KR20010025107A - 치료제 - Google Patents

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이카이가츠시게
사가와히로아키
가토이쿠노신
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오미야 히사시
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Abstract

활성 성분으로서 화학식(I)의 성분, 화학식(II)의 성분, 및 그의 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 치료 또는 예방을 위하여 세포자멸의 유발을 필요로하는 질병, 암질병, 치료 또는 예방을 위하여 활성 산소 생산의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 일산화 질소 생산의 억제를 요구하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 프로스타글란딘 합성의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 활막(syonovial) 세포 증식의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 열 쇼크 단백질 생산의 유도를 필요로하는 질병, 또는 치료 또는 예방을 위하여 α-글리코시다제의 억제를 필요로하는 질병용 치료제 또는 예방제:
상기 식에서,
X 및 Y는 H 또는 CH2OH이고, 단 X가 CH2OH일 때, Y가 H 이고, X가 H일 때, Y는 CH2OH 이며,
R은 SH 그룹-함유 화합물로부터 SH 그룹을 유리시켜 얻어진 잔기이다;
및 화학식(I)의 성분, 화학식(II)의 성분, 및 그의 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 식품, 음료, 화장품등.

Description

치료제{Therapeutic agents}
최근, 세포자멸(apoptosis)(세포의 자폭 또는 자기-파괴)이라고 불리는 세포 또는 조직의 사망 방식에 관심이 끌리고 있다.
세포자멸은 세포의 게놈에 본래 프로그램되어 있는 사망이고, 병인론적 세포사인 괴사와는 다르다. 특히, 하기 과정이 세포사에 이르게 하는 것으로 고려된다. 특정의 외부 또는 내부 인자(들)에 의해 유인되는(triggered) 세포자멸을 프로그램한 유전자의 활성화는 프로그램된 사망 단백질의 생합성을 야기한다. 일부 경우에, 불활성 형태로 세포내에 존재하는 프로그램된 사망 단백질은 활성화된다. 이렇게 생성된 활성 프로그램된 사망 단백질은 세포를 파괴한다.
원하는 조직 또는 세포에서 세포자멸의 유발은 매우 가치가 있는데, 그이유는 자연적인 방법으로 생체로부터 불필요하거나 해로운 세포를 제거하는 것을 가능하게 하기 때문이다.
본 발명은 천연물질로부터 유래된 생리학적으로 활성인 물질의 이용에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 생리학적으로 활성인 물질, 그 물질을 제조하는 방법, 활성 성분으로서 생리학적으로 활성인 물질을 함유하는 약제학적 조성물, 식품 또는 음료, 항산화제 조성물, 신선도를 보존하기 위한 조성물 및 화장품 조성물에 관한 것이다.
도 1은 샘플 2의 순상(normal phase) HPLC 크로마토그램을 예시한다.
도 2는 체류시간이 4.05 내지 4.16분인 분획의 매스 스펙트럼을 예시한다.
도 3은 체류시간이 4.05 내지 4.16분인 분획의1H-NMR 스펙트럼을 예시한다.
도 4는 DGE의 존재하에서 다양한 배양 조건하에서 배양하여 수득된 배지중의 NO2 -농도를 예시한다.
도 5는 DGE가 예비-배양동안 첨가되는 다양한 배양 조건하에서 인큐베이팅하여 수득된 배지중의 NO2 -농도를 예시한다.
도 6은 DGE가 예비-배양동안 첨가되는 다양한 배양 조건하에서 인큐베이팅하여 수득된 배지중의 프로스타글란딘 E2농도를 예시한다.
도 7은 DGE와 GSH사이의 반응 생성물의 매스 스펙트럼을 예시한다.
도 8은 DGE와 GSH사이의 반응 생성물의1H-NMR 스펙트럼을 예시한다.
도 9는 DGE와 GSH사이의 반응 생성물의13C-NMR 스펙트럼을 예시한다.
도 10은 DGE의 존재하에서 배양됐을 때3H-티미딘 섭취를 예시한다.
본 명세서에서 사용된바, 3,6-언하이드로갈락토즈는 화학식(III)의 3,6-언하이드로갈락토피라노즈:
화학식(IV)의 그의 알데하이드:
또는 화학식(V)의 그의 수화물이다:
또한, 이는 그의 설페이트화 유도체 및 메틸화 유도체를 포함한다. 화학식(III) 내지 (V)에 의해 나타내지는 화합물의 구조는 다른 표현 형태를 사용하여 나타내질 수 있다. 화학식(III) 내지 (V)의 화합물은 이러한 다른 표현 형태 로 나타내지는 화합물 및 그들의 가능한 호변이성체를 포함한다. 또한, 화학식(III) 내지 (V)의 배위는 원하는 활성이 발휘되는 한 특정한 것에 제한되지 않는다. D-형태 또는 L-형태, 또는 그의 혼합물이 사용될 수 있다.
예를들어, 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물은 본 발명에서의 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질을 pH 7 미만의 산성 조건하에서의 가수분해 및/또는 효소적 분해에의해 제한없이 수득될 수 있다. 다르게는, 이는 화학적으로 합성될 수 있다.
본 발명에서 바람직하게 사용된 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물은 예를들어 비환원 말단이 환원 말단에 아가로비오즈, k-카라비오즈 또는 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는, 아가로비오즈 및 k-카라비오즈이외의 올리고사카라이드와 같은, L-갈락토즈-6-설페이트이외의 슈가인 가용성 사카라이드를 포함한다. 아가로올리고사카라이드, 즉 비-환원 말단이 L-갈락토즈인 사카라이드는 프로드러그로서 매우 적절하다.
본 발명의 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질의 예는 제한되는 것은 아니지만 한천, 아가로즈, 아가로펙틴, 푸노란, 포르피란, 카라기난, 푸르셀라란 및 하이프니안과 같은 적조류로부터의 점성 폴리사카라이드를 포함한다[Kyoritsu-shuppan Inc., "Tatouseikagaku 1-Kagakuhen-(Biochemistry of Polysaccharides 1-Chemistry-), pp. 314 (1969)]. 본 발명에서 사용된 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질은 또한 이들 폴리사카라이드를 함유하는 물질을 함유한다.
예를들어, 겔리디움 아만시(Gelidium amansii), 겔리디움 자포니쿰(Gelidium japonicum), 겔리디움 파시피쿰(Gelidium pacificum), 겔리디움 서브코스타툼(Gelidium subcostatum), 프테로클라디아 테누이스(Pterocladia tenuis) 및 아칸토펠티스 자포니카(Acanthopeltis Japonica)와 같은 겔리디아시(Gelidiaceae)에 속하는 적조류, 그라실라리아 베루코사(Gracilaria verrucosa) 및 그라실라리아 기가스(Gracillaria gigas)와 같은 그라실라리아시(Gracilariaceae)에 속하는 적조류, 세라미움 콘도이(Ceramium Kondoi) 및 캄필라에포라 하이프나에오이데스(Campylaephora hyponaeoides)와 같은 세라미아시(Ceramiaceae)에 속하는 적조류 및 다른 적조류가 아가로즈 및 아가로펙틴용 원료로서 사용된다. 보통, 수종류의 조류가 원료로서 배합되어 사용된다. 겔리디움(Gelidium) 젤리는 원료 조류를 뜨거운 물로서 추출하고, 이어서 추출물을 냉각하여 수득한다. 한천은 겔리디움 젤리를 냉동-탈수시키거나 압축-탈수시키고 건조시켜 젤리디움 젤리로부터 물을 제거하여 수득한다. 한천은 보통 약 70%의 아가로즈와 약 30%의 아가로펙틴을 함유한다. 한천은 고순도의 아가로즈를 제조하기 위하여 추가로 정제될 수 있다.
본 발명에서 사용된 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질은 상기 언급된 한천용 원료 조류, 겔리디움 젤리, 한천, 정제된 아가로즈, 정제된 아가로펙틴 및 이들 물질의 제조동안 수득되는 중간체 생성물 또는 부산물을 포함한다.
보통 태양아래서 건조된 조류가 원료로서 사용된다. 신선한 조류 및 건조된 조류 모두 본 발명에서 사용될 수 있다. 건조동안 물을 분무하는 동안 표백되는 조류, 소위 표백된 조 조류 또한 사용될 수 있다. 바, 벨트, 판지, 실 및 분말을 포함하는 다양한 형태의 한천이 공급 조류에 관계없이 사용될 수 있다. 저순도 또는 고순도로 다양한 아가로즈 함량을 갖는 정제된 아가로즈가 사용될 수 있다.
아가로즈는 D-갈락토즈와 3,6-언하이드로-L-갈락토즈가 번갈아 함께 결합된 주요 구조를 갖는 폴리사카라이드이다. 상기 구조에서, D-갈락토즈의 1 위치가 β-글리코시드 결합을 통해 3,6-언하이드로-L-갈락토즈의 4위치에 결합되어 있고, 3,6-언하이드로-L-갈락토즈의 1-위치가 α-글리코시드 결합을 통해 D-갈락토즈의 3-위치에 결합되어 있다. α-1,3-결합은 묽은 산에 의한 온화한 가수분해 또는 α-아가라제에 의해 선택적으로 가수분해된다[Carbohydr. Res., 66: 207(1978)]. β-1,4-결합은 β-아가라제에 의해 선택적으로 가수분해된다.
카라기난은 기가티나시(Gigatinaceae), 솔리에리아시(Solieriaceae), 하이프니아시(Hypneaceae) 등에 속하는 적조류에 함유되어 있는 폴리사카라이드이다. κ-카라기난, λ-카라기난 및 η-카라기난이 알려져 있다. κ-카라기난은 D-갈락토즈-4-설페이트의 1-위치가 β-글리코시드 결합을 통해 3,6-언하이드로-D-갈락토즈의 4-위치에 결합되어 있고, 3,6-언하이드로-D-갈락토즈의 1-위치가 α-글리코시드를 결합을 통해 D-갈락토즈-4-설페이트의 3-위치에 결합되며, 이들이 번갈아 반복되는 기본 구조를 갖는다. λ-카라기난은 D-갈락토즈의 1-위치가 β-글리코시드 결합을 통해 D-갈락토즈-2,6-디설페이트의 4-위치에 결합되어 있고, D-갈락토즈-2,6-디설페이트의 1-위치가 α-글리코시드를 결합을 통해 D-갈락토즈의 3-위치에 결합되어 있으며, 그들이 번갈아 반복되는 기본 구조를 갖는다. 카라기난은 식품용 겔화제(gelling agent)로서 이용된다.
화학적, 물리적 및/또는 효소적 수단에 의해 수득된 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질의 부분적 분해 생성물은 또한 본 발명에서 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질로서 사용될 수 있다. 또한, 환원 말단에 3,6-언하이드로가락토즈를 갖는 화합물은 화학적, 물리적 및/또는 효소적 수단에 의해 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질을 부분 분해하여 제조할 수 있다.
환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 함유하는 정제된, 부분적으로 정제된 또는 조물질은 목적에 따라 본 발명에서 사용될 수 있다.
3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질의 화학적 분해수단의 예는 pH 7 미만의 아래의 산성 조건하의 가수분해를 포함한다. 물리적 분해 수단의 예는 전자기파 또는 초음파의 조사를 포함한다. 효소 분해의 수단의 예는 아가라제 및 카라기나제와 같은 하이드로라제에 의한 가수분해를 포함한다.
pH 7미만의 산성 조건하에서 3,6-언하이드로가락토즈-함유 물질을 분해하기 위하여 사용된 조건은 분해가 환원 말단에 아가로비오스, κ-카라비오즈 또는 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는, 아라비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물과 같은 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 생성하는 한 특정한 것에 한정되지 않는다.
예를들어, 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물은 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질을 0.0001 내지 5 N의 농도의 산에 용해시키거나 현탁시키고 혼합물을 수초 내지 수일동안 반응시켜 제조한다. 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 제조하는데에 요구되는 반응 시간은 반응동안 혼합물을 가열하여 단축된다.
어떠한 산도 3,6-언하이드로가락토즈-함유 물질을 용해시키거나 현탁시키는데에 사용될 수 있다. 염산, 황산 및 질산과 같은 무기산 및 시트르산, 포름산, 아세트산, 락트산 및 아스코브산과 같은 유기산이 사용될 수 있다. 산은 제한없이 0.0001 내지 5 N, 바람직하게는 0.001 내지 1N의 농도로 사용될 수 있다. 또한, 반응은 제한없이 0 내지 200℃, 바람직하게는 20 내지 130℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 반응은 제한없이 수초 내지 수일동안 수행될 수 있다. 산 및 그의 농도, 및 온도 및 반응 시간은 적절하게 선택될 수 있다. 이러한 선택은 다음에 따라 좌우된다: 아가로즈 또는 카라기난과 같은 원료로서 사용되는 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질; 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈와 같은 흥미로운 환원 말단에 3,6-언하이드로가락토즈를 갖는 화합물 및 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는, 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물의 수율; 및 흥미로운 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는, 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물의 중합도. 일반적으로, 산 분해 반응은 약한 산보다 강산, 낮은 산 농도보다 높은 산 농도, 및 저온보다 고온을 선택하여 보다 빠르게 진행한다.
예를들어, 10중량%의 농도로 0.1 N HCl중에 한천을 현탁시키고, 한천을 100℃에서 13분동안 가열하여 용해시켜 수득된 산 분해 생성물은 용액이 그의 냉동점으로 냉각되어도 더 이상 겔화(gelate) 되지 않는다. 용액중에 함유된 당류를 겔 여과 HPLC, 순상(normal phase) HPLC등으로 분석했을 때, 고분자량의 당류는 거의 관찰되지 않고, 대부분의 당류는 10개 또는 그미만의 당(sugar)으로 구성된 가용성 당류로 분해된 것으로 밝혀졌다.
예를들어, 본 발명에서 사용된 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈 이외의 화합물은 제한없이 당이 3,6-언하이드로갈락토즈의 1-위치이외의 하이드록사이드 그룹에 결합된 것이다. 그의 예는 아가로비오즈, 아가로테트라오즈, 아가로헥사오즈, 아가로옥타오즈 및 아가로데카오즈와 같은 아가로즈를 산으로 분해하거나, 또는 α-아가라제로 분해하여 수득된 생성물을 포함한다. 또한, 카라기난을 산으로 분해하거나 카라기나제로 분해하여 수득된 생성물이 또한 예시될 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용된 환원 말단에 3,6-언하이드로칼락토즈를 갖는 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물은 다음으로부터 선택된 하나이상이 3,6-언하이드로갈락토즈의 1-위치에 있는 것이외의 하이드록시 그룹에 결합된 것을 포함한다: 글루코즈, 만노즈 및 갈락토즈와 같은 헥소즈; 크실로즈, 아라비오즈 및 리보즈와 같은 펜토즈; 글루쿠론산, 갈락투론산, 만누론산 및 글루쿠론산과 같은 우론산; 글루코자민 및 갈락토자민과 같은 아미노당; N-아세틸뉴라민산과 같은 시알산; 퓨코즈와 같은 데옥시 슈가; 및 에스테르, 그의 아미드 및/또는 락톤.
또한, 다음의 것이 본 발명에서 사용된 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물로 정의된다: 피루베이트 그룹 및/또는 설페이트 그룹이 환원 말단에 3,6-언하이드로칼락토즈를 갖는, 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물 및 하이드록시 그룹이 메틸화된 것.
환원 말단의 3,6-언하이드로가락토즈의 1-위치에 있는 탄소가 아노머(anomer) 탄소이기 때문에, 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물에 대해 α-이성체 및 β-이성체가 존재한다. 어느 것도 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물로서 본 발명에서 사용될 수 있다. 또한, 환원 말단의 3,6-언하이드로갈락토즈의 1 위치에 알데히드를 갖는 것이 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물로서 사용될 수 있다. 3,6-언하이드로갈락토즈의 D-이성체 또는 L-이성체가 사용될 수 있다. 또한, α-이성체, β-이성체 및 알데히드의 혼합물 및 D-이성체 및 L-이성체의 혼합물이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 세포자멸-유발 물질은 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물(예를들어, 아가로비오즈, κ-카라비오스 또는 3,6-언하이드로갈락토즈를 환원 말단에 갖는, 아가로비오스 및 κ-카라비오즈이외의 화합물)을 중성 내지 알칼리성 조건하에서 처리하여 수득될 수 있다. 또한 이는 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질을 7이하의 pH에서 산 분해하고/하거나 효소 분해하고, 산 분해 및/또는 효소 분해 생성물을 중성 내지 알칼리성 조건하에서 처리하여 수득될 수 있다.
pH 7이상의 알칼리성 조건하에서 화합물을 처리하는데 있어서, 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물, 예를들어 환원 말단에 아가로비오즈, κ-카라비오즈 또는 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는, 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물로 부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 용해시키거나 현탁시키는데에 어떠한 알칼리도 사용될 수 있다. 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 칼슘 및 암모늄과 같은 무기 염기 및 트리스, 에틸아민 및 트리에틸아민과 같은 유기 염기가 사용될 수 있다. 알칼리는 제한되지 않지만 0.0001 내지 5 N, 바람직하게는 0.001 내지 1N의 농도에서 사용될 수 있다. 또한, 반응은 제한되지 않지만 0 내지 200℃, 바람직하게는 20 내지 130℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 반응은 제한되지 않지만 수초 내지 수일동안 수행될 수 있다. 알칼리 및 그의 농도, 및 반응 온도 및 시간은 적절히 선택될 수 있다. 이러한 선택은 다음에 따른다: 원료로서 사용된 화합물; 및 목적하는 세포자멸-유발 물질의 수율. 일반적으로, 본 발명의 세포자멸-유발 물질의 생산은 저 알칼리 농도보다 고알칼리 농도(7이상의 어떤 pH도 사용될 수 있지만), 및 저온 보다 고온을 선택하여 보다 빠르게 진행한다.
예를들어, 본 발명의 세포자멸-유발 물질은 pH 11.5에서 아가로비오즈 또는 κ-카라비오즈의 용액을 제조하고, 이를 37℃에서 5분간 인큐베이팅하여 제조된다.
본 발명의 이렇게 생산된 세포자멸-유발 물질을 함유하는 알칼리성 용액은 목적에 따라 중화된후, 또는 pH 7미만의 산성 용액으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 세포자멸-유발 물질의 세포자멸-유발 활성은 지표로서 예를들어 종양 세포에 대한 항증식 활성을 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 세포자멸-유발 물질은 지표로서 활성을 사용하여 정제할 수 있다. 화학적 및 물리적 수단을 포함하는 공지된 정제 수단이 사용될 수 있다. 물질은 겔 여과, 분자량 분획막을 사용한 분획, 용매 추출 및 이온 교환 수지를 이용한 다양한 크로마토그래피 또는 조합한 것등과 같은 정제 수단을 사용하여 정제할 수 있다.
정제된 형태의 본 발명의 세포자멸-유발 물질은 상기 기술된 바와 같은 화학식(I) 의 화합물에 의해서 예시될 수 있다.
예를들어, X가 CH2OH이고, Y가 H인 화학식(I)의 화합물은 중성 내지 알칼리성 조건하에서 아가로비오즈를 처리하여 수득된 생성물로부터 정제된다. 다른한편, X가 H이고, Y가 CH2OH인 화학식(I)의 화합물은 κ-카라비오즈를 중성 내지 알칼리성 조건하에서 처리하여 수득된 생성물로부터 정제된다.
본 발명에서 사용된 화학식(I)의 화합물은 3,6-언하이드로갈락토즈 또는 그의 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물(예를들어, 환원 말단에 아가로비오즈, κ-카라비오즈 또는 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는, 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물)을 상기 기술된 바와 같이 중성 내지 알칼리성 조건하에서 처리하여 생산한다. 본 발명은 본 발명에서 사용된 화학식(I) 의 화합물, 및 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물의 생리학적 활성의 발현을 목적으로 하는 용도를 포함한다.
본 발명은 생체내에서 본 발명의 화학식(I)의 화합물의 활성의 발현을 목적으로 하는 프로드러그의 사용을 포함한다. 기관 또는 조직에 친화성을 갖는 리간드를 갖는 3,6-언하이드로갈락토즈는 바람직하게는 프로드러그로서 사용된다. 이러한 프로드러그는 세포에 혼입된후 생리학적 조건하에서 화학식(I) 의 화합물로 전환되고, 다양한 생리학적 기능을 나타내다. 갈락토즈가 리간드로서 예시된다. 다른 것중에서 간 조직을 효율적으로 표적화 하는 것은 리간드로서 갈락토즈를 사용하여 달성된다. 이러한 리간드를 갖는 화합물은 비환원 말단에 갈락토즈를 갖는 아가로비오즈, 아가로헥사오즈 및 아가옥타오즈와 같은 아가로올리고사카라이드를 포함한다. 아가로올리고사카라이드는 프로드러그로서 유용하다.
인간은 장기간 비환원 말단에 갈락토즈를 갖는 아가로올리고사카라이드를 섭취해왔다. 아가로올리고사카라이드는 환원 말단에 있는 3,6-언하이드로갈락토즈가 중성 내지 알칼리성 조건하에서 유리되어 화학식(I)의 화합물로 전환된후, 생리학적 활성을 나타낸다. 즉, 프로드러그로서 체내에 흡수된 아가로올리고사카라이드는 화학식(I)의 화합물로 전환된후, 생리학적 활성을 나타낸다. 아가로올리고사카라이드는 효율적인 흡수를 위해 적절한 분자량을 갖는다. 그러므로, 이들은 소화관에서 쉽게 흡수된다. 또한, 비환원 말단에 있는 갈락토즈는 아가로올리고사카라이드가 간에서 활성적으로 흡수되게 하고, 간을 통과하는 혈류에서 그의 순환을 용이하게 한다. 흡수된후, 아가로올리고사카라이드는 비환원 말단에 있는 갈락토즈에 친화성을 갖는 조직의 국소에서 화학식(I)의 화합물로 전환되어 생리학적 활성을 나타낸다. 따라서, 아가로올리고사카라이드는 프로드러그로 투여될 수 있으며, 이 프로드러그는 매우 안정하고, 효율적으로 혼입되고, 농축된 상태로 국소에서 화학식(I)의 화합물로 전환되어 생리학적 활성을 나타낸다.
화학식(I)의 화합물의 염은 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 공지된 방법이 화합물을 염으로 전환시키는데에 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 화학식(II)의 화합물은 화학식(I)의 화합물을 SH 그룹-함유 화합물과 반응시켜 수득된 반응 혼합물중에 생성된다.
사용되는 SH 그룹-함유 화합물의 예는 제한되는 것은 아니지만 메탄티올, 부탄티올, 머캅토에탄올, SH 그룹-함유 아미노산 및 SH 그룹-함유 아미노산 유도체를 포함한다. SH 그룹-함유 아미노산의 예는 시스테인 및 호모시스테인을 포함한다.
SH 그룹-함유 아미노산 유도체의 예는 상기-언급된 아미노산의 유도체, 예를들어 시스테인 유도체, 시스테인-함유 펩타이드 및 시스테인 유도체-함유 펩타이드를 포함한다. 시스테인-함유 펩타이드는 펩타이드가 그의 구성으로서 시스테인을 갖는한 특정한 것으로 제한되지 않는다. 본 발명의 시스테인-함유 펩타이드는 올리고펩타이드(예를들어, 글루타치온)와 같은 작은 분자 및 단백질과 같은 거대 분자를 포함한다. 또한, 시스틴 또는 호모시스틴을 함유하는 펩타이드는 예를들어 환원 조건하에서 반응동안 시스테인- 또는 호모시스테인 펩타이드를 생성시키는 조건하에서의 처리를 혼입시켜 본 발명의 시스테인- 또는 호모시스테인-함유 펩타이드로 사용될 수 있다. 시스테인-함유 펩타이드는 또한 당류, 지질 등을 함유하는 시스테인-함유 펩타이드를 포함한다. 다르게는, 상기 기술된 바와 같은 다양한 물질의 염, 산 무수물, 에스테르등이 사용될 수 있다.
화학식(II)의 화합물을 생산하기 위한 화학식(I) 의 화합물과 SH 그룹-함유 화합물사이의 반응은 공지된 반응 조건하에서 수행될 수 있다. 반응은 SH 그룹-함유 화합물의 SH-그룹이 반응성인 어떤 조건에서도 수행될 수 있다.
화학적 및 물리적 수단을 포함하는 정제를 위한 공지 수단이 화학식(I)과 SH 그룹-함유 화합물 또는 그의 유도체를 반응시켜 생성된 화학식(II)의 화합물을 정제 및 분리시키는데에 사용될 수 있다.
화학식(I)의 화합물은 예를들어 생체내에서 시스테인 및 글루타치온과 같은 SH 그룹-함유 화합물과 반응하여 약제학적으로 유용한 화학식(II)에 의해 나타내지는 대사(metabolic) 유도체를 생성한다. 따라서, 대사 유도체에 의해 나타내지는 약제 효과는 화학식(I)의 화합물을 투여하여 또한 수득될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 생체내에서 화학식(II)의 화합물의 생성을 목적으로 하는 화학식(I)의 화합물의 사용을 포함한다.
화학식(II)의 화합물의 염은 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 공지된 방법이 화합물을 염으로 전환시키는데에 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염은 생리학적 활성, 예를들어 세포자멸-유발 활성, 항암성의 활성, 항산화제 활성, 예를들어 활성 산소 생성 억제 활성, 과산화지질 라디칼 생성의 억제 활성, 일산화질소 생성 억제 활성, 병인성 미생물에 대한 항미생물 활성, 항돌연변이원 활성, α-글리코시다제 억제 활성, 면역조절 활성, 프로스타글란딘 합성 억제 활성, 항-염증 활성, 항알레르기 활성, 사이토킨 생성 조절 활성, 항류마티즘 활성, 항당뇨병 활성, 활막 세포 증식 억제 활성, 및 열 쇼크 단백질 생산 유발 활성을 갖는다. 이들 활성에 기인하여, 다음 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 질병은 치료 또는 예방을 위해 세포자멸의 유발을 필요로하는 질병, 암 질병, 치료 또는 예방을 위하여 활성 산소 생성 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 과산화지질 라디칼 생산의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 일산화질소 생산의 억제를 필요로하는 질병, 병원성의 미생물에 의해 야기되는 질병, 돌연변이원에 의해 유발되는 질병, 치료 또는 예방을 위해 α-글리코시다제의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 면역조절을 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 프로스타글란딘 합성의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 염증의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 알레르기의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 사이토카인 생산의 조절을 필요로하는 질병, 류마티즘, 당뇨병, 치료 또는 예방을 위하여 활막 세포 증식의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 열 쇼크 단백질 생산의 유발을 필요로하는 질병. 달리말하면, 다음 약제학적 조성물이 제조될 수 있다. 세포자멸 유발용 조성물, 항암 조성물, 항산화제 조성물, 예를들어 활성 산소 생산 억제 조성물, 과산화지질 라디칼 생산 억제용 조성물 및 일산화 질소 생산 억제용 조성물, 항미생물 조성물, 항바이러스 조성물, 항돌여변이원 조성물, 항고혈당(anti-hyperglycemic) 조성물, 항고지혈증 조성물, 면역조절 조성물, 프로스타글란딘 합성 억제용 조성물, 항염증 조성물, 항알레르기 조성물, 사이토카인 생산 조절 조성물, 활막 세포 증식 억제용 조성물, 항류마티즘 조성물, 항당뇨병 조성물, 및 열 쇼크 단백질 생산 유발 조성물.
활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 본 발명의 세포자멸 유발용 조성물은 자가면역 질병, 종양 세포, 바이러스등으로 감염된 세포를 갖는 환자로부터 자가-반응성(autoreactive) 림프구를 제거하는데에 유용하다. 이는 원하는 조직 또는 세포에서 세포자멸을 유발하여 자연적인 방법으로 생체내에서 불필요하거나 해로운 세포를 제거하는데에 사용될 수 있다. 본 발명의 세포자멸을 유발하기위한 조성물이 효과적인 질병의 예는 자가면역 질병, 예를들어 전신성 홍반성 낭창, 면역-중재된 신염, 다발성 경화증 및 콜라겐 질병, 및 류마티즘을 포함한다.
본 발명의 세포자멸을 유발하기위한 조성물은 세포자멸을 유발하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 이 방법은 세포자멸 유발의 메카니즘을 밝히고, 세포자멸의 유발자 및 세포자멸 유발 억제제를 스크리닝하는데에 유용하다.
본 발명의 세포자멸 유발용 조성물의 세포자멸-유발 활성은 IL-1β 전환 효소 억제제 V [Z-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-플루오로메틸케톤:Takara Shuzo]와 같은 카스파제(caspase) 억제제에 의해 억제된다. 따라서, 조성물에 의해 유발되는 세포자멸은 카스파제에 의해 좌우되는 세포자멸에 의한 세포사인 것으로 여겨진다.
카스파제는 다음 이유로 세포자멸의 중요한 중재자로서 기능을 하는 것으로 입증되었다. 이는 다양한 세포사 전에 증가된다. 그의 과발현은 세포사를 유발한다. 세포자멸은 CrmA 및 p35와 같은 펩타이드 억제제 또는 억제 단백질에 의해 억제되고; 세포자멸은 정상적인 것과 비교된바 카스파제-1 또는 카스파제-3 경우 녹아웃(knockout) 마우스에서 부분적으로 억제된다[Seikagaku (Biochemistry), 70:14-21(1998)]. 즉, 시스테인 프로테아제, 카스파제는 세포자멸과정동안 활성화되어 핵 또는 세포질의 단백질을 분해한다. 카스파제는 먼저 전구체로서 합성되고, 이어서 진행동안 활성화된다. 카스파제 활성화 경로의 조절은 세포의 운명을 결정한다. 포유동물은 10가지 또는 그이상 유형의 카스파제를 갖는다. 상류 카스파제가 하류 카스파제로 진행하여 캐스케이드 방식으로 세포내 단백질 분해 활성을 증폭시킨다[Saibo Kogaku (Cell Technology), 17:875-880(1998)]. 대조적으로, 시스테인 프로테아제, 카스파제의 억제제를 이용한 처리 활성의 억제는 카스파제-의존 세포자멸에 기인한 세포사를 멈추게 할 수 있다.
본 발명에서 사용된 화학식(I), 화학식(II) 및 그의 염은 활성 산소와 같은 산화 물질의 생산을 억제하는데에 유용하다. 그러므로, 활성 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 활성 산소 생산 억제용 조성물과 같은 항산화제 조성물은활성 산소의 생산 및/또는 과잉에 의해 야기되는 질병을 치료하거나 방지하는데에 유용하다.
활성 산소는 일반적으로 라디칼 활성 산소 및 비-라디칼 활성 산소로 분류될 수 있다. 라디칼 활성 산소는 하이드록시 라디칼, 하이드록시퍼옥시 라디칼, 퍼옥시 라디칼, 알콕시 라디칼, 이산화 질소, 산화 질소(이하, NO라고 언급함), 틸라디칼(thylradical) 및 슈퍼옥사이드를 포함한다. 다른한편, 비-라디칼 활성 산소는 일중항(singlet) 산소, 과산화 수소, 지질 하이드로퍼옥사이드(lipid hydroperoxide), 차아염소산, 오존 및 퍼옥소니트리트를 포함한다. 이들 모두는 다수의 병리학적 상태, 예를들어 다양한 염증 질병, 당뇨병, 암 동맥 경화증, 신경 질병 및 허혈성 재관류 질환에 포함된다.
활성 산소는 항상 생체내에서 수개의 경로를 통해 낮은 농도로 생산된다. 이렇게 생산된 활성 산소는 피할 수 없고, 다음을 포함한다: 마토콘드리아와 같은 전자 수송 시스템으로부터 생리학적으로 누출되는 슈퍼옥사이드 및 과산화 수소, 생산이 구리 및 철과같은 전이 금속에 의해 촉매되는 하이드록시 라디칼, 감염에 대한 방어를 위해 호중구(neutrophils) 또는 단핵세포에 의해 생성되는 차아염소산 및 아르기닌의 분해에 의해 생성된 NO. 생체는 생산과 제거사이에 균형을 유지하기 위하여 활성 산소의 생산에 대한 효소 및 소분자 화합물을 포함하는, 활성 산소를 제거하기위한 시스템을 갖는다. 그러나, 생체는 몇가지 이유로 생산 시스템의 활성화에 기인하거나, 대조적으로 제거 시스템의 불활성화에 기인하여 생산 시스템이 제거 시스템에 우위를 점한다면 산화적으로 손상을 입는다. 이런 상태를 산화적 스트레스라고 부른다. 또한 내부 불균형외에, 생체는 항상 대기 및 식품과 같은 외부 물질에 기인하여 산화적 스트레스에 노출된다. 그러므로, 산화적 스트레스는 모든 사람의 1일 생활에서 불가피한다.
달리말하면, 생체는 상기 기술된 바와 같은 다양한 질병에 관여하는 산화적 스트레스에 기인하여 질병을 야기하거나 질병을 악화시키는 환경에 항상 노출되어 있다. 그러므로, 본 발명의 활성 산소 생산을 억제하기 위한 조성물과 같은 항산화제 조성물은 산화적 스트레스에 의해 야기되는 질병을 예방하고 치료하거나 산화적 스트레스에 기인한 질병 상태의 악화를 방지하는데에 또한 유용하다.
지질 과산화 반응은 항상 산화적 스트레스와 결합되어 있다. 일단 지질 과산화물 라디칼이 생성되면 반응이 진행된다. 반응에서 생산된 4-하이드록시-2-노넨알(HNE)은 글루타치온 또는 단백질을 특이적으로 목표화하는 독성 알데하이드이다. HNE와 단백질 사이의 반응의 생성물은 다양한 질병 조직에서 검출되고, 산화적 스트레스와 결합된 질병 상태의 유발자로 여겨진다. 따라서, 활성 성분으로서 지질 과산화물 라디칼의 생산을 억제할 수 있는 본 발명에서 사용된 항산화제 물질(즉, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염)을 함유하는 항산화제 조성물은 산화적 스트레스에 의해 야기되는 연령-관련된 질병을 예방하거나 치료하는데에 유용하다.
NO는 내피-유래된 이완인자(EDRF)의 필수 성분이다[Nature, 327:524-526(1987)]. 본 발명은 치료 또는 예방을 위하여 NO 생산의 억제를 필요로하는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 치료 또는 예방을 위해 NO 생산의 억제를 요구하는 질병의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 독성 쇼크에 의해 야기되는 전신 저혈압, 특정의 사이토카인 등에 의한 치료, 혈압 반응에서의 감소, 당뇨병, 혈관기능장해, 질병에 의해 야기되는 혈관 확장증, 조직 손상, 심장혈관 허혈, 통상과민, 뇌 허혈, 혈관신생을 수반하는 질병 등을 포함한다.
산화질소 합성효소(NOS)는 L-아르기닌 및 산소로부터 L-시트룰린 및 NO를 생산한다. 구성적으로 발현되는 cNOS 및 유도성 iNOS는 NOS 경우 알려진 것이다. iNOS는 LPS 및 IFN-γ와 같은 사이토카인 또는 세포독소로 자극하여 유발되어 대식세포등에서 NO를 생산한다. iNOS 자체는 유기체의 시스템을 유지하는데에 필수적이다. 다른한편, iNOS는 다양한 인자에 기인하여 과발현됐을 때 다양한 질병을 야기하고 과잉의 NO를 생산하는 것이 입증되었다.
본 발명은 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염이 iNOS의 발현을 억제한다는 것을 확인했다. 확인은 웨스턴 블로팅을 사용하여 단백질 수준에서 및 RT-PCR을 사용하여 메신저 RNA에서 수행하였다. 따라서, 본 발명에서 사용된 화학식(I), 화학식(II) 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물은 다양한 인자에 기인하여 과발현되어 과잉의 NO를 생산하는 iNOS의 발현을 억제한다. 그러므로, 본 화합물은 치료 및 예방을 위해 NO 생산의 억제를 필요로하는 질병을 치료 및 예방하는데에 효과적이다.
본 발명에서 사용된 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염은 대식세포에서 NO 생산을 억제한다. 따라서, 이들은 대식 세포에서 NO 생산에 의해 야기되는 질병, 발암등을 치료 및 예방하는데에 유용하다. 본 발명에서 사용된 화합물에 의한 NO 생산의 억제는 LPS 또는 IFN-γ와 같은 NO 생산의 유발자를 길항적으로 억제하지는 않는다. 본 발명에서 사용된 화합물을 미리 첨가했을 때, NO 생산의 억제 효과는 향상된다. 그러므로, 본 발명에서 사용된 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물은 항산화제 물질의 생산 방지용 조성물의 활성 성분으로서 매우 유용하다.
본 발명의 NO 생산을 억제하기 위한 조성물은 NO 생산의 메카니즘 및 NO 작용의 방식을 연구하는데에 유용하고, NO 생산의 메카니즘에 관여하는 물질의 스크리닝에 사용될 수 있다.
혈관신생은 고체 암의 성장에 필요하다. 혈관 내피 성장 인자/혈관 투과성 인자(VEGE)는 이 과정에서 중요한 역할을 한다. NO는 다양한 종양 세포에서 VEGF를 유도한다. 본 발명의 NO 생산을 억제하기 위한 조성물은 또한 NO 생산을 억제하여, 암조직 주위의 혈관신생을 억제하여 종양세포에서 VEGE 생산을 억제한다. 본 발명의 NO 생산을 억제하기 위한 조성물이 종양 세포가 고체 암을 형성하도록 피하에 이식된 마우스에 투여되었을 때, 암 조직 주변의 혈관신생은 불충분하여 암은 떨어져 나간다.
니트로소아민은 니트로소 그룹이 2차 아민에 결합된 일련의 화합물이다. 본 분야에 알려진 수백가지 형의 많은 니트로소아민은 DNA를 손상시켜 동물에 발암 활성을 나타낸다. 니트로소아민은 인간에서 발암과 깊이 관련이 있는 것으로 생각되어진다. 니트소아민은 보통 위에서 니트리트와 아민사이의 반응에 의해 생산되어 진다. NO는 중성 pH의 생리학적 조건하에서 조차 아민과 반응하여 니트로소아민을 생산한다. NO 생산은 간디스토마증 또는 간경변을 앓는 환자에서 증가되고, 이들 질병은 역학적으로 암과 깊은 관계를 갖는다. 그러므로, 특히 고-위험 그룹의 발암은 NO 생산의 증가를 방지하기 위하여 본 발명의 NO 생산을 억제하기 위한 조성물을 투여하여 방지될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 NO 생산 억제용 조성물은 두단계, 즉 발암의 억제 및 암성(cancerous) 조직에서 혈관신생의 억제에서 항암제 활성을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 화합물은 두 개의 상승적 효과의 결과로 항암제 활성을 나타낸다. 하나는 종양 세포를 죽이는 세포자멸을 유발하는 직접적 효과이다. 또다른 것은 종양세포에서 NO 생산을 억제하여 달성되는, NO에 의해 유발되는 VEGF를 포함하는 혈관신생을 억제하여 종양 세포가 죽게하는 비간접적 효과이다.
NO는 또한 염증 손상부위에서 특징적으로 관찰되는 부종을 유발한다. 달리말하면, 이는 혈관 투과성을 증가시킨다[Maeda et al., Japanese Journal of Cancer Research, 85:331-334(1994)]. NO는 염증 중재자인 프로스타글란딘의 생합성을 증가시킨다[Salivemini et al., Proceedings of National Academy of Sciences, USA, 90:7240-7244(1993)]. 다른한편, NO는 빠르게 슈퍼옥사이드 라디칼과 반응하여 퍼옥소니트리트 이온을 생산한다. 이 퍼옥소니트리트 이온은 세포 및 조직의 염증 손상을 일으키는 것으로 여겨진다.
NO 생산은 활성화된 면역 세포가 기관에 들어가 사이토카인을 방출할 때 유발된다. 인슐린-의존 당뇨병은 섬 β세포의 특정한 파괴에 의해 야기되고, 이 파괴는 NO에 의해 야기된다고 생각되어진다. 류마티스 관절염, 골관절증, 통풍성 관절염 또는 베체트 질병과 관련된 관절염을 앓는 환자의 손상 부위의 활액 유체는 동일 환자의 정상적 관절 또는 건겅한 개인의 관절에서보다 높은 농도로 NO를 함유한다. 본 발명의 NO 생산 억제용 조성물을 이러한 환자에게 투여했을 때, 손상 부위의 NO 생산은 억제되고, 결과적으로 질병 상태를 개선한다.
NO 생산은 뇌 허혈 동안 및 재관류후 증가되어 뇌조직에 손상을 일으킨다. 뇌허혈동안 환자에게 본 발명의 NO 생산 억제용 조성물을 투여하면 뇌조직의 손상을 경감하고 프로그노시스(prognosis)를 개선한다.
아라키돈산 대사가 조직의 염증 및 동통의 상승에 크게 관여한다. 세포막의 인지질로부터 유래된 아라키돈산은 생체내에서 사이클로옥시게나제의 작용에 의하여 프로스타글란딘, 프로스타사이클린 및 트롬복산으로 대사된다. 이들중, 프로스타글란딘은 혈관확장 활성을 가져, 결과적으로 기관에의 혈류 증가 활성을 가진다. 특히, 프로스타글란딘 E2및 I2는 혈류 증가 활성에 기인화여 염증 부위에서 부종 및 백혈구 침투를 증가시킨다. 따라서, 진정 및 항염증 활성이 프로스타글란딘의 생합성을 억제하는 본 발명의 프로스타글란딘 E2합성 억제용 조성물을 투여하여 나타날 수 있다. 또한, 염증 부위에 침입된 백혈구는 활성 산소를 생산하고, 산화적 스트레스 조건을 일으킨다. 따라서, 프로스타글란딘의 생합성을 억제하는 본 발명의 프로스타글란딘 E2합성 억제용 조성물은 상기 기술된 바와 같은 산화적 스트레스에 의해 야기되는 다양한 질병의 예방, 치료 또는 악화의 예방에 또한 유용하다.
또한, NO는 염증 손상부위에서 특징적으로 관찰되는 부종을 유발한다. 즉 혈관 투과성을 증가시키고, 상기 기술된 바와 같이 염증 중재자인 프로스타글란딘의 생합성을 증가시킨다. 본 발명의 NO 생산 억제 효과 및 프로스타글란딘 E2합성 억제 효과는 산화적 스트레스에 의해 야기되는 다양한 질병의 예방, 치료 또는 악화의 예방에서의 상승적 효과 뿐만아니라 진정 및 항-염증 활성을 나타내도록 상승적으로 작용한다. 본 발명의 면역 조절 조성물은 림프구 블라스토게네시스 (blastogenesis)를 억제하는 활성 및 혼합된 림프구 반응을 억제하는 활성과 같은 면역조절 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 면역조절 조성물은 면역 시스템 또는 면역인자의 비정상성에 기인된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 조성물로서 유용하다.
림프구 블라스토게네시스는 질소가 림프구의 표면상의 수용체에 결합하여 림프구를 활성화시키고 그의 분할 및 증식을 조장하는 반응이다. 혼합된 림프구 작용은 동종(allogeneic) 동물로부터 수득된 림프구가 혼합되고 배양되어, 주요 조직화합성 항원의 비화합성에 기인하여 림프구의 활성화를 유도하여 림프구의 분할 및 증식을 촉진한다. 본 발명의 면역 조절 조성물은 이들 반응을 억제하고, 특히 림프구의 비정상 증가에 의해 야기되는 만성 질병, 예를들어 만성 신염, 만성 대장염, I 형 당뇨병 및 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질병을 치료하고 예방하는데 유용하고, 또한 이식 거절 억제에 유용하다.
화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염은 70-kDa 열 쇼크 단백질(HSP70)과같은 열 쇼크 단백질의 생산을 유도하는 활성을 가진다. 이들은 헤파티티스 바이러스, AIDS 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(versicular stomatitis virus) 및 헤르페스 바이러스등과같은 RNA 바이러스 및 DNA 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 갖는다. 열 쇼크 단백질은 종양 면역에 관여한다. 따라서, 이들 화합물은 종양 면역에 또한 효과적이다. 또한, 열 쇼크 단백질은 항염증을 포함하는 생물학적 방어에 포함된다. 따라서, 인플루엔자 바이러스에 기인한 감기와 같은 바이러스 질병은 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염을 투여하여 예방 및 치료될 수 있다.
본 발명의 세포자멸 유발을 위한 조성물은 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 사용하고, 공지된 약제학적 담체와 제형화하여 제조할 수 있다. 조성물은 일반적으로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 고체 담체 및 임의로 용매, 분산화제, 유화제, 버퍼링제, 안정화제, 부형제, 결합제, 붕해제, 윤활제등과 혼합하여 제형화한다. 제제는 고체 제제의 형태, 예를들어 정제, 과립, 산제, 분말제 및 캡슐, 또는 액체 제제 형태, 예를들어 보통의 용액, 현탁제 및 유제일 수 있다. 또한, 조성물은 건조된 제제로 제형화될 수 있고, 이는 사용하기전에 적절한 담체를 첨가하여 액체 제제로 재구성될 수 있다.
본 발명의 세포자멸을 유발하기 위한 조성물은 주사 제제 및 드립(drip)과 같은 경구 제제 또는 비경구 제제로 투여될 수 있다.
약제학적 담체는 상기 언급된 특별한 투여 경로 및 투여 형태에 따라 선택될 수 있다. 경구 제제 경우, 전분, 락토즈, 슈크로즈, 만니트, 카복실메틸셀룰로즈, 옥수수전분, 무기염등이 예를들어 이용될 수 있다. 결합제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 유동성-촉진제, 풍미제, 착색제, 향미제등이 또한 경구 재제에 포함될 수 있다.
비경구 제제가 본 발명의 활성 성분, 즉 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 희석제에 용해시키거나 현탁시켜 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 희석제는 주사용 증류수, 생리 식염수, 글루코즈 수용액, 주사용 식물유, 참깨유, 땅콩유, 콩유, 옥수수유, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 임의로는 살균제, 안정화제, 삼투 조절제, 무통화제(smoothing agent)등이 용액 또는 현탁액에 첨가될 수 있다.
본 발명의 세포자멸 유발용 조성물은 조성물의 투여 형태에 적절한 경로를 통해 투여된다. 투여 경로는 특정한 것에 제한되지 않는다. 조성물은 내부적으로 또는 외부적으로(또는 국소적으로) 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사 제제는 예를들어 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여될 수 있다. 외부 제제는 좌약을 포함한다.
본 발명의 세포자멸 유발을 위한 조성물의 투여량은 적절히 결정되며 특별한 투여형태, 투여 경로 및 목적 및 치료하려는 환자의 연령, 체중 및 상태에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 성인 개인당 1일 투여량은 제제중에 함유된 활성 성분의 양으로 kg당 10㎍ 내지 200 mg이다. 물론, 투여량은 다양한 인자에 따라 변할 수 있다. 그러므로, 일부 경우에, 상기보다 적은 투여량이 충분할 수 있으나, 다른 경우, 상기 이상의 투여량이 요구될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 그자체로 경구적으로 투여될 수있으나, 선택된 식품 및 음료에 첨가하여 매일 섭취할 수 있다.
본 발명의 항암제 조성물은 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 사용하고, 이를 공지된 약제학적 담체와 제형화하여 제조할 수있다. 항암제 조성물은 세포자멸 유발용 조성물에 대해 상기 기술된 바와 같은 방법에 따라 제조될 수 있다.
항암제 조성물은 조성물의 투여 형태에 적절한 경로를 통해 투여된다. 투여 경로는 특정한 하나로 제한되지 않는다. 조성물은 내부적으로 도는 외부적으로(또는 국소적으로) 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사 제제는 예를들어 정맥내, 근육내, 피하, 피내등으로 투여될 수 있다. 외부 제제는 좌약을 포함한다.
항암제 조성물의 투여량은 적절히 결정되며 특별한 투여형태, 투여 경로 및 목적 및 치료하려는 환자의 연령, 체중 및 상태에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 성인 개인당 1일 투여량은 제제중에 함유된 활성 성분의 양으로 kg당 10㎍ 내지 200 mg이다. 물론, 투여량은 다양한 인자에 따라 변할 수 있다. 그러므로, 일부 경우에, 상기보다 적은 투여량이 충분할 수 있으나, 다른 경우, 상기 이상의 투여량이 요구될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 그자체로 경구적으로 투여될 수있으나, 선택된 식품 및 음료에 첨가하여 매일 섭취할 수 있다. 류마티즘은 골막세포 및 연골세포가 손상된 자가면역질환이다. 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염은 활막 세포에 세포자멸-유발 활성을 갖는다. 따라서 항류마티스성 조성물은 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 사용하고, 이를 공지된 약제학적 담체와 함께 제형화하여 제조할 수 있다. 항류마티스 조성물은 상기 기술된 바와 같은 방법에 따라 제조할 수있다.
항류마티스성 조성물은 경구 제제 또는 주사 제제 및 드립과 같은 비경구 제제로서 투여될 수있다.
약제학적 담체는 상기 언급된 특별한 투여 경로 및 투여 형태에 따라 선택될 수있고, 세포자멸용 조성물에 대해서 상기 기술된 방법에 따라 사용될 수있다.
항류마티스성 조성물은 조성물의 투여 형태에 적절한 경로를 통해 투여된다. 투여 경로는 특정한 것에 제한되지 않는다. 조성물은 내부적으로 또는 외부적으로(또는 국소적으로) 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사 제제는 예를들어 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여될 수 있다. 외부 제제는 좌약을 포함한다.
활성 성분으로서 화학식(I), 화합물(II) 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 항류마티스성 조성물의 투여량은 적절히 결정되며 특별한 투여형태, 투여 경로 및 목적 및 치료하려는 환자의 연령, 체중 및 상태에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 성인 개인당 1일 투여량은 제제중에 함유된 활성 성분의 양으로 0.01 내지 50mg, 바람직하게는 0.1 내지 10 mg이다. 물론, 투여량은 다양한 인자에 따라 변할 수 있다. 그러므로, 일부 경우에, 상기보다 적은 투여량이 충분할 수 있으나, 다른 경우, 상기 이상의 투여량이 요구될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 그자체로 경구적으로 투여될 수 있거나, 선택된 식품 및 음료에 첨가하여 매일 섭취할 수 있다.
또한, 다음 조성물이 세포자멸 유발용 조성물에 대해서 상기 기술된 바와 같은 방법에 따라 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 사용하여 제조할 수 있다: 항산화제 조성물, 활성 산소 생산 억제 조성물, 과산화지질 라디칼 생산 억제용 조성물, NO 생산 억제용 조성물, 병인성 미생물에 대한 항미생물 조성물, 항돌여변이원 조성물, 프로스타글란딘 합성 억제용 조성물, 활막 세포 증식 억제용 조성물, 열 쇼크 단백질 생산 유발형 조성물 및 항바이러스 조성물. 세포자멸 유발용 조성물에 대해 상기 기술된 바와 같은 투여량 및 투여 경로가 상태에 따라 사용될 수 있다.
화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염이 슈크라제 및 말타제와 같은 다양한 α-글리코시다제에 대해 억제 활성을 나타낸다. 그러므로, 항고혈당 조성물, 항고지혈성 조성물, 항비만 조성물, 항당뇨병 조성물등이 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 세포자멸 유발용 조성물에 대해 기술된 것과 같은 방법에 따라 제조될 수 있다. 세포자멸 유발용 조성물에 대해 상기 기술된 바와 같은 투여량 및 투여 경로가 상태에 따라 사용될 수있다. α-글리코시다제 억제용 조성물은 통상적인 방법에 따라 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 사용하여 제조할 수 있다. α-글리코시다제를 억제하기 위한 방법은 α-글리코시다제를 억제하기 위한 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하고, 그를 희석하여 제조되고/되거나 첨가하여 제조된 식품 또는 음료를 제공한다. 본 발명의 식품 또는 음료는 세포자멸-유발 활성, 항암성의 활성, 항산화제 활성, 병인성 미생물에 대한 항미생물 활성, 항돌연변이원 활성, 프로스타글란딘 합성 억제 활성, 열 쇼크 단백질 생산 유발 활성, 항바이러스 활성, α-글리코시다제 억제 활성을 갖는다. 따라서, 화학식(I), 화학식(II) 및 그의 염에 민감한 질병, 예를들어 치료 또는 예방을 위하여 세포자멸 유발을 필요로하는 질병, 암성 질병, 치료 또는 예방을 위하여 활성 산소 생산의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 NO 생산의 억제를 필요로하는 질병, 병원성 미생물에 의해 야기되는 질병, 돌연변이원에 일으켜지는 질병, 프로스타글란딘 합성등, 치료 또는 예방을 위하여 열 쇼크 단백질 생산의 유발을 필요로하는 질병, 바이러스 질병, 치료 또는 예방을 위하여 α-글리코시다제의 조절을 필요로하는 질병 등의 질병 상태를 개선하거나 예방하는데에 매우 유용하다.
본 발명의 식품 및 음료를 생산하는 과정은 특정한 것으로 제한되지 않는다. 쿡킹, 가공을 포함하는 공정 및 식품 및 음료를 제조하기 위해 일반적으로 이용되는 다른 공정이 첨가하여 제조되고/되거나 희석하여 제조된 생성된 식품 또는 음료가 활성 성분으로서 화학식(I), 화학식(II) 및 그의 염을 함유하는한 사용될 수있다.
예를들어, 식품 또는 음료의 생산에서, 화학식(I)의 화합물은 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 중성 내지 알칼리성 조건하에서 처리하여 수득된다. 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물은 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질을 산성 조건에서 가수분해하거나, 효소 분해하여 수득된다.
예를들어, 한천, 아가로즈및/또는 카라기난이 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질로서 사용될 수 있다. 아가로비오즈, κ-카라비오즈 및 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는, 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물이 환원 말단에 3,6-언하이드로가락토즈를 갖는 화합물로서 사용될 수있다.
본 발명의 식품 또는 음료는 식품 또는 음료의 제조동안 화학식(I)의 화합물과 SH 그룹-함유 화합물사이의 반응에 의하여 생성된 화학식(II)의 화합물을 함유하고, 그를 희석하여 제조되고/되거나 그를 첨가하여 제조된 식품 또는 음료를 또한 포함한다.
본 발명의 식품 또는 음료는 특정한 것에 제한되지 않으며, 그의 예는 다음을 포함한다: 곡물 가공품(예를들어, 소매분 가공품, 전분류 가공품, 예비혼합된 가공품, 면류, 마카로니류, 빵류, 판소, 메밀 국수류, 밀기울, 녹두국수, 포장된 떡), 유지가공품(예를 들어, 가소성 오일, 튀김 오일, 샐러드유, 마요네즈류, 드레싱 등), 콩 가공품(예를 들어, 두부류, 된장, 발효시킨 콩(청국장)), 식육 가공품(예를들어, 햄, 베이컨, 압착된 햄 및 소세지), 수산제품(예를들어,냉동된 으깬 어육, 어묵, 으깬 생선살을 길죽하게 빚어 대꼬챙이에 꿰어 굽거나 찐 관모양의 음식, 다진 생선살에 마 등을 갈아 넣고 반달형으로 쪄서 굳힌 식품, 어육을 갈아서 당근·우엉 등을 섞어 기름에 튀긴 음식, 생선을 다져 밀가루 반죽과 함께 동그랗게 뭉쳐서 삶은 것, 생선의 뼈·껍질까지 섞어서 만든 하치 어묵, 어육햄, 소세지, 가다랭이를 쪼개 발리어 쪄서 말린 포, 어란 가공품, 수산물 통조림, (생선·조개·해초 등의)조림), 유제품(원유, 크림, 요구르트, 버터, 치즈, 연유, 분유 및 아이스 크림), 야채·과일 가공품(예를들어, 페이스트류, 잼류, 피클류, 과일 쥬스, 야채 음료 및 혼합 음료), 과자류(예를들어, 초콜레이트, 비스켓, 스위트 롤빵(sweet bun), 케이크, 쌀-케이크 스위트, 및 라이스 스위트), 알콜 드링크(예를들어, 일본술, 중국술, 와인, 위스키, 소주, 보드카, 브랜디, 진, 럼, 맥주, 소프트 알콜 드링크, 과일주 및 리큐르), 럭셔리 음료(luxury drink)(예를들어, 녹차, 홍차, 우롱차, 커피, 청량음료 및 유산균 음료), 양념(예를들어, 간장, 소스, 식초 및 조미술), 캔, 병 또는 백에 넣어진 식품(예를들어, 쇠고기와 함께 지은 밥, 가마솥밥, 찹쌀로 지은 팥밥, 카레, 기타 각종 조리된 식품), 반-건조된 또는 농축 식품(예, 간 페이스트, 다른 스프레드(spread), 매밀 국수 또는 우동용 수프 및 농축 수프), 건조 식품(예를들어, 인스탄트 국수 인스턴트 카레, 인스탄트 커피, 분말 쥬스, 분말 수프, 인스탄트 된장국, 조리된 식품, 조리된 음료, 조리된 수프), 냉동 식품(예를들어, 전골, 차완-무시(chawan-mushi), 장어구이, 함박스테이크, 사오-마이, 교자, 각종 스테이크, 후르츠 칵테일 등), 고형식품, 액체식품(수프 등), 향신료류 등의 농산·임산 가공품, 축산 가공품, 수산 가공품 등.
본 발명의 식품 또는 음료가 희석되어 제조되고/되거나 첨가하여 제조된 본 발명의 식품 또는 음료가 생리학적 기능을 나타내는데 필요한 양으로 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는한, 그들의 형태는 특정한 것에 제한되지 않는다. 식품 또는 음료는 정제, 과립 및 캡슐과 같은 먹을 수 있는 형태이다.
본 발명의 식품 또는 음료가, 생리학적 활성을 갖는, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성된 그룹으로 부터 선택된 화합물을 함유한다. 세포자멸-유발 활성 및 항암 활성과 같은 화합물의 생리학적 기능은 식품 또는 음료를 섭취시 발암을 예방하는 효과, 암을 억제하는 효과를 제공한다. 즉, 본 발명의 식품 또는 음료는 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염에 민감한 질병을 예방하거나 질병상태를 개선시키는 건강 식품 또는 음료이다. 특히, 이들은 위장 건강을 유지하는데에 유용하다.
또한, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하고, 희석하여 제조되고/되거나 첨가하여 제조된 식품 또는 음료가 화합물의 α-글리코시다제 억제 활성에 기초하여 항고혈당, 항당뇨병, 항비만 또는 항고지혈 식품 또는 음료로서 유용하다.
또한, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염은 활성 산소 생산 억제 활성 및 과산화 지질 라디칼 생산의 억제 활성과 같은 항산화제 활성을 갖는다. 그러므로, 이들은 활성 산소 생산 억제 조성물, 과산화지질 라디칼 생산 억제용 조성물 및 NO 생산 억제용 조성물과 같은 항산화 식품 또는 음료용 항산화제 조성물로서 항산화제 식품 또는 음료의 제조에 사용될 수 있다. 활성 성분으로서 상기 언급된 화합물로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 함유하는 본 발명의 항산화제 조성물의 제제는 특정한 하나에 한정되지 않는다. 조성물은 적절하게는 종래의 방법에 따라 화합물이 적용되는 식품 및 음료에 좌우되어 예를들어 산제, 페이스트, 유제등으로 제형화될 수 있다. 활성 성분으로서 본 발명에서 사용된 화합물을 함유하는 식품 및 음료는 본 발명의 항산화제 조성물을 사용하여 편리하게 제조될 수 있다.
본 발명은 화학식(I) 또는 화학식(II)로 나타내지는 항산화용 화합물을 제공한다.
예를들어, 화학식(I)에 의해 나타내지는 항산화용 화합물은 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질의 pH 7미만의 산성 조건하에서 산분해에 의해 및/또는 효소적 분해에 의해 생성된 생성물을 중성 내지 알칼리성 조건하에서 처리하여 수득될 수 있다. 정제 및 부분적으로 정제된 물질 모두 사용될 수있다.
사용될 수 있는 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질의 예는 한천, 아가로즈 및/또는 카라기난과 같은 적조류로부터 유래된 것을 포함한다.
화학식(II)에 의해 나타내지는 항산화용 화합물은 화학식(I)의 화합물과 SH 그룹-함유 화합물을 반응시켜 수득될 수 있다. 정제 및 부분적으로 정제된 물질 모두 사용될 수있다.
본 발명의 항산화용 화합물은 활성 산소와 같은 생체내에서 산화제의 생산을 제거 또는 억제하는데에 유용하다. 따라서, 화합물은 활성 산소의 생산 및/또는 과잉에 의해 야기되는 질병을 예방하거나 질병 상태를 개선시키는데에 유용하다.
상기 기술된 바와 같이, 활성 산소를 생산하는 시스템이 생체내의 제거 시스템에 우위가 되었을 때, 생체를 산화적으로 손상시켜 발생되는 산화적 스트레스는 다양한 질병에 관여한다. 따라서, 생체는 항상 산화적 스트레스에 의해 야기되는 질병 또는 질병상태의 악화에 이르게되는 환경에 노출되어 있다. 그러므로, 산화적 스트레스에 의해 야기되는 질병을 예방, 치료 또는 악화 예방을 위해 매일 적당한 양의 항산화제 물질을 섭취하는 것이 바람직하다. 적당한 양의 항산화제 물질을 매일 섭취하기 위하여, 식품 및/또는 음료로서 그를 섭취하는 것이 바람직하다. 희석하여 제조되고/되거나 첨가하여 제조된 본 발명의 항산화용 화합물을 함유하는 식품 및 음료는 항산화제 식품 또는 음료 또는 항-산화적 스트레스 식품 또는 음료로서 매우 유용하다.
본 발명에서 사용된 화합물은 보습성(ability of retaining water)도 갖는다. 따라서, 이는 항변비제 조성물 및 항변비 식품 또는 음료의 제조에 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 활성 성분으로서 화합물(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 화장품 조성물을 제공한다.
상기 언급된 화합물을 활성 성분으로 함유하는 화장품 조성물은 다음 형태로 제형화될 수 있다: 크림, 밀크 로션, 로션, 페이셜-클린싱 및 립스틱 및 화운데이션과 같은 메이크업 화장품, 바디 비누, 비누등과 같은 기초 화장품 조성물등. 화합물은 또한 모발에 효과적이다. 본 발명의 화장품 조성물은 모발 보호제품, 예를들어 헤어 토닉, 헤어 리퀴드, 헤어 세트 로션, 헤어블라우제, 헤어 크림 및 헤어 코트와 같은 모발제품 및 헤어 화장품 제품, 예를들어 샴푸, 헤어 린스 및 헤어 처리의 형태로 제조될 수 있다. 화장품 조성물중에 혼합된 화합물의 양은 미백, 보습 또는 항산화 활성에 의존하여 적절히 결정될 수 있다. 화장품중에 다른 성분으로서는 통상적인 화장품 조성물중에 혼합되는 것이 사용될 수 있다. 미백 활성 및 보습 활성은 JP-A 8-310937에 기술된 통상적 방법에 의해서 측정될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물은 미백 활성, 보습 활성, 항산화제 활성, 활성 산소 생산 억제 활성 및 피부에 대한 항산화 스트레스 활성, 및 보습 활성, 항산화제 활성, 활성 산소 생산 억제 활성 및 모발에 대한 항산화 스트레스 활성 등에 기초한 우수한 성질을 갖는다.
본 발명은 활성 성분으로서 화합물(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 신선도 보존용 조성물을 제공한다. 화합물(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염은 항산화제 활성, 신선도 보존 활성, 티로시나제 활성 억제 활성, 항 병원성 미생물 활성 및 항돌연변이원 활성을 갖는다. 따라서, 식품의 색 변화, 부패, 산화 등을 효과적으로 예방하는 식품의 신선도 보존 조성물이 활성 성분으로서 화합물(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 사용하여 공지된 제형 방법에 따라 제조될 수있다. 본 발명의 신선도 보존 조성물은 다양한 식품, 생선 식품, 가공된 식품 등의 맛 및 신선도를 유지하는데에 매우 유용하다.
본 발명에 따른 세포자멸 유발형 조성물은 활성 성분으로서 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 중성 내지 알칼리성 조건에서 처리하여 생산된 세포자멸 유발 물질(이하 간단히 세포자멸 유발 물질이라 언급함)을 사용하여 제조될 수있다. 이러한 조성물은 세포자멸유발용 조성물에 대해서 상기 기술된 바와 같은 방법에 따라서 제조할 수있다.
활성 성분으로서 본 발명의 세포자멸-유발 물질을 함유하는 세포자멸 유발용 조성물의 투여량은 특별한 투여형태, 투여 경로, 목적 및 치료하려는 환자의 연령, 체중 및 상태에 따라 적절히 결정되고 변할 수 있다. 일반적으로, 성인 경우 1일 투여량은 제제중에 함유된 활성 성분의 양으로 10㎍ 내지 200 mg/kg이다. 물론, 투여량은 다양한 인자에 따라 변할 수 있다. 그러므로, 일부 경우에 상기 보다 적은 양이 충분할 수 있으나, 다른 경우 상기 보다 많은 투여량이 필요로할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 그자체로 경구적으로 투여될 수 있으나, 선택된 식품 및 음료에 첨가하여 매일 섭취할 수 있다.
활성 성분으로서 본 발명의 세포자멸-유발 물질을 함유하는 세포자멸 유발용 조성물은 종양 세포에 대해서 항증식 활성을 갖는다. 따라서, 활성 성분으로서 본 발명의 세포자멸-유발 물질을 사용하여 항암 조성물을 제조할 수 있다.
세포자멸 유발용 조성물에 대해서 상기 기술된 바와 같은 생산 방법, 투여량 및 투여 경로가 활성 성분으로서 본 발명의 세포-자멸 유발 물질을 함유하는 항암 조성물용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 세포자멸-유발 물질은 암성 질병 등을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서 사용될 수 있다. 활성 성분으로서 본 발명의 세포자멸-유발물질에 의해 나타내지는 화합물을 사용한 세포자멸 유발 방법은 생물학적 방어의 메카니즘, 암성 질병 등의 연구 및 세포자멸 유발의 억제제를 개발하는데에 유용하다.
희석하여 제조되고/되거나 첨가하여 제조된, 본 발명의 세포자멸-유발 물질을 함유하는 식품 및 음료는 생리학적 활성을 나타내기 위한 유효량의 물질을 함유한다. 본 발명의 식품 또는 음료(세포자멸 유발용 식품 또는 음료 또는 항암 식품 및 음료)를 제조하기 위한 방법은 특정한 하나로 제한되지 않는다. 쿡킹, 가공을 포함하는 공정 및 식품 및 음료를 제조하기 위해 일반적으로 이용되는 다른 공정이 결과적인 식품 또는 음료가 세포자멸-유발 활성 또는 항암 활성을 나타내기 위한 유효량의 본 발명의 세포자멸-유발 물질을 함유하는 한 사용될 수 있다. 식품 또는 음료의 제조에서, 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 원료 물질을 pH 7 미만의 알칼리성 조건하에서 처리하여 본 발명의 세포자멸-유발 물질을 함유하고, 희석하여 제조되고/되거나 첨가하여 제조된 식품 및 음료가 본 발명의 식품 또는 음료에 포함된다.
첨가하여 제조되고/되거나 희석하여 제조된 본 발명의 본 발명의 식품 또는 음료가 본 발명의 세포자멸-유발 물질을 함유하는 한, 그들의 형태는 특정한 하나로 제한되지 않는다. 식품 및 음료는 먹을 수 있는 형태, 예를들어 정제, 과립 및 캡슐일 수 있다.
본 발명의 식품 및 음료는 세포자멸-유발 활성 및 항암 활성을 갖는다. 그러므로, 이들은 소화기관등의 질병 상태를 개선시키거나 암을 예방하는데에 매우 유용하다.
화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물, 그의 염 및 본 발명의 세포자멸-유발물질의 어느 것을 100 mg/kg의 단일 투여량으로 마우스에 경구 투여하였을 때에 사망이 관찰되지 않았다.
상기 기술된 바와같이, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물, 그의 염 및 본 발명의 세포자멸-유발물질은 다양한 생리학적 작용을 기초로하여 의약, 식품 및 음료를 포함하는 다양한 분야에서 매우 유용하다.
식품 및 음료의 제조에서 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 원료물질을 pH 7초과의 알칼리성 조건하에서 처리하여 인위적으로 제조한 본 발명의 화학식(I) 및/또는 세포자멸-유발 물질의 용도도 본 발명에 의해 포함된다.
식품 또는 음료중에 제조되거나 화학식(I)의 화합물과 SH 그룹-함유 화합물, 예를들어 SH-그룹-함유 아미노산 또는 그의 유도체(예, 글루타치온)사이의 반응 생성물로서 생산된 화학식(II)의 화합물의 용도도 또한 본 발명에 의해 포함된다.
하기 실시예는 추가로 본 발명을 상세히 예시하며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: L-글리세로-1,5-에폭시-1αβ,6-디하이드록시-시스-헥스-3-엔 -2-온(DGE) 및 D-글리세로-1,5-에폭시-1αβ,6-디하이드록시-시스-헥스-3-엔-2-온(κ-DGE)
(1) 2.5 g의 시판되는 한천(Agar Noble, Difco)을 50 ml의 0.1N HCl중에 현탁시키고, 현탁액을 100℃에서 13분간 가열하여 용액을 제조하였다. 실온으로 냉각한 후, NaOH로 pH를 약 중성 pH로 조정한후, 용액을 Cosmonice 필터를 통하여 여과하고, 다음과 같이 순상(nomal phase) HPLC상에서 분리하였다.
칼럼: TSKgel Amide-80(21.5 mm ×300 mm, Toso)
용매 A: 90% 아세토니트릴 수용액
용매 B: 50% 아세토니트릴 수용액
유속: 5 ml/분
용출: 용매 A로부터 용매 B로의 선형 구배(80분) →용매 B(20분)
검출: 195 nm에서의 흡광도
적용된 샘플 양: 2 ml
66.7, 78.5 또는 85.5분의 체류시간에서의 피크를 모으고 매스 분광 분석을 하였다. 이들 물질은 각각 아가로비오즈, 아가로테트라오즈 및 아가로헥사오즈인 것으로 밝혀졌다. 상기 기술된 바와 같이 HPLC상에서 분리를 8회 반복하였다. 이렇게 분리된 분획을 감압하에서 건조시켜 각각 122 mg의 아가로비오즈, 111 mg의 아가로테트라오즈 및 55 mg의 아가로헥사오즈를 수득하였다.
(2) 12 ㎕의 1N NaOH를 실시예 1-(1)에서 수득된 아가로비오즈의 100 mM 수용액(샘플 1) 600 ㎕에 첨가하여 pH를 11.5로 조정하였다. 용액을 37℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 이어서 12 ㎕의 1N HCl을 용액에 첨가하여 pH를 약 5로 조정하였다(샘플 2). 50 ㎕의 용액에 추가로 1㎕의 1N HCl을 첨가하여 pH를 약 2로 조정하였다(샘플 3).
샘플 1 내지 3의 세포자멸-유발 활성으로서 종양 세포에 대한 항증식 활성을 다음과 같이 측정하였다. 결과로서, 샘플의 각각은 종양 세포에 대해 거의 동등한 항증식 활성을 가졌다.
샘플 1 내지 3을 개별적으로 여과에 의해 멸균시키고 멸균수로 적절히 희석하였다. 각 희석액의 10㎕를 96웰 마이크로티터 플레이트의 한 웰에 위치시켰다. 56℃에서 30분간 처리된, 10% 태아 소 혈청(Gibco)를 함유하는 RPMI 1640 배지(Nissui) 90㎕ 및 5,000 개의 HL-60 세포(ATCC CCL-240)를 거기에 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 48시간동안 인큐베이션했다. 세포 형태를 광학 현미경으로 조사하였다. 포스페이트 완충 염수중의 5 mg/ml 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(Sigma) 용액 10㎕를 거기에 추가로 첨가하고, 추가로 4시간동안 인큐베이션을 계속하였다. 0.04 N HCl을 함유하는 2-프로판올 100 ㎕를 웰에 첨가하고, 혼합물을 완전히 교반하였다. 590 nm에서의 흡광도를 측정하여 세포 성장 수준을 결정하였다.
(3) 실시예 1-(2)에 기술된 바와 같은 샘플 1 내지 3을 실리카 겔 시트 60F254(Merck)에 점적하고, 에탄올:1-부탄올:물=5:5:1을 사용하여 전개시켰다. 이어서 오르시놀-황산 시약을 시트에 분무하여 반점을 검출하였다. 결과로서, 샘플 2 또는 샘플 3에서는 아가로비오즈에 대한 어떤 반점도 관찰되지 않았으나, 수개의 새로운 반점이 관찰되었다.
샘플 1 및 2 각각의 10㎕를 다음과 같이 순상 HPLC상에서 분리하였다.
칼럼: PALPAK 형 S(4.6 ×250 mm, Takara Shuzo)
이동상 A: 90% 아세토니트릴 수용액
B: 50% 아세토니트릴 수용액
유속: 1 ml/분
용출: 이동상 A(10분) →이동상 A로부터 이동상 B로 선형 구배(40분) →이동상 B(10분)
검출: 195 nm에서의 흡광도
칼럼 온도: 40℃
결과로서, 샘플 1에서 관찰된 아가로비오즈에 대한 피크가 샘플 2에서는 관찰되지 않았고, 다수의 새로운 피크가 관찰되었다. 샘플 2의 각각의 피크를 모으고, 감압하에서 증발건조시켜 물에 용해시켰다. 종양 세포에 대한 항증식 활성을 상기 기술된 바와 같은 방법으로 각 분획에 대해 측정하였다. 결과로서, 활성이 4.05 내지 4.16 분의 체류시간에서의 분획에 존재하였다.
이들 결과는 도 1에 나타나 있다. 도 1은 샘플 2의 순상 HPLC 크로마토그램을 예시한다. 도 1에서, 수평축은 체류 시간(분)을 나타내고, 수직축은 흡광도를 나타낸다.
(4) 알칼리-처리된 제조물을 실시예 1-(2)에 기술된 방법에 따라 실시예 1-(1)에서 제조된 아가로테트라오즈 및 아가로헥사오즈 및 0.1N 염산으로 κ-카라기난의 분해 생성물로부터 제조된 κ-카라비오즈부터 제조하였다. 이어서, 종양 세포에 대한 항증식 활성을 실시예 1-(2)에서 기술된 바와같이 측정하였다. 결과로서, 종양 세포에 대한 항증식 활성이 알칼리-처리된 제조물 각각에 대해 관찰되었다.
κ-카라기난을 다음과 같이 제조하였다.
κ-카라기난(Sigma, c-1263)의 2.5 g을 0.1 HCl 50 ml중에 현탁시키고, 현탁액을 100℃에서 16분동안 가열하여 용액을 제조하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, NaOH로 약 중성 pH로 중화시키고, Cosmonice 필터를 통해 여과하며, 실시예 1-(3)에 기술된대로 순상 HPLC상에서 분리하였다. 27.8분의 용출 시간에서 κ-카라비오즈를 함유하는 분획을 모으고 감압하에서 증발 건조시켜 κ-카라비오즈를 제조하였다.
(5) 2.5 g의 시판되는 한천(Agar Noble)를 0.1 N HCl 50 ml에 현탁시키고, 현탁액을 100℃에서 13분간 가열하여 용액을 제조하였다. 용액을 실온으로 냉각시켰다. pH를 NaOH로 12로 조정하였다. 이어서 용액을 중화시켰다.
중화된 용액을 실시예 1-(3)에 기술된 바와같이 순상 HPLC 시켰다. 각각의 피크를 모으고, 감압하에서 증발 건조시키고 물에 용해시켰다. 각 분획의 종양 세포에 대한 항증식 활성을 상기 기술된 바와같이 측정하여, 4.05 내지 4.16 분의 체류시간에서의 분획의 항증식 활성을 확인하였다. 또한, 세포자멸 소체의 형성을 확인하였다.
다음으로, 4.05 내지 4.15 분의 체류시간의 분획을 다량 모아서 구조 분석용 샘플을 제조하였다.
이어서 고속원자충격질량분석(FAB-MS)을 이어서 DX302 질량 분석계(Nippon Denshi)를 사용하여 수행하였다. 또한 샘플을 중 디메틸 설폭사이드중에 용해시키고, 핵자기 공명법(NMR)으로 구조 분석을 하였다. 그 결과를 하기에 나타낸다.
4.05 내지 4.16분 체류시간 분획의 매스 스펙트럼을 도 2에 예시하였다. 4.05 내지 4.16분의 체류시간의 분획의1H-NMR 스펙트럼을 도 3에 예시하였다. 도 2에서 수평축은 m/z값을 나타내고, 수직축은 상대적 강도(%)를 나타낸다. 도 3에서, 수평축은 화학적 시프트 값(ppm)을 나타내고, 수직축은 시그날 강도를 나타낸다.
FAB-MS: m/z 145[M+H]+
샘플을 디메틸 설폭사이드에 용해시켰다. 글리세롤을 측정을 위한 매트릭스로 사용하였다.
결과를 중디메틸 설폭사이드의 잔류 프로톤의 화학적 시프트 값을 2.49 ppm으로 가정하여 표현하였다.
1H-NMR에서의 시그날 동정 번호는 다음 식으로 나타내진다.
이들 결과로부터, 체류시간 4.05 내지 4.16분의 체류시간에서의 분획이 L-글리세로-1,5-에폭시-1αβ,6-디하이드록시-시스-헥스-3-엔-2-온(이하, DGE라고 간단히 언급함)을 함유함이 밝혀졌다.
유사하게, κ-카라비오즈를 본 실시예에서 상기 기술된 바와 같이 알칼리로 처리하였다. 세포자멸-유발 물질인 D-글리세로-1,5-에폭시-1αβ,6-디하이드록시 -시스-헥스-3-엔-2-온(이하, κ-DGE라고 언급함)을 상기 기술된 것과 같은 방법으로 알칼리-처리된 제제로부터 정제하였다.
(6) 한천 분말(Nacalai Tesque) 45 g을 400 ml의 증류수에 현탁시켰다. 11 N HCl 4.1 ml 및 450 ml가 되도록 증류수를 현탁액에 첨가하였다. 생성된 산성 현탁액을 90℃에서 35분간 가열하였다. 가열된 산성 용액을 10 N NaOH로 중화시켰다. 여기에 1N NaOH 2.7ml를 추가로 첨가하였다. 용액을 37℃에서 15분간 알칼리성 조건하에서 인큐베이션했다. 알칼리-처리된 용액을 1N HCl로 중화시키고, 이어서 증발기를 사용하여 150 ml로 농축하였다. 농축물을 동부피의 에틸 아세테이트로 10회 추출하였다. 10회 추출후 에틸 아세테이트상을 모으고, 증발기를 사용하여 2 ml로 농축하고, 이어서 20 ml의 클로로포름:메탄올=9:1에 용해시켰다. 생성된 용액을 하기 조건하에서 실리카 칼럼 크로마토그래피상에서 분리하였다: 칼럼 부피: 250 ml; 유압: 0.2 Kgf/cm2; 이동상 용매: 클로로포름:메탄올=9:1; 및 분획 부피: 8 ml. 각 분획의 일부분을 박층 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=9:1로 전개)상에서 분석하였다. 약 0.25의 Rf값을 갖는 반점만을 함유하는 분획 52 내지 78을 DGE-함유 분획으로 모으고, 이를 증발기를 사용하여 2 ml로 농축시켰다. 농축물을 상기 기술된 바와 같이 다시 실리카 칼럼 크로마토그래피시켰다. 분획 64 내지 96을 DGE-함유 분획으로 모으고, 증발기를 사용하여 농축시키며, 이어서 8 ml의 증류수에 용해시켰다. DGE 수용액을 동결건조시켜 113 mg의 DGE 제조물을 수득하였다.
실시예 2: 세포자멸 유발 시험
(1) HL-60 세포를 56℃에서 30분간 처리한 10% 소 태아 혈청(JRH)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Bio Whittaker)에서 37℃에서 배양하고, 2.5 ×105세포/4.5 ml의 농도로 RPMI 1640 배지에 현탁시켰다.
125 μM, 250 μM, 500 μM, 1 mM, 2 mM 또는 4 mM의 DGE 수용액 500 ㎕를 4.5 ml의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 5% CO2의 존재하에서 37℃에서 24시간 인큐베이션했다.
배양된 세포를 광학 현미경하에서 조사하였다. 최종 농도 50 μM 또는 그이상으로 DGE의 존재하에서 배양된 세포에서 핵의 응축, 세포의 수축 및 세포자멸 소체의 형성이 관찰되었다. 이러한 현상은 500 ㎕의 염수를 첨가하여 배양된 대조군 세포에서는 관찰되지 않았다.
Saibo Kogaku, Bessatsu (Cell Technology, Suppl.) Jikken Protocol Series: Apoptosis Jikken Protocol (Experimental Protocol Series: Experimental Protocols for Apoptosis)(Shujun-sha) pp. 129-130 and analysis of DNA fragmentation as described in Bio Manual UP Series: Saishin Apoptosis Jikken-ho (Bio Manual UP Series: Current Experimental Methods for Apoptosis)(Yodo-sha) pp. 61-63에 기술된대로 FACScan을 이용한 세포자멸 세포의 측정은 상기 기술된 것과 동일한 방법으로 24 또는 48시간동안 배양된 세포를 사용하여 수행하였다. 결과적으로, 최종 농도 50 μM 또는 그이상의 최종 농도로 DGE의 존재하에서 배양된 세포에서 세포자멸이 관찰되었다. 50 또는 100 μM의 농도의 DGE의 존재하에서 배양된 세포에서는 DNA 단편화가 관찰되었다. 이러한 현상은 500 ㎕의 염수가 첨가된 대조군 세포에서는 관찰되지 않았다.
(2) 실시예 2-(1)에서 기술된대로 24시간 배양된 세포의 일부분을 0.4% 트리판 블루로 염색하고 광학 현미경으로 조사하였다. 염색되지 않은 생존 세포의 수 및 푸르게 염색된 죽은 세포의 수를 계수하였다. 50%의 생존성을 가져오는 DGE의 농도[생존성50(μM)]는 81.7μM인 것으로 측정되었다. 상기 기술된바와 같이, DGE는 세포자멸-유발 활성에 기인하여 종양세포에 대해 항증식 활성을 나타냈다. 또한, κ-DGE도 유사한 활성을 나타냈다.
실시예 3: 과산화지질 라디칼 생산 억제 시험
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 3A(National Collection of Type Culture, NCTC 8319)를 5 ml의 브레인 하트 인퓨전 배지(Difco, 0037-17-8)에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 세포를 원심분리에 의해 모으고, 포스페이트 완충 염수로 3회 세척하고, 이어서 1 ×107콜로니 형성 유니트/ml의 농도로 포스페이트 완충 염수에 현탁시켰다. 100 ㎕의 세포 현탁액, 10 또는 100 mM의 DGE 수용액 100 ㎕, 1 mg/ml의 메테모글로빈 용액(Sigma, M9250) 100㎕, 포스페이트 완충 염수 600 ㎕ 및 50 mM의 3급-부틸 하이드로퍼옥사이드 용액(Katayama Kagaku, 03-4 990) 100 ㎕의 혼합물을 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 혼합물에 2 ×NMP 배지 1 ml를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 2 ×NMP를 다음과 같이 제조하였다: 8 g의 영양 브로쓰(Difco, 0003-01-6), 5 g의 트립톤(Difco, 0123-17-3), 5 g의 NaCl, 10 g의 만니톨(Nacalai Tesque, 123-03) 및 0.035 g의 페놀 레드(Nacalai Tesque, 268-07)을 증류수에 용해시켜 부피를 500 ml로 만들고; pH를 NaOH로 7.4로 조정하며; 이어서 혼합물을 여과에 의해 멸균시켜 2 ×NMP 배지를 수득하였다. 생성된 혼합물을 NMP 배지(2 x NMP 배지를 멸균수로 2배 희석하여 제조)로 매 3배 희석하여 12개의 일련의 희석액을 제조하였다. 160 ㎕의 각 희석액을 96웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 위치시켰다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 배지의 색을 육안으로 관찰하였다. 박테리아의 성장의 결과로 웰중의 배지의 색이 붉은 색에서 노란색으로 변하는 샘플을 과산화지질 라디칼 생산을 억제하는 활성을 갖는 것으로 동정하였다.
그 결과를 표 1에 나타냈다. 표 1에서 +는 웰중에 박테리아의 성장이 관찰되는 샘플을 나타내고, -는 웰중에 박테리아의 성장이 관찰되지 않는 샘플을 나타낸다. 표에서 상부줄의 수는 37℃에서 30분간 3급-부틸 하이드로퍼옥사이드 및 세포와 반응한 반응 혼합물중의 DGE의 농도를 나타낸다.
표 1
DGE 1 mM 10 mM
박테리아의 성장 - +
이들 결과로부터 알 수 있듯이, DGE는 과산화지질 라디칼 생산 억제 활성을 나타냈다. 또한, 유사한 활성이 하기 기술된 κ-DGE 및 DGE-GSH에서 관찰되었다.
실시예 4: NO 생산 억제 시험
(1) RAW264.7 세포(ATCC TIB 71)를 페놀 레드없이 10% 소 태아 혈청(Gibco) 및 2 mM L-글루타민(Life Technologies Oriental, 25030-149)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(Bio Whittaker, 12-917F)에 3 x 105세포/ml의 농도로 현탁시켰다. 500 ㎕의 현탁액을 48-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 12시간동안 인큐베이션했다. 25 ㎍/ml 리포폴리사카라이드(LPS, Sigma, L-2012) 및 500 U/ml 인터페론-γ(IFN-γ, Cosmobio, GZM-MG-IFN 판매)를 함유하는 수용액 10㎕, 및 250 또는 500 μM의 DGE 수용액 10㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가로 12시간동안 인큐베이션했다. 배지에서 NO의 산화에 의해 생산된 NO2 -의 농도를 이어서 측정하였다. 대조군으로서, LPS 또는 IFN-γ가 첨가되지 않은 그룹 및 DGE가 첨가되지 않은 그룹이 제공되었다.
배양후, 4% Griess의 시약(Sigma, G4410) 100 ㎕를 배지 100 ㎕에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분동안 정치하였다. 이어서 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 배지중의 NO2 -농도는 상기 기술된 바와 같은 동일한 배지에 용해된 공지 농도의 NaNO2를 사용하여 제조된 캘리브레이션 곡선을 참조로하여 계산하였다. 모든 측정은 3중으로 수행하였다.
결과로서, DGE는 LPS 및 IFN-γ에 의해 유발된 NO 생산을 투여량-의존적으로 억제하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4는 DGE의 존재하에서 각각의 배양 조건에서 인큐베이션된 배지중의 NO2 -농도를 예시한다. 도 4에서, 수평축은 배양 조건을 나타내고, 수직축은 NO2 -농도(μM)를 나타낸다.
RNA를 상기 기술된 것과 유사한 조건하에서 4, 6, 또는 8시간동안 배양된 RAW264.7 세포로부터 제조하였다. RNA안에 함유된 유발성 NO 합성제[iNOS; Biochem. Byophys. Res. Commun., 215:148-153(1995)]를 코딩하는 mRNA 의 양을 RT-PCR 방법에 의해 측정하였다. 결과로서, iNOS mRNA로 부터의 DNA 단편의 증폭이 DGE 수용액이 첨가되지 않은 대조군 세포에서 관찰되었다. 다른한편, DGE 수용액이 첨가된 세포의 경우에서는 단편의 증폭이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 DGE 에 의한 NO 생산의 억제가 iNOS 전사의 억제를 통해 야기된다는 것을 제시한다.
(2) RAW264.7 세포를 페놀 레드없이 10% 소 태아 혈청 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지에 3 x 105세포/ml의 농도로 현탁시켰다. 현탁액 500 ㎕를 48-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 위치시켰다. 플레이트를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 6시간동안 인큐베이션했다. 물에 DGE를 0.5 mM의 농도로 용해시키고 여과에 의해 멸균시켜 제조된 수용액 10 ㎕를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가로 0.5 또는 5시간 동안 인큐베이션했다. 5 ㎍/ml LPS 및 2000 U/ml IFN-γ를 함유하는 수용액 10㎕를 이어서 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가로 12시간동안 인큐베이션했다. 배지중의 NO의 산화에 의해 생성된 NO2 -의 농도를 측정하였다. 대조 그룹으로서 LPS 또는 IFN-γ가 첨가되지 않은 그룹과 DGE가 첨가되지 않은 그룹을 제공했다.
배양후, 4% Griess 시약 100 ㎕를 배양 상등액 100 ㎕에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분동안 정치시켰다. 이어서 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 배지중의 NO2 -농도를 상기 기술된 것과 같은 배지중에 용해된 기지의 농도의 NaNO2를 사용하여 제조된 검량선(calibration curve)을 참고로하여 계산하였다.
모든 측정은 3중으로 수행하였다.
결과로서, NO 생산의 강한 억제가 0.5 시간동안 배양된 그룹과 비교해서 LPS 및 IFN-γ첨가전에 DGE의 존재하에서 5시간동안 배양된 그룹에서 관찰되었다.
그 결과를 도 5에 나타냈다. 도 5는 예비 배양동안 DGE가 첨가된 다양한 배양 조건에서 인큐베이팅하여 얻어진 배지중의 NO2 -의 농도를 예시한다. 도 5에서, 수평축은 배양 조건을 나타내고, 수직축은 NO2 -농도(μM)를 나타낸다.
상기 기술된 바와 같이, DGE는 NO 생산 억제 활성을 나타냈다. 또한, κ-DGE도 유사한 활성을 나타냈다.
실시예 5: 항미생물 활성 시험
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) W3110(박테리아 1), 살모넬라 티피머리움(Salmonella typhimurium) LT2(박테리아 2), 바실러스 서브티리스(Bacillus subtilis) IFO3021(박테리아 3), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) IFO3080(박테리아 5) 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) GS5(박테리아 5)에 대한 DGE 의 항미생물 활성을 다음과같이 조사하였다.
박테리아 1 내지 4를 L-브로쓰에서 밤새 배양했다. 배양물을 탁도를 측정하여 감수성 보우일론(Bouillon) 배지(Nissui)로 약 2 x 105세포/180 ㎕의 농도로 희석하였다. 박테리아 5는 브레인 하트 인퓨전 배지에서 밤새 배양하였다. 배양물을 탁도를 측정하여 브레인 하트 인퓨전 배지로 약 2 x 105세포/180 ㎕의 농도로 희석시켰다. 각 박테리아 희석액 180 ㎕를 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 위치시켰다. 다른한편, 각각의 박테리아 희석액을 추가로 희석하여 L-브로쓰 또는 브레인 하트 인퓨전 배지의 플레이트상에 스프레딩시켰다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션 시켰다. 생성된 콜로니를 계수하여 초발(starting) 생존 세포수를 측정하였다.
14.4 mg/ml DGE 용액을 매 2배로 희석하여 일련의 희석액을 제조하였다. 각 희석액 20 ㎕를 박테리아 희석액이 위치된 웰에 위치시켰다. 세포를 37℃에서 24시간동안 정치배양하였다. 배양후, 각 배양물의 탁도를 측정하였다. 염수가 첨가된 대조군보다 탁도가 낮은 웰중의 샘플의 농도를 최소 성장-억제 농도로 정의하였다.
또한, 박테리아 세포 성장이 관찰되지 않은 웰로부터의 배양물을 플레이트에 스프레딩시켰다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션한후, 콜로니수를 계수하여 생존 세포수를 측정하였다. 미리 측정된 초발 생존 세포수와 비교하여 샘플의 첨가로부터 24시간 정치배양후 생존 세포수가 낮은 배양물중의 샘플의 농도를 최소 살박테리아 농도로 정의하였다. 박테리아 1 내지 5에 대한 DGE의 최소 성장-억제 농도 및 최소 살박테리아 농도를 표 2에 나타낸 바와 같이 측정하였다.
표 2
최소 성장-억제 농도(㎍/ml) 최소 살박테리아 농도(㎍/ml)
박테리아 1 360 720
박테리아 2 360 720
박테리아 3 360 720
박테리아 4 360 720
박테리아 5 90 180
상기 기술된 바와같이, DGE는 항미생물 활성을 나타냈다. 또한, 하기 기술된 κ-DGE 및 DGE-GSH도 유사한 활성을 나타냈다.
실시예 6: 항돌연변이원 활성 시험
항돌연변이원 활성을, β-갈락토시다제 활성을 참고로하여 돌연변이원성을 측정할 수 있는 우무(umu) 시험에 의해 환경적 돌연변이원을 검출하기 위한 방법(Mutation Research, 147:219(1985)에 따라 측정하였다. 간략하게, 25 ㎕의 돌연변이원[10㎍/ml의 미토마이신(mitomycin) C (DNA 가교제) 또는 7 ㎍/ml의 4-니트로퀴놀린-1-옥사이드(NQO, DNA 메틸화제)]을 다양한 농도(1.0, 5.0, 10 또는 12 mM)의 DGE 용액 50 ㎕에 첨가하였다. 0.12의 OD600의 TGA 배지중의 살모넬라 티피머리움 TA1535/pSK1002의 배양물을 혼합물에 첨가하여 최종 부피를 1.5 ml로 만들었다. 이어서, 혼합물을 진탕하면서 37℃에서 2시간동안 인큐베이션하였다. 200 ㎕의 배양물을 Miller의 방법[Experiments in molecular genetics, pp. 352(1972)]에 따라 β-갈락토시다제 활성을 측정하기 위하여 사용하였다. 그 결과를 표 3에 나타냈다.
표 3. β-갈락토시다제 활성
DGE의 최종 농도(mM) 0 0.03 0.17 0.33 0.5
미토마이신 C 611 590 570 451 383NQO 1437 1376 1212 1038 926
상기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 0.5 mM의 최종 농도에서의 DGE는 미토마이신 C, DNA 가교제에 대해서 37%의 항돌연변이 활성, 및 NQO, 메틸화제에 대해 36%의 항돌연변이 활성을 나타냈다. 또한, 하기 기술된 κ-DGE 및 DGE-GSH 도 또한 유사한 활성을 나타냈다.
실시예 7: 항암 활성 시험
(1) 한천 분말(Wako Pure Chemical Industries)을 3%의 최종 농도로 50 mM 시트르산 용액에 첨가하였다. 혼합물을 95℃에서 160분동안 가열하고, pH12 알칼리로 처리하고, 이어서 사용할 때 중화시켜 항암 활성 시험용 시험 용액을 제조하였다.
숫컷 누드 마우스(SPE/VAFBalb/cAnNCrj-nu, 4 주령)를 Nippon Charles River로부터 구입하고, 1주일동안 예비사육하였다. 인간 결장 암세포주 HCT116(ATCC CCL-247)을 1.5 x 106세포/마우스로 마우스에 피하 이식하였다.
결장 암세포주를 이식하고 2주후, 사용직전 pH 6.5로 조정된 항암 활성 시험용 시험 용액을 음료수로서 매주 5일동안 마우스에 자유롭게 공급했다. 마우스당 용액의 1일 섭취 총 부피는 3.5 ml이었다. 또한 Oriental 효모로부터의 MF를 먹이로서 마우스에 자유롭게 공급했다.
시험 용액의 투여를 시작하고 4주후, 고체 암을 시험동물을 공급받은 각 마우스로부터 제거하여, 고체 암의 중량을 보통 물이 공급된 대조 마우스로 부터의 것과 비교하였다. 이 시험을 그룹당 10마리를 사용하여 수행하였다.
결과로서, 암 성장의 유의적인 억제가 항암 활성 시험용 시험 용액을 경구적으로 공급받은 그룹에서 관찰되었다.
(2) 에를리흐(Ehrlich)의 악성종양 세포를 18마리의 암컷 ddY 마우스(5주령, 체중 약 25 g)에 복강내로 투여하였다(1.2 x 106세포/마우스). 30일동안 계속 관찰을 하였다. 평균 생존일수, 연명률 및 30일간 생존수를 계산하였다. 마우스를 각 그룹이 6마리가 되게 3 그룹으로 나누었다. 하나는 대조 그룹이고, 다른 두그룹은 DGE를 각각 2 mg/kg 및 20 mg/kg 공급받았다. DGE를 암투여후 다음날로부터 4일동안 복강내 투여하였다.
그 결과를 표 4에 나타냈다. 평균 생존일수는 대조 그룹의 경우 14.3일이었다. DGE를 2 mg/ml 및 20 mg/kg으로 각각 공급받은 그룹의 경우 30일 생존수는 1 및 3마리이었다. DGE를 2 mg/ml 및 20 mg/kg으로 공급받은 그룹의 경우, 평균 생존일 수는 23.7일 및 28.0일 이었고, 연명률은 각각 141% 또는 그이상 및 195% 또는 그이상이었다. 따라서, 유의적인 연명 효과가 관찰되었다.
표 4
평균 생존일수(일) 연명률(%) 30일 생존수
대조군 14.3 100 0
2 mg/kg의 DGE 23.7 ＞141 1
20 mg/kg의 DGE 28.0 ＞195 3
상기 기술된 바와 같이, DGE는 항암 활성을 나타내었다. 또한 하기 기술되는 κ-DGE 및 DGE-GSH 또한 유사한 활성을 나타내었다.
실시예 8: 멜라닌생산 억제 시험
10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에 현탁된 마우스 멜라노마 세포 B16BL6을 5 x 104세포/웰/2 ml 배지로 6-웰 플레이트에 분배시키고, 플레이트를 37℃에서 인큐베이션했다. 2일째, 100 ㎕의 DGE 용액(2 mg/ml 내지 0.2 mg/ml)을 첨가하였다. 7일째, 배지를 교환하고, 동시에 100 ㎕의 DGE 용액(2 mg/ml 내지 0.2 mg/ml)을 첨가하였다. 8일째, 세포를 수확하였다. DNA, RNA 및 단백질을 분해한후, 400 nm에서의 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성 억제 활성을 측정하였다.
간략히, 아스피레이션에 의해 배지를 제거한후, 20 mM EDTA 용액에 용해시킨 0.25% 트립신 0.3ml를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 10분동안 인큐베이션했다. 새로운 배지 2 ml를 웰에 첨가하고, 세포를 현탁시켰다. 현탁액을 튜브에 옮겼다. 배지를 원심분리에 의해 제거하고, 세포를 2 ml PBS에 현탁시키고, 다시 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 5 mM의 염화 마그네슘을 함유하는 50 mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH 5.0) 30 ㎕ 및 70,000 U/ml DNase I(Takara Shuzo) 1㎕를 세포에 첨가하였다. 혼합물을 완전히 혼합하고, 이어서 37℃에서 2시간 인큐베이션하여 DNA를 분해시켰다. 이어서, 1 ㎕의 10 mg/ml 리보뉴클레아제 A(Sigma)를 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 50℃에서 1시간동안 인큐베이션하여 RNA를 분해하였다. 마지막으로, 100 ㎍/ml 프로테이나제 K(Sigma), 0.1% 트리톤 X 및 10 mM EDTA 를 함유하는 100 mM 트리스-하이드로클로라이드 버퍼(pH 7.8)을 첨가하여 총 부피를 2 x 106세포 경우 200 ㎕로 만들었다. 혼합물을 37℃에서 16시간동안 인큐베이션한후, 400 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
결과로서, DGE 경우의 멜라닌 생성 억제 활성을 관찰하여, 그의 미백 효과를 확인하였다. 또한, 하기 기술된 κ-DGE 및 DGE-GSH도 유사한 활성을 나타냈다.
실시예 9: α-글루코시다제 억제 시험
(1) DGE의 α-글루코시다제 억제 활성을 α-글루코시다제에 대한 발색 기질인 p-니트로페닐-α-D-글루코피라노시드와 효모 유래의 α-글루코시다제를 반응시키고 비색법으로 가수분해에 의해 방출된 4-니트로페놀을 정량화하여 측정하였다. 간략하게, 10 ㎕의 α-글루코시다제 용액[40 mU/ml, S. cerevisiae 유래, Sigma, 10mM 포스페이트 버퍼(pH 7.2, 37℃)에 용해된] 및 10 mM 포스페이트 버퍼(pH 7.2, 37℃)에 용해된 시험 화합물을 함유하는 용액 10 ㎕를 혼합했다. 1.5 mg/ml 기질 용액[Sigma, 10 mM 포스페이트 버퍼(pH 7.2, 37℃)에 용해된] 80 ㎕를 첨가하여 반응을 개시하였다. 37℃에서 40분간 반응시킨후, 410 nm에서의 흡광도를 측정하였다(Shimadzu uv2200). 그 결과를 표 5에 나타냈다. 여기에서의 나머지 활성은 시험 샘플이 없는 활성을 100%로 정의하여 계산하였다.
표 5
첨가된 DGE의 양(μM) 흡광도(OD 410 nm) 나머지 활성(%)
0 0.444 100
5 0.433 98
50 0.401 90
500 0.221 50
1000 0.114 26
5000 0.083 19
이들 결과로 부터 알 수 있듯이, DGE는 α-글루코시다제 억제 활성을 나타냈다. α-글루코시다제 활성을 50 %억제하는 DGE의 농도(IC50)는 500μM이었다.
(2) 래트 소장 점막유래의 α-글루코시다제의 조효소 제조물[Arne Dahlqvist, Anal. Biochem., 7:18-25(1964)에 기술된 방법에 따라 제조]을 다음과같이 DGE의 α-글루코시다제 억제 활성을 측정하는데에 사용하였다.
효소반응을 위해, 100 mM의 최종 농도(가용성 전분 경우 0.5%)로 10 mM 포스페이트 버퍼(pH 7.0)중의 기질로서 슈크로즈, 말토즈, 트레하로즈 또는 가용성 전분 용액 80㎕를 동일한 버퍼로 적절하게 희석된 시험 샘플 용액 10 ㎕에 첨가하였다. 여기에 래트 소장으로부터 제조된 조효소 10 ㎕를 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 20분간 반응시켰다.
글루코즈 측정용 시약(Wako Pure Chemical Industries) 3 ml를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 5분간 반응시킨후, 혼합물중의 글루코즈 함량으로서 505 nm에서의 흡광도를 측정하여 효소반응을 평가하였다.
α-글리코시다제에 의한 각 기질의 분해에 대한 DGE의 억제 활성을 상기 언급된 방법에 따라 4개의 상이한 농도로 DGE를 사용하여 측정하였다. α-글리코시다제 억제 활성을 DGE가 없는 대조군의 활성을 100%로 정의하여 상대 활성(%)으로서 표현하였다.
그 결과를 표 6에 나타내었다.
표 6
DGE(mM) 0.2 0.5 1.0 2.0
슈크로즈 91 92 83 71
말토즈 96 97 100 96
트레하로즈 98 96 99 100
가용성 전분 100 95 91 92
Dixon 플로트를 사용하여 측정된 슈크로즈에 대한 DGE의 억제 상수(Ki)는 6.0 mM이었다.
슈크로즈를 기질로서 사용했을 때, DGE는 말토즈 등을 사용했을 때보다도 더높은 α-글리코시다제 억제 활성을 나타냈다. 또한, 하기 기술된 κ-DGE 및 DGE-GSH 또한 유사한 α-글리코시다제 억제 활성을 나타냈다.
실시예 10: 항류마티스 활성 시험
DSEK 세포는 만성 류마티즘을 앓는 인간 환자의 활막으로 부터 설정된 섬유아세포 세포주이고, 시험관내 류마토이드 모델로서 Department of Second Internal Medicine, Integrated Medical Center, Saitama Collage of Medicine에 소장되어 있다. DSEK 세포를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 포화되도록 10% FBS(Bio Whittaker)를 함유하는 Iscov-MEM 배지(IMDM: Gibco-BRL)에서 배양하였다. 세포를 트립신-EDTA 용액(Bio Whittaker)을 사용하여 3 x 104세포/ml의 농도로 동일한 배지에 현탁시켰다. 200 ㎕의 현탁액을 96-웰 마이크로티터 플레이트(Falcon)의 각 웰에 분배하였다. 세포 성장이 80% 포화되는 5 내지 7일동안 배양한후, 배지를 25, 50, 75, 100, 200 또는 400 μM의 농도로 DGE를 함유하는 상기 언급된 배지 200 ㎕로 교체했다.
24 또는 72시간후, Premix WST-1(Takara Shuzo, MK400) 10㎕를 각 웰에 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 3.5시간동안 반응시켰다. 세포 성장의 정도를 450 nm에서의 흡광도(A450)로부터 650 nm(A650)에서의 흡광도를 빼 수득된 값으로 표현했다.
그 결과를 표 7에 나타냈다.
표 7
DGE 농도(μM) 배양 기간24시간 72시간
세포 성장도(A450-650)
0 3.98 3.94
25 3.86 3.33
50 3.24 3.25
100 2.88 2.05
200 1.26 0.48
400 0.71 0.35
A450-650데이터를 기초로하여 결정된 반-세포 성장 억제시키는 농도(IC50)는 각각 24시간에서는 207 μM이고, 72시간에서는 112 μM이었다.
상기 기술된 바와같이, 시험관내 류마토이드 모델(DSEK 세포)에서 류마토이드 세포의 성장이 PBS가 첨가된 대조군 웰과 비교된바 DGE가 첨가된 웰에서 강력하게 억제하였다. 또한, 화합물이 성장 억제 활성을 유지할 뿐만아니라 시간 경과에 따라 활성을 향상시키는 경향이 있는 것이 인식되었다.
이들 결과는 DGE가 강한 항류마티스 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 그러므로, DGE는 만성 류마티즘에 대해서 효과적인 치료제 및 건강 식품으로서 개발되는 것이 기대된다. 또한, 하기 기술된 κ-DGE 및 DGE-GSH도 또한 유사한 활성을 나타냈다.
150 ㎕/웰의 세포 상등액을 24시간 또는 72시간에서 DSEK 세포 배양물로부터 회수하였다. 세포로부터 사이토카인(인간 TGF-β, 인간 FGF-β, 인간 IL-1α 및 인간 IL-10)의 생산(발현)에 대한 DGE의 효과를 각각의 사이토카인(인간 FGF-β 및 인간 IL-10에 대한 인터겐으로부터 및 인간 IL-1α 및 인간 TGF-β에 대한 프로메가로 부터 )에 특이적인 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.
결과로서, DGE는 인간 IL-1α및 인간 FGF-β의 생성 억제 활성 및 인간 IL-10 및 인간 TGF-β의 생성 향상 활성을 나타냈다.
실시예 11: 프로스타글란딘 E2생산 억제 시험
10% 소 태아 혈청을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지에 RAW264.7 세포를 3 x 105세포/㎖ 가 되도록 현탁시켰다. 500㎕의 현탁액을 48웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 가하고, 플레이트를 5% CO2의 존재하에, 37℃에서 6시간 배양하였다. DGE를 0.5 mM의 농도로 물에 용해시키고, 여과에 의해 멸균시켜 제조된 수용액 10㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가로 0.5시간 또는 5시간 인큐베이션하였다. 그 후, 각 웰에 50㎍/㎖ LPS 수용액 10㎕를 첨가하였다. 플레이트를 12시간 인큐베이션한 후, 프로스타글란딘 E2의 양을 측정하였다. 또한, 대조 그룹으로서 LPS가 첨가되지 않은 그룹 및 DGE가 첨가되지 않은 그룹을 설정하였다.
배양한 후, 세포 상등액내의 프로스타글란딘 E2의 양을 ELISA KIT(Neogen, Co.404110)를 이용하여 측정하였다. 측정은 모두 3중으로 수행하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 예비-배양동안 DGE가 첨가된 아양한 배양 조건에서 인큐베이션하여 수득된 배지중의 프로스타글란딘 E2농도를 예시한다. 도 6에서 수평축은 배양 조건을 나타내고, 수직툭은 프로스타글란딘 E2농도(ng/ml)를 나타낸다.
그 결과, DGE는 LPS에 의해 유발된 프로스타글란딘 E2생산을 억제하였다. 또한, LPS를 첨가하기 전에, DGE의 존재하에서 0.5시간 인큐베이션한 그룹보다 5시간 인큐베이션한 그룹에서, 프로스타글란딘 E2생산억제가 더욱 강하다는 것이 확인되었다.
실시예 12 열 쇼크 단백질 유발시험
2 ×105세포/ml의 농도로 HL-60 세포 및 10%의 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 5㎖를 6웰 플레이트의 각 웰에 위치시켰다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2의 존재하에 24시간동안 인큐베이션하였다. 최종 농도가 0, 6.25, 12.5, 25, 50 또는 100 μM이 되도록 DGE를 첨가하였다. 추가로 6시간 인큐베이션을 계속하였다.
배양후, 세포수를 세었다. 세포를 원심분리하여 회수하고, PBS로 세척하여, DGE 처리세포를 제조하였다. 또한, 45℃에서 10분간 열처리한 후, 동일한 방법으로 배양된 세포도 제조하였다.
이 처리세포들을 이용하여, 몰리큘러 클로닝(Molecular Cloning)[Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 기재된 방법에 따라 SDS-PAGE에 사용하였다. 처리세포를, 2.5 ×105세포/ml의 농도로 SDS-PAGE 샘플 버퍼에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 100℃에서 10분간 처리하였다. 5 ㎕씩의 각 세포 현탁액을 2 개의 SDS-PAGE 겔 (5% 스태킹 겔(stacking gel), 10% 세파레이션 겔(separation gel))에 적용하고, 전기영동을 수행하였다. 한쪽의 겔은 쿠마시 염색(Goomassie staining)을 하였다. 다른 쪽의 겔은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 트랜스퍼막(polyvinylidene difluoride transfer membrane)[ImmobilonTM: Millipore, Cat. # IPVH000-10]에 블로팅하였다. 이 막을 Block Ace(Dainippon Pharmaceutical, Cat. # UK-B25)를 사용하여 4℃에서 밤새 블로킹하였다.
블로킹한 막에 열 유도되는 70kDa의 열 쇼크 단백질과 특이적으로 반응하는 모노크로날 항체 HSP72/73(Ab-1)(Oncogene Research Products, Cat. # HSP01)를 반응시켰다. 막을 0.05% Tween 20을 포함하는 TBS로 세정하고, 추가로, TBS로 세정하였다. 이어, 막을 퍼옥시다제가 복합된 이차항체 HRT-토끼 항마우스 1gG(H+L)(Zymed Laboratories, Inc., Cat. # 61-6520)와 반응시켜, 상술한 바와 같이 세정하였다. 이처럼, 일차항체 및 이차항체와 반응시킨 막에, 케미루미놀 시약 르네상스TM(chemiluminol reagent, RenaissanceTM)(Dupont NEN, Cat. #NEL-100)를 반응시켰다. 막을 X-선 필름에 노광하여 70kDa 열 쇼크 단백질의 유도를 확인하였다.
그 결과, DGE에 의한 70kDa 열 쇼크 단백질의 유도가 확인되었다. 그 유정도를 표 8에 나타내었다. 도 8에서, + 는 유도수준을 나타낸다. +가 많은 만큼 유도가 강하다는 것을 의미한다. 한편, - 는 유도가 확인되지 않았다는 것을 의미한다.
또한, κ-DGE 및 후술하는 DGE-GSH도 유사한 열 쇼크 단백질 유도 활성을 나타내었다.
표 8
세포의 처리 열 쇼크 단백질 유도
45℃에서 10분간 열처리 + + +0 μΜ DGE -6.25 μΜ DGE +12.5 μΜ DGE +25.0 μΜ DGE + +50.0 μΜ DGE + + +100 μΜ DGE + + + +
실시예 13 5-L-글루타치온-S-일-2-하이드록시-3,7-디옥사비시클로[2.2.2]옥탄-1-올(DGE-GSH)의 제조
(1) DGE와 환원형 글루타치온(GSH ; Nacalai Tesque)을 각각 20mM의 농도로 PBS에 용해시키고, 혼합물을 37℃에서 밤새 반응시켰다. 이 반응혼합물 100㎕를 순상 칼럼 PAL-PAK 형 S상에서 분획하였다. 크로마토그래피를 다음 조건에서 수행하였다: 유량 1 ㎖/분, 0∼10분 동안은 0.1% TFA가 함유된 90% 아세토니트릴 수용액, 10∼50분 동안은 0.1% TFA가 함유된 90% 아세토니트릴 수용액으로부터 0.1% TFA가 함유된 50% 아세토니트릴 수용액에 대한 선형구배, 검출: 195 ㎚에서의 흡광도; 분획 수집 : 매 1.5분. 각 분획을 농축건조시키고, 50㎕ 증류수에 재용해시켰다. HL-60 세포를 이용하여 실시예 1-(2)와 같은 방법으로 종양세포증식억제활성을 측정하였다. 그 결과, 30∼40부근의 분획을 첨가한 그룹에서 세포자멸 소체가 관찰되었다. 이들 그룹은 대조군에 물을 첨가한 그룹에 비해 590㎚에서의 흡광도가 낮고, 세포증식이 억제되었다. 상기 방법과 동일한 방법으로 제조한 활성분획 50 ㎕을 역상 크로마토그래피(TSKgel ODS-80Ts(5㎛), Toso, 4.6 ×250 ㎜)상에서 분획하였다. 크로마토그래피를 다음 조건하에서 수행하였다: 유속 1㎖/분, 0.1% TFA가 함유된 증류수(0∼15분), 0.1% TFA가 함유된 증류수로부터 0.1% TFA가 함유된 50% 아세토니트릴 수용액에의 선형구배(15∼30분), 0.1% TFA가 함유된 50% 아세토니트릴 수용액(30∼45분), 검출: 215㎚에서의 흡광도; 분획의 수집: 매 1.5분. 각 분획을 농축건조시키고, 50㎕의 증류수에 재용해시켰다. HL-60 세포를 이용하여 실시예 1-(2)와 같은 방법으로 종양세포증식억제활성을 측정하였다. 그 결과, 4∼9부근의 분획을 첨가한 그룹에서, 세포자멸 소체가 관찰되었다. 이들 그룹은 대조군에 물을 첨가한 그룹에 비해 590㎚에서의 흡광도가 낮고, 세포증식이 억제되었다. 이 결과는 세포자멸 유발 활성을 입증한다.
전술한, 순상 크로마토그래피를 10회 반복하였다.
세포자멸 유발 활성을 갖는 분획을 수집하여, 농축건조시킨 후, 1 ㎖ 증류수에 재용해시키고 순상 크로마토그래피시켜 정제분획을 제조하였다. 그후, 순상 크로마토그래피에 의해 정제된 분획을 전술한 역상 크로마토그래피에 걸었다. 세포자멸 유발활성을 갖는 분획을 수집하고 농축건조시켰다. 그 결과, 20m m DGE와 20mM 글루타치온을 함유하는 반응 혼합물 1㎖로부터 5㎎의 세포자멸 유발 활성을 갖는 화합물이 얻어졌다. 이 화합물을 이용하여 구조결정을 행하였다.
(2) 실시예 13-(1)에서 수득된 세포자멸 유발성 물질, 즉 DGE와 글루타치온의 반응 생성물의 질량분석을 DX302 질량분석계를 이용하여 행하였다. 또한, 샘플을 중수에 용해시켜, 핵자기공명법(NMR)으로 그 구조를 분석하였다. 그 결과를 이하에 나타내었다.
실시예 13-(1)에서 수득된 세포자멸 유발 물질의 질량 스펙트럼을 도 7에 예시하였다. 물질의1H-NMR 스펙트럼을 도 8에 예시하였다. 물질의13C-NMR 스펙트럼을 도 9에 나타내었다. 도 7에서, 수평축은 m/z 값을 나타내고, 수직축은 상대강도(%)를 나타낸다. 또한, 도 8 및 도 9에서, 수평축은 화학 시프트값(ppm)을 나타내고, 수직축은 시그날의 강도를 나타낸다.
FAB-MS : m/z 452[M+H]+
474[M+Na]+
544[M+글리세롤+H]+
566[M+글리세롤+Na]+
매트릭스로서 글리세롤을 이용하였다.
1H-NMR의 화학시프트값은 HOD의 화학시프트값을 4.65ppm으로 추축하여 표현하였다.
13C-NMR의 화학시프트값은 디옥산의 화학시프트값을 67.4ppm으로 추측하여 표현하였다.
또한,1H-NMR 및13C-NMR의 피크의 귀속 번호는 하기식과 같다.
이상으로부터, 실시예 13-(1)에서 수득된 세포자멸 유발 물질은, 5-L-글루타치온-S-일-2-하이드록시-3,7-디옥사비시클로[2.2.2]옥탄-1-올(이하, 간단히 DGE-GSH로 언급한다)]인 것이 명확해졌다.
실시예 14 세포자멸 유발 시험
실시예 13-(1)에서 수득된 DGE-GSH 수용액 10㎎/㎖를 여과하여 멸균시키고, 멸균수로 2배, 4배, 8배, 16배, 32배, 64배, 128배, 256배 또는 512배 희석하였다. 실시예 1-(2)에 기재된 방법으로 이 희석액들의 HL-60세포에 대한 증식억제활성을 측정하였다. 그 결과, DGE-GSH를 첨가한 그룹에서 세포자멸 소체가 관찰되었다. 이 그룹은 대조군인 물 첨가된 그룹에 비해 590㎚에서의 흡광도가 낮고, 세포증식이 억제되었다. 이 결과를 토대로 계산된 590㎚에서의 흡광도가 물 첨가된 대조군에 비해 2분의 1이 되는 50% 증식억제농도인 GI50은 약 48.7㎍/㎖이었다.
실시예 15 NO 생산 억제 시험
RAW264.7 세포를 페놀 레드없이 10% 소 태아 혈청 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지에 3 x 105세포/ml의 농도로 현탁시켰다. 500 ㎕의 현탁액을 48-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 12시간동안 인큐베이션했다. 50 ㎍/ml 리포폴리사카라이드 및 5000 U/ml 인터페론-γ를 함유하는 수용액 10 ㎕과 실시예 13-(1)에서 제조한 DGE-GSH를 1mM의 농도로 물에 용해시키고, 여과하여 멸균한 수용액 10 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가로 16시간동안 인큐베이션하였다. NO가 배지에서 산화됨으로써 생긴 NO2 -의 농도를 측정하였다. 또, 대조군으로서 LPS 또는 IFN-γ이 첨가되지 않은 그룹 및 DGE-GSH가 첨가되지 않은 그룹이 제공되었다.
배양후, 4% Griess 시약(Sigma, G4410) 100 ㎕를 배지 100 ㎕에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분동안 정치하였다. 이어서 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 배지중의 NO2 -농도를 상기 기술된 바와같은 배지중에 용해된 주어진 농도의 NaNO2를 사용하여 제조된 캘리브레이션 곡선(calibration curve)으로부터 계산하였다.
그 결과, 어떤 것도 전혀 첨가되지 않은 배지중의 NO2 -농도가 4.6 μΜ이고, LPS 및 IFN-γ을 첨가하고, DSG-GSH가 첨가되지 않은 대조군 배지 중의 NO2 -농도가 12.1 μΜ이었다. DGE-GSH가 첨가된 배지중의 NO2 -농도는 9.4μΜ로 낮아, DGE-GSH는 LPS 및 IFN-γ에 의한 NO 생산 유도 억제 효과를 나타냈다.
실시예 16 프로스타글란딘 E2생산 억제 시험
RAW264.7 세포를 페놀 레드없이 10% 소 태아 혈청 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지에 3 x 105세포/ml의 농도로 현탁시켰다. 500 ㎕의 현탁액을 48-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 12시간동안 인큐베이션했다. 50 ㎍/ml 리포폴리사카라이드 수용액 10 ㎕과 실시예 13-(1)에서 제조한 DGE-GSH를 1mM의 농도로 물에 용해시키고, 여과하여 멸균한 수용액 10 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가로 16시간동안 인큐베이션한 후, 프로스타글란딘 E2의 양을 측정하였다. 또한, 대조군으로서 LPS가 첨가되지 않은 그룹 및 DGE-GSH가 첨가되지 않은 그룹을 제공하였다.
배양후, 세포 상등액내의 프로스타글란딘 E2의 양을 프로스타글라딘 E2ELISA Kit(Neogen, Code 404110)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 어떤 것도 전혀 첨가되지 않은 배지중의 프로스타글란딘 E2농도가 50.3ng/㎖이었다. LPS가 첨가되고 DGE-GSH가 첨가되지 않은 대조군 배지의 프로스타글란딘 E2농도가 63.4ng/㎖이었다. DGE-GSH가 첨가된 배지중의 프로스타글란딘 E2농도는 50.7ng/㎖로 낮아, DGE-GSH는 LPS에 의한 프로스타글란딘 E2생산 유도를 억제함을 나타냈다.
실시예 17 림프구 활성화 억제 시험
ddY 마우스 (암컷, 7주령, 체중 약 25g)는, Nippon SLC로부터 구입하고, 1주일 동안 예비 사육한 후, 실험에 사용하였다. 마우스로부터 비장을 적출하고, 잘게 분쇄하여 10% 소 태아 혈청(HyClone)을 함유한 RPMI-1640 배지에 현탁하여 단세포 현탁액을 얻었다. 플라스틱 페트리 접시에 접착된 접착성 세포를 제거하고, 비접착성 세포를 비장 림프구로서 이용하였다. 비장 림프를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에 2 ×106세포/㎖의 농도로 현탁시켰다. 200㎕의 현탁액을 96웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 파종하였다. 대조군이외의 각 웰에 각 농도의 DGE를 첨가하였다. 추가로 각 웰에 5㎍의 Con A(Nacalai Tesque)를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서, 5% CO2탄산가스의 존재하에 2일간 인큐베이션하였다. 배양종료 1일전에 37 kBq의3H-티미딘(3H-thymidine)(Daiichi Pure Chemicals)을 각 웰에 첨가하여 펄스-라벨을 수행하였다. 배양후, 세포를 글래스필터에 회수하여 방사활성을 측정하였다.
결과를 도 10에 나타내었다. 미토겐(mitogen) 자극에 의해 활성화된 림프구의 증식에 대하여 DGE는 용량의존적인 억제 활성을 나타내었고, 0.3㎍/㎖의 농도에서 증식을 거의 완전히 억제하였다. 따라서, 림프구의 활성화에 대한 억제 작용이 나타났다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 세포자멸 유발조성물, 항암조성물, 활성 산소 생산 억제 조성물, 과산화 지질 라디칼 생산 억제 조성물 및 NO 생산 억제 조성물 등과 같은 항산화제 조성물, 프로스타글라딘 합성 억제 조성물, 항병원성 미생물 조성물, 신선도 보존 조성물, 항돌연변이원 조성물, 항고혈당 조성물, 항고지혈증 조성물, 열 쇼크 단백질 생산 유도 조성물, 항바이러스 조성물 및 α-글루코시다제 억제 조성물의 활성성분으로서 유용한, 화학식(Ⅰ)로 표시되는 화합물, 화학식(Ⅱ)로 표시되는 화합물, 그의 염, 및 본 발명의 세포자멸 유발성 물질이 제공된다.
이 물질들을 함유하며, 이들을 희석 및/또는 첨가하여 제조된 식품 및 음료는 세포자멸 유발 활성, 항암 활성, 활성산소 생산 억제 활성 및 NO 생산 억제 활성등과 같은 항산화제 활성, 프로스타글라딘 합성 억제 활성, 항병원성 미생물 억제 활성, 항돌연변이원 활성, 항고혈당 활성, 항비만 활성, 열 쇼크 단백질 생산 유도 활성 및 항바이러스 활성을 갖는 기능성 식품 또는 음료로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 암환자나 바이러스성 질병을 앓는 환자의 병변세포에 세포자멸을 유발하고, 이와 같은 질병들의 예방하거나 증상의 개선에 효과적인 식품 또는 음료를 제공한다. 세포자멸은 식품 또는 음료로 본 발명의 상기 언급된 화합물들을 경구 흡수시 유도될 수있다. 그러므로, 대장암 및 위암 등의 소화기계통의 암의 경우, 본 발명의 식품 또는 음료는 소화기계통의 암의 질병 상태를 예방하거나 증상을 개선시키는데 뛰어난 효과를 가진다. 또한, 그 활성 산소 생성 억제 작용등과 같은 항산화작용에 의해 상기한 식품 및 음료는 항산화스트레스용 식품 또는 음료로서도 우수하다.
또한, 화학식(Ⅰ) 또는 화학식(Ⅱ)로 표시되는 화합물은 활성 산소 생산 억제용 항산화용 화합물로서 유용하다. 본 발명의 항산화용 화합물을 함유하고, 그를 희석 및/또는 첨가하여 제조되는 식품 또는 음료는, 활성 산소와 같은 생체내 산화물질이 원인이 되는 질병의 증상 개선용 식품 또는 음료로서 유용하다. 또한, 본 발명의 식품 또는 음료는 변비개선 또는 예방에 효과적이다.
본 발명에 의해 제공되는 화학식(Ⅰ) 로 표시되는 화합물, 화학식(Ⅱ)로 표시되는 화합물 및 그 염은 식품 및 음료에 활성 산소 억제 작용 등의 항산화성을 부여하는 신기능성 화합물로서 유용하다.
본 발명의 화합물은 신선도 유지 효과를 갖는다. 그러므로, 이들은 식품 또는 상하기 쉬운 식품의 맛이나 신선도의 유지에 매우 유용하다.
더욱이, 본 발명의 화합물을 함유하는 화장품은 미백용 또는 보습용 화장품으로서 유용하다.
본 발명의 주목적은 천연물질로부터 유래된 세포자멸-유도 활성과 같은 생리학적 기능을 갖는 고도의 안전한 물질 및 그물질의 생산 방법 및 용도를 제공한다.
본 발명은 다음과 같이 개략된다. 본 발명의 제 1 면은 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물, 및 그의 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하고, 치료 또는 예방을 위하여 세포자멸의 유발을 필요로하는 질병, 암질병, 치료 또는 예방을 위하여 활성 산소 생산의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 일산화질소 생산의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 프로스타글란딘 합성의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 활막(syonovial) 세포 증식의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 열 쇼크 단백질 생산의 유발을 필요로하는 질병, 또는 치료 또는 예방을 위하여 α-글리코시다제의 억제를 필요로하는 질병을 치료 또는 예방을 위하여 사용되는 약제학적 조성물에 관한 것이다:
상기 식에서,
X 및 Y는 H 또는 CH2OH이고, 단 X가 CH2OH일 때, Y가 H 이고, X가 H일 때, Y는 CH2OH 이며,
R은 SH 그룹-함유 화합물로부터 SH 그룹을 유리시켜 얻은 잔기이다.
본 발명의 제 2 면은 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 중성 내지 알칼리성 조건하에서 처리하는 것을 포함함을 특징으로 하여 화학식(I)의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 3 면은 화학식(II)의 화합물 또는 그의 염에 관한 것이다.
본 발명의 제 4 면은 화학식(I)의 화합물을 SH 그룹-함유 화합물과 반응시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 화학식(II)의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 5 면은 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하고, 그를 희석하여 제조되고/되거나 그를 첨가하여 제조된, 식품 또는 음료에 관한 것이다.
본 발명의 제 6 면은 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 중성 내지 알칼리성 조건하에서 처리하여 수득된 화학식(I)의 화합물을 함유하는 식품 또는 음료에 관한 것이다.
본 발명의 제 7 면은 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 항산화제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제 8 면은 본 발명의 제 7 면의 항산화제 조성물을 함유하는 식품 또는 음료에 관한 것이다.
본 발명의 제 9 면은 화학식(I) 또는 화학식(II)의 항산화용 화합물에 관한 것이다. 예를들어, 본 화합물은 활성 산소 생산을 억제하기 위한 화합물로서 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 제 10 면은 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 신선도를 보존하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제 11 면은 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 화장품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제 12 면은 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 α-글리코시다제 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제 13 면은 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 중성 내지 알카리성 조건하에서 처리하여 제조된 세포자멸-유발 물질에 관한 것이다.
본 발명의 제 14 면은 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 중성 내지 알카리성 조건하에서 처리하여 제조된 세포자멸-유발 물질을 함유하고, 그를 희석하여 제조되고/되거나 그를 첨가하여 제조된 식품 또는 음료에 관한 것이다.
이하에서, 본 발명은 첨부된 도면을 참고로하여 상세히 설명될 것이다.

Claims (23)

  1. 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물, 및 그의 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하고, 치료 또는 예방을 위하여 세포자멸의 유발을 필요로하는 질병, 암질병, 치료 또는 예방을 위하여 활성 산소 생산의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 일산화질소 생산의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 프로스타글란딘 합성의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 활막(syonovial) 세포 증식의 억제를 필요로하는 질병, 치료 또는 예방을 위하여 열 쇼크 단백질 생산의 유도를 필요로하는 질병, 또는 치료 또는 예방을 위하여 α-글리코시다제의 억제를 필요로하는 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 사용되는 약제학적 조성물:
    상기 식에서,
    X 및 Y는 H 또는 CH2OH이고, 단 X가 CH2OH일 때, Y가 H 이고, X가 H일 때, Y는 CH2OH 이며,
    R은 SH 그룹-함유 화합물로부터 SH 그룹을 유리시켜 얻은 잔기이다.
  2. 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 중성 내지 알칼리성 조건하에서 처리하는 것을 포함함을 특징으로 하여 제 1 항에서 정의된 화학식(I)의 화합물을 제조하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물이 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질을 산성 조건하에서 가수분해하거나 효소분해하여 수득되는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물이 아가로비오즈, κ-카라비오즈, 및 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는, 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물인 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질이 한천, 아가로즈 및/또는 카라기난인 방법.
  6. 제 1 항에서 정의된 화학식(II)의 화합물 또는 그의 염.
  7. 제 1 항에서 정의된 화학식(I)의 화합물을 SH 그룹-함유 화합물과 반응시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 화학식(II)의 화합물의 제조방법.
  8. 제 1 항에서 정의된 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하고, 그를 희석하여 제조되고/되거나 그를 첨가하여 제조된, 식품 또는 음료.
  9. 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 중성 내지 알칼리성 조건하에서 처리하여 수득된 제 1 항에서 정의된 화학식(I)의 화합물을 함유하고, 그를 희석하여 제조되고/되거나 그를 첨가하여 제조된, 식품 또는 음료.
  10. 제 9 항에 있어서, 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물이 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질을 산성 조건하에서 가수분해하거나 효소분해하여 수득되는 식품 또는 음료.
  11. 제 10 항에 있어서, 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물이 아가로비오즈, κ-카라비오즈, 및 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는, 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물인 식품 또는 음료.
  12. 제 10 항에 있어서, 3,6-언하이드로갈락토즈-함유 물질이 한천, 아가로즈 및/또는 카라기난인 식품 또는 음료.
  13. 활성 성분으로서 제 1 항에서 정의된 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 항산화제 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 활성 산소 생산 억제용 조성물인 항산화제 조성물.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 따른 항산화제 조성물을 함유하는 식품 또는 음료.
  16. 제 1 항에 따른 화학식(I) 또는 화학식(II)의 항산화용 화합물.
  17. 제 16 항에 있어서, 활성 산소 생산 억제용인 화합물.
  18. 활성 성분으로서 제 1 항에서 정의된 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 신선도 보존용 조성물.
  19. 활성 성분으로서 제 1 항에서 정의된 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 화장품 조성물.
  20. 활성 성분으로서 제 1 항에서 정의된 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 그의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물을 함유하는 α-글리코시다제 억제용 조성물.
  21. 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 중성 내지 알카리성 조건하에서 처리하여 제조된 세포자멸-유발 물질.
  22. 제 21 항에 있어서, 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물이 아가로비오즈, κ-카라비오즈, 및 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는, 아가로비오즈 및 κ-카라비오즈이외의 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물인 물질.
  23. 3,6-언하이드로갈락토즈 및/또는 환원 말단에 3,6-언하이드로갈락토즈를 갖는 화합물을 중성 내지 알칼리성 조건하에서 처리하여 제조된 세포자멸-유도 물질을 함유하고, 그를 희석하여 제조되고/되거나 그를 첨가하여 제조된, 식품 또는 음료.
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