JP5749878B2 - カノーラタンパク質単離物の調製および養殖におけるその使用 - Google Patents

Description

本出願は、２００４年２月１７日出願の米国特許仮出願第６０／５４４，３４６号の米国特許法第１１９条に基づく優先権を主張するものである。
本発明は、カノーラタンパク質単離物の調製および養殖におけるその使用に関する。

カノーラタンパク質単離物は、カノーラ油糧種子粗粉から形成することができる。本願の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年５月３日出願の米国特許出願第１０／１３７，３９１号および対応するＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０８９５９７号に、少なくとも１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク含有量を有するカノーラタンパク質単離物をカノーラ油糧種子粗粉から作製する方法が記載されている。この手順は、塩溶液を用いてカノーラ油糧種子粗粉を抽出するステップ、得られるタンパク質水溶液を油糧種子粗粉の残渣から分離するステップ、選択膜技術を用いてイオン強度を実質上一定に保ちながら少なくとも約２００ｇ／Ｌまで水溶液のタンパク質濃度を上昇させるステップ、得られたタンパク質濃縮溶液を冷水に希釈して、タンパク質ミセルの形成を生ずるステップ、タンパク質ミセルを沈殿させて、非晶質、粘性、ゼラチン状、グルテン様のタンパク質ミセル（ＰＭＭ）を形成するステップ、およびケルダール窒素（Ｎ×６．２５）で求めて少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含有量を有するタンパク質ミセルを、上澄み液から回収するステップを含む多段階プロセスである。本明細書では、タンパク質含有量は乾燥重量に基づいて求める。回収したＰＭＭは乾燥させることができる。

上述のプロセスの一実施形態においては、米国特許出願第１０／１３７，３９１号に詳述されているように、ＰＭＭ沈殿ステップからの上澄み液を処理して、湿ったＰＭＭおよび上澄み液から、乾燥タンパク質を含むタンパク質単離物を回収する。この手順は、まず、限外ろ過膜を用いて上澄み液を濃縮し、濃縮済み上澄み液と湿ったＰＭＭを混合し、その混合物を乾燥することによって実施される。得られるカノーラタンパク質単離物は、高純度の少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質を含む。

上述のプロセスの別の実施形態においては、米国特許出願第１０／１３７，３９１号に詳述されているように、ＰＭＭ沈殿ステップから上澄み液を処理して、上澄み液からタンパク質を回収する。この手順は、まず、限外ろ過膜を用いて上澄み液を濃縮し、濃縮済みの液を乾燥することによって実施される。得られるカノーラタンパク質単離物は、高純度の少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質を含む。

上述の米国特許出願の手順は本質的にバッチ手順である。本願の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年１１月１９日出願の米国特許出願第１０／２９８，６７８号および対応するＰＣＴ公開第ＷＯ ０３／０４３４３９号に、カノーラタンパク質単離物を製造するための連続プロセスが記載されている。これらによると、カノーラ油糧種子粗粉と塩溶液を連続的に混合し、これらの混合物をパイプで搬送しながら、カノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、このタンパク質水溶液をカノーラ油糧種子粗粉から連続的に分離し、このタンパク質水溶液を連続的に搬送し選択膜操作にかけて実質上一定のイオン強度を保ちながらタンパク質水溶液のタンパク質含有量を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増大させ、得られる濃縮済みタンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質ミセルを形成させ、所望量のＰＭＭが沈殿容器に堆積するまで上澄み液を連続的に溢れさせながら、これらのタンパク質ミセルを連続的に沈殿させる。このＰＭＭを沈殿容器から取り出し乾燥させる。このＰＭＭは、ケルダール窒素（Ｎ × ６．２５）で求めて少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ × ６．２５）のタンパク質含有量を有する。

前述の米国特許出願第１０／１３７，３９１号に記載のように、溢れた上澄み液を処理してカノーラタンパク質単離物を回収することもできる。

カノーラ種子は、約１０〜約３０ｗｔ％のタンパク質を含んでいることが知られており、異なった数種類のタンパク質構成要素が同定されている。これらのタンパク質は、異なる沈降係数（Ｓ）によって識別される。これらの知られている同定されたタンパク質には、クルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）として知られる１２Ｓグロブリン、およびナピン（ｎａｐｉｎ）として知られる２Ｓ貯蔵タンパク質が含まれる。

本願の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００３年４月１５日出願の米国特許出願第１０／４１３，３７１号および対応するＰＣＴ公開第ＷＯ ０３／０８８７６０号に記載のとおり、ＰＭＭ由来のカノーラタンパク質単離物は、主として７Ｓタンパク質といくらかの１２Ｓタンパク質からなるが、上澄み液由来のカノーラタンパク質単離物は、主に２Ｓタンパク質からなる。

このような従来の方法では、カノーラタンパク質単離物は、濃縮したカノーラタンパク質溶液からＰＭＭを沈殿させることによって得られ、またそれとは別に追加量のカノーラタンパク質溶液を得るべく上澄み液を別に処理することによって得られる。

カノーラは、菜種またはアブラナとしても知られている。

本発明では、タンパク質の濃縮ステップから得られる濃縮タンパク質溶液は、ＰＭＭを生成するために処理したり、上澄み液を別に処理したりせずに直接乾燥させる。この手順によって１２Ｓ、７Ｓおよび２Ｓタンパク質の広いスペクトルを有するカノーラタンパク質単離物の生成が簡単になる。プロセスステップ数が少ないので、より経済的なやり方で単離物が形成される。

したがって、本発明は、カノーラタンパク質単離物の調製方法であって、
（ａ）カノーラ油糧種子粗粉を抽出して、該カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、タンパク質含有量が５〜４０ｇ／Ｌであり、ｐＨが５〜６．８であるタンパク質水溶液を形成すること、
（ｂ）該カノーラ油糧種子粗粉の抽出残渣から該タンパク質水溶液を分離すること、
（ｃ）選択膜技術を用いてイオン強度を実質上一定に保ちながら、該タンパク質水溶液のタンパク質濃度を少なくとも５０ｇ／Ｌまで増加させて濃縮したタンパク質溶液を得ること、および
（ｄ）該濃縮したタンパク質溶液を乾燥させて、タンパク質含有量が乾燥重量に基づき少なくとも９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のカノーラタンパク質単離物を得ること
からなることを特徴とする方法である。

本発明に従って生成されるカノーラタンパク質単離物は、カノーラタンパク質プロフィールが、２Ｓカノーラタンパク質約２５〜約５５ｗｔ％、７Ｓカノーラタンパク質約４５〜約７５ｗｔ％、１２Ｓカノーラタンパク質約０〜約１５ｗｔ％であり、好ましくは、２Ｓカノーラタンパク質約４０〜約５０ｗｔ％、７Ｓカノーラタンパク質約５０〜約６０ｗｔ％、１２Ｓカノーラタンパク質約１〜約５ｗｔ％である。

本発明の方法に従って製造されるカノーラタンパク質単離物は、加工食品のタンパク質強化、油の乳化、ベーキング食品（ｂａｋｅｄ ｇｏｏｄｓ）の本体形成材、気体を閉じ込める製品中の発泡剤など、タンパク質単離物の通常の用途に使用することができる。さらに、カノーラタンパク質単離物は、人造肉（ｍｅａｔ ａｎａｌｏｇｓ）に有用なタンパク質繊維に形成することができ、卵白の代用品または卵白がバインダーとして使用される食料製品の増量材として使用することができる。カノーラタンパク質単離物は、栄養補給剤としても使用することできる。カノーラタンパク質単離物のその他の用途は、ペットフード、飼料、養殖、工業および化粧用の用途、パーソナルケア製品（ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃａｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）である。

本発明の方法によって形成されるタンパク質単離物は、前述の米国特許出願に記載の手順によって得られるものより、一般的に純度が低く、とりわけ塩の含有量が高いので、人以外の用途に使用されることが好ましい。このタンパク質単離物の特定の用途の１つは、下記に詳述する養殖の飼料としての用途である。しかし、残っている塩の含有量を減少させるために、透析やダイアフィルトレーションなど、任意の好都合な手順によってこのタンパク質単離物を処理することもできる。

本発明の別の態様によれば、本明細書の方法によって生成されるカノーラタンパク質単離物を含む、養殖用飼料組成物が提供される。この飼料組成物を、サケおよびマスを含めたサケ科の魚に給餌するために特に配合することができる。

（発明の一般的な説明）
カノーラタンパク質単離物は、前述の米国特許出願に一般的に記載されているように、バッチプロセスまたは連続プロセスまたは半連続プロセスの何れかによって、カノーラ油糧種子粗粉から単離することができる。

カノーラタンパク質単離物を得るプロセスの最初のステップでは、カノーラ油糧種子粗粉からタンパク性材料を可溶化させる。カノーラ油糧種子粗粉から回収されるタンパク性材料は、カノーラ種子またはその他の油糧種子中に自然に存在するタンパク質でよく、あるいは、このタンパク性材料は、遺伝子操作で改変されているが天然タンパク質の疎水性および極性の特徴を所持しているタンパク質でもよい。カノーラ粗粉は、カノーラ油糧種子からカノーラ油を除去して得られる、例えば温ヘキサン抽出またはコールドオイルエキストルージョン法（ｃｏｌｄ ｏｉｌ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）から得られる、様々なレベルの非変性タンパク質を含む、任意のカノーラ粗粉でよい。カノーラ油糧種子からのカノーラ油の除去は通常、本明細書に記載するタンパク質単離物回収手順とは別の操作として実施する。

塩の存在によって油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去が促進されるので、食品グレードの塩の溶液の使用によって、タンパク質の可溶化は最も効率よく実施される。カノーラタンパク質単離物が養殖などの非食品用途向けなら、非食品グレードの薬品も使用できる。塩化カリウムなどのその他の塩も使用できる。塩は通常塩化ナトリウムであるが、かなりの量のタンパク質の可溶化の実施を可能にするために、塩溶液は、イオン強度が少なくとも約０．０５であり、好ましくは、少なくとも約０．１０である。塩溶液のイオン強度が増加するにつれて、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶化の度合は、当初は最大値に達するまで増加。その後はイオン強度を増加しても、可溶化したタンパク質の総量は増加しない。タンパク質の最大の可溶化を生じさせる食品グレードの塩の溶液のイオン強度は、使用される塩および選択される油糧種子粗粉に応じて変わる。

約０．８未満のイオン強度を利用することが通常好ましく、より好ましくは約０．１〜約０．６のイオン強度を利用する。

バッチプロセスでは、タンパク質の塩による可溶化は、好ましくは、通常約１０〜約６０分である可溶化の時間を減少させるために撹拌しながら、少なくとも約５℃の温度、好ましくは約３５℃までの温度で実施する。高い全体的生産収量が得られるように、ほぼ実際上可能なかぎりの量のタンパク質を油糧種子粗粉から抽出するために可溶化を実施することが好ましい。

約５℃の温度下限は、この温度より下では可溶化が実用にならないほど遅くなることから選択されるが、好ましい温度上限の約３５℃は、バッチ式では、この温度より高いとプロセスが経済的でないことから選択される。

連続プロセスでは、カノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出は、カノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続的な抽出の実施と矛盾しない任意の方式で実施される。一実施形態では、カノーラ油糧種子粗粉を、食品グレードの塩の溶液と連続的に混合し、その混合物を、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を実施するのに十分な滞留時間に適した長さのパイプまたは導管に、そのような滞留時間に適した流速で通液する。このような連続手順では、好ましくは、ほぼ実際上可能なかぎりの量のタンパク質をカノーラ油糧種子粗粉から抽出する目的で可溶化を実施するために、塩の可溶化ステップを、約１０分までの時間内で迅速に実施する。連続手順での可溶化は、好ましくは約３５℃を超え、一般に最高で約６５℃の高温で行うことが好ましい。

食品グレードの塩の水溶液およびカノーラ油糧種子粗粉は本来、約５〜約６．８のｐＨを有する。約５．３〜約６．２のｐＨ値が好ましい。

塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて、任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムの使用によって、約５〜約６．８の範囲内の任意の所望の値に調整することができる。

可溶化ステップ中の食品グレードの塩の溶液の油糧種子粗粉の濃度は広い範囲の値を取り得る。典型的な濃度の値は約５〜約１５％ｗ／ｖである。

塩の水溶液でタンパク質を抽出するステップは、カノーラ粗粉中に存在する脂肪を可溶化するという追加の効果を有しており、その結果、脂肪が水性層に存在することになる。

抽出ステップから得られるタンパク質溶液は、一般的にタンパク質濃度が約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌである。

塩の水溶液は酸化防止剤を含んでもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムやアスコルビン酸など、任意の好都合な酸化防止剤でよい。使用する酸化防止剤の量は、約０．０１〜約１ｗｔ％まで及んでよく、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液中のフェノール類の酸化を防止するのに役立つ。

抽出ステップから得られる水性層は次いで、粗粉残渣を除去するために、デカンタ遠心分離機を使用し、続いて分離板型遠心分離および／またはろ過を行うなど、任意の好都合な方式で、カノーラ粗粉の残渣から分離することができる。

最終のカノーラタンパク質単離物の色は、粉末状活性炭またはその他の色素吸着剤を分離されたタンパク質水溶液と混合することにより、薄い色とより薄い黄色に改善することができ、次いで好都合には、ろ過により吸着剤を除去してタンパク質溶液を得る。ダイアフィルトレーションも色素除去に使用することができる。

分離したタンパク質水溶液のこうした色素除去ステップは、任意の適当な色素吸着剤を用いて、任意の好都合な条件下で、一般に室温で実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５〜約２％ｗ／ｖの量が用いられる。

その開示が参照により本明細書に組み込まれた米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、カノーラ種子粗粉がかなりの量の脂肪を含んでいる場合、これらの特許に記載の脱脂ステップを、以下で論じる分離したタンパク質水溶液および濃縮したタンパク質水溶液に実施することもできる。色改善ステップを実施するときは、このようなステップを、最初の脱脂ステップの後に実施することができる。

油糧種子粗粉を塩の水溶液で抽出することの代替手段として、水だけを用いてこのような抽出をすることも可能であるが、水だけの利用では、塩の水溶液よりも油糧種子粗粉から少ないタンパク質が抽出される傾向がある。このような代替手段を用いる場合、下記に記載する濃縮ステップ中にタンパク質を溶液中に維持するために、油糧種子粗粉の残渣から分離後のタンパク質溶液に、塩を、上記で論じた濃度で添加することもできる。脱色ステップおよび／または最初の脱脂ステップを実施するときは、塩を一般に、このような操作の完了後に加える。

別の代替手順は、油糧種子粗粉を食品グレードの塩の溶液で、６．８を超え、一般に最高で９．９の比較的高いｐＨ値で抽出することである。食品グレードの塩の溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム水溶液など任意の好都合な食品グレードのアルカリの使用により、ｐＨにおいて所望のアルカリ値に調整することができる。別法として、油糧種子粗粉を、塩の溶液を用いて、ｐＨ約５未満、一般にｐＨ約３までの比較的低いｐＨで抽出することができる。このような代替手段を用いる場合、油糧種子粗粉抽出ステップから得られる水性層を次いで、デカンタ遠心分離機を使用し、続いて分離板型遠心分離及び／又はろ過を行うなど、任意の好都合な方式で、カノーラ粗粉の抽出残渣から分離して、粗粉の残渣を除去する。分離した粗粉の残渣は乾燥して破棄してよい。

高いｐＨまたは低いｐＨの抽出ステップから得られるタンパク質水溶液を次いで、下記で論じるさらなる処理の前に、上記で論じたように、ｐＨを約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２の範囲に調整する。このようなｐＨ調整は、必要に応じて、塩酸などの任意の好都合な酸、または水酸化ナトリウムなどのアルカリを用いて実施する。

タンパク質水溶液を次いで、そのイオン強度を実質上一定に保ちながら、そのタンパク質濃度を、通常約４〜約２０倍に濃縮する。このような濃縮は一般に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約２００ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する、濃縮されたタンパク質溶液を得るために実施する。

濃縮ステップは、異なる膜の材質および構成を考慮して、約３，０００〜約１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンなどの適当な分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する、中空糸膜やスパイラル巻きの膜（ｓｐｉｒａｌ−ｗｏｕｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）などの膜を用いた、限外ろ過やダイアフィルトレーションなど任意の好都合な選択膜技術を使用するなど、バッチまたは連続操作と矛盾しない任意の好都合な方式で実施することができる。これらの膜は、中空糸またはスパイラル巻きの膜でよい。連続操作には、これらの膜を、タンパク質水溶液が膜を通過するとき、所望の濃度が可能になる寸法にすることができる。

濃縮したタンパク質溶液を次いで、抽出溶液と同じモル濃度およびｐＨの塩の水溶液を用いたダイアフィルトレーションにかけることができる。このようなダイアフィルトレーションは、約２〜約２０容（ｖｏｌｕｍｅ）のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０容のダイアフィルトレーション溶液を用いて実施することができる。ダイアフィルトレーション操作では、透過液の膜透過により、タンパク質水溶液からさらなる量の異物が除去される。ダイアフィルトレーション操作は、透過液中にかなりのさらなる量のフェノール類および認識できる色が存在しなくなるまで実施することができる。このようなダイアフィルトレーションは、異なる膜の材質および構成を考慮して、約３，０００〜約１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜を用いて実施することができる。

酸化防止剤が、ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の期間、ダイアフィルトレーション媒体中に存在してよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムやアスコルビン酸など、任意の好都合な酸化防止剤でよい。ダイアフィルトレーション媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％に及び、好ましくは約０．０５ｗｔ％でよい。酸化防止剤は、濃縮したカノーラタンパク質単離物溶液中に存在するフェノール類の酸化を防止するのに役立つ。

濃縮ステップおよびダイアフィルトレーションステップは、任意の好都合な温度、一般に約２０〜約６０℃で、かつ任意の好都合な時間実施して、所望の濃縮度を実現することができる。使用する温度およびその他の条件はある程度、濃縮を実施するのに使用する膜装置、および溶液の所望のタンパク質濃度に依存する。

このステップでの約２００ｇ／Ｌ超の好ましい濃度にまでタンパク質溶液を濃縮すると、プロセスの収率が、乾燥したタンパク質単離物として回収される抽出されたタンパク質の比率で表して、約４０％超、好ましくは約８０％超のレベルに増加するのみならず、乾燥後の最終のタンパク質単離物の塩濃度が低下する。単離物の塩濃度を制御できることは、塩濃度のばらつきが特定の食品用途における機能的および感覚的特性に影響をおよぼす単離物の用途において重要である。

よく知られるように、限外ろ過および同様の選択膜技術は、高分子量種の透過を防ぎながら、低分子量種の透過を可能にする。低分子量種には、食品グレードの塩のイオン種のみならず、炭水化物、色素、非栄養因子、ならびに任意の低分子量の形のタンパク質などの源材料から抽出された低分子量材料が含まれる。膜の分子量カットオフは通常、異なる膜の材質および構成を考慮して、異物を通過させながら、溶液中のかなりの比率のタンパク質を確実に保持するように選択される。

濃縮され、場合によってはダイアフィルトレーションされたタンパク質溶液は、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、必要であれば、さらなる脱脂操作にかけることもできる。

上記の色素除去操作の代替手段として、濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を色素除去操作にかけることもできる。粉末状活性炭ならびに粒状活性炭（ｇｒａｎｕｌａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ）（ＧＡＣ）をここで使用できる。色素吸着剤として使用できる別の材料はポリビニルピロリドンである。

カノーラタンパク質溶液の色素吸収剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般に室温で、実施することができる。粉末状活性炭は、約０．０２５〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。色素吸着剤としてポリビニルピロリドンを使用する場合、約０．５〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２〜３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色素吸着剤は、ろ過など、任意の好都合な手段により、カノーラタンパク質溶液から除去することができる。

任意選択の色素除去ステップから得られる、濃縮され、場合によってはダイアフィルトレーションされたタンパク質溶液は、貯蔵の結果として、またはその他の理由で元の粗粉に存在していて、かつ抽出ステップ中に粗粉からカノーラタンパク質単離物溶液中に抽出された細菌を殺すために低温殺菌にかけることもできる。このような低温殺菌は、任意の所望の低温殺菌条件下で実施することができる。一般的に、濃縮され、場合によってはダイアフィルトレーションされたタンパク質溶液を、約５５〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の温度に、約１０〜約１５分間、好ましくは約１０分間加熱する。低温殺菌した濃縮タンパク質溶液を次いで、以下に記載のさらなる処理のために、好ましくは約２５〜約４０℃の温度に冷却する。

濃縮ステップ、任意選択のダイアフィルトレーションステップ、任意選択の色素除去ステップ、および任意選択の脱脂ステップから得られた濃縮タンパク質溶液を次いで、噴霧乾燥や凍結乾燥など、任意の好都合な技術により乾燥した形に乾燥させると、タンパク質含有量が少なくともタンパク質約９０ｗｔ％（Ｎ × ６．２５）、好ましくは少なくともタンパク質約１００ｗｔ％（Ｎ × ６．２５）の、（示差走査熱量測定法で求めて）実質上改変されていないカノーラタンパク質単離物が得られる。カノーラタンパク質単離物は、カノーラタンパク質プロフィールが２Ｓカノーラタンパク質約２５〜約５５ｗｔ％、７Ｓカノーラタンパク質約４５〜約７５ｗｔ％、１２Ｓカノーラタンパク質約０〜約１５ｗｔ％であり、好ましくは、２Ｓカノーラタンパク質約４０〜約５０ｗｔ％、７Ｓカノーラタンパク質約５０〜約６０ｗｔ％、１２Ｓカノーラタンパク質約１〜約５ｗｔ％である。

前述のとおり、カノーラタンパク質単離物の潜在的用途の１つは、養殖における用途である。養殖のサケ科の魚の養殖においては、飼料が操業費用の約３５〜６０％を占め、飼料のコストの約半分はタンパク質源から来ている。高品質の（飼料用の）魚粉が、サケ科の魚のための餌における、主要なタンパク質源として使用されている。というのは、それらは非常に味がよく、かつ高レベルの消化可能なタンパク質およびエネルギーと優れたアミノ酸および脂肪酸プロフィールを有するからである。

しかし、魚粉は、品質、入手しやすさ、および価格がまちまちである。品質は、原材料のタイプおよび鮮度と加工および貯蔵条件、ならびにプレスケーキに占める可溶性物質の割合および酸化防止剤のレベルによって影響される。

魚および甲殻類の養殖、ペットフードおよび特殊な家畜飼料の需要が増大したために、魚粉のコストが増加するであろうことが予想されている。養殖の収益性は、生産コストと養殖製品の市場価値の関係によって左右されるため、魚粉価格がより高くなることは生産コストが増加し、そのために収益マージンが減少することを意味する。

生産コストを減少させる方法の１つは、サケ科の魚の飼料における魚粉を部分的にまたは完全に代替するための新規なより安価なタンパク質製品の開発を通してである。魚粉の代用品のソースの１つは、カノーラ油糧種子粗粉を含めた油糧種子粗粉である。このような飼料は、かなり安定した化学組成を有し、これらの飼料のコストは、タンパク質１キログラムあたりで高品質魚粉のコストの半分に満たない。さらに、カノーラ油糧種子粗粉は、以下の表６に示したように、魚に必要な必須アミノ酸プロフィールに基づいた優れた評価を有する。

しかし、フィチン酸、グルコシノレート、およびフェノール化合物を含めた非栄養因子（ＡＮＦ）と不溶性繊維が存在し、飼料の味のよさ、および消化吸収性を損なうので、カノーラ油糧種子粗粉の使用には欠点がある。

ある未発表の研究では、淡水のニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）および海水のタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）用のカノーラタンパク質濃縮物（７４ｗｔ％タンパク質）の栄養価が評価された。

タンパク質の消化吸収性の点では、カノーラタンパク質製品は、タンパク質の消化吸収率が魚粉より良く、エネルギーの消化吸収率が魚粉と類似しており、算出した可消化エネルギーが魚粉と類似していた。カノーラタンパク質製品は、最適なタンパク質濃度より低い濃度においてさえ、市販用の飼料材料と同じ成長比および飼料摂取量を示した。

タンパク質効率（ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｔｉｏ）（ＰＥＲ）は、全てのタンパク質配合物にとっての単一の最重要かつ明確な指標である。未発表の研究に使用されたカノーラタンパク質製品は、タンパク質濃度が加工の難しさから最適なタンパク質濃度に満たなかったが、それにもかかわらず、このカノーラタンパク質製品飼料は、特別な研究飼料かつ特別な市販用飼料であった基礎飼料に匹敵するＰＥＲを有した。特別な市販用飼料のＰＥＲは、カノーラタンパク質製品および基礎のＰＥＲ値と統計的に同じであった。これらの結果は、大豆タンパク質では濃縮物または単離物のいずれの形でも達成することができない。

本発明の製品のタンパク質の分布、および本明細書に記載した手順によって真のタンパク質単離物が提供されることを考慮すると、本発明の製品を使用することにより、サケ科の魚では未発表の研究で達成されたものに比べて改良された給餌結果が達成できることが期待される。

カノーラタンパク質単離物を、濃縮されたタンパク質溶液を乾燥させることにより形成する場合、この生成物は、前述の先行技術である米国特許出願第１０／１３７，３９１号で論じられているＰＭＭ手順による単離より、かなり高い濃度の塩の残渣を含む。塩の存在は、例えば養殖での使用など、タンパク質単離物のある種の用途には有害ではない。

しかし、塩の存在が、カノーラタンパク質単離物の目的とする用途に有害である場合、乾燥させる前のタンパク質の水溶液（濃縮され、場合によってはダイアフィルトレーションされたカノーラタンパク質溶液の形でもよい）を、透析またはダイアフィルトレーションにかけることによって、塩を除去することができる。

実施例
実施例１：
本実施例は、カノーラタンパク質単離物を提供するための、本発明の手順を例示する。

市販用カノーラ油糧種子粗粉ｌｏｔ ＡＬ０２２ １５０ｋｇを、０．１Ｍの生理的食塩水（ＮａＣｌ）１０１０．５Ｌに１９．８℃で添加し、３０分間混合してタンパク質水溶液を得た。混合の中間時点（１５分）において、０．０５ｗｔ％または５００ｇｗ／ｖのアスコルビン酸を、酸化防止剤として添加した。抽出液のｐＨは６．１２で、生理食塩水の本来のｐＨに何ら調節を加えなかった。

抽出溶液から粗粉を除去するために、粗粉のスラリーを、バキュームフィルターベルト（ｖａｃｕｕｍ ｆｉｌｔｅｒ ｂｅｌｔ）上を移動させ、その結果、平均タンパク質含有量が１．７４ｗｔ％（１７．４ｇ／Ｌ）の溶液７９０Ｌを得た。

次いで、さらにタンパク質溶液を清澄化させるために、この溶液を、遠心分離式スラッジ除去装置（ｄｅｓｌｕｄｇｅｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）および２．０ｕｍパッドを備えるフィルタープレスを通過させた。清澄化させた最終のタンパク質抽出液は、体積が７８０Ｌで、タンパク質含有量が１．５８ｗｔ％（１５．８ｇ／Ｌ）であった。

次いで、清澄化させたタンパク質溶液のアリコット７００Ｌを、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）の５回スパイラル巻きした膜（５ ｓｐｉｒａｌ ｗｏｕｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を用いる２膜システムで限外ろ過（ＵＦ）した。これらの膜は、ＭＷＣＯ範囲が５，０００ダルトンである。全体の体積減少は、７００Ｌから３２Ｌへの減少、すなわち２１．８分の１の体積減少であった。得られた３２Ｌの濃縮したタンパク質溶液すなわち濃縮液は、平均タンパク質含有量が２５．１０ｗｔ％（２５１ｇ／Ｌ）であった。

ＵＦステップからの濃縮液を、６０℃で１０分間低温殺菌し、次いでアリコットをＡＰＶ噴霧乾燥機で乾燥させた。

乾燥した生成物の最終のタンパク質含有量はそのままの状態で９３．０８ｗｔ％、乾燥重量ベースで９５．４６ｗｔ％（Ｎ × ６．２５）であった（窒素のパーセンテージ値はＬｅｃｏ ＦＰ５２８ 窒素定量機を用いて求めた）。このバッチをＢＷ−ＡＬ０２２−Ｉ０２−０３Ａと命名した。

実施例２：
本実施例では、カノーラタンパク質単離物の実験室スケールのサンプルの調製について述べる。

実施例１で使用したものと同じカノーラ粗粉７５ｇを、０．１０Ｍ 生理食塩水（１５％ｗ／ｗ）５００ｍＬに添加し、混合物を回転式振とう機で２２０ｒｐｍで３０分間振とうした。１．９９ｗｔ％のタンパク質を含む抽出液を、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、ひだ付きろ紙（ｃｒｅｐｅ−ｆｌｕｔｅｄ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）でろ過した。

３５０ｍｌのろ液を、Ａｍｉｃｏｎ限外ろ過ユニットで５，０００ＭＷＣＯのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を用いて濃縮し、１５０ｍｌの濃縮液を回収した。濃縮液を、０．１Ｍ 生理食塩水３５０Ｌを用いてダイアフィルトレーション（ＤＦ）にかけて、６．２４ｗｔ％のタンパク質を含むＤＦ濃縮液７５ｍｌを生成した。

冷却した温度でＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ６〜８，０００ＭＷＣＯチューブを用いて濃縮液を透析した。透析したサンプルを凍結し、次いで凍結乾燥した。得られたカノーラタンパク質単離物は、タンパク質含有量が１０１ｗｔ％（Ｎ × ６．２５）であった。

実施例３：
本実施例では、実施例１および２で生成されたカノーラタンパク質単離物のタンパク質分析を提供する。

実施例１および２に記載のように調製したカノーラタンパク質単離物についてＨＰＬＣ分析を行った。ベンチスケールの抽出液、ベンチスケールのＤＦ透過液、およびベンチスケールのＤＦＵＦ透析したカノーラタンパク質単離物のＨＰＬＣクロマトグラムを、それぞれ図１のＡ、ＢおよびＣに示す。

２つの異なる日付のＢＷ−ＡＬ０２２−Ｉ０２−０３ＡサンプルのＨＰＬＣクロマトグラムを図２のＡおよびＢに示す。

実施例１および２に記載のように調製したカノーラタンパク質単離物の分析結果を以下の表１〜５に示す。表５は、本願の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年１０月９日出願の米国特許出願第１０／２６６，７０１号に記載のとおりに調製したサンプルの、典型的なＰＭＭ由来（Ｃ３００）および上澄み液由来（Ｃ２００）のカノーラタンパク質単離物と比較した、アミノ酸分析を含む。

このデータからわかるように、ピーク面積に基づけば、ベンチスケールの単離物（実施例２）は、Ｉ０２単離物（実施例１）より高いタンパク質比を示している。両方とも、球状タンパク質（７Ｓ、１２Ｓ、＞１２Ｓ、およびサブユニット）が、全タンパク質ピーク面積の約２／３を含み、アルブミン（２Ｓおよびプロナピン）がその他の１／３を占めることを示している。

ＨＰＬＣクロマトグラムで見出されたその他の成分は、ピーク面積に基づけば、ベンチスケールの単離物中の比較的高いフィチン酸塩のレベル、ならびにより低いフェノール類（およびその他）含有量を示している。これは、ベンチスケールの単離物が、Ｉ０２単離物より少ない遊離フェノール酸含有量しか含んでいないことを示した。波長３３０ｎｍの吸光度に基づく色の相違は、ろ過膜では除去できないタンパク質に結合したフェノール類によるものである。

Ｉ０２のＨＰＬＣ−ＳＥＣ（図２、表２）プロフィールは、２００３年９月１９日に行った最初の走査から、２００３年１２月１８日に行ったより最近のものまで、アスコルビン酸を例外として、ほとんど変化しなかった。アスコルビン酸は徐々に酸化し、この期間全体で時間の経過につれて量（ピーク面積で求めた）が減少した。その結果、表に示されるように、他の成分の比率が増加したが、これはタンパク質の比率にはほとんど影響がなかった。

ベンチスケールサンプル（抽出液、ＵＦ透過液、ＤＦ透過液、ＤＦ濃縮液、ＤＦ透析したＦＤ濃縮液の再可溶化物）（図１、表１）のＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析は、ＵＦ、ＤＦおよび透析ステップでフェノール類およびその他の成分の大部分が除去されたが、フィチン酸の除去にはより効果が少なかったことを示している。フィチン酸は、タンパク質と強く会合する傾向がある。そうであっても、フィチン酸はベンチスケールの透過液のＨＰＬＣクロマトグラム中に観察され、このことはフィチン酸が膜を通して部分的に除去されたこと（おそらく全体の２０〜３０％）を示している。

実施例１の単離物は、表に示されるように、塩およびその他のミネラルを含んでおり、それらは単離物の最終の乾燥重量の約３％に達した（表３）。毒性の成分は検出されなかった。これらの結果から、ベンチスケールの単離物は、このサンプルの調製にＤＦおよび透析ステップを使用したために、タンパク質の比率がより高くなっていることがわかる。

アミノ酸分析の結果を、表４Ａおよび４Ｂ中で「全アミノ酸１００ｇあたりのｇ」に換算した。平均値および標準偏差も示され、それらから差が最小であることが示された。これは予想されていたことである。というのは、ＤＦおよび透析ステップでは、非タンパク質が除去されるが、非タンパク質は、多くの遊離のアミノ酸およびペプチドがない限り、アミノ酸バランスに著しくは影響しないからである。

表５は、このサンプルのアミノ酸プロフィールを以前の研究の結果と比較している。この濃縮液は、（Ａ８およびＡ１０粗粉からの）以前の濃縮液ならびにＡ１０粗粉からのＰｕｒａｔｅｉｎサンプルと組成において非常に類似している。Ｐｕｒａｔｅｉｎは、ＰＭＭとＳｕｐｅｒｔｅｉｎの混合物であり、この濃縮液の分析結果に類似しているはずである。

表５はまた、Ｃ２００およびＣ３００（Ａ１０粗粉）のアミノ酸プロフィールを示している。この濃縮液およびＰｕｒａｔｅｉｎサンプルはこれら２種の単離物の間に入るが、これは予想されることである。

リシンは、穀物にはあまり多くない必須アミノ酸である。油糧種子、とりわけカノーラは、高レベルのリシンを含む傾向がある。濃縮液の分析から、かなりの量のリシンがあることが明らかになっており、このことによりこの単離物の栄養的品質（魚またはその他の人以外の飼料向けでさえも）が改善されるはずである。必須アミノ酸組成は、表５の下部に示したとおり、濃縮液単離物では非常に高い。

全体的に、分析結果によって、濃縮液Ｃ５００は、範囲がＣ２００およびＣ３００の間に及ぶ良質のアミノ酸組成をもった単離物であることが示されている。この単離物は、低いレベルの非タンパク質を含んでおり、ベンチスケール実験では、塩、フェノール類およびその他の未知の物質が限外ろ過によって除去されることが示されている。ベンチスケールの抽出液データによって示されるように、ダイアフィルトレーションおよび透析は、非タンパク質のこの除去を改善することができる。しかし、これは、Ｉ０２結果によって示されるように、単離物を生成するために必ずしも必要ではない。

開示の概要
本開示を要約すると、養殖の用途を含めた多くの用途を有するカノーラ油糧種子タンパク質単離物の、新規の調製方法が提供される。本発明の範囲内で変更が可能である。

ベンチスケール実験ＨＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムで、Ａはベンチスケール抽出液、ＢはベンチスケールＤＦ透過液、ＣはベンチスケールＤＦ透析単離物のクロマトグラムを示す。 ＢＷ−ＡＬ０２２−Ｉ０２−０３Ａ♯１Ｃ５００ＨＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムで、Ａは２００３年９月１９日のＩ０２単離物、Ｂは２００３年１２月１８日のＩ０２単離物のクロマトグラムを示す。

Claims (21)

1. カノーラタンパク質単離物を調製する方法であって、
   （ａ）カノーラ油糧種子粗粉を抽出して、該カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、タンパク質含有量が５〜４０ｇ／Ｌであり、ｐＨが５〜６．８であるタンパク質水溶液を形成すること、
   （ｂ）該カノーラ油糧種子粗粉の抽出残渣から該タンパク質水溶液を分離すること、
   （ｃ）選択膜技術を用いてイオン強度を実質上一定に保ちながら、該タンパク質水溶液のタンパク質濃度を少なくとも５０ｇ／Ｌまで増加させて濃縮したタンパク質溶液を得ること、および
   （ｄ）該濃縮したタンパク質溶液を乾燥させて、タンパク質含有量が乾燥重量に基づき少なくとも９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のカノーラタンパク質単離物を得ること
   からなることを特徴とする方法。
2. 前記カノーラタンパク質単離物が少なくとも１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含有量を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記カノーラタンパク質単離物が、
   ２Ｓカノーラタンパク質 ２５〜５５ｗｔ％、
   ７Ｓカノーラタンパク質 ４５〜７５ｗｔ％、及び
   １２Ｓカノーラタンパク質 ０〜１５ｗｔ％
   であるカノーラタンパク質プロフィールを有する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記カノーラタンパク質単離物が、
   ２Ｓカノーラタンパク質 ４０〜５０ｗｔ％、
   ７Ｓカノーラタンパク質 ５０〜６０ｗｔ％、及び
   １２Ｓカノーラタンパク質 １〜 ５ｗｔ％
   であるカノーラタンパク質プロフィールを有する、請求項３に記載の方法。
5. バッチ式で実施され、前記工程（ａ）におけるカノーラ油糧種子粗粉の抽出を、少なくとも０．０５のイオン強度を有し、ｐＨが５〜６．８の水性塩溶液を用い、少なくとも５℃の温度で、５〜４０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有するタンパク質溶液が得られるように実施する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記水性塩溶液が０．１〜０．６のイオン強度を有する、請求項５に記載の方法。
7. 前記水性塩溶液が５．３〜６．２のｐＨを有する、請求項５または６に記載の方法。
8. 前記工程（ａ）におけるカノーラ油糧種子粗粉の抽出を、前記水性塩溶液を１０〜３０分間撹拌しながら実施する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記工程（ａ）におけるカノーラ油糧種子粗粉の抽出中の前記水性塩溶液中のカノーラ油糧種子粗粉の濃度が５〜１５ｗｔ％である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記工程（ａ）におけるカノーラ油糧種子粗粉の抽出から得られる前記タンパク質溶液が、１０〜３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記水性塩溶液が酸化防止剤を含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 連続式で実施され、前記抽出ステップが、
    （ｉ）前記カノーラ油糧種子粗粉を、イオン強度が少なくとも０．０５でｐＨが５〜６．８の水性塩溶液と、５〜６５℃の温度で連続的に混合し、
    （ｉｉ）１０分までの時間、該カノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出しながら、該混合物をパイプで連続的に搬送し、タンパク質含有量が５〜４０ｇ／Ｌのタンパク質水溶液を形成することによって実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記水性塩溶液が０．１〜０．６のイオン強度を有する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記水性塩溶液が５、３〜６．２のｐＨを有する、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 前記工程（ｉ）の混合における前記水性塩溶液中のカノーラ油糧種子粗粉の濃度が５〜１５％ｗ／ｖである、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記工程（ｉ）の混合における温度が少なくとも３５℃である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記工程（ｉｉ）において、前記タンパク質水溶液が１０〜３０ｇ／Ｌのタンパク質含有量を有する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記水性塩溶液が酸化防止剤を含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記カノーラ油糧種子粗粉を水で抽出し、それに続いて、得られたタンパク質水溶液に塩を添加して、少なくとも０．０５のイオン強度を有するタンパク質水溶液を得る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記塩を添加した後のタンパク質水溶液が、０．１〜０．６のイオン強度を有する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記濃縮ステップを限外ろ過によって実施して、タンパク質濃度が少なくとも２００ｇ／Ｌの濃縮タンパク質溶液を得る、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。