KR101510315B1

KR101510315B1 - 멜라닌 생성 억제 및 주름개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101510315B1
Application number: KR20130072199A
Authority: KR
Inventors: 황재삼; 윤은영; 남성희; 안미영; 이준하; 김인우; 권용남
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2015-04-10
Also published as: KR20150000153A

Abstract

본 발명은 멜라닌 생성 억제 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 멜라닌 생성 억제 및 주름개선용 화장료 조성물은 왕지네(Scolopendra subspinipes)추출물을 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 세포독성을 일으키지 않으면서, 티로시나제(tyrosinase)의 글리코실화(glycosylation)반응을 방해하여 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하는 멜라닌 생성 억제용 및 엘라스타아제(elastase) 저해하는 주름개선용 화장료 조성물이 제공된다.

Description

멜라닌 생성 억제 및 주름개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for inhibition of melanin synthesis and anti-wrinkle}

본 발명은 멜라닌 생성 억제 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포독성이 없고 멜라닌 생성 억제효과가 우수한 왕지네(Scolopendra subspinipes)추출물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 억제 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

멜라닌은 티로신(Tyrosin)이라는 아미노산이 원료로서, 동물, 식물, 미생물 등에서 발견되는 검은 색소로 생육이나 발달에 필수적이진 않지만 어떤 환경에 대한 생존력과 경쟁력을 높여주는 물질이다.

멜라닌은 주로 피부에 존재하고 있으며, 멜라닌 세포가 피부에 적거나 존재하지 않으면 백색증(Albino)에 걸리고, 멜라닌이 과잉 축적되면 기미, 주근깨 등을 형성시킬 뿐만 아니라, 피부 노화를 촉진하며 피부암 유발에 있어서도 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 멜라닌은, 티로신(tyrosine)을 기질로 이용하는 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 글리코실화(glycosylation)되고, 글리코실화된 티로시나제(glycosylated tyrosinase)가 멜라닌을 함유하고 있는 세포 소기관인 멜라노좀(melanosome)으로 이동하면서, 멜라닌(melanin)이 생합성되는 것으로 보고되고 있다.

이에, 멜라닌 세포의 과잉 생성을 억제하기 위하여 티로시나제(tyrosinase)의 활성을 억제하는 물질에 대한 연구가 대부분 이루어지고 있으며, 관련 선행기술로는 한국등록특허 제10-0760875호 "멜라닌 생성 억제 피부미백용 화장품 조성물"과 한국공개특허 제10-2012-0109150호 "멜라닌 생성 억제용 조성물" 등이 있다.

또한, 인체의 중성구 과립구내에 존재하는 엘라스타아제(elastase)의 활성 여부는 기질인 N-succinyl-(Ala)-3-pnitroanilide 가 나이트로아닐라이드(nitroanilide, NA)로 분해되면서 일어나는 변화를 흡광도를 측정함으로써 확인 가능하다.

Elastase는 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다.

Elastase 저해제로는 우르솔릭산(ursolic acid) 등이 elastse 저해제로 이용되고 있는데, ursolic acid는 물이나 오일 등의 용매에는 잘 녹지 않는 물성을 가지고 있기 때문에 제제화하기 어려워 일반적으로 사용화하기 어려운 문제점이 있다.

본 발명의 목적은 멜라닌 생성의 주 원인으로 지목되는 티로시나제(tyrosinase)의 글리코실화(glycosylation) 활성을 억제하고, 세포 독성을 띄지 않는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 억제용 및 엘라스타아제(elastase)를 저해하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 멜라닌 생성 억제 및 주름개선용 화장료 조성물은 왕지네(Scolopendra subspinipes) 추출물을 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.

상기 멜라닌 생성억제용 화장료 조성물은 상기 왕지네(Scolopendra subspinipes) 추출물이 70% 에탄올로 추출된 것을 특징으로, 티로시나제(tyrosinase)의 글리코실화(glycosylation)반응을 억제하여 멜라닌 생성을 억제하는 것이 특징이다.

상기 주름개선용 화장료 조성물은 상기 왕지네(Scolopendra subspinipes) 추출물이 50% 에탄올로 추출된 것을 특징으로, 엘라스타아제(elastase)효소활성을 억제하여 주름을 개선하는 것이 특징이다.

상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 파운데이션, 젤, 연고 또는 스프레이 중 어느 하나의 제형을 갖는 것이 특징이다.

본 발명에 의해, 세포독성을 일으키지 않으면서, 티로시나제(tyrosinase)의 글리코실화(glycosylation)반응을 방해하여 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하는 멜라닌 생성 억제용 및 엘라스타아제(elastase) 저해하는 주름개선용 화장료 조성물이 제공된다.

도 1은 본 발명의 왕지네 추출물이 멜라닌 생성세포(melanoma cell)에서의 세포 독성 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 왕지네 추출물의 자유라디탈 소거 활성을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 왕지네 추출물이 멜라닌 생성세포(melanoma cell)에서의 멜라닌 생성 억제를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 왕지네 추출물의 세포내 티로시나제(tyrosinase)효소 활성을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 왕지네 추출물의 티로시나제(tyrosinase)효소 활성을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)으로 나타낸 도면이다.
도 6는 본 발명의 왕지네 추출물의 엘라스타아제(elastase) 효소 활성을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.

본 발명자들은 자연계에서 존재하는 약제들로부터 부작용이 없는 멜라닌 생성 억제물질 및 주름개선 화장료 조성물을 발견하고자 연구한 결과, 왕지네의 추출물이 멜라닌 생성 억제에 효과를 나타냄과 동시에 엘라스타아제 효소의 활성저해를 확인하였으며, 특히 Scolopendra subspinipe 종의 왕지네 추출물에서 우수한 멜라닌 생성 억제효과와 엘라스타아제 효소 활성 저해를 나타냄을 확인하였다.

상기 왕지네(Scolopendra subspinipe)는 왕지네목 왕지네과의 절지동물로 한국 또는 일본 등지에 많이 분포하며, 몸빛깔은 흑록색이고 머리는 붉은색이며, 몸은 수많은 마디로 이루어져 있으며 마디마다 1쌍 또는 2쌍의 다리가 있다.

이러한 왕지네(Scolopendra subspinipe)는 예로부터 한방에서 대나무 막대기로 머리와 꼬리를 묶어서 말린 것을 사용하였으며, 이는 오공(蜈蚣)·토충(土蟲)·천룡(天龍)이라 하며, 거풍·진경·소종·청혈(淸血)의 효능이 있어서 중풍, 경간(驚癎), 관절염, 림프선염, 암종(癌腫)등에 처방되기도 한다.

이와 같이 왕지네(Scolopendra subspinipe)는 보통 항염증활성 또는 항암활성제로써 많이 사용되어 왔지만 인체 무해하면서 세포독성도 일으키지 않고, 티로시나제(tyrosinase)의 글리코실화(glycosylation)를 방해하여 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하며 엘라스타아제(elastase) 효소 활성을 억제하는 왕지네추출물의 제조과정에 대해서는 연구된 바가 없다.

이에 본 발명은 Scolopendra subspinipe의 왕지네에 적합한 추출방법을 도출해내며, 화장료 조성물로써의 유효성분으로 실질적은 사용범위를 확인하여 인체무해하면서 멜라닌 생성 억제능을 나타내며 엘라스타아제의 효소 활성을 억제하는 화장료 조성물을 제공하게 된다.

이하, 멜라닌 생성 억제 효과 및 엘라스타아제 효소 활성 억제효과를 갖는 왕지네(Scolopendra subspinipe) 추출물의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1. 제 1단계; 왕지네 분말 제조

본 단계에서는 Scolopendra subspinipe 종 왕지네를 준비한 후, 이를 건조한 다음 분쇄하여 분말형태로 제조한다.

구체적으로 설명하면, 상기 Scolopendra subspinipe 종 왕지네에는 다량의 수분이 함유되어 있기 때문에 최적의 멜라닌 생성효과를 나타내는 유효성분을 추출해 내기 위해 수분이 완전히 없는 상태가 되어야 한다. 이에 상기 Scolopendra subspinipe 종 왕지네를 분말화하기 전에 건조과정을 거친다.

이때, 상기 왕지네(Scolopendra subspinipe)에 함유되어 있는 유효성분들의 변화를 최소화시키기 위해서 20~24시간 동안 동결건조를 하는 것이 좋다.

그 다음 하기 추출의 용이성을 위해 상기 건조된 왕지네(Scolopendra subspinipe)는 분쇄기를 이용하여 분말형태로 제조한다.

2. 제 2단계; 왕지네 추출물 제조

본 단계에서는 상기 제조한 왕지네(Scolopendra subspinipe)분말을 유기용매로 추출한 후 감압농축하여 왕지네(Scolopendra subspinipe) 추출물을 제조한다.

구체적으로 설명하면, 왕지네(Scolopendra subspinipe)분말은 유기용매에 완전히 침지시킨 다음 35~40℃에서 20~30시간동안 추출한다. 이때 사용되는 상기 유기용매로는 메탄올과 에탄올, 증류수(DW) 및 에틸아세테이트(Ethyl acetate)이며, 이들 중 피부 기능성 효과에 따른 추출 용매를 다르게 사용한다.

이렇게 추출된 상기 왕지네 추출물은 불순물 제거를 위하여 필터로 거른 후, 감압 농축하여 본 발명의 멜라닌 생성 억제용 화장료 조성물의 유효성분으로 포함하는 왕지네(Scolopendra subspinipe) 추출물을 제조한다. 상기 왕지네 추출을 보관하여 사용할 시 통상적으로 사용되는 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 상기 왕지네 추출물을 녹인 후 -50~-70℃에 보관한다.

이와 같이 멜라닌 생성 억제 및 주름개선용 화장료 조성물을 화장퓸용 제형으로 제조할 시에는 나머지 잔량으로 화장품 소재로 통상의 허용가능한 물질을 포함하며, 제형의 일예로는 로션제(lotion), 액제(液劑), 유제, 에멀션제, 현탁제(懸濁劑), 정제(錠劑) 및 캡슐제(capsule)가 있다.

화장료로 사용되는 경우 유연 화장수, 밀크로션, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스, 클렌싱 폼, 클렌싱 워터, 팩 또는 보디오일 등의 기초 화장료 및 화운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료 형태로 활용가능하다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들의 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 본 발명의 멜라닌 생성 억제 효과를 갖는 왕지네 추출물 제조

왕지네(Scolopendra subspinipes)의 수분을 완전히 제거하기 위하여 동결건조한 후, 상기 건조물을 분쇄하여 왕지네 분말을 준비하였다.

상기 왕지네 분말 1g에 70% 농도의 에탄올 10㎖를 첨가한 후 37℃에서 24시간동안 추출하였다.

추출된 추출물은 불순물 제거를 위하여 필터로 거른 뒤 감압 농축한 후 100㎕의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹여 -70℃에 보관하여 본 발명의 멜라닌 생성 억제 효과를 갖는 왕지네 추출물을 제조하였다.

<실시예 2> 본 발명의 엘라스타아제 효소 활성 억제 효과를 갖는 왕지네 추출물 제조

왕지네(Scolopendra subspinipes)의 수분을 완전히 제거하기 위하여 동결건조한 후, 상기 건조물을 분쇄하여 왕지네 분말을 준비하였다.

상기 왕지네 분말 1g에 50% 농도의 메탄올 10㎖를 첨가한 후 37℃에서 24시간동안 추출하였다.

추출된 추출물은 불순물 제거를 위하여 필터로 거른 뒤 감압 농축한 후 100㎕의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹여 -70℃에 보관하여 본 발명의 엘라스타아제 효소 활성 억제 효과를 갖는 왕지네 추출물을 제조하였다.

<실험예 1> 본 발명의 왕지네 추출물로부터 세포 독성 확인

(1) 실험방법

마우스 유래한 멜라노마 세포주로 일반적으로 미백 물질 스크리닝에 사용되는 멜라닌 생성세포(B16/F10 melanoma cell)을 이용하여, 유기용매별로 추출된 왕지네 추출물로부터 세포 독성을 확인하는 실험을 실시하였다.

상기 멜라닌 생성세포(B16/F10 melanoma cell)는 CO₂배양기(37℃, 5% CO₂)에서 10% 소태아혈청(Fetal Bovin Serum, Gibco.Co)이 포함된 동물세포배양배지(DMEM)에서 배양하였고, 동물세포배양배지(DMEM)에는 항생제(100unit/㎖ penicillin, 100㎍/㎖ streptomycin)를 첨가하였다.

멜라닌 생성세포(B16/F10 melanoma cell)에 대한 세포 독성을 확인하기 위해 세포독성측정(MTS assay)방법으로 분석하였다. 상기 세포독성측정(MTS assay)방법은, 살아있는 미토콘드리아의 탈수소효소(Dehydrogenase)에 의해 노란색의 MTS 테트라졸륨(MTS tetrazolium)이 갈색빛을 띄는 보라색의 포마잔(Formazan)으로 전환될 때의 흡광도를 측정하는 방법이다.

96-well 배양용기에 2×10⁴ cell/㎖ 농도의 세포를 100㎕씩 분주한 후 왕지네 추출물을 0, 100, 300 및 500 ㎍/㎖의 농도로 각 세포에 24시간 동안 처리하였다.

이후, 10 ㎕ CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent (MTS) (Promega, USA)를 첨가하고 3~4시간 반응시켰다. 세포성장의 저해는 멀티 디텍터(multi detector, Beckman, DTX8800)을 이용하여 450nm 파장에서 흡광도 측정을 통해 확인하였다.

(2) 실험결과

유기용매별로 추출한 왕지네 추출물을 대상으로 B16/F10 melanoma cell(멜라닌 생성세포)세포를 이용하여 세포독성을 확인한 결과 도 1에도 나타나 있듯이, 최대농도인 500 ㎍/㎖에서도 B16/F10 melanoma세포는 큰 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다.

<실험예 2> 본 발명의 왕지네 추출물로부터 자유 라디컬 소거 활성 확인

(1) 실험방법

프리라디컬 소거 활성 분석법은 안정한 자유라디칼인 2.2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)가 수소공여체와 반응하는 능력을 바탕으로 DPPH가 환원되어 탈색되는 현상을 흡광도를 이용하여 측정하는 실험방법이다. 이에 본 실험에서는 유기용매를 이용하여 추출한 왕지네 추출물을 각 500 ㎍/㎖ 농도로 50 ㎕ 씩 준비하고 1 mM 농도의 DPPH 시약 150 ㎕ 와 37 ℃ 1시간 반응 후 517 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

(2) 실험결과

도 2에서와 같이 유기용매를 이용하여 추출된 지네 추출물의 자유라디칼 소거 능이 20% 미만임을 확인 할 수 있었으며 50% 에탄올을 이용하여 추출한 왕지네 추출물의 자유 라디칼 소거 능이 약 17% 로서 왕지네 추출물 중에 가장 높은 소거 능력을 보임을 확인 하였다.

<실험예 3> 본 발명의 왕지네 추출물로부터 멜라닌 생성 억제 효과 확인

(1) 실험방법

마우스 유래한 멜라노마 세포주로 일반적으로 미백 물질 스크리닝에 사용되는 멜라닌 생성세포(B16/F10 melanoma cell)을 이용하여, 유기용매별로 추출한 왕지네 추출물로 멜라닌 생성량을 확인하는 실험을 실시하였다.

상기 멜라닌 생성세포(B16/F10 melanoma cell)는 6 Well plate에 10⁶/Well로 분주하고, 각각의 Well에 왕지네 추출물을 500㎍/㎖ 처리한 후, 37℃의 CO₂배양기에서 48시간 동안 배양하였다.

배양된 세포를 수집하고, 세포수를 측정한 다음 3,000rpm에서 3분간 원심분리하여 침전된 펠렛(pellet)을 얻었으며, 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하고 60℃에서 1시간 반응하여 펠렛(pellet)을 녹였다.

실험군으로는 대표적인 멜라닌 생성억제제인 아스코르브산(Ascorbic acid, 150ppm)을 사용하였으며, 멀티 디텍터(multi detector, Beckman, DTX8800)을 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정, 이에 따른 멜라닌 양을 산출하였다.

(2) 실험결과

상기 멜라닌 생성량을 측정하는 실험을 통해 확인한 결과, 도 3과 같이 메탄올로 추출한 왕지네 추출물과 에탄올에서 추출된 왕지네 추출물의 멜라닌 생성량이 실험군으로 사용된 아스코르브산(Ascorbic acid)에 비하여 감소됨이 확인되었다.

또한, 이 중에서도 70% 에탄올(ethanol)로 추출한 지네 추출물(실시예 1)의 멜라닌 감소 효과가 가장 높음을 알 수 있었다.

<실험예 4> 본 발명의 왕지네 추출물로부터 세포 내 티로시나제 활성(Tyrosinase activity)억제 효과 확인

(1) 실험방법

유기용매별로 추출한 왕지네 추출물이 멜라닌 생성을 억제하는 원인을 알아보기 위하여, 멜라닌 생성에 중요한 효소로 알려져 있는 티로시나제(Tyrosinase)의 활성여부를 확인하였다.

먼저, 마우스 유래 세포주인 멜라닌 생성세포(B16/F10 melanoma cell)를 6 Well plate에 10⁶/Well로 분주하고, 각각의 Well에 왕지네 추출물을 500㎍/㎖ 처리한 후, 37℃의 CO₂배양기에서 48시간 동안 배양하였다.

배양된 세포를 트립신(Trypsin)을 이용하여 수거하고, PBS(phosphate buffered saline)로 세척하였다.

그 다음, 균질화 버퍼(homogenization buffer, 0.1mM sodium phosphate buffer, 1% triton X-100)를 각각 100㎕ 첨가하여, 초음파분쇄기(sonicator)로 1시간동안 세포를 용해시킨 후 원심분리하여 분리된 상등액을 시료로 사용하였다.

500㎕ 0.1M sodium phosphatase buffer에 10mM L-DOPA와 시료를 처리하고 37℃에서 3시간 반응시키고, 실험군으로는 대표적인 멜라닌 생성억제제인 아스코르브산(Ascorbic acid, 150ppm)을 사용하였다.

세포 내 티로시나제 활성(Tyrosinase activity)억제 확인을 위하여 시료들과 아스코르브산(150ppm)을 멀티 디텍터(multi detector, Beckman, DTX8800)를 이용하여 470nm에서 흡광도를 측정하였다.

(2) 실험결과

세포내 티로시나제 활성(Tyrosinase activity)를 측정한 결과, 도 4에 나타나 있듯이 멜라닌 생성량 감소와 마찬가지로 티로시나제 활성도 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

그 중에서도, 100% 메탄올과 70% 에탄올(ethanol)에서 추출한 왕지네 추출물이 실험군으로 사용된 아스코르브산(Ascorbic acid)에 비하여 티로시나제 활성이 크게 감소되었다.

그러나, 메탄올은 독성이 강한 공업용 물질로, 인체의 신경계나 눈과 간에 치명적인 영향을 미칠 수 있기 때문에, 안정성을 감안하여 상기 왕지네 추출물을 멜라닌 생성 억제제로 사용할 때 70% 에탄올(ethanol)로 추출한 왕지네 추출물(실시예 1)을 사용하는 것이 가장 좋다.

<실험예 5> 본 발명의 왕지네 추출물로부터 티로시나제(tyrosinase) 확인

(1) 실험방법

유기용매별로 추출한 왕지네 추출물을 각각 500㎍/㎖씩 48시간 처리 또는 버퍼(buffer)가 처리된 세포를 20분간 30NP40 buffer(50mM Tris-Cl pH8.0, 1% NP-40 또는 Triton X-100, 150nM NaCl, Protease inhibitor caktail)로 용해(lysis)한 후 단백질 정량(Protein assay, Bio rad)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다.

유기용매별로 추출한 추출물을 단백질 전기영동(12% SDS-PAGE,polyacrylamide gel electrophoresis)하였고, 겔(gel)에 존재하는 단백질을 250mΩ로 2시간 나이트로셀룰로스 막(nitrocellurose membrane)으로 이동(transfer)시켰다.

또한, 비특이적인 반응을 없애기 위하여 5% 탈지유(skim milk)용액으로 막의 불필요한 부분을 차단하였다. 그 다음으로 티로시나제 래빗(tyrosinase rabbit)항체(cell signaling), 베타-액틴(β-actin)항체(Sigma, USA)를 각각 1차 항체로 사용하여 밤새 반응하고, 여기에 서양고추냉이과산화효소(Horseradish peroxidase,HRP)가 결합된 항-래빗(rabbit)항체(Promega,USA)와 항-마우스 항체(Promega.USA)를 2차 항체로 1시간~2시간 동안 반응하였다.

실험군으로는 미백화장품의 원료로 많이 사용되는 알부틴(arbutin)을 사용하였으며, 상기 유기용매별로 추출한 왕지네 추출물 시료들과 알부틴(arbutin)을 ECL system(Amersham,USA)으로 발색하고, 각각의 표지된 단백질을 확인하였다.

(2) 실험결과

티로시나제(tyrosinase)를 확인한 결과로는 도 5에 나타나 있듯이 대조군으로 사용된 무처리 세포(Control)에서 글리코실화(Glycosylation)된 티로시나제(tyrosinase)가 일반 티로시나제(tyrosinase)보다 많이 발현됨을 확인할 수 있었다.

이는 세포내 티로시나제(tyrosinase)가 글리코실화(Glycosylation)되어 정상적으로 멜라닌이 생성되었음을 의미하며, 반면에 70% 에탄올로 추출된 왕지네 추출물(실시예 1)을 처리한 밴드에서는 글리코실화된 티로시나제보다 일반 티로시나제가 많이 발현되어 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예 6> 본 발명의 왕지네 추출물로부터 엘라스타제(elastase)활성 확인

(1) 실험방법

유기용매를 이용하여 추출한 왕지네 추출물의 피부 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 엘라스타제 효소가 기질인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide와 반응하여 p-nitroanilide를 생성하는 성질을 이용하여 실험을 진행하였다. 먼저 왕지네 추출물을 0, 100 ,300 그리고 500 ㎍/㎖ 농도로 준비하고 50 mM Tris-HCl(ph 8.5)에 녹인 elastase(0.6unit/㎖) 용액 50 ㎕를 가한 후 기질로 50 mM Tris-HCl(ph 8.5)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide (1mg/ml)을 100 ㎕ 첨가하여 30분 반응 시키고 multi detecter (Beckman, DTX8800)를 이용하여 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다.

(2) 실험결과

상기 실험결과, 도 6에 나타나 있듯이 유기용매로 추출한 왕지네 추출물은 엘라스타제 활성 억제능을 갖는 것으로 확인 되었다. 특히 50 % 메탄올로 추출된 왕지네 추출물(실시예 2)이 500 ㎍/㎖에서 무처리 대비 약 70 %의 저해 활성을 나타내어 가장 높은 활성을 보였으며 또한 50 %, 70 % 에탄올과 메탄올을 이용한 추출한 왕지네 추출물과 에틸 아세테이트로 추출한 추출물은 농도가 증가할수록 엘라스타제 활성 저해능이 높아짐을 확인 할 수 있었다.

이에, 세포독성을 일으키지 않으면서, 티로시나제(tyrosinase)의 글리코실화(glycosylation)반응을 방해하여 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하는 멜라닌 생성 억제용 및 엘라스타아제(elastase) 저해하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있게된다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

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Scolopendra subspinipe 종의 왕지네 유래 50% 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하되, 화장료 조성물 1 ㎖당 300~500㎍를 포함하여 엘라스타아제(elastase)효소활성을 억제시켜 주름이 개선되는 것이 특징인,
주름개선용 화장료 조성물.
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제5항의 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 파운데이션, 젤, 연고 또는 스프레이 중 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는,
주름개선용 화장료 조성물.
Scolopendra subspinipe 종 왕지네를 준비한 후, 이를 20~24시간 동안 동결건조한 다음 분쇄하여 왕지네 분말을 제조하는 제1단계;
상기 제1단계에서 제조한 왕지네 분말을 50% 에탄올에 완전히 침지시킨 다음 35~40℃에서 20~30시간동안 추출한 후 필터한 다음, 감압농축하여 왕지네 추출물을 제조하는 제2단계 및,
상기 왕지네 추출물을 화장료 조성물 1 ㎖당 300~500㎍로 포함되도록 하여 엘라스타아제(elastase)효소활성을 억제시켜 주름이 개선되는 주름개선용 화장료 조성물을 제조하는 제3단계;를 포함하는,
주름개선용 화장료 조성물의 제조방법.