KR101599482B1 - 리퀴리티제닌을 포함하는 백반증 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감초(Glycyrrhiza Radix) 추출물로부터 고순도로 정제되어 화장품 등의 원료로서 사용되어 그 안전성이 확보된 리퀴리티제닌을 활성성분으로 포함하는 백반증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

리퀴리티제닌을 포함하는 백반증 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising comprising the liquiritigenin for prevention and treatment of vitiligo}

본 발명은 리퀴리티제닌을 포함하는 백반증 예방 및 치료용 조성물, 상세하게는 감초(Glycyrrhiza Radix) 추출물로부터 고순도로 정제되어 화장품 등의 원료로서 사용되어 그 안전성이 확보된 리퀴리티제닌을 활성성분으로 포함하는 백반증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부색을 결정하는 색소로서 멜라닌, 헤모글로빈, 카로티노이드가 있으며, 이들 색소에 의해 인간의 피부, 모발, 눈 등의 다양한 색깔이 결정된다.

상기 색소 중 멜라닌은 인간의 피부색을 결정하는 가장 중요한 색소로서, 그 성질 및 분포의 정도에 따라 피부색이 다르게 나타나게 된다. 멜라닌은 멜라닌 세포에 의해 생성되는 흑갈색 색소로서 일정량 이상의 자외선을 차단하고 피부에 형성된 산소 라디칼을 제거하여 피부를 보호하는 역할을 한다.

백반증은 상기한 바와 같은 기능을 가지는 멜라닌 세포의 파괴로 인하여 여러 가지 크기와 형태의 백색 반점이 피부에 나타나는 후천적 탈색소성 질환을 말하며, 정확한 원인은 아직 알려져 있지 않고, 백반증 환자의 약 30%에서 가족력이 발견되기 때문에 유전적 요인이 의심되며, 스트레스, 외상, 일광 화상 등이 백반증 발생에 보조적으로 작용하는 원인으로 알려져 있다.

이와 같은 백반증은 현재 다음과 같은 방법으로 치료하고 있다.

첫째, 광화학요법으로 광감작제인 소랄렌(psoralen)은 내복하고 햇볕이나 자외선을 조사하는 방법이다. 대한민국 특허출원 제10-2003-0056823호는 광감작제를 투여한 후 국소적으로 케미컬 라이트를 조사하여 줌으로써 세포독성이 얻어지도록 하여 종양 등을 수축시키거나 파괴할 수 있도록 하는 광역학 치료법을 개시하고 있다. 그러나 상기 방법은 피부암의 광역동치료에 주로 사용가능하며 백반증의 광치료에 사용하기에는 독성이 심하고 또한 광감작제를 사용하기 때문에 외부 활동에 제약이 있으며 화상을 입기 쉽고 피부 노화가 촉진된다.

둘째, 스테로이드요법으로 스테로이드 치료는 병변 부위가 적을 때는 국소 도포나 트리암시놀론을 이용한 국소주사를 시행하고, 광범위하게 퍼져 있으면 전신 투여를 시행한다.

상기 방법 또한 장기적인 치료를 요하므로 피부수축을 포함한 피부 및 전신적인 부작용을 유발할 위험이 있다.

셋째, 외과적 치료법으로 표피이식술, 세포이식술 등이 시도되나 아직 보편적으로 시행되지는 않으며, 넓은 범위를 치료할 수 없는 단점이 있다.

넷째, 기타 방법으로는 짙은 화장으로 감추는 방법, 복합비타민 치료 등이 있으나 아직은 어떠한 방법도 완치를 기대할 수 없다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 안전성이 확보되며, 치료 효과가 뛰어난 백반증 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은,

리퀴리티제닌을 활성성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 백반증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 조성물에 있어서,

상기 리퀴리티제닌은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10중량%로 함유될 수 있다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 조성물에 있어서,

상기 조성물의 제형은 연고, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 세럼, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.

본 발명에 따른 상기 조성물은 약학적 조성물 또는 화장품 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 세포독성이 없을 뿐만 아니라 Tyrosinase 활성을 유도하여 멜라닌 생합성을 촉진시키기 때문에 백반증(vitiligo)의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 리퀴리티제닌의 세포 독성 평가 결과 도면이다.
도 2는 리퀴리티제닌의 B16F10 cell에서의 Tyrosinase 활성 측정 결과 도면이다.
도 3은 리퀴리티제닌의 멜라닌 생합성량 측정 결과 도면이다.
도 4는 리퀴리티제닌의 B16F10 cell에서 멜라닌 생합성량 측정 결과 도면이다.
도 5는 리퀴리티제닌의 멜라닌 생합성에 대한 현미경 관찰 결고 도면이다.

이하 본 발명에 대한 구체적인 실시예를 통하여 설명하기로 한다.

본 발명의 리퀴리티제닌은 감초 추출물에 포함되어 있는 성분으로서 감초 추출물로부터 고순도 정제하여 제조할 수 있으며, 그 제조방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 알려져 있으며, 본 발명에서 사용되는 리퀴리티제닌은 제조방법 및 출처에 대해서는 특별한 제한 없이 사용이 가능하다.

본 발명에서는 목적하는 효과를 얻기 위하여 상기의 리퀴리티제닌은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10중량% 함유될 수 있다. 0.0001중량% 미만으로 사용하였을 때는 적절한 효능을 기대하기 어렵고, 10중량% 초과하여 사용할 경우에는 제품의 안전성 및 안정성에 좋지 않은 영향을 줄 수 있다.

본 발명에 의한 외용제 조성물은 피부에 직접 도포하여 적용하는 조성물로서 약학적 조성물 내지 화장료 조성물은 그 제형에 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 연고, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 세럼, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

이하 리퀴리티제닌에 대한 실시예와 실험예를 통하여 본 발명에 대하여 상세하게 설명하기로 한다.

1. 세포독성평가

● 실험 방법

- 세포 배양

melanoma cell line인 B16F10 cell을 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic (Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Grand Island, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 4일에 한번 씩 계대 배양을 실시하였다.

- 세포 생존률 측정 ( MTT 분석)

시료가 세포의 성장에 미치는 영향을 측정하기 위하여 MTT 분석을 수행 하였다. 대사가 왕성한 살아있는 세포는, 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소작용에 의하여 수용성의 노란색인 3-(4,5-dimethylthiaxo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide를 환원시켜 자주색을 띠는 비수용성 formazan을 형성한다.

B16F10 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 2.0 × 10⁴ cells/mL로 96 well plate에 넣고 18시간 배양 후 각 시료 농도별로 처리하고 24시간 배양하였다. 이후 MTT 용액 50㎕를 첨가하여 4시간 동안 반응 시켰다. 배양배지를 완전히 제거하고 dimethylsulfoxide를 200㎕를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후, microplate reader 를 사용하여 540nm 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생장률을 평가하였다.

● 실험 결과

첨부된 도 1 및 하기 표 1에서 보는 바와 같이 12. 5 내지 25㎍/㎖에서는 세포 독성을 나타내지 않음 확인할 수 있었다.

sample		Cell viability (%)
-		100
liquiritigenin (㎍/㎖)	12.5	101.8 ± 0.02
	25	99.9 ± 0.07
	50	18.7 ± 0.1
	100	4.6 ± 0.01

2. B16F10 cell 에서의 Tyrosinase 활성 측정

● 실험 방법

B16F10 cell를 배양하여 24 well plate에 각 well 당 세포를 2.0 × 10⁴ cell/well가 되도록 분주하고 시료를 농도별로 조제한 후 처리하여 48 시간 배양한다. 이후 각 well을 PBS로 2회 세척한 다음 1% triton-x100 용액을 넣어 용해하고 e-tube에 옮겨 얼음에 옮겨 3 회 정도 냉동 해동을 반복하여 4℃, 15,000 rpm/15분 원심 분리한 상등액을 tyrosinase 활성 측정용액으로 사용하였다. 96 well plate에 이 효소액을 40㎕넣고 기질인 L-DOPA 100㎕, PBS 60㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응 시킨 뒤 475nm에서 흡광도를 측정하였다. tyrosinase의 활성도는 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 계산하였다.

● 실험 결과

첨부한 도 2 및 하기 표 2를 참조하면, 피부 내 멜라닌 중합체 생합성을 효과적으로 저해할 수 있는 tyrosinase 활성을 측정한 결과, 리퀴리티제닌은 Tyrosinase 활성을 유도함을 확인할 수 있었으며, 25㎍/㎖의 농도에서 가장 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다.

sample		Tyrosinase activity (%)
α-MSH(-)		-
α-MSH(+, 100 nM)		100
α-MSH(+) + Arbutin (100 μM)		82.3 ± 0.04
α-MSH(+) + liquiritigenin (㎍/㎖)	12.5	68.4 ± 0.03
	25	124.9 ± 0.04
	50	105.0 ± 0.03

3. 멜라닌 생합성량 측정

● 실험 방법

DMEM 배지로 배양된 B16F10 세포를 24 well plate에 2.0X10⁴ cell/well가 되게 분주하고 24시간 배양한다. 이후 α-MSH (200 nM)와 시료를 농도별로 조제하여 첨가한 후 48시간 후에 인산완충액(pH 7.4)으로 세척하였다. 그 다음 멜라닌에 1N NaOH를 가하여 80℃ 에서 1시간 반응시킨 후 분광광도계 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 생합성 저해는 시료 용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

● 실험 결과

첨부한 도 3 및 하기 표 3에서 보는 바와 같이 α-MSH 처리에 의해 멜라닌 합성이 유도됨을 확인할 수 있었고, 리퀴리티제닌의 25㎍/㎖의 농도에서 α-MSH 단독 처리군보다 약 2배 이상의 멜라닌합성을 유도하고 있음을 확인할 수 있었다.

sample		Melanin contents (%)
α-MSH(-)		-
α-MSH(+, 100 nM)		100
α-MSH(+) + Kojic acid (50 μM)		92.8 ± 0.05
α-MSH(+) + Arbutin (100 μM)		59.1 ± 0.04
α-MSH(+)+ liquiritigenin (㎍/㎖)	6.25	126.5 ± 0.03
	12.5	153.0 ± 0.03
	25	220.2 ± 0.04

4. B16F10 cell 에서 시료 자체의 멜라닌 생합성량 측정

● 실험 방법

DMEM 배지로 배양된 B16F10 세포를 24 well plate에 2.0X10⁴ cell/well이 되게 분주하고 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 첨가한 후 48시간 후에 인산완충액(pH 7.4)으로 세척하였다. 그 다음 멜라닌에 1N NaOH를 가하여 80℃에서 1시간 반응시킨 후 분광광도계 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 생합성 저해는 시료 용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

● 실험 결과

첨부한 도 4 및 표 4에서 보는 바와 같이, B16F10 cell에서 리퀴리티제닌 자체의 멜라닌 합성능을 평가하기 위해 α-MSH를 처리하지 않고 멜라닌 생합성량을 조사한 결과, 리퀴리티제닌은 멜라닌 합성을 유도하고 있음을 확인할 수 있었으며, 리퀴리티제닌의 25㎍/㎖의 농도에서 가장 뛰어난 멜라닌합성을 유도 효과를 확인할 수 있었다.

sample		Melanin contents (%)
α-MSH(-)		100
Kojic acid (50 μM)		102.5 ± 0.04
Arbutin (100 μM)		85.5 ± 0.03
liquiritigenin (㎍/㎖)	6.25	123.2 ± 0.05
	12.5	156.9 ± 0.04
	25	255.9 ± 0.04
	50	127.3 ± 0.04

5. 현미경 조사

● 실험 방법

세포의 형태 변화를 관찰하기 위해 B16F10 cell를 배양한 후 시료를 처리하여 현미경을 이용하여 관찰하였다.

● 실험 결과

첨부한 도 5에서 보는 바와 같이 B16F10 cell에 리퀴리티제닌을 농도별로 처리하여 현미경 관찰 결과, α-MSH (200 nM) 에 의해 멜라닌 합성이 유도됨을 알 수 있었으며 양성대조군인 Arbutin (100 μM) 은 멜라닌 합성을 저해하고 있음을 육안으로 확인할 수 있었다. 반면 리퀴리티제닌의 경우에는 멜라닌 합성을 유도하고 있음을 확인할 수 있었다.

6. 피부 이상 반응 평가

● 리퀴리티제닌을 포함한 피부용 크림의 제조

리퀴리티제닌의 피부 이상 반응 평가를 위해 하기 표 5의 성분함량으로 리퀴리티제닌을 2.0중량% 함유한 피부용 크림으로 제조하였다.

피부용 크림 제조를 위하여, 정제수, 글리세린 및 부틸렌글리콜을 혼합하고 70℃에서 용해하였으며(수상), 상기 세 성분과 트리메탄올아민을 제외한 나머지 성분을 70℃에서 용해하였다(유상). 상기 유상을 수상에 첨가하고 호모믹서(도쿠슈 키카, 일본)로 교반하여 1차 유화하였고, 여기에 트리메탄올아민을 최종 첨가하였다. 혼합액에 생성된 기포를 제거한 후, 실온으로 냉각시켜 피부용 크림을 제조하였다.

성분	함량(%)
정제수	71.9
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
리퀴리티제닌	2.0
카프릴릭 카프리 트리글리세라이드	6.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.5
세테아릴 알코올	1.0
트리메탄올아민	0.1
총중량	100.0

● 실험 결과

상기 제조한 피부용 크림을 피부에 12주간 적용한 결과 사용 후 홍반(erythema), 부종(edema), 인설(scaling), 가려움(itching), 자통(stinging), 작열감(burning), 뻣뻣함(tightness), 따끔거림(prickling)의 존재 여부를 면밀히 관찰하고 피부 이상반응이 나타날 시 심한 정도에 따라 등급을 표시하고 이에 대한 검사 소견을 작성하였다.

피부이상반응	없다(0)	약하다(1)	양호하다(2)	심하다(3)
홍반	16
부종	16
인설	16
가려움	16
자통	16
작열감	16
뻣뻣함	16
따끔거림	16

상기 표 6에 기재된 바와 같이, 16명의 피험자로부터 알레르기성 접촉 피부염(allergic contact dermatitis)이나 자극성 접촉피부염(irritant contact dermatitis)의 이상 소견은 관찰되지 않았다. 따라서 본 인체적용시험에 사용된 리퀴리티제닌을 포함하는 피부용 크림은 피부에 자극이 없는 안전한 기제라고 볼 수 있다.

Claims (4)

1. 리퀴리티제닌을 활성성분으로 25㎍/㎖ 포함하는 것을 특징으로 하는 백반증 예방 및 치료용 피부 외용제 약학적 조성물.
   
   
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