CN102370591A - 石榴皮提取方法及其提取物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化妆品工业,尤其是一种石榴皮提取物的制备方法及其提取物在化妆品中的应用。是将石榴科植物石榴的果皮进行机械研磨粉碎,制成粉末;再将粉末经过有机溶剂的多次回流萃取提取而成;溶剂萃取出的组分经色谱法或分馏法进一步纯化,分离得到石榴皮提取物。可应用在诸如营养滋润剂,防晒护肤剂,抗皱美白剂,洁面乳,眼霜,爽肤水等多种日用化妆品中。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品工业,尤其是一种石榴皮提取物的制备方法及其提取物在化妆品中的应用。
背景技术
化妆品是流行性很强的商品,其消费紧随社会潮流而动,具有鲜明的时代特征。随着医学研究的深入,广大消费者对使用化学合成物制造的化妆品持有更加谨慎的态度。近年来,化妆品生产开始原料的天然化,人们希望通过天然动植物中的有效成分的添加,达到产品安全性和功效性的提高。
皮肤是维护人体生命和健康的重要组成部分,直接与外界接触,是机体的第一道屏障,级易受到环境的影响而导致损伤。除了年龄带来的老化因素外,炎症和过敏等应激反应,污染,紫外线都是引起皮肤衰老的重要原因。随着社会人口老龄化和环境的劣化,人们越来越需要长效,高效的调节性和预防性护肤品,所以为抗自由基,抗氧化,抗辐射等生理活性的植物提取物提供了广阔的应用空间。这些天然植物的提取物具有副作用小,疗效佳的特点,具体功效可归纳为抗炎,防皱,美白,祛班,止痒,保湿,减肥等方面。
皮肤衰老主要表现在两个方面,一是胶原蛋白在各种蛋白酶的作用下降解流失,皮肤失去弹性形成皱纹;二是皮肤表面黑色素细胞活化产生色素沉着,逐渐产生黄褐斑,老年斑等各种色斑。在皮肤的衰老过程中,胰蛋白酶和基质金属蛋白酶不但参与皮肤结构中的基质蛋白和胶原蛋白的降解,而且参与黑色素细胞的激活和黑色素向表皮的转运和沉着。胰蛋白酶和基质金属蛋白酶也能使皮肤内的胶原纤维交联和变性,失去弹性,当皮肤内水分不足时,胶原纤维断裂而形成皱纹。皮肤衰老的深层次原因还包括表皮角质形成细胞代谢的减慢,真皮成纤维细胞增殖分裂的速度降低。因此,能够抑制胰蛋白酶和基质金属蛋白酶,保护皮肤基质蛋白和胶原蛋白的天然化合物的发现,是化妆品行业对抗皮肤衰老一直以来追寻的目标。
基质金属蛋白酶(matrix metdloproteinases,MMPs)是由多种锌离子依赖性酶组成的能降解细胞外基质蛋白(extracellular matrix,ECM)的重要酶类。几乎能降解细胞基质的所有成分(胶原、明胶、粘性蛋白、纤维粘连蛋白、蛋白多糖等)。其天然抑制剂组织金属蛋白酶抑制剂也逐渐成为国内外研究的热点。基质金属蛋白酶和其抑制剂的平衡在体内维持细胞外基质降解中起重要作用。二者的生物学功能的失衡经常导致出现各种病理现象,如,风湿性关节炎,慢性溃疡,皮肤老化等。MMPs是自然进化中高度保守的一类酶,广泛分布于植物、脊椎动物、无脊椎动物中。在正常稳定状态的组织中,MMPs表达量极少;当细胞外基质中基质金属蛋白酶及其组织抑制剂的失衡时,出现多种病理现象,如炎症、胚胎发生、血管形成、肿瘤侵袭转移,其表达量上升。基质金属蛋白酶是一个大家族,新的MMPs在不断被发现,MMP家族也正在迅速地扩大,因其需要Ca++、Zn++等金属离子作为辅助因子而得名,其家族成员具有相似的结构,一般由5个功能不同的结构域组成 :(1)疏水信号肽序列;(2)前肽区,主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后,MMPs酶原被激活;(3)催化活性区,有锌离子结合位点,对酶催化作用的发挥至关重要;(4)富含脯氨酸的铰链区;(5)羧基末端区,与酶的底物特异性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。MMPs成员上述结构的基础上各有特点。各种MMP间具有一定的底物特异性,但不是绝对的。同一种MMP可降解多种细胞外基质成份,而某一种细胞外基质成分又可被多种MMP降解,但不同酶的降解效率可不同。MMPs几乎能降解ECM中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,在肿瘤侵袭转移中起关键性作用,从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视,被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。目前MMPs家族已分离鉴别出26个成员,编号分别为MMP1~26。MMP-3 和MMP-10能作用于PG、LN、FN、Ⅲ型和Ⅳ型胶原及明胶。MMP-7能作用于明胶和FN。MMPs的活性受到三个水平的调节,即基因转录水平,无活性酶前体经蛋白水解作用而激活以及特异性抑制因子(TIMP)的作用。
皮肤老化是人体衰老的主要表现之一,也是目前人们极为关注的话题。除了年龄等生理原因,长期反复的紫外线照射是皮肤光老化的重要因素,皱纹形成是皮肤老化的最为重要特征。基质金属蛋白酶(matrix metallo preteinases,MMPs)在各种生理、病理条件下细胞外基质降解和重塑中起着关键作用,可以降解含或不含胶原成分的皮肤真皮细胞外基质。有研究表明,在在体实验和细胞培养实验中, MMPs在衰老皮肤真皮成纤维细胞(fibroblast;FB)的表达明显增强,说明其在衰老发生及皱纹形成过程中有重要作用,尤其是MMP1和MMP3[1,2] (1. Shworth JL, Murphy G, Rock MJ, et al.Fibrillin degradation by matrix metalloproteinases: implications for connective tissue remodelling.Bio-chem J,1999,340(Pt1):171.; 2. Hermann G, Brermeisen P, Wlaschek M, et al.Paoralen photoactivation promotes morphological and functional changes in fibroblasts in vitro reminiscent of cellular senescence[J]. J Cell Sci, 1998,111(Pt 6):759.)
石榴皮为石榴科植物石榴的果皮。 秋季石榴果实成熟,顶端开裂时采摘,除去种子及隔瓤,切瓣晒干,或微火烘干。干燥的果皮呈不规则形或半圆形的碎片状,厚2~3毫米。外表面暗红色或棕红色,粗糙,具白色小凸点;顶端具残存的宿萼;基部有果柄。内面鲜黄色或棕黄色,并有隆起呈网状的果蒂残痕。质脆而坚,易折断。气微弱,味涩。以皮厚实、色红褐者为佳。
其化学成分 含石榴皮素(granatin)、白桦脂酸(betulic acid)、熊果酸(ursolic acid)、异槲皮甙(isoquercitrin)等。 近年来的研究表明,石榴皮具有多重的药用功效,主要表现为如下几方面:
1.收敛作用
石榴皮含多含糅质,当它们与粘膜、创面等接触后,能沉淀或凝固局部的蛋白质,使在表面形成较为致密的保护层,有助于局部创面愈合或保护局部免受刺激。
2.抗菌作用
石榴皮煎剂在试管内对志贺、施氏、福氏和宋内等4钟痢疾杆菌均有抗菌作用,对志贺作用最强,施氏、福氏次之 ,对宋内痢疾杆菌作用较差。比较400种中药对于伤寒杆菌、霍乱弧菌、葡萄球菌等的试管内杀菌力,证明石榴皮抑制伤寒杆菌的作用最强。此外,体外实验证明对结核杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌等多种细茵均有抑制作用。
3.抗病毒作用
鸡胚法实验证明,石榴皮煎剂稀释到1:1万—1:10万仍有抑制流感病毒(甲型PR8株)的作用。采用细胞培养技术,证实糅质是石榴皮抗生殖器疮疹病毒的有效成分。其特点不仅能够抑制病毒在细胞内的增殖,更为重要的是显示较强的直接杀灭病毒和阻止及吸附细胞的作用。
石榴皮具有小毒,生物碱部分是石榴皮的主要毒性成分,较原生药的毒性强25倍,大剂量口服后对动物骨骼肌有藜芦碱,或箭毒样作用。文献检索未见外用石榴皮提取物导致的任何不良反应的报道。至今为止,还没有发现石榴皮具有抑制皮肤弹性降低或抗皱美白功效之报道。
现有文献未见有石榴皮提取物及其衍生物、类似物具有抑制基质金属蛋白酶MMP3活性的报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种石榴皮提取物的提取方法,是将石榴科植物石榴的果皮进行机械研磨粉碎,制成粉末;再将粉末经过有机溶剂的多次回流萃取提取而成;溶剂萃取出的组分经色谱法或分馏法进一步纯化,分离得到石榴皮提取物。
所述干燥石榴皮原料的粉碎粒度为100um-5000um; 采用30-90%的乙醇水溶液加热回流提取;石榴皮粉与溶剂的比例为1:10;萃取温度保持在20-90℃之间;提取时间在8-24小时之间;乙醇提取液经1-40%活性炭脱色后浓缩,干燥。
本发明的另一目的是提供一种石榴皮提取物在化妆品中的应用,是将石榴皮提取物作为植物添加剂添加到化妆品当中,作为皮肤抗皱,美白祛斑防治中的天然植物添加剂。
上述作为添加剂的量为0.01%-30%重量百分比。
上述的化妆品为软膏,乳霜,护肤霜,护肤乳液,粉底霜,眼霜,精华素,洗面奶,化妆水,面膜或防晒霜。
本发明所涉及到的最新研究表明,石榴皮的乙醇提取物具有抑制导致皮肤基质蛋白和胶原蛋白降解的基质金属蛋白酶MMP的活性,在0.1%-3%的浓度范围内呈剂量依赖关系,具备了作为一种高效,安全,经济的植物组分进一步开发成抗皮肤皱纹产生,减缓皮肤弹性降低,美白祛斑的外用护肤化妆品的充分和必要条件。
附图说明
图1是本发明的石榴皮干燥药材提取工艺流程图。
图2是石榴皮提取物抑制基质金属蛋白酶活性的实验研究图。
具体实施方式
实施例1 石榴皮干燥药材提取工艺
本发明中提及的石榴皮提取物是由石榴科植物石榴的果皮中经过有机溶剂的多次回流萃取提取而成。溶剂萃取出的组分经过色普法或分馏法进一步纯化,分离得到产品。
所述干燥石榴皮原料的粉碎粒度为100um-5000um; 采用30-90%的乙醇水溶液加热回流提取;石榴皮粉与溶剂的比例为1:10;萃取温度保持在20-90℃之间;提取时间在8-24小时之间;乙醇提取液经1-40%活性炭脱色后浓缩,干燥,备用。工艺流程如图1所示。
样品药液经过进一步浓缩,干燥,制的石榴皮乙醇提取物。产品外观为深棕色粉末(也可以以溶液或浸膏的形式存在),主要成分为Flavonoids:5~15%;Polyphenols: 10~15%; Saccharides:5~10%;Pigment:1~2%; Moisture:1~5%;其他成分: <50%。石榴皮提取物鉴别参考《中国药典》(2010年版P87)相应条目,具体如下:
取本品3g,加无水乙醇30ml,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水20ml使溶解,滤过,滤液用石油醚(60~90℃)振摇提取2次,每次20ml,弃去石油醚液,水液再用乙酸乙酯振摇提取2次,每次20ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试溶液。另取没食子酸对照品,加甲醇职称每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010版附录VIB)试验,吸取上述两种溶液各5μ1,分别点于同一聚酰胺薄膜上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10:1:1::1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中,在对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
理化鉴别:取本品粉末1g,加水10ml,置60℃水浴中加热10分钟,趁热滤过。取滤液1ml,加1%三氯化铁的溶液1滴,即显墨绿色。(鞣质反应)
实施例2 石榴皮提取物抑制基质金属蛋白酶活性的试验研究
试验材料:
1. MMP-3酶 (美国Calbiochem公司产品,货号:444217);
2. MMP3酶反应底物:MCA-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH2 trifluoroacetate salt(瑞士Bachem公司,货号:M-2110);
3. MMP-2/MMP-9抑制剂(美国Calbiochem公司产品,货号:444241);
4. 96孔黑底培养板(美国Corning公司产品,货号3654);
5. 10×Zymogran Developing Buffer(美国invitrogen公司,货号:LC2671);
6. DMSO(国药化学公司,货号:30072418)
试剂制备
1) 1×Zymogran Developing Buffer:用蒸馏水稀释10×Zymogran Developing Buffer(1:10),25℃储存。
2) 基质金属蛋白酶:MMP3
1)母液10uL每管分装(6.05 uM),- 80℃储存
2)酶工作液(30nM):用1×Zymogran Developing Buffer以1:200稀释母液(实验当天配制),放于冰上。
3. 酶反应底物:MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg:Bachem, Cat. M-1895
1)母液(2 mM):1mg底物溶于457uL DMSO中。
2)母液40uL每管分装,- 80℃储存
3)工作液(8 uM):用1×Zymogran Developing Buffer以1:250稀释母液(实验当天配制)
4. 阳性对照:MMPs抑制剂
1)母液(10 mM):5mg MMPs抑制剂溶于1.31mL DMSO中。
2)母液100uL每管分装,- 20℃储存
3)工作液(5mM):用DMSO以1:2稀释母液(实验当天配制)
5. 植物提取物
1). 称取相应重量提取物,加PBS溶解配成提取物母液(3mg/mL)
2). 取5uL提取物母液稀释于45uL缓冲液中,制备工作液(300 ug/mL),实验当天配制;
6. 30%DMSO(v/v):用缓冲液以3:10稀释100%DMSO。
实验方法:
1. 加MMP3酶工作溶液至96孔黑底培养板各孔中,100uL/孔。
2. 培养板C1-C10各孔中加入植物提取物工作溶液2uL,C11孔加2uL阳性对照,C12孔加2uL 30%DMSO,置25℃孵育15分钟;
3. 每孔加入100uL酶反应底物,开始反应;
4. 立刻培养板置于多功能酶标仪内,于激发波长320nm及参比波长392nm连续测定各孔读值10分钟;保存Vmax用于数据分析;
5. 计算
抑制率(%)=(阳性对照Vmax均值–样本Vmax)/阳性对照Vmax均值×100%
阳性对照Vmax均值=酶/DMSO/底物的均值(n=8)
样本Vmax=含酶/提取物/底物的孔的Vmax值(n=2)
实验结果:表1
以上表1和图2的实验表明,石榴皮提取物明显抑制基质金属蛋白酶MMP3的活性,且抑制呈剂量依赖关系,采用XLFIT数理统计软件计算半数抑制浓度(IC50)为1.27ug/mL。
根据上述的实例,本发明可以有许多的改良和变更。因此,应当明白,在所附权利要求的范围内,除这里的描述之外,本发明也可以用其他方法实施。
实施例3:制备护肤霜 (按重量比例计)
石榴皮乙醇提取物 0.1-3%
甘油 3-8 %
辛酸/癸酸/三甘油酯 3-8 %
棕榈酸异辛酯 3-8 %
十六醇/十八醇 3-5 %
C12-20 烷基葡糖苷 1-3 %
鲸蜡硬脂醇聚醚-25 1-3 %
聚二甲基硅氧烷 1-3 %
矿油 3-8 %
羟苯甲酯 0.1-0.5%
苯氧乙醇 0.3-0.5%
香精 适量
去离子水 加之100%
配制方法:将去粒子水和水相的甘油、羟苯甲酯加热至80℃,同时将油相的棕榈酸异辛酯、辛酸/癸酸/三甘油酯、十六醇/十八醇、C12-20 烷基葡糖苷、鲸蜡硬脂醇聚醚-25、聚二甲基硅氧烷、苯氧乙醇加热至80℃,将油相溶液搅拌下缓缓加入水相溶液中,均质搅拌2-5分钟,开启真空,搅拌保温15分钟后搅拌降温,降温至50℃时加入石榴皮乙醇提取物和适量香精,搅拌均匀即配成护肤霜。
实施例4:制备护肤水 (按重量比例计)
石榴皮乙醇提取物 0.1-3%
甘油 3-8 %
海藻糖 0.1-1 %
柠檬酸 0.05-1 %
柠檬酸钠 0.2-2 %
PEG-60氢化蓖麻油 0.2-2 %
丁二醇/水/DMDM 乙内酰脲/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯溶液 0.2-0.5%
乙醇 5-10%
香精 适量
去离子水 加之100%
配制方法:将去离子水、甘油、海藻糖加热至80℃后保温15分钟,后搅拌降温,降温至50℃时加入石榴皮乙醇提取物和乙醇预溶液、PEG-60氢化蓖麻油和香精的预溶液以及丁二醇/水/DMDM 乙内酰脲/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯溶液,再用柠檬酸和柠檬酸钠的缓冲溶液调节pH至5.5-6.5以内,搅拌均匀即配成护肤水。
综上,将干燥石榴皮进行机械研磨粉碎,加入乙醇回流加热提取;提取物经浓缩、脱色等工艺处理,分离得到乙醇提取物,用于加工外用护肤化妆产品。体外生物活性试验证明,石榴皮提取物可以抑制基质金属蛋白酶MMP3的活性,在一定的浓度范围内呈剂量依赖关系。具备了进一步开发成减缓皮肤弹性降低,皱纹产生及减少色素沉着的外用护肤化妆品的充分和必要条件,可应用在诸如营养滋润剂,防晒护肤剂,抗皱美白剂,洁面乳,眼霜,爽肤水等多种日用化妆品中。
Claims (5)
1.一种石榴皮提取物的提取方法,是将石榴科植物石榴的果皮进行机械研磨粉碎,制成粉末;再将粉末经过有机溶剂的多次回流萃取提取而成;溶剂萃取出的组分经色谱法或分馏法进一步纯化,分离得到石榴皮提取物。
2.根据权利要求1所述的石榴皮提取物的提取方法,其特征在于,所述干燥石榴皮原料的粉碎粒度为100um-5000um; 采用30-90%的乙醇水溶液加热回流提取;石榴皮粉与溶剂的比例为1:10;萃取温度保持在20-90℃之间;提取时间在8-24小时之间;乙醇提取液经1-40%活性炭脱色后浓缩,干燥。
3.一种石榴皮提取物在化妆品中的应用,其特征在于,是将石榴皮提取物作为植物添加剂添加到化妆品当中,作为皮肤抗皱,美白祛斑防治中的天然植物添加剂。
4.根据权利要求3所述的石榴皮提取物在化妆品中的应用,其特征在于,所述作为添加剂的石榴皮提取物量为0.01%-30%重量百分比。
5.根据权利要求4所述的石榴皮提取物在化妆品中的应用,其特征在于,所述的化妆品为软膏,乳霜,护肤霜,护肤乳液,粉底霜,眼霜,精华素,洗面奶,化妆水,面膜或防晒霜。
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