KR102040230B1

KR102040230B1 - 푸르푸로갈린을 포함하는, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102040230B1
Application number: KR1020170123603A
Authority: KR
Inventors: 현진원; 강희경; 고영상; 안미정; 김태훈
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2017-09-25
Publication date: 2019-11-04
Also published as: WO2019059512A3; WO2019059512A9; WO2019059512A2; CN111093607A; KR20190034956A

Abstract

본 발명은 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물로 이용할 수 있다.

Description

푸르푸로갈린을 포함하는, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising purpurogallin for protecting skin against reactive oxygen species, ultraviolet ray or particulate matter}

본 발명은 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물, 의약외품 조성물 및 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 우리 몸의 중요한 기관들을 보호하는 보호막 역할을 할 뿐만 아니라 수분 증발을 조절하고 외부 감염으로부터 몸을 보호하는 역할을 한다. 하지만, 아무리 외부로부터의 바이러스 침투를 막아내는 피부일지라도 과도한 자외선, 오염된 환경 등 외부로부터 받는 스트레스는 피부 자극을 유발하게 되고, 결국에는 피부 노화로 이어지게 된다.

자외선 B(ultraviolet B, UVB 방사선(radiation), 파장: 280-320 nm)는 피부암(skin cancer), 면역시스템 억제 및 광노화(photo-aging) 등의 피부에 대한 유해 작용을 일으키는 주요 환경 요인 중 하나이다. 이러한 UVB에 의해 발생된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 지질(lipids), 단백질(proteins) 및 DNA와 같은 세포 성분들에 산화성 손상(oxidative damage)을 일으켜, 결과적으로 피부 노화를 촉진시키고 다양한 피부 병변을 유발하게 된다.

상기 활성산소종은 불안정한 상태에 있는 산소로, 환경오염과 화학물질, 자외선, 혈액순환장애, 스트레스 등으로 산소가 과잉생산된 것이다. 이렇게 과잉생산된 활성산소는 사람 몸속에서 산화작용을 일으키게 되는 데, 세포막, DNA, 그 외의 모든 세포 구조가 손상당하고 손상의 범위에 따라 세포가 기능을 잃거나 변질된다. 또한, 피부 세포에서 활성산소종은 산화적 스트레스를 유발하여 피부 노화를 촉진시키게 한다.

활성산소종(ROS)으로 인한 세포 손상으로부터 피부를 보호하기 위한 수많은 항산화물들이 제시되었으며, 예를 들면 (-)-에피갈로카테킨-3-갈레이트((-)-epigallocatechin-3-gallate) 및 레스베라트롤(resveratrol) 등이 UVB로 인한 피부 손상을 억해하는 것으로 알려져 있다. 또한, 카로티노이드(carotenoids), 페놀화합물(phenolics) 또는 항산화 비타민(antioxidant vitamins) 등의 화합물을 함유하는 다양한 종류의 해조류(marine algae) 또는 해초류(seaweed)들도 생물학적 항산화 시스템 및 직접적인 유리 라디칼(free radicals) 소거를 통해 피부 세포에서의 산화 스트레스(oxidative stress)를 완화시키는 것으로 알려져 있다.

한편, 최근 중국의 산업화로 인해 발생하고 있는 중금속 등의 유해물질이 섞인 미세먼지, 황사, 스모그는 피부 노화 및 피부 트러블의 주요 원인으로 인식되고 있다.

미세먼지는 우리 눈에 보이지 않는 아주 작은 물질로 대기 중에 오랫동안 떠다니거나 흩날려 내려오는 직경 10㎛ 이하의 입자상 물질을 말한다. 석탄, 석유 등의 화석연료가 연소될 때 또는 제조업ㆍ자동차 매연 등의 배출가스에서 나오며, 기관지를 거쳐 폐에 흡착되어 각종 폐질환을 유발하는 대기오염물질이다. 환경부에 따르면 2017년 3월 우리나라와 국제적으로 사용하는 미세먼지에 대한 용어가 달라 혼란스럽다는 지적에 따라 지름이 10㎛ 이하인 미세먼지(PM10)는 부유먼지, 지름이 2.5㎛ 이하인 초미세먼지(PM2.5)는 미세먼지로 정의한다.

미세먼지, 황사 등과 같은 오염 물질들은 피부 내 스트레스를 야기하는데, 이러한 스트레스는 활성산소에 의해 생성된다. 활성산소는 미토콘드리아 내 전자전달체 및 백혈구 세포의 활성화 등 정상적인 세포기능을 유지하는데 중요한 역할을 담당하는 세포 내 신호전달 물질로 작용한다. 그러나 활성산소들은 불안정하고 산화력이 높아 생체물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스(oxidative stress)를 유발하게 된다.

이에 본 발명에서는, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호 효과를 가지는 화장료 조성물을 개발하고자 하였다.

대한민국 공개특허 10-2008-0085404호

본 발명의 목적은 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 유효성분으로, 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.

상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin)를 포함하는 화장료 조성물은 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호 효과를 가진다.

본 발명에서 "푸르푸로갈린(Purpurogallin)"의 화학식은 다음과 같다.

[화학식 1]

본 발명의 일실시예에서, 푸르푸로갈린(Purpurogallin)은 인간 각질형성세포 세포주(human keratinocyte cell line, HaCaT)를 이용한 실험에서 세포 독성이 없었으며, 과산화수소(H2O2) 유도된 세포내 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)과 히드록시 라디칼 등의 활성 산조종 소거효과가 있는 것을 확인하여 활성산소종에 대한 피부 보호용 화장료 조성물의 유효성분으로 이용이 가능하다.

또한, 본 발명에서 상기 활성산소종은 과산화수소(H2O2) 또는 히드록시 라디칼(hydroxyl radical)일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서, 푸르푸로갈린(Purpurogallin)이 UVB 유도된 세포내 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS) 소거 효과를 가지는 것을 확인하였으며, UVB 자극에 의해 증가된 DNA 손상, 단백질 손상과 지질 과산화를 현저히 감소시키는 것을 확인하였다.

또한, 푸르푸로갈린(Purpurogallin)이 HaCaT 세포에서 UVB 조사에 의해 증가된 세포사멸을 억제하였으며, 세포사멸체(apoptotic body)를 감소시켜, UVB 유도된 세포사멸에 대한 보호 효과를 가지는 것을 확인하였다.

따라서, 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin)은 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물의 유효성분으로 이용이 가능하다.

본 발명에서, 상기 자외선은 자외선 B(ultraviolet-B, UV B)일 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin)은 자외선 B로 인해 발생된 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 소거(scavenging) 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin)은 자외선 B로 인한 세포내 지질 과산화, DNA 손상 또는 단백질 손상을 감소시키는 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서, 푸르푸로갈린(Purpurogallin)은 인간 각질형성세포 세포주에서 미세먼지(PM, particulate matter) 처리에 의해 유발된 ROS와 세포 사멸체를 억제하는 것을 확인하였는 바, 미세먼지에 대한 피부 보호 효과가 있는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin)은 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물의 유효성분으로 이용이 가능하다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서, 푸르푸로갈린(Purpurogallin)가 인간 각질형성세포 세포주에서 UVB 조사, 미세먼지(PM, particulate matter) 또는 UVB와 미세먼지(PM, particulate matter) 처리에 의해 유발된 ROS와 세포 사멸체를 억제하는 것을 확인하였는 바, 미세먼지와 자외선에 대한 피부 보호 효과가 있는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin)는 미세먼지 또는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물의 유효성분으로 이용이 가능하다.

또한, 본 발명에서, 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin)은 미세먼지로 인해 발생된 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 소거(scavenging) 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin)은 자외선 B 또는 미세먼지에 노출된 세포의 세포사멸(apoptosis)을 저해(inhibition)하는 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 유효성분으로서 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 염으로는 화장품학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동일한 몰량의 화합물 및 산 수용액 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 화장품학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물은 전체 조성물 중량에 대하여 0.001 내지 100 중량％의 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 0.01 내지 50 중량％의 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 의약외품 조성물을 제공한다.

상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin), 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어 "생리학적으로 허용 가능"은 생리학적으로 허용되고 생물체에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않으면서, 투여되는 화합물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있는 통상적으로 사용되는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다.

본 발명의 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 소독 청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드 워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제 등일 수 있다.

본 발명의 조성물을 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호 목적으로 의약외품에 포함시킬 경우, 상기 조성물을 그대로 포함하여 사용하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있으며, 본 발명에 의한 의약외품 조성물은 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 함유할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호용 피부외용제 조성물을 제공한다.

상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin), 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호, 생리학적으로 허용 가능한 염에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에 의한 피부외용제 조성물은, 예를 들어, 연고, 로션, 가용화상, 현탁액, 에멀젼, 크림, 젤, 스프레이, 파프제, 경고제, 패치제 또는 물파스 등을 들 수 있지만, 이들에만 한정되지 않고, 당업계에 주지된 어떠한 기제에도 배합될 수 있다. 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 함유할 수 있다.

도 1은 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)의 ROS 생성 저해 효과를 나타낸다. (A) HaCaT 세포를 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) (0, 2.5, 5, 10 μM)로 24시간 처리하고 MTT 분석으로 세포 생존능을 측정하였다. (B) DCF-DA 분석을 이용하여 H2O2에 의해 생성된 PG (2.5, 5, 10 μM)의 세포내 ROS 제거능을 검출하였다. * H2O2의 대조군 세포와 유의하게 다름을 의미한다 (p<0.05). (C) 10 μM PG의 히드록시 라디칼 제거능은 팬톤 반응을 이용하여 예측하였다. *대조군과 유의하게 다름을 의미한다; #UVB군과 유의하게 다름을 의미한다.
도 2는 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) (10 μM)의 UVB 유도 세포 손상 억제 효과를 나타낸다. DCF-DA (녹색) 및 DPPP (청색) 염색 후, 세포내 ROS (A) 및 지질 과산화 (B)의 검출에 공초점 현미경을 사용하였다. (C) DNA 손상은 comet 분석으로 분석되었다. (D) 단백질 산화는 카르보닐 형성량을 측정하여 분석하였다. *대조군 세포와 유의하게 다르고 (p<0.05), # UVB 조사된 세포와 유의하게 다름을 의미한다 (p<0.05).
도 3은 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) (10 μM)의 UVB 유도 세포사멸에 대한 보호 효과를 나타낸다. (A) MTT 분석은 UVB 조사 후 HaCaT 세포 생존능에 대하여 수행되었다. *대조군과 유의하게 다름을 의미한다; # UVB군과 유의하게 다름을 의미한다. (B) 세포를 JC-1로 염색한 후 유세포 분석으로 미토콘드리아 막 전위 (ΔΨm)를 평가하였다. *대조군 세포와 유의하게 다름을 의미한다 (p<0.05); # UVB 조사 세포와 유의하게 다름을 의미한다 (p<0.05). (C) 형광 현미경으로 Hoechst 33342로 염색된 사멸 세포(화살표)를 검출하였다. *대조군 세포와 유의하게 다름을 의미한다 (p<0.05); #UVB 조사 세포와 유의하게 다름을 의미한다 (p<0.05).
도 4의 (A)는 세포를 DCF-DA (녹색)으로 염색하고, 공초점 현미경을 이용하여 미세먼지(PM, particulate matter)에 의해 유도된 세포내 ROS를 검출하였다. (B) 형광 현미경으로 Hoechst 33342로 염색된 사멸 세포(화살표)를 검출하였다. *대조군 세포와 유의하게 다름을 의미한다 (p<0.05); # PM 세포와 유의하게 다름을 의미한다 (p<0.05).
도 5의 (A)는 UVB 조사군, 미세먼지(PM, particulate matter) 처리군에서의 ROS에 의해 형성된 DCF의 형광 강도(녹색)를 나타낸다. (B)는 형광 현미경으로 Hoechst 33342로 염색된 사멸 세포(화살표)를 검출하였다. *대조군 세포와 유의하게 다름을 의미한다 (p<0.05); # UVB 조사 세포와 유의하게 다름을 의미한다 (p<0.05).

A. 재료와 방법

실시예 1. 시약

푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG), N-아세틸 시스테인 (NAC), 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질 (DPPH), 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트 (DCF-DA), [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움] 브로마이드 (MTT), Hoechst 33342 및 5,5-디메틸-1-피롤린-N-옥사이드 (DMPO)를 시그마 알드리치사 (St.Louis, MO, USA)에서 구입했다. 디페닐-1-피레닐포스핀 (DPPP)은 Molecular Probes사 (Eugene, OR, USA)에서 구입하였다. 모든 화학물질과 시료는 분석 등급이었다.

실시예 2. 세포 배양과 UVB 조사( UVB irradiation)

인간 각질형성세포 세포주(human keratinocyte cell line, HaCaT)는 Amore Pacific Company (Yongin, Republic of Korea)에서 구입하였으며, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기에서 37℃에 유지되었다. 상기 세포주는 30분간 56°C에서 가열한 10% 소혈청, 스트렙토마이신(100 ㎍/ml) 및 페니실린 (100 units/ml)을 포함하는 DMEM 배지에서 성장시켰다. UVB 에너지 스펙트럼이 280 nm 내지 320 nm인 UVB 소스(source)로서 CL-1000M UV Crosslinker (UVP, Upland, CA, USA)를 이용하였고, 본 발명에서 UVB 조사량은 30 mJ/cm2이었다.

실시예 3. 세포 생존능 (Cell viability)

세포를 24-웰 플레이트에 0.8×105 cells/ml의 밀도로 접종하였다. 상기 세포를 플레이트 바닥에 완전히 부착한 후, 2.5, 5, 및 10 μM의 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)를 가하였다. MTT 원액(stock solution) (50 ㎕, 2 mg/ml)을 각 웰에 첨가하여 총 반응 부피를 500 ㎕로 맞추고, 4시간 동안 배양하였다. 또한, 1 mM NAC 또는 20 μM 푸르푸로갈린을 세포에 처리하고 한 시간 후에 30 mJ/cm2 UVB를 조사하였다. 37℃ 에서 24시간 배양한 후, MTT 원액(2 mg/ml) 10 ㎕을 각 웰에 첨가하여 총 반응 부피를 500 ㎕로 맞추었고, 4시간 세포 배양하였다. 이 후, 상층액을 흡인하였다(aspirated). 각 웰의 포르마잔 결정을 디메틸설폭사이드 (DMSO) 500 ㎕에 용해시키고, 스캐닝 멀티웰 분광 광도계(scanning multi-well spectrophotometer)로 540 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

실시예 4. 히드록시 라디칼의 검출

팬톤(Fenton) 반응 (H2O2+FeSO4)에 의해 생성된 히드록시 라디칼을 DMPO와 반응시켰다. 그 결과로 형성된 DMPO/·OH 부가 생성물을 ESR 분광계를 사용하여 검출하였다. 인산염 완충액 (pH 7.4)을 0.3 M DMPO, 10 mM FeSO4, 10 mM H2O2, 및 10 μM DQA (3,4-dicaffeoylquinic acid) 각각의 0.02 ml와 혼합하고 2.5분 후에 ESR 스펙트럼을 기록하였다. ESR 분광계 매개 변수는 다음과 같이 설정하였다: 중심 자기장, 336.8 mT; 전력, 1.00 mW; 주파수, 9.4380 GHz; 변조 폭(modulation width), 0.2 mT; 진폭(amplitude), 600; 스윕 폭(sweep width), 10 mT; 스윕 시간(sweep time), 0.5 분; 시상수(time constant), 0.03 초; 및 온도, 25℃.

실시예 5. 세포내 ROS 측정

DCF-DA법을 이용하여 H2O2 (1mM) 또는 UVB 조사 (30 mJ/cm2)에 의해 유도된 세포 내 ROS의 수준을 측정하였다. 16시간 플레이팅 후, 세포는 2.5, 5, 및 10 μM 농도의 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)로 한 시간 동안 처리하였다. 세포는 30분과 8시간 동안 H2O2 또는 UVB를 처리하였다. 25 μM DCF-DA를 10분간 첨가한 후에, LS-5B 분광형광계 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 이용하여 2’,7’-디클로로플루오레세인 형광을 검출하였다. 세포 내 ROS의 제거 효과 (%) = [(H2O2 또는 UVB 단독 처리한 경우의 형광값) - (H2O2 또는 UVB 처리한 세포에 PG 처리한 경우의 형광값) / (H2O2 또는 UVB 처리한 경우의 형광값)]×100.

세포내 ROS의 이미지 분석에 있어서, 4-웰 챔버 슬라이드에 2×105 cells/well의 밀도로 세포를 접종하였다. 16시간 후, 10 μM 농도의 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)를 한 시간 처리하고, 슬라이드에 6시간 더 UVB (30 mJ/cm2)를 노출 및/또는 미세먼지(PM, particulate matter) (50 ppM)을 18시간 37°C에서 노출하였다. 웰마다 DCF-DA 50 μM을 30분간 37°C에서 가하였다. PBS로 3회 세척한 후, 염색된 세포를 마운팅 배지(DAKO, Carpinteria, CA, USA)로 챔버 슬라이드에 마운팅하였다. Laser Scanning Microscope 5 PASCAL software (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)가 장착된 공초점 현미경으로 이미지를 얻었다.

실시예 6. 단세포 겔 전기영동 (Comet 분석)

산화성 DNA 손상도는 Comet 분석에 의해 평가되었다. 세포 현탁액을 39℃에서 0.5% 저융점 아가로오스 (LMA) 75 ㎕와 혼합하고, 혼합물을 1% 정상 용융 아가로오스 (NMA) 200㎕가 예비코팅된 완전히 동결된 현미경 슬라이드에 도말(spreading)하였다. 아가로오스가 고화된 후, 슬라이드를 다른 0.5% LMA 170 ㎕로 커버한 후, 용해 용액 (2.5 M NaCl, 100 mM Na-EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100 및 10% DMSO, pH 10)으로 4℃에서 1시간 동안 침지하였다. 이어서, 슬라이드를 300 mM NaOH 및 10 mM Na-EDTA (pH 10)를 함유하는 겔 전기영동 장치에 넣고 40분간 배양하여 DNA 풀림(unwinding)과 알칼리 취약 손상(alkali-labile damage)의 발현을 유도했다. 그 후, 전기장 (300 mA, 25 V)을 30분간 25℃에서 가하여 양극을 향해 음전하로 하전된 DNA가 끌려가게 했다. 슬라이드를 중성 완충액 (0.4 M Tris, pH 7.5)에서 4℃에서 5분간 3회 세척한 후, 10 ㎍/mL 에티디움 브로마이드 80 ㎕로 염색하고 형광 현미경과 이미지 분석기 Komet 5.5 (Andor Technology, Belfast, UK)를 사용하여 관찰하였다. 각 슬라이드 당 50개의 세포에서 꼬리 길이와 comet 꼬리 중에서의 전체 형광 퍼센트를 기록하였다.

실시예 7. 지질 과산화 분석

DPPP를 프로브로 사용하여 지질 과산화를 평가하였다. DPPP는 지질 하이드로퍼옥사이드와 반응하여 형광 물질인 DPPP 산화물을 생성하여 막 손상의 징후를 제공한다. 세포를 1시간 동안 10 μM 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)로 처리한 후에 UVB (30 mJ/cm2)에 노출하였다. 5시간 후, 5 mM DPPP를 가하고, 30분간 암실에서 배양하였다. 형광 현미경과 이미지 분석기 Komet 5.5 (Andor Technology, Belfast, UK)으로 DPPP 형광 사진을 분석하였다.

실시예 8. 단백질 카르보닐 형성

세포를 10 μM 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)를 포함한 배지에 1 시간 접종한 후, 12시간 배양하면서 UVB(30 mJ/cm2)에 노출하였다. 형성된 단백질 카르보닐의 양은 제조사의 지침에 따라 OxiselectTM 단백질 카르보닐 효소-결합 면역흡수 분석 (ELISA) 키트를 이용하여 판단하였다 (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA).

실시예 9. Hoechst 33342을 이용한 핵 염색

세포를 10 μM 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)로 처리하고 1시간 후에 PM(미세먼지, particulate matter) (50 ppm) 및/또는 UVB (30 mJ/cm2)로 처리하여 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이 후, DNA 특이적 형광 염료 Hoechst 33342 (10 mg/ml 원액 1.5 ㎕)를 각 웰에 첨가하고 세포를 37℃에서 10분간 배양하였다. 염색된 세포를 CoolSNAP-Pro 컬러 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경으로 가시화하였다. 핵 응축도를 평가하였고, 사멸 세포의 수를 측정하였다. 세포사멸 지수 = (푸르푸로갈린 처리군의 사멸세포 수/푸르푸로갈린 처리군의 총 세포수)/(대조군의 사멸 세포수/대조군의 총 세포수).

통계분석

모든 측정은 3회 실시하였고 모든 값은 평균±표준 오차로 표시하였다. 결과는 분산 분석 후 Tukey 시험을 수행하여 평균의 차를 분석하였다. 모든 경우에, p 값<0.05은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

B. 실험 결과

실험예 1. PG의 ROS 생성 저해 효과

MTT 분석은 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)의 사용 농도에 관계없이 HaCaT 세포에 대한 세포 독성을 나타내지 않음을 보여주었다. 대조군에 비해서, 각 시료 처리군의 세포 생존능은 96% 보다 높았다 (도 1A). 또한, DCF-DA 분석을 이용하여 H2O2 처리 후, PG의 세포내 ROS 제거 활성을 판단하였다 (도 1B). 형광 분광 데이터를 통해, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)은 농도 의존적으로 H2O2 처리 세포의 세포내 ROS 제거 효과를 가지는 것을 확인하였으며, 구체적으로 대조군과 비교하면, 각각 2.5 μM 에서 11%, 5 μM 에서 23%, 10 μM에서 42%였다. (도 1B). 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) (10 μM)의 히드록시 라디칼 제거능을 평가하기 위해, ESR 분광을 수행하였다. FeSO4 + H2O2 계에서, DMPO/·OH 부가 생성물은 대조군에서 약 3366의 시그널을 나타냈고, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)군에서는 약 2090까지 감소되었다 (도 1C). 이러한 결과는 PG가 ROS를 효과적으로 제거하는 것을 증명한다.

결론적으로, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)는 세포독성이 없으며, H2O2 유도된 세포내 ROS, 히드록시 라디칼 소거 효과가 우수한 것으로 확인되었다.

실험예 2. PG의 UVB 유도 세포 손상 방지 효과

우선, 공초점 현미경으로 얻은 사진은 10 μM 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)가 UVB 선에 의해 초래되는 강도 (녹색)를 약화시키는 것을 보여주었다 (도 2A). 이는 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)이 ROS 제거 특성을 갖는 것을 의미한다.

또한, 지질 과산화는 DPPP로부터 생성된 형광 생성물 DPPP 옥사이드를 조사하여 확인하였다. DPPP 산화물의 강도는 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) 처리 (청색)한 UVB 노출 세포보다 UVB 노출 세포에서 더 높았다 (도 2B). 따라서, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)이 지질 과산화를 억제하는 것을 알 수 있었다.

다음으로, comet 분석은 UVB 유도 DNA 손상과 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)의 보호 효과를 평가하는 데 이용되었다. 대표 현미경 사진은 comet 꼬리의 길이와 꼬리에서 형광이 차지하는 비율을 보여준다(도 2C). 그 결과 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) 전처리는 꼬리의 형광을 유의하게 감소시킬 뿐만 아니라, UVB 처리에 의해 유도된 꼬리 길이는 65%에서 22%으로 감소되는 것을 확인하였다.

마지막으로, 단백질 카르보닐화 분석으로 단백질 산화 과정 동안의 카르보닐기를 검출하였다. 그 결과, UVB 조사는 카르보닐 잔사의 농도를 높이지만, UVB 노출군에 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) 전처리를 하면 단백질 카르보닐의 형성이 저해되는 것을 확인하였다 (도 2D).

요약하면, 이러한 결과는 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)가 UVB 조사에 의해 유도되는 산화적 손상으로부터 DNA 손상, 지질 과산화, 및 단백질 손상을 억제하고 DNA, 지질, 및 단백질을 효과적으로 보호한다는 것을 의미한다.

실험예 3. PG의 UVB 조사에 의해 유도된 세포사멸의 저해 효과

HaCaT 세포의 생존능은 MTT 분석을 이용하여 평가하였다 (도 3A). UVB 조사는 대조군 세포에 비해서 세포 생존능을 59%로 낮추었다. 그러나, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) 전처리군은 세포 생존능을 77%로 높였는데, 이는 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)이 UVB 유도 세포사멸로부터 세포를 보호한 것을 입증하는 것이다.

다음으로, 유세포 분석은 세포사멸체의 수를 측정하는 데 이용되었다 (도 3B). 세포사멸은 미토콘드리아 막 침투성 및 전위의 변화를 유발하는데, 세포사멸 유도 미토콘드리아 기능 장애는 JC-1 염색에 의해 검출될 수 있다. 그 결과 UVB 조사 세포는 가장 많은 수의 사멸 세포를 포함하여, 형광 세기가 180이었으나, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) 전처리는 사멸 세포 수를 감소시켰고, 형광 세기가 154이었다. 따라서, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)은 UVB 유도된 세포사멸에 대한 보호 효과를 가지는 것을 알 수 있었다.

또한, 세포를 Hoechst 33342로 염색하여 세포 사멸의 특징인 핵 응축도와 세포 사멸체 형성을 가시화하였다. 대조군과 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) 처리 세포에서는 정상 핵이 관찰되었으나, UVB 조사 세포에서 현저한 핵 응축이 관찰되었다 (도 3C).

따라서, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)는 UVB 유도된 피부 세포사멸에 대한 보호 효과를 가지는 것을 알 수 있었다.

실험예 4. PG의 PM 유도 ROS 생성과 세포사멸의 저해효과

공초점 현미경으로 얻은 이미지는 10 μM 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)가 미세먼지(PM, particulate matter)에 의한 강도 (녹색)을 약화시킴을 보여주었다 (도 4A). 이는 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)이 ROS 생성을 저해하는 것을 의미한다.

또한, 핵 응축과 Hoechst 33342 염색에 의한 세포사멸체 형성을 보여주는 이미지를 통해, 미세먼지(PM, particulate matter) 처리 세포에서 세포사멸이 가장 많은 것을 확인하였으며, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) 전처리는 세포사멸로부터 세포를 보호하는 것을 확인하였다 (도 4B).

결론적으로, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)는 미세먼지(PM, particulate matter) 유도된 ROS 소거 및 피부 세포의 세포사멸에 대한 보호 효과를 가지는 것을 알 수 있었다.

실험예 5. PG의 PM과 UVB 유도 산화성 손상과 세포사멸에 대한 보호 효과

공초점 현미경으로 얻은 이미지를 통해, 미세먼지(PM, particulate matter) 또는 UVB 조사가 세포내 ROS를 생성하고 촉진하는 것을 확인하였다. 또한, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) (10 μM)은 UVB 조사, PM 또는 PM+UVB 조사에 의해 유래된 강도 (녹색)을 감소시키는 것을 확인하였다. (도 5A). 이는 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)이 미세먼지 또는 UVB 조사에 유발된 ROS 생성을 억제하는 것을 의미한다.

더욱이, Hoechst 33342을 이용한 핵 염색 결과를 통해, 미세먼지(PM, particulate matter)가 UVB 유도 세포사멸을 더욱 증가시켰으나, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG) 전처리군은 미세먼지 또는 UVB 조사에 의해 증가된 세포 사멸을 억제하는 것을 확인하였다(도 5B).

따라서, 푸르푸로갈린(Purpurogallin, PG)가 인간 각질형성세포 세포주에서 UVB 조사 또는 UVB 조사와 미세먼지(PM, particulate matter) 처리에 의해 유발된 ROS와 세포 사멸체를 억제하는 바, 자외선과 미세먼지에 의한 피부 보호 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin)은 미세먼지로 인해 발생된 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 소거(scavenging) 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타내는 것인, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 푸르푸로갈린(Purpurogallin)은 미세먼지에 노출된 세포의 세포사멸(apoptosis)을 저해하는 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타내는 것인, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형인 것인, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.
푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 의약외품 조성물.
푸르푸로갈린(Purpurogallin) 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 피부외용제 조성물.