脂类。
浸提步骤所得的蛋白质溶液的蛋白质浓度通常为约5至约40g/L，优选为约10至约30g/L。
盐水溶液中可含有抗氧化剂。所述抗氧化剂可以是任何合适的抗氧化剂，如亚硫酸钠或者抗坏血酸。所采用的抗氧化剂量在约0.01至约1wt％之间变化，优选约0.05wt％。抗氧化剂用以抑制蛋白质溶液中酚类物质的氧化。
然后可通过任何合适方式，使浸提步骤所得的水相与残余卡诺拉粕分离，例如通过采用滗析离心机，接着通过碟式离心法和/或过滤，除去残余的粕。分离出的残余粕可进行干燥，以便处置。
可通过将粉状活性炭或者其他色素吸附剂与分离出的蛋白质水溶液混合，然后方便地通过过滤法除去吸附剂，以提供蛋白质溶液，改善最终卡诺拉分离蛋白的颜色，使其颜色较浅，黄颜色较淡。也可使用渗滤法除去色素。
所述色素去除步骤可在任何合适的条件下进行，通常在分离出的蛋白质水溶液的环境温度下，采用任何合适的色素吸附剂来进行。对于粉状活性炭，用量为约0.025％至约5％w/v，优选约0.05％至约2％w/v。
在卡诺拉籽粕含有相当数量的脂类的情况下，如在美国专利第5,844,086号和第6,005,076号(转让至其受让人，其公开内容通过引用结合到本文中)中所述，那么可将其中描述的除油步骤用于分离的蛋白质水溶液和下文讨论的浓缩蛋白质水溶液。当进行颜色改善步骤时，这个步骤可在第一除油步骤之后进行。
作为用盐水溶液浸提油籽粕的替代方案，所述浸提可只用水来进行，尽管比起盐水溶液，只用水往往从油籽粕浸提出较少的蛋白质。在采用这种替代方案的情况下，可将盐以上述浓度加入到从残余油籽粕分离出的蛋白质溶液中，以使蛋白质在下述浓缩步骤中得以维持在溶液中。当进行除色步骤和/或第一脱脂步骤时，盐通常是在这种操作完成后加入。
另一种替代程序是在相对较高的pH值下，即高于约6.8，通常最高达约9.9下，用食品级盐溶液浸提油籽粕。可通过使用任何合适的食品级碱，如氢氧化钠水溶液，将食品级盐溶液的pH调至期望的碱性值。或者，可在相对较低的pH值下，即低于约pH 5，通常低至约pH 3下，用盐溶液浸提油籽粕。在使用这种替代方案的情况下，随后可通过任何合适方式，使油籽粕浸提步骤所得的水相与残余卡诺拉粕分离，例如通过采用滗析离心法，接着通过碟式离心法和/或过滤，除去残余的粕。分离出的残余粕可进行干燥，以便处置。
然后，如上所述，将在高或者低pH浸提步骤中获得的蛋白质水溶液的pH调至约5至约6.8的范围，优选约5.3至约6.2的范围，接着再如下文所讨论作进一步的处理。可适当使用任何合适的酸(如盐酸)或者碱(如氢氧化钠)，进行所述pH调整。
然后将蛋白质水溶液浓缩，通常约4至约20倍，以提高其中的蛋白质浓度，同时保持其中的离子强度基本不变。通常进行这种浓缩操作，以提供蛋白质浓度为至少约50g/L，优选至少为约200g/L的浓缩蛋白质溶液。
可通过任何适合分批或者连续操作的合适方式，如通过采用任何合适的选择性膜技术(如超滤或者渗滤)，来进行浓缩步骤，使用的膜例如中空纤维膜或者螺旋错流膜，视不同的膜材质及形式而定，其合适分子量截留值(MWCO)如约3,000至约100,000道尔顿，优选约5,000至约10,000道尔顿。膜可以是中空纤维膜或者螺旋错流膜。对于连续操作，确定膜的尺寸，以允许蛋白质水溶液透过膜时能够获得期望的浓缩程度。
然后，可使用摩尔浓度和pH与浸提溶液相同的盐水溶液，对浓缩蛋白质溶液进行渗滤步骤。可使用约2至约20体积的渗滤溶液，优选约5至约10体积的渗滤溶液来进行这种渗滤操作。在渗滤操作中，更多数量的污染物可随透过液通过膜而从蛋白质水溶液中除去。渗滤操作可进行到透过液中没有另外相当数量的酚类物质和可见颜色存在为止。可视不同的膜材质及形式而定，使用分子量截断值在约3,000至约100,000道尔顿的范围内，优选约5,000至约10,000道尔顿的范围内的膜进行这种渗滤操作。
在渗滤步骤的至少一部分过程中，在渗滤介质中可存在抗氧化剂。所述抗氧化剂可以是任何合适的抗氧化剂，如亚硫酸钠或者抗坏血酸。渗滤介质中采用的抗氧化剂的量取决于所采用的材料，可在约0.01至约1wt％的范围内变动，优选约0.05wt％。抗氧化剂用以抑制浓缩卡诺拉分离蛋白溶液中存在的酚类物质的氧化。
浓缩步骤和渗滤步骤可在任何合适的温度下进行，通常为约20℃至约60℃，进行的时间足以实现期望的浓缩程度。所用的温度和其他条件在一定程度上取决于用以进行浓缩操作的膜设备和期望的溶液蛋白质浓度。
在这个步骤中将蛋白质溶液浓缩至高于约200g/L的优选浓度，不仅将方法得率提高到高于约40％，优选高于约80％的水平(以回收为干分离蛋白的浸提蛋白质的比例计)，而且还降低了干燥后最终分离蛋白的盐浓度。控制分离蛋白的盐浓度的能力对于分离蛋白的应用是重要的，盐浓度的变化会影响具体食品应用中的功能性质和感观性质。
众所周知，超滤及类似的选择性膜技术允许低分子量物质通过，而阻止较高分子量物质通过。低分子量物质不仅包括食品级盐的离子，也包括从原始材料中浸提出来的低分子量物料，如碳水化合物、色素和抗营养因子，以及任何低分子量形式的蛋白质。视不同的膜材质及形式而定，通常选定膜的分子量截断值，以保证相当比例的蛋白质得以保留在溶液中，同时又让污染物通过。
如美国专利第5,844,086号和第6,005,076号中所描述，如有需要，可对浓缩和任选渗滤过的蛋白质溶液进行进一步的除油操作。
作为上述脱色操作的替代方案，可对浓缩和任选渗滤过的蛋白质溶液进行脱色操作。在这里，可使用粉状活性炭以及颗粒状活性炭(GAC)。可用作颜色吸附剂的另一种材料是聚乙烯吡咯烷酮。
颜色吸附剂处理步骤可在任何便利条件下，通常在卡诺拉蛋白质溶液的环境温度下进行。对于粉状活性炭，用量可以为约0.025％至约5％w/v，优选约0.05％至约2％w/v。当用聚乙烯吡咯烷酮作为颜色吸附剂时，用量可以为约0.5％至约5％w/v，优选约2％至约3％w/v。可通过任何便利手段，如通过过滤，将颜色吸附剂从卡诺拉蛋白质溶液中除去。
可对从任选脱色步骤获得的浓缩和任选渗滤过的蛋白质溶液进行巴氏灭菌，以杀灭任何细菌，所述细菌可能因为保藏或者其他原因在原来的粕中早已存在，且在浸提步骤中被从粕中浸提到卡诺拉分离蛋白溶液中。这种巴氏灭菌可在任何期望的巴氏灭菌条件下进行。通常，将浓缩和任选渗滤过的蛋白质溶液加热到约55°至约70℃的温度，优选约60°至约65℃，保持约10至约15分钟，优选约10分钟。然后可将巴氏灭菌过的浓缩蛋白质溶液冷却，优选冷却至约25°至约40℃的温度，以供如下所述进行进一步的处理。
然后通过任何便利技术，如喷雾干燥法或冷冻干燥法，使从浓缩步骤、任选渗滤步骤、任选脱色步骤和任选除油步骤获得的浓缩蛋白质溶液干燥成干品形式，以提供蛋白质含量为至少约90wt％蛋白质(N x 6.25)，优选至少约100wt％蛋白质(N x 6.25)，且基本未变性(通过差示扫描量热法测定)的卡诺拉分离蛋白。卡诺拉分离蛋白的卡诺拉蛋白质分布为约25至约55wt％的2S卡诺拉蛋白质、约45至约75wt％的7S卡诺拉蛋白质和约0至约15wt％的12S卡诺拉蛋白质，优选约40至约50wt％的2S卡诺拉蛋白质、约50至约60wt％的7S卡诺拉蛋白质和约1至约5wt％的12S卡诺拉蛋白质。
如前所述，卡诺拉分离蛋白的一个潜在用途是在水产养殖中。在鲑科鱼类的饲养中，饲料约占生产费用的35至60％，且约一半的饲料成本来自蛋白质来源。优质的鱼粉被用作鲑科鱼类食物中蛋白质的主要来源，因为它味道极佳，可消化蛋白质和能量水平高，氨基酸和脂肪酸分布极好。
然而，鱼粉在质量、可获得性和价格方面各不相同。质量受原材料类型和新鲜程度、加工和贮藏条件以及可溶性物质与滤饼的比例和抗氧化剂水平的影响。
由于对有鳍鱼类和甲壳类养殖、宠物食品和特种牲畜饲料的需求增加，预测鱼粉的价格将提高。由于水产养殖的利润水平取决于生产成本和饲养产品市场价格之间的关系，较高的鱼粉价格将意味着生产成本增加，从而减少利润空间。
降低生产成本的一个方法是通过开发新的更便宜的蛋白质产品来部分或全部代替鲑科鱼类食物中的鱼粉。鱼粉的一个替代品来源是油籽粕，包括卡诺拉油籽粕。这种粕化学组成相当固定，且成本不到高质量的鱼粉的一半(以每公斤蛋白质计)。另外，如下表6所示，基于鱼类所需的必需氨基酸分布，卡诺拉油籽粕的等级极好。
然而，卡诺拉油籽粕由于存在包括植酸、硫代葡萄糖苷和酚类化合物的抗营养因子(ANF)及不溶性纤维，使其适口性和可消化性下降，其使用存在缺点。
一项未发表的研究评估了卡诺拉蛋白浓缩物(74wt％蛋白质)对淡水虹鳟鱼(Oncorltynchus inykiss)和海水大西洋鲑(Salmo salar)的营养价值。
在蛋白质可消化性方面，卡诺拉蛋白产品的蛋白质消化系数比鱼粉好，能量消化系数与鱼粉近似，计算出的可消化能量与鱼粉近似。卡诺拉蛋白质产品即使在低于最适蛋白质浓度下，仍显示出与市售饲料相同的生长率和饲料摄入率。
蛋白质功效比例(PER)是所有蛋白质制品的唯一最重要积极(positive)指标。在未发表研究中所用的卡诺拉蛋白质由于加工困难，其蛋白质浓度低于最佳值，但尽管如此，卡诺拉蛋白产品膳食具有与基本膳食可比的PER，所述基本膳食是特殊研究膳食(specialresearch diet)和特殊商业膳食(special commercial diet)。特殊商业饮食的PER在统计学上与卡诺拉蛋白产品和基础PER值相同。这些结果不能用浓缩物或分离物形式的大豆蛋白取得。
鉴于本发明产品中的蛋白质分布和通过本文所述程序进行的真正分离蛋白的提供，预期通过使用本发明产品，可获得的鲑科鱼类饲养结果比在未发表的研究中获得的有所改善。
当通过对浓缩蛋白质溶液进行干燥制得卡诺拉分离蛋白时，所述产品比经上述已有技术即美国专利申请第10/137,391号所讨论的PMM方法分离所得的产品含有明显更高浓度的残余盐。盐的存在对分离蛋白的某些用途，例如在水产养殖的用途不会有害。
然而，在盐的存在对卡诺拉分离蛋白的预期用途有害的情况下，可在干燥之前通过透析或渗滤蛋白质水溶液(其可为浓缩、任选渗滤的卡诺拉蛋白质溶液形式)将盐除去。
实施例
实施例1：
本实施例说明本发明提供卡诺拉分离蛋白的方法。
在19.8℃下，将150kg AL022批市售卡诺拉油籽粕加入到1010.5L 0.1M盐水(NaCl)中，混合30分钟，以提供蛋白质水溶液。在混合的中途(15分钟)，加入0.05wt％或500g w/v的抗坏血酸作为抗氧化剂。浸提pH是6.12，盐的天然pH未作调整。
为从浸提溶液中除去粕，将粕浆通过真空过滤带，结果获得790L平均蛋白质含量为1.74wt％(17.4g/L)的溶液。
然后将所述溶液通过自动清洗离心机(desludger centrifuge)和装有2.0um过滤垫的压滤机以进一步澄清蛋白质溶液。最终的澄清蛋白质提取物体积为780L，蛋白质含量为1.58wt％(15.8g/L)。
然后在二膜系统上用聚偏二氟乙烯(PVDF)5螺旋错流膜使700L的澄清蛋白质溶液等分试样进行超滤(UF)。这些膜的MWCO范围为5000道尔顿。总体积从700L减少至32L或者说减少21.8倍体积。所得的32L浓缩蛋白质溶液或截留液平均蛋白质含量为25.10wt％(251g/L)。
将UF步骤所得的截留液在60℃下巴氏灭菌10分钟，然后将等分试样在APV喷雾干燥器上进行干燥。
干制品的最终蛋白质含量原样为93.08wt％，以干重计为95.46wt％(N x 6.25)。(百分氮含量用Leco FP528定氮仪测定)。该批标识为BW-AL022-I02-03A。
实施例2：
本实施例描述实验室规模的卡诺拉分离蛋白样品的制备。
将75kg实施例1所用的相同卡诺拉粕加入到500mL 0.10M盐水溶液(15％w/w)中，混合物在旋转摇动器上以220rpm振荡30分钟。含1.99wt％蛋白质的浸出物以10,000rpm离心20分钟，并通过绉布槽纹(crepe-fluted)滤纸过滤。
在Amico Ultrafiltration装置上用5000MWCO的聚醚砜(PES)膜浓缩350ml滤液，直至收集到150ml截留液。用350L 0.1M盐水溶液对截留液进行渗滤(DF)，产生75ml含6.24wt％蛋白质的DF截留液。
在冷冻温度下，使用Spectra/Por 6-8,000MWCO管对截留液进行透析。将透析样品冷冻，然后冻干。所得卡诺拉分离蛋白的蛋白质含量为101wt％(N x 6.25)。
实施例3：
本实施例提供对实施例1和2中生产的卡诺拉分离蛋白的蛋白质分析。
对如实施例1和2所述制备的卡诺拉分离蛋白进行HPLC分析。台式浸提物、台式DF透过液、台式DF UF透析的卡诺拉分离蛋白HPLC色谱图分别见图1A、1B和1C。
两个不同日期测定的BW-AL022-I02-03A样品HPLC色谱图见图2A和2B。
如实施例1和2所述制备的卡诺拉分离蛋白的分析结果包含于下表1-5中。表5包含样品与典型的得自PMM(C300)和得自上清液(C200)的卡诺拉分离蛋白的氨基酸比较分析，所述卡诺拉分离蛋白如2002年10月9日提交的共同待审美国专利申请第10/266,701号所述进行制备，所述专利申请转让至其受让人，其公开内容通过引用结合到本文中。
从这些数据可看到，台式分离物(实施例2)显示出的蛋白质比例(基于峰面积)比I02分离物(实施例1)高。两者都显示出球状蛋白质(7S、12S、＞12S和亚单位)占总蛋白质峰面积的约2/3，白蛋白(2S和油菜籽蛋白原(pronapin))占另外的1/3。
在HPLC色谱图中发现的其它成分表明在台式分离物中植酸水平相对较高，酚类(及杂类成分)含量较低(基于峰面积)。这个结果表明台式分离物比I02分离物含有较少的游离酚酸。颜色差异(基于A330’)可能是由于蛋白质上所粘附的酚类不能通过过滤膜除去。
从2003年9月19日的首次扫描到2003年12月18日的最近操作，I02HPLC-SEC(图2，表2)分布除抗坏血酸外基本保持不变。如这一时间范围的峰面积所测出，抗坏血酸随时间而氧化，数量发生减少。结果，如所显示，其它成分比例提高，但这对蛋白质比例影响极微。
台式样品(再溶解的提取物、UF透过液、DF透过液、DF截留液和DF透析FD截留液)(图1，表1)的HPLC-SEC分析表明，UF、DF和透析步骤除去了大部分的酚类物质和杂类成分，但除去植酸不够有效。植酸往往与蛋白质牢固地结合。尽管如此，在台式透过液的HPLC色谱图中还是观察到植酸，这表明部分植酸(可能是总量的20-30％)通过膜除去。
如所显示，实施例1的分离物含有盐和其它矿物质，占分离物最终干重的约3％(表3)。没有检测到毒性成分。结果显示由于在本样品的制备中使用DF和透析步骤，台式分离物蛋白质含量较高。
在表4A和4B中，将氨基酸分析结果转换为“克每100克氨基酸”。表中同时显示平均值和标准偏差，表明差异极少。这是所期望的，因为DF和透析步骤除去的是非蛋白质，所述步骤不以任何显著方式影响氨基酸平衡，除非有大量的游离氨基酸和缩氨酸存在。
表5将当前样品的氨基酸分布与先前研究的结果进行了比较。当前截留液的成分与先前的截留液(得自A8和A10粕)以及得自A10粕的Puratein样品非常相似。Puratein是PMM和Supertein的混合物，应当与截留液分析结果相似。
表5还显示了C200和C300(A10粕)的氨基酸分布。截留液和Puratein样品落在这两种分离物之间，这是所期望的。
赖氨酸这种必需氨基酸在谷类中含量低。油籽特别是卡诺拉的赖氨酸水平往往较高。截留液分析揭示出相当数量的赖氨酸，这将改善这种分离物的营养品质(即使用于鱼类或其它非人类饲料)。表5底部显示，截留液分离物的必需氨基酸组成相当高。
总之，分析结果显示截留液C500是一种质量氨基酸组成在C200和C300之间的分离物。这种分离物的非蛋白质水平低，而台式研究显示盐类、酚类物质和其它未知物质通过超滤除去。如台式浸提资料所示，渗滤和透析可改善非蛋白质的去除。然而，如IO2结果所示，这不是生产分离物所必需的。
公开内容的总结
现总结本公开内容如下：本发明提供制备具有多种用途(包括在水产养殖中)的卡诺拉油籽分离蛋白的新方法。在本发明的范围内可能有各种修改方案。
表1a
C500样品，UF DF FD，Lab#21,681，03/12/17-19
  变量   平均值   标准偏差
  水分   n.d.   n.d.
  Leco蛋白质(原样)   101.09％   0.03％
  Leco蛋白质(干重)   n.d.   n.d.
表1b
C500样品，Lab#21,681，HPLC-SEC结果
变量   提取物Lab#216701∶4稀释   透过液Lab#21,679不稀释   DF透过液Lab#21,680不稀释   DF截留液Lab#21,6811∶4稀释   DF截留液FD，lab#216811％W/V
  蛋白质占总面积％   23.8％   0.0％   0.0％   62.6％   77.3％
  植酸占总面积％   3.3％   5.2％   4.3％   11.2％   8.7％
  酚类物质占总面积％   37.6％   52.2％   47.6％   12.7％   3.6％
  杂类成分占总面积％   35.3％   42.6％   48.1％   13.5％   10.4％
 ＞12S+12S占蛋白质面积％   6.5％   0.0％   0.0％   6.9％   6.7％
  7S占蛋白质面积％   58.0％   0.0％   0.0％   57.2％   57.7％
  7S亚单位占蛋白质面积％   0.2％   0.0％   0.0％   0.1％   0.2％
变量   提取物Lab#216701∶4稀释   透过液Lab#21,679不稀释   DF透过液Lab#21,680不稀释   DF截留液Lab#21,6811∶4稀释   DF截留液FD，lab#216811％W/V
  球蛋白占蛋白质面积％   64.6％   0.0％   0.0％   64.1％   64.5％
  2S+油菜籽蛋白原占蛋白质面积％ 35.4％ 0.0％ 0.0％ 35.9％ 35.5％
表1c
C500样品，1％W/V Lab#21,681
  变量：   读数：   以干重计的酚类物质％
  吸光度：330-nm   3.70AU   0.81％
  pH   5.83   -
n.d.＝未测，UF＝超滤，DF＝渗滤，FD＝冻干，AU＝吸光度单位球蛋白＝＞12S+12S+7S+亚单位
表2a
C500样品，BW-AL022-I02-03A#1SD，Lab#20,576，03/12/19
变量：   9月8日平均值 标准偏差   12月17日平均值 标准偏差
  水分   2.49％   0.06％   n.d.   n.d.
  Leco蛋白质(原样)   93.08％   0.24％   94.57％   0.50％
  Leco蛋白质(干重)   95.46％   0.24％   n.d.   n.d.
表2b
C500样品，Lab#20,576，HPLC-SEC结果
变量：   C5009月8日首次测试1％W/V   C50012月17日末次测试1％W/V
  蛋白质占总面积％   72.5％   73.0％
  植酸占总面积％   3.2％   5.0％
  酚类物质占总面积％   37.6％   52.2％
  抗坏血酸占总面积％   4.6％   0.7％
  杂类成分占总面积％   3.5％   3.9％
  ＞12S+12S占蛋白质％   5.5％   5.3％
  7S占蛋白质％   64.1％   62.7％
  7S亚单位占蛋白质％   0.1％   1.4％
  球蛋白占蛋白质％   69.7％   69.3％
 2S+油菜籽蛋白原占蛋白质％   30.3％   30.7％
表2c
C500样品，1％W/V Lab#20,576
  变量：   读数：   计算的酚类物质％干重
  吸光度：330-nm   1.45AU   0.32％
  pH   -   -
n.d.＝未测，UF＝超滤，DF＝渗滤，SD＝喷雾干燥，AU＝吸光度单位球蛋白＝＞12S+12S+7S+亚单位
表3
BW-AL022-I02-03A#1C500Lab#20,576，Dec.23/03实验室外结果
  变量：   收到时的样品   样品干重
  水分   2.49％   -
  干物质   -   96.07％
  变量：   收到时的样品   样品干重
  粗蛋白质(Nx6.25)   93.00％   96.81％
  钙   0.10％   0.10％
  磷   0.40％   0.42％
  镁   0.11％   0.11％
  钾   0.31％   0.32％
  铜   0.0011％   0.0011％
  钠   0.73％   0.76％
  氯化钠当量   1.85％   1.92％
  锌   0.0007％   0.0007％
  锰   ＜0.0001％   ＜0.0001％
  铁   0.0119％   0.0124％
  硼   0.0005％   0.0005％
  铅<sup>2</sup>   0.00ppm   0.00ppm
  镉<sup>2</sup>   0.00ppm   0.00ppm
  矿物质总量<sup>1</sup>   2.78％   2.92％
1包括对钠的氯化物的估计。
2铅和镉都在阈限之下。
Figure G2005800115235D00191
Figure G2005800115235D00201
表6
硬骨鱼对Burcon截留液的氨基酸需求(g/100g蛋白质)
氨基酸 鲑科鱼类<sup>1</sup> 鲇鱼<sup>1</sup> 鲤鱼<sup>1</sup>   BW-AL022-I02-03A#1   Dec 15/03台式试验
  精氨酸   4.2   4.3   4.4   7.5   7.3
  组氨酸   1.6   1.5   2.4   2.4   2.2
  异亮氨酸   2.0   2.6   3.0   4.2   4.3
  亮氨酸   3.6   3.5   4.7   7.7   7.9
  赖氨酸   4.8   5.0   6.0   4.6   5.0
  苏氨酸   2.0   2.1   4.2   3.3   3.0
  色氨酸   0.6   0.5   0.8   5.7   5.5
  缬氨酸   2.2   3.0   4.1   5.7   5.5
 蛋氨酸+半胱氨酸   2.4   2.3   3.5   4.1   4.7
 苯丙氨酸+酪氨酸 5.3 4.8 8.2 6.6 6.5
1加拿大安大略省圭尔夫市圭尔夫大学动物和家禽科学系鱼类营养研究实验室D.P.Bureau&C.Y.Cho

Claims (14)

1.一种制备卡诺拉分离蛋白的方法，其特征在于：
(a)浸提卡诺拉油籽粕，以导致所述卡诺拉油籽粕中的蛋白质溶解，形成蛋白质含量为5至40g/L和pH 5至6.8的蛋白质水溶液；
(b)使蛋白质水溶液与残余卡诺拉油籽粕分离；
(c)使用选择性膜技术，将所述蛋白质水溶液的蛋白质浓度提高到至少50g/L，同时保持离子强度基本不变，以提供浓缩蛋白质溶液；
(d)将浓缩蛋白质溶液干燥，以提供以干重计蛋白质含量为至少90wt％(Nx6.25)、具有25至55wt％的2S卡诺拉蛋白质，45至75wt％的7S卡诺拉蛋白质和0至15wt％的12S卡诺拉蛋白质的卡诺拉蛋白质分布的卡诺拉分离蛋白。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述卡诺拉分离蛋白的卡诺拉蛋白质分布为40至50wt％的2S卡诺拉蛋白质，50至60wt％的7S卡诺拉蛋白质和1至5wt％的12S卡诺拉蛋白质。
3.权利要求1或2的方法，所述方法以分批模式进行，其特征在于所述卡诺拉油籽粕的所述浸提通过在至少5℃温度下使用盐水溶液实现，所述盐水溶液离子强度为至少0.05，pH为5至6.8，以产生蛋白质浓度为5至40g/L的蛋白质溶液。
4.权利要求1或2的方法，所述方法以连续方式实现，其特征在于所述浸提步骤如下实现：
(i)在5°至65℃的温度下将所述卡诺拉油籽粕与盐水溶液连续混合，所述盐水溶液离子强度至少0.5，pH为5至6.8，
(ii)在最高10分钟的时间内通过管道连续输送所述混合物，同时使蛋白质从卡诺拉油籽粕中浸提出来，形成蛋白质含量为5至40g/L的蛋白质水溶液。
5.权利要求1或2的方法，其特征在于在所述使蛋白质水溶液与残余卡诺拉油籽粕分离之后，对蛋白质水溶液进行色素去除步骤。
6.权利要求1或2的方法，其特征在于所述油籽粕用水浸提，随后向所得蛋白质水溶液中加入盐，以提供离子强度为至少0.05的蛋白质水溶液。
7.权利要求1或2的方法，其特征在于所述浓缩步骤通过超滤实现，以产生蛋白质含量为至少200g/L的浓缩蛋白质溶液。
8.权利要求1或2的方法，其特征在于在所述干燥步骤之前使用离子强度为至少0.05的盐水溶液对所述浓缩蛋白质溶液进行渗滤。
9.权利要求1或2的方法，其特征在于在所述干燥步骤之前对所述浓缩蛋白质溶液进行色素去除步骤。
10.权利要求1或2的方法，其特征在于在所述干燥步骤之前对所述浓缩蛋白质溶液进行巴氏灭菌步骤。
11.权利要求1或2的方法，所述方法包括将干燥的卡诺拉分离蛋白配制成用于水产养殖的饲料组合物。
12.权利要求11的方法，其中所述饲料组合物用于饲养鲑科鱼类。
13.一种用于水产养殖的饲料组合物，所述饲料组合物包含通过权利要求1或2的方法生产的卡诺拉分离蛋白。
14.权利要求13的用于水产养殖的饲料组合物，所述组合物配制成用于饲养鲑科鱼类。
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