KR102271934B1 - 다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 대한 피부보호용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물로 이용할 수 있다.

Description

다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 대한 피부보호용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising fermented Laminaria japonica for protecting skin against particulate matter}

본 발명은 다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물, 의약외품 조성물 및 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 우리 몸의 중요한 기관들을 보호하는 보호막 역할을 할 뿐만 아니라 수분 증발을 조절하고 외부 감염으로부터 몸을 보호하는 역할을 한다. 하지만, 아무리 외부로부터의 바이러스 침투를 막아내는 피부일지라도 과도한 자외선, 오염된 환경 등 외부로부터 받는 스트레스는 피부 자극을 유발하게 되고, 결국에는 피부 노화로 이어지게 된다.

최근 중국의 산업화로 인해 발생하고 있는 중금속 등의 유해물질이 섞인 미세먼지, 황사, 스모그는 피부 노화 및 피부 트러블의 주요 원인으로 인식되고 있다.

미세먼지는 우리 눈에 보이지 않는 아주 작은 물질로 대기 중에 오랫동안 떠다니거나 흩날려 내려오는 직경 10㎛ 이하의 입자상 물질을 말한다. 석탄, 석유 등의 화석연료가 연소될 때 또는 제조업ㆍ자동차 매연 등의 배출가스에서 나오며, 기관지를 거쳐 폐에 흡착되어 각종 폐질환을 유발하는 대기오염물질이다. 환경부에 따르면 2017년 3월 우리나라와 국제적으로 사용하는 미세먼지에 대한 용어가 달라 혼란스럽다는 지적에 따라 지름이 10㎛ 이하인 미세먼지(PM₁₀)는 부유먼지, 지름이 2.5㎛ 이하인 초미세먼지(PM_2.5)는 미세먼지로 정의한다.

미세먼지, 황사 등과 같은 오염 물질들은 피부 내 스트레스를 야기하는데, 이러한 스트레스는 활성산소에 의해 생성된다. 활성산소는 미토콘드리아 내 전자전달체 및 백혈구 세포의 활성화 등 정상적인 세포기능을 유지하는데 중요한 역할을 담당하는 세포 내 신호전달 물질로 작용한다. 그러나 활성산소들은 불안정하고 산화력이 높아 생체물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스(oxidative stress)를 유발하게 된다.

이에 본 발명에서는, 미세먼지에 대한 피부 보호 효과를 가지는 화장료 조성물을 개발하고자 하였다.

대한민국 공개특허 10-2008-0085404호

본 발명의 목적은 다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 유효성분으로, 다시마 발효물을 포함한다.

상기 다시마 발효물을 포함하는 화장료 조성물은 미세먼지에 대한 피부 보호 효과를 가진다.

본 발명에서 “다시마(Laminaria japonica)” 는 한국, 중국 및 일본의 해안 지방에서 널리 소비되고 있는 갈조류이다. 상기 다시마는 태평양 연안에 20여 종이 자라고 있으며 10m 이상의 큰 종류도 있는데, 주요 종으로는 참다시마 (L.japonica), 오호츠크다시마(L.ochotensis), 애기다시마(L.religiosa) 등이 있다. 옛날부터 한국을 비롯하여 일본 및 중국 등 동아시아에서 식용해 왔으며, 특히, 단백질 성분인 글루탐산과 아스파르트산을 다량 함유하고 있어 조미 재료로 예부터 널리 이용되어 왔다. 상기 다시마에는 다당류가 가장 많으며, 그 종류로는 알긴산과 셀룰로오스, 그리고 수용성인 퓨코이딘 등이 있다.

본 발명의 “다시마 발효물”은 다시마 또는 다시마 추출물에 발효 균주를 접종시키고 배양하여 수득한 발효물을 의미한다.

본 발명에서 용어, "추출물"은 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명에서 추출물의 건조는 채취한 식물로부터 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 음지에서 자연건조의 방법으로 진행될 수 있다. 또한, 파쇄 또는 분쇄는 이후 추출과정에서 식물의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄 또는 분쇄하여 분말화할 수 있다. 상기 건조와 파쇄 또는 분쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.

본 발명의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다.

본 발명에서 다시마 발효물은 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있다. 구체적으로 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 수득될 수 있다. 또한, 상기 저급 알코올은 에탄올일 수 있다.

상기 발효균주로 유산균, 구체적으로 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플렌타럼(Lactobacillus plantarum), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 또는 그 혼합 균주일 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 브레비스 BJ21(Lactobacillus brevis BJ21)을 접종하고 발효시켜 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 다시마 발효물은 인간 각질형성세포 세포주(human keratinocyte cell line, HaCaT)를 이용한 실험에서 세포 독성이 없음을 확인하였고, 다시마 발효물이 인간 각질형성세포 세포주에서 미세먼지(PM, particulate matter) 처리에 의해 유발된 산화적 스트레스와 미토콘드리아 손상 및 세포자멸을 억제 하는 것을 확인하였는바, 미세먼지에 대한 피부 보호 효과가 있는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 다시마 발효물은 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물의 유효성분으로 이용이 가능하다.

따라서, 본 발명에서, 상기 다시마 발효물은 미세먼지로 인해 발생된 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 소거(scavenging) 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타낼 수 있는 바, 미세먼지에 대한 피부보호 효과와 더불어, 항산화 효과도 가진다.

또한, 본 발명에서, 상기 다시마 발효물은 미세먼지에 노출된 세포의 미토콘드리아 손상을 억제하는 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 다시마 발효물은 미세먼지에 노출된 세포의 세포자멸(apoptosis)을 저해(inhibition)하는 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 의약외품 조성물을 제공한다.

상기 다시마 발효물, 미세먼지에 대한 피부 보호에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다.

본 발명의 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 소독 청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드 워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제 등일 수 있다.

본 발명의 조성물을 활성산소종, 자외선 또는 미세먼지에 대한 피부 보호 목적으로 의약외품에 포함시킬 경우, 상기 조성물을 그대로 포함하여 사용하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있으며, 본 발명에 의한 의약외품 조성물은 상기 다시마 발효물을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 함유할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 피부외용제 조성물을 제공한다.

상기 다시마 발효물, 미세먼지에 대한 피부 보호, 생리학적으로 허용 가능한 염에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에 의한 피부외용제 조성물은, 예를 들어, 연고, 로션, 가용화상, 현탁액, 에멀젼, 크림, 젤, 스프레이, 파프제, 경고제, 패치제 또는 물파스 등을 들 수 있지만, 이들에만 한정되지 않고, 당업계에 주지된 어떠한 기제에도 배합될 수 있다. 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 상기 다시마 발효물을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명은 다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물로 이용할 수 있다.

도 1은 다시마 발효물이 세포 독성, 자유 라디칼 소거 및 세포 내 ROS에 미치는 영향을 분석한 결과이다. (a) 세포 독성 분석결과로, 세포를 다양한 농도의 다시마 발효물(FST) 추출물을 처리하고, 24시간 후 MTT 분석을 이용하여 세포 생존력을 분석하였다. 데이터는 세 번의 실험을 실시한 결과로, 평균 ± SE로 표시하였다. (b) 자유 라디칼 소거능을 분석한 결과로, DPPH 라디칼의 양을 520 nm에서 분광 광도법으로 측정하였고, 과산화수소 (H₂O₂)에 의해 생성된 세포 내 ROS는 DCF-DA 염색 후 (c) 분광광도계 또는 (d) 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다. N-아세틸시스테인 (NAC)은 양성 대조군으로 사용되었다. * H₂O₂을 단독 (FST 없음) 사용한 경우와 유의한 차이가 있다 (P<0.05). (e) 슈퍼옥사이드 음이온 및 DMPO에 의해 생성된 DMPO-OOH는 ESR 분광법으로 분석하였다. * 대조군과 슈퍼옥사이드 음이온에 비해 각각 p<0.05, # p<0.05. (f) 수산기 라디칼과 DMPO에 의해 생성된 DMPO-OH는 ESR 분광법으로 분석하였다. * 대조군과 수산기 라디칼에 비해 각각 p<0.05, #p<0.05. (g) DCF-DA 염색 후 공초점 현미경을 사용하여 생성된 세포 내 ROS를 분석하였다.
도 2는 다시마 발효물(FST)이 PM_2.5 유도 산화 손상에 미치는 효과를 분석한 결과이다. (a) DNA 절단은 코멧 분석으로 분석하였다. * 미처리 세포와 PM_2.5 처리 세포에 비해 각각 p<0.05, # p<0.05. (b) 세포 용해물을 전기 영동하고 phospho 히스톤 H2A.X 단백질을 특이 항체로 검출하였다. (c) 단백질 산화는 카르보닐기 형성을 측정하여 분석하였다. * 미처리 세포와 PM_2.5 처리 세포에 비해 각각 p<0.05, # p<0.05. (d) 지질 과산화는 DPPP 염색 후 공초점 현미경을 사용하여 분석하였다.
도 3은 PM_2.5 유도 세포자멸사에 대한 다시마 발효물(FST)의 보호 효과를 분석한 결과이다. 세포를 다시마 발효물 (800 ㎍/㎖)로 처리하고 1시간 후에 PM_2.5로 처리하였다. (a) 형광 현미경을 통해 Hoechst 33342 염료로 염색된 세포에서 세포 자멸체 (화살표)가 관찰하였고 정량하였다. * 대조군과 유의한 차이가 없고 (p<0.05), ** PM_2.5 처리 세포와 유의한 차이가 있다 (p<0.05). (b) 세포질 히스톤 관련 DNA 분절을 정량하였다. * 대조군과 유의한 차이가 없고 (p<0.05) ** PM_2.5 유도 세포와 유의한 차이가 있었다(p <0.05).
도 4는 다시마 발효물(FST)은 PM_2.5로 자극된 미토콘드리아 고유의 세포자멸사 조절을 확인한 결과이다. 공초점 현미경으로 JC-1 염색 후 ΔΨm을 평가하였다.
도 5는 다시마 발효물(FST)의 카스파제 의존 신호 전달에 의한 PM_2.5 유도 세포자멸사에 대한 보호효과를 확인한 결과이다. (a) 세포 용해물(lysates)을 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동한 후, 니트로셀룰로즈 막으로 트랜스퍼하였다. 그 후 카스파제-9, 카스파제-3, PARP, 및 액틴의 특이 항체를 이용하여 면역블롯팅(immunoblotting)을 수행하였다. (b) 세포를 Z-VAD-FMK (30 μM) 및 FST (800 ㎍/㎖)로 처리하였다. 1시간 후, 세포를 PM_2.5로 처리하고 24 시간 더 배양한 후 Hoechst 33342 염색 후 형광 현미경으로 세포 자멸체 형성을 관찰하고 정량하였다. 세포 자멸체는 화살표로 나타냈다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 방법>

다시마 발효물과 미세먼지(PM _2.5 )의 준비

다시마를 적당한 크기로 분쇄하고, 다시마의 15배(w/v)의 물을 첨가하였다. 그 후 배지성분(효모 추출물 및 글루코스)을 혼합하고 멸균(121℃, 30분)하였으며, 1.2%(v/v)의 균주(L. brevis BJ20) 배양액을 접종하여 37℃에서 48시간 동안 발효시켜 다시마 발효물(fermented sea tangle, FST)을 제조하였다.

미세먼지는 Sigma-Aldrich사의 디젤 미세 먼지 (입자상 물질, NIST 1650b (PM2.5))를 사용하였다. 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 중 PM_2.5의 원액 (stock solution, 25 mg/㎖)을 제조하여 30분간 초음파 처리하여 현탁된 PM_2.5 입자의 응집을 방지하였다. 실험은 원액 중 PM_2.5 조성의 변화를 방지할 수 있도록 원액 제조 후 1 시간 이내에 수행하였다.

시료

[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움] 브로마이드 (MTT), 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질 (DPPH) 라디칼, N-아세틸시스테인 (NAC), 2’,7’-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트 (DCF-DA), 5,5-디메틸-1- 피롤린-N-옥사이드 (DMPO), Hoechst 33342 염료, 트리판 블루 용액 (0.4%) 및 1차 항-액틴 항체는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하였다. 일차 항-포스포 H2A.X,- 카스파제-9, -카스파제-3, -PARP 항체는 Cell Signaling Technology사 (Beverly, MA, USA) 제품을 구입하였다. 1차 항-Bcl-2 (N-19), -Bax (B-9) 및 -Bim (H-191) 항체는 Santa Cruz Biotechnology사 (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 구입하였다. 디페닐-1-피레닐포스핀(DPPP)과 플루오-4-아세톡시메틸 에스테르(Fluo-4-AM)는 Molecular Probes사 (Eugene, OR, USA) 제품을 구입하였다. 5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤즈 이미다졸릴카르보시아닌 아이오다이드 (JC-1)는 Invitrogen사 (Carlsbad, CA, USA) 제품을 구입하였다. Z-VAD-FMK는 Tocris Bioscience사 (Minneapolis, MN) 제품을 구입하였다.

모든 기타 화학 물질과 시약은 분석 등급을 사용하였다.

세포 배양

인간 HaCaT 각질 형성 세포 (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Germany)를 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 세포를 10% 열처리로 비활성화된 태아 소혈청과 항생 항균제(antibiotic-antimycotic, 100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B) (Gibco, Life technologies Co., Grand Island, NY, USA)를 함유한 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium)으로 배양하였다.

세포 생존율

24-웰 플레이트에 0.8×10⁵ cells/㎖의 밀도로 접종하였다. 배양 16시간 후 다시마 발효물을 100, 200, 400, 800 또는 1600 ㎍/mL의 농도가 되도록 처리하였다. 각 웰에 MTT 원액 (125 ㎕, 2 mg/㎖)을 가하고, 4시간 후에 800 × g으로 5분간 원심분리하여 상층액을 흡입하였다. 각 웰의 포르마잔 결정을 DMSO (350 ㎕)에 용해하여, 96-웰 플레이트로 옮기고 주사 다공성 분광광도계를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

DPPH 라디칼의 검출

100, 200, 400, 800 또는 1600 ㎍/mL 농도의 다시마 발효물을 DPPH (1x10-4 M)을 포함하는 메탄올 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 격렬하게 진탕하였다. 3시간 후, 미반응 DPPH의 양을 분광광도계를 사용하여 520 nm에서 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능(%)은 [(DPPH 라디칼의 광학 밀도) - (처리군의 광학 밀도) / (DPPH 라디칼의 광학 밀도)] × 100으로 계산하였다.

세포 내 ROS의 검출

H2O2 또는 PM_2.5 처리된 세포에서 ROS를 검출하기 위해서 세포를 1.5 x 10⁵ cells/well의 밀도로 접종(seeding)하였다. 도말(plating) 16시간 후 세포를 100, 200, 400, 800 또는 1600 ㎍/㎖ 농도의 다시마 발효물로 처리하였다. 30분 후, H2O2 (1mM) 또는 PM_2.5 (50 ㎍/㎖)를 플레이트에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 30분간 더 배양한 후, DCF-DA 용액 (25 μM)을 첨가하였다. DCF-DA를 첨가한 후 10분 후에 PerkinElmer LS-5B 형광분광분석기(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 2',7'-디클로로플루오레세인 (DCF) 생성물의 적색 형광을 검출하고 정량하거나, 또는 유세포 분석기(flow cytometry, Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 검출하고 Cell Quest 소프트웨어로 분석하였다.

세포내 ROS 소거능 (%)은 [(H₂O₂ 처리시 광학 밀도) - (처리군의 광학 밀도) / (H₂O2 처리시 광학 밀도)] × 100으로 계산하였다. 세포내 ROS의 생성에 대한 사진 분석은 커버 슬립을 배치한 6-웰 플레이트에 2 x 10⁵ cells/well 밀도로 세포를 접종하여 수행하였다. 도말 16시간 후, 세포를 800 ㎍/㎖ 농도의 다시마 발효물로 처리하였다. FST 추출 처리 후 1 시간 후에, 플레이트를 PM_2.5로 처리하였다. 24시간 후에, DCF-DA (100 μM)를 각 웰에 첨가하고, 세포를 37℃에서 30분간 더 배양하였다. 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척한 후, 염색된 세포를 현미경 슬라이드에 마운팅하였다. 세포사진은 공초점 현미경의 레이저 주사 현미경 5 PASCAL 프로그램 (Carl Zeiss, Jena, Germany)를 사용하여 획득하였다.

ESR에 의한 라디칼 측정

슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion)은 잔틴/잔틴 산화효소 시스템을 통해 생성된 후 니트론 스핀 트랩 (nitrone spin trap, DMPO)과 반응하였다. 그 후, DMPO/ㆍOOH 부가물은 JES-FA 전자 스핀 공명 (ESR) 분광기 (JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하여 검출하였다. 요약하면, 잔틴 산화효소 (0.25 U/㎖) 20 ㎕를 잔틴 (10 mM), DMPO (3 M) 및 다시마 발효물 (800 ㎍/㎖) 각각 20 ㎕와 혼합하고, 5분 후에 ESR 신호 생성을 기록하였다.

ESR 분광기 매개 변수는 다음과 같았다.

자기장 336 mT, 전력 1.00 mW, 주파수 9.4380GHz, 진폭변조(modulation amplitude) 0.2 mT, 게인(gain) 500, 스캔시간 0.5분, 스캔폭 10 mT, 시간상수 0.03초, 온도 25℃, 슈퍼옥사이드 음이온 생성값은 검출된 신호값 (임의 단위)으로 나타냈다.

수산기 라디칼은 펜톤 (Fenton) 반응 (H₂O₂ + FeSO₄)에 의해 생성된 후 DMPO와 반응하였다. 생성된 DMPO/ㆍOH 부가물은 ESR 분광법에 의해 검출되었다. DMPO (0.3 M), FeSO₄ (10 mM), H₂O₂ (10 mM) 및 다시마 발효물 (800 ㎍/㎖) 각각 0.2 ㎖와 인산 완충 용액 (pH 7.4)을 혼합한 후 2.5분 후에 ESR 스펙트럼을 기록 하였다. ESR 분광기 매개 변수는 다음과 같이 이용하였다.

자기장 336 mT, 전력 1.00 mW, 주파수 9.4380 GHz, 변조진폭 0.2 mT, 게인(gain) 200, 스캔시간 0.5 분, 스캔폭 10 mT, 시간상수 0.03초, 온도 25℃, 수산기 라디칼 생성값은 검출된 신호값 (임의 단위)으로 나타내었다.

Hoechst 33342을 이용한 핵 염색

세포를 Z-VAD-FMK와 다시마 발효물 (800 ㎍/㎖), 또는 다시마 발효물만 처리하고 1시간 후에 PM_2.5로 처리하였다. 세포를 추가로 24시간 동안 37°C에서 배양하였다. DNA 특이적 형광 염료인 Hoechst 33342 (10 mg/㎖ 원액, 1.5 ㎕)를 각 웰에 첨가하고 세포를 37℃에서 10분간 배양하였다. 염색된 세포를 CoolSNAP-Pro 컬러 디지털 카메라 (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)가 장착된 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. 핵 응축도를 평가하고 사멸세포(apoptotic cell)의 수를 정량하였다.

세포자멸사 지수(Apoptotic index)는 (처리군의 사멸세포수 / 처리군의 총 세포수) / (대조군의 사멸세포수 / 대조군의 총 세포수)로 계산하였다.

트립판 블루 분석

35 mm 배양 접시에 1.0 x 10⁵ cells/㎖의 농도로 세포를 접종하고 16시간 배양한 후 세포를 Z-VAD-FMK와 다시마 발효물 (800 ㎍/㎖) 또는 다시마 발효물만을 처리하였다. 1시간 후, PM_2.5 (50 ㎍/㎖)를 플레이트에 첨가하였다. 0.1% 트립판 블루 용액 1 방울을 0.1 ㎖ 세포 현탁액에 첨가하고 실온에서 5분간 염색한 후, 생존 세포 수와 사멸 세포 수를 10배 배율 현미경으로 계수하였다.

세포 생존율 (%) = [염색되지 않은 세포수 / (염색되지 않은 세포수 + 염색된 세포수)] × 100으로 계산하였다.

단일 세포 겔 전기 영동 (Comet assay)

세포가 도포된 슬라이드를 용해액 (2.5M NaCl, 100mM Na-EDTA, 10mM Tris, 1% Trion X-100 및 10% DMSO, pH 10)에 4℃에서 1시간 침지하고, 전기 영동하였다. 그 후, 에티디움 브로마이드로 염색하고, 이미지 분석 소프트웨어 (Kinetic Imaging, Komet 5.5, UK)가 장착된 형광 현미경으로 관찰하였다. 각 슬라이드마다 50개의 세포에서 코멧 꼬리의 전체 형광 백분율과 꼬리 길이를 기록하였다.

웨스턴 블롯팅 (Western blotting)

세포 및 마우스 피부 용해물(lysate)을 SDS-PAGE에서 전기영동 하여 분리한 후, 분리된 단백질을 막으로 옮겨 phospho-H2A.X에 대한 1차 항체와 액틴으로 반응시킨 후, 2차 항체 (Pierce, Rockford, IL, USA)와 반응시켰다. Amersham Enhanced Chemiluminescence Plus Western Blotting Detection system (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다.

단백질 카르보닐화

단백질 용해 완충액을 사용하여 전체 세포 단백질을 분리하고, 분광광도계로 정량하고, 제조사의 지침에 따라 OxiSelect™ 단백질 카르보닐 ELISA 키트 (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA)를 사용하여 단백질 카르보닐화를 판단하였다.

지질 과산화 분석

기술된 바와 같이 형광 프로브인, 디페닐-1-피레닐포스핀 (DPPP, 분자 프로브) 5 μM으로 세포를 염색하고 (Morita et al. 2016), FV10-ASW 뷰어 4.2 소프트웨어가 장착된 Olympus FV1200 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 분석하였다.

미토콘드리아 막 전위 (Δψm) 측정

미토콘드리아 전위 Δψ는 친유성 양이온 형광 염료인 5,5′,6,6′-테트라클로로-1,1’,3,3’-테트라에틸벤즈이미다졸릴카르보시아닌 아이오다이드 (JC-1, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 염색한 후 공초점 현미경으로 분석하였다.

통계 분석

통계적 유의성은 변량 분석과 버전 SigmaStat 3.5 소프트웨어로 Tukey 검정 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)을 이용하여 판단하였다. 모든 값은 평균 ± 표준 오차로 표시하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것으로 간주하였다.

<결과>

실시예 1. 다시마 발효물의 ROS 소거 효과

다시마 발효물에 대한 최적의 실험 조건을 결정하기 위해서 다시마 발효물의 세포 독성을 먼저 결정하였다. MTT 분석 결과, 다시마 발효물은 1600 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 HaCaT 세포에 대한 독성이 없음을 확인하였다 (도 1a). 다시마 발효물은 DPPH 유리 라디칼을 농도 의존적으로 소거하였다. 구체적으로 농도가 100 ㎍/㎖일 때, 소거율은 3%, 200 ㎍/㎖일 때 소거율은 11%, 400 ㎍/㎖일 때 소거율은 18%, 800 ㎍/㎖일 때, 소거율은 23%, 1,600 ㎍/㎖일 때 소거율은 31%로 측정되어 농도가 증가함에 따라 소거율이 증가되는 것을 확인하였다. 양성 대조군은 잘 알려진 ROS 소거제인 NAC (2 mM)을 사용하였으며, ROS 소거율은 91%로 측정되었다 (도 1b).

이와 유사하게, 다시마 발효물이 H2O2 유도 세포내 ROS를 농도 의존적으로 감소시켰다. 구체적으로 ROS 소거율은 100 ㎍/㎖에서 14%, 200 ㎍/㎖에서 23%, 400 ㎍/㎖에서 43%, 800 ㎍/㎖에서 50%였고, 1600 ㎍/㎖에서 58%로 농도가 증가함에 따라 ROS 소거율이 증가하였다. 양성대조군인 NAC의 ROS 소거율은 61%로 측정되었다. (도 1c).

또한, 다시마 발효물의 PM_2.5에 의해 유도되는 세포내 ROS 소거 효과를 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. 다시마 발효물의 소거율은 100 ㎍/㎖의 농도에서 8%로 측정되었다. 다시마 발효물의 소거율은 200㎍/㎖에서 14%, 400㎍/㎖에서 20%, 800 ㎍/㎖에서 34%였고, 1600 ㎍/㎖에서 28%로 측정되어 800 ㎍/㎖에서 효과가 가장 우수함을 확인하였다. 양성 대조군인 NAC은 47%로 측정되었다(도 1d).

따라서, 이후 실험에서의 다시마 발효물을 800 ㎍/㎖로 사용하였다. 다시마 발효물의 슈퍼옥사이드 음이온과 수산기 라디칼 소거 효과를 ESR 분광법으로 조사하였다. 잔틴/잔틴 산화 효소 시스템에서 슈퍼옥사이드 음이온 신호는 2,756 이었지만 다시마 발효물을 처리함에 따라 1,868로 감소되었다 (도 1e). 다시마 발효물에 의해 펜톤(Fenton) 반응에 의해 생성된 하이드록시 라디칼 신호가 3,044에서 1,657로 감소하였다 (도 1f). DCF-DA 시약을 사용하여 검출된 공초점 현미경 형광 강도는 다시마 발효물 전처리로 인해 PM_2.5에 의해 유도되는 하이드록시 라디칼 생성이 상당히 감소됨을 확인하였다(도 1g).

실시예2. 다시마 발효물이 DNA, 단백질 및 지질 등 PM _2.5 유도 산화적 손상 거대 분자 물질에 미치는 효과

다음에는 DNA 가닥 절단, 단백질 카르보닐기 형성 및 지질 과산화 정도를 평가하여 다시마 발효물의 PM_2.5 에 의한 세포성분의 산화 손상에 대한 보호 효과를 분석하였다. 알칼리 코멧(comet) 분석을 통해 PM_2.5 에 의해 세포 DNA 손상이 유도되는 것을 확인하였다. 세포에 PM_2.5를 처리하면 DNA 절단 수가 증가되어 코멧 유사 구조의 꼬리에서 형광의 강도가 증가하였다. PM_2.5에 노출된 세포에서 꼬리 DNA의 비율은 20%로 증가하였다. 반면 다시마 발효물로 전처리한 세포에서는 11%로 나타났다(도 2a). 즉, 다시마 발효물이 PM_2.5에 의한 DNA 손상을 억제함을 확인하였다.

또한, 웨스턴 블롯 결과, PM_2.5 처리군에서 핵 히스톤 H2A.X (이중 가닥 DNA 절단에 대한 민감성 마커)의 인산화가 증가하는 반면에, 다시마 발효물 전처리군은 phospho-H2A.X의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도 2b). PM_2.5에 노출된 배양 세포의 단백질 카르보닐기 함량은 현저하게 증가하였다 (49 nmol/mg). 반면, 다시마 발효물 (44 nmol/mg)로 전처리한 세포에서 PM_2.5에 유도되는 단백질의 카르보닐기의 형성이 감소하였다(도 2c).

지질 과산화 지표인 DPPP 산화물의 형광 강도는 미처리군(control) 및 다시마 발효물 처리 세포(FST)에 비해 PM_2.5을 처리한 세포의 형광 강도가 증가하였으나, 다시마 발효물 전처리(FST+PM_2.5)에 의해 유의하게 감소하였다. 즉, 다시마 발효물이 PM_2.5에 의한 지질 과산화를 방지함을 확인하였다 (도 2d).

실시예3. 다시마 발효물이 PM _2.5 유도 세포자멸사에 미치는 효과

산화 스트레스 측면에서 ROS는 정상적인 생리 경로를 방해하고 세포사를 초래할 수 있다. 이러한 전환은 주로 Ca²⁺ 신호 전달을 통해 매개된다. 따라서, PM_2.5 유도 세포에서 세포 내 Ca²⁺ 수준에 대해 다시마 발효물이 미치는 효과를 Ca²⁺ 형광 지시약인 Fluo-4-AM 사용하여 평가하였다. 공초점 현미경 분석결과, 대조군(Control) 세포와 비교하여 PM_2.5 유도 세포에서 Ca²⁺ 형광 강도가 증가하였다. 그러나, 다시마 발효물 처리에 의해 PM_2.5 유도 세포의 형광 강도가 감소되는 것을 확인하였다(도 3a). PM_2.5가 인간 HaCaT 각질 형성 세포에서 세포자멸사를 유도함으로써 세포사를 일으키는 것이 증명되었다 (Piao et al., 2018). 물론, 대조군과 FST만 처리한 세포에서는 온전한 (손상되지 않은) 핵이 관찰되었다. PM_2.5 처리된 세포에서는 현저한 핵분절 (세포 자멸체가 형성되는 특성)이 관찰되었다. 그러나 PM_2.5에 의해 증가된 핵분절은 다시마 발효물의 전처리에 의해 유의하게 감소되었다 (도 3b).

실시예4. 다시마 발효물이 PM _2.5 유도 미토콘드리아 손상에 대한 보호 효과

미토콘드리아는 산화적 인산화가 발생하고 ROS이 생성되는 부위로서, 막 투과성을 통한 세포자멸사(apoptosis)의 조절과 밀접하게 관련된다. 미토콘드리아 의존성 세포 사멸을 나타내는 ΔΨm의 변화를 확인하기 위해 양이온 친유성 형광 염료 JC-1을 사용하였다.

JC-1은 형광형미경에서 정상적인 미토콘드리아를 가지고 있는 세포의 경우 적색형광으로 확인이 가능하고, 미토콘드리아의 기능 손상되고 ΔΨm가 탈분극되었을 때 녹색형광으로 변화되어 건강한 미토콘드리아와 손상된 미토콘드리아를 식별할 수 있다.

형광 현미경 분석결과 대조군(control) 세포와 다시마 발효물(FST) 처리 세포가 강한 적색 형광이 나타나며, 미토콘드리아 막이 분극 상태임을 나타낸다. 그러나, PM_2.5를 처리하면 적색형광의 수준이 감소되고 녹색 형광의 수준을 증가하여, 미토콘드리아 막의 탈분극이 유도되는 것을 확인하였다. 반면, 다시마 발효물과 PM_2.5을 처리한 세포에서, PM_2.5만 처리한 세포와 비교하여 적색 형광의 증가하고 녹색 형광이 감소하여 탈분극이 억제되는 것을 확인하였다(도 4).

상기 결과를 통해 다시마 발효물이 미토콘드리아 손상을 억제하여 PM_2.5 유도 세포자멸사로부터 각질 형성 세포를 보호함을 확인하였다.

실시예5. 카스파제 의존 신호 전달에 의해 다시마 발효물이 PM _2.5 유도 세포 손상 보호 효과

HaCaT 세포에서 PM_2.5 유도 세포자멸사와 카스파제의 관련 가능성을 판단하기 위해, 다시마 발효물이 카스파제 경로에 관여하는 주요 조절 단백질의 활성화에 미치는 영향을 분석하였다. 세포핵을 Hoechst 33342로 염색하고 형광 현미경으로 확인하였다. 대조군 세포에서 손상되지 않은 핵이 나타났으나, PM_2.5 처리된 세포에서는 유의한 핵분절 및 세포자멸체가 형성되었다. 그러나, 다시마 발효물 또는 다시마 발효물+Z-VAD-FMK(irreversible pan-caspase inhibitor)는 PM_2.5 처리 세포에서 핵분절을 현저하게 감소시켰다 (도 5a).

또한, PM_2.5, 다시마 발효물, 다시마 발효물 + PM_2.5 또는 Z-VAD-FMK + 다시마 발효물 + PM_2.5의 처리 후 세포의 생존을 평가하여 다시마 발효물이 PM_2.5 처리 세포의 생존력을 향상시키는지를 조사하였다. 트립판 블루 (trypan blue) 분석으로 세포 생존력을 분석한 결과, PM2.5 처리 세포의 경우 53%로 나타났으며, 다시마 발효물 전처리/PM_2.5 처리 세포의 경우 71%이며, Z-VAD-FMK/다시마 발효물 전처리/PM_2.5 처리 세포의 경우 88%로 나타났다 (도 5b). 이들 결과는 다시마 발효물이 카스파제 의존 세포자멸사 경로를 억제함으로써 세포 자멸사로부터 세포를 보호함을 확인하였다.

Claims (6)

1. 다시마 발효물을 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물로,
   상기 다시마 발효물은 미세먼지로 인해 발생된 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 소거(scavenging) 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타내고, 미세먼지에 노출된 세포의 세포자멸(apoptosis)을 저해하는 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타내는 것인, 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형인 것인, 화장료 조성물.
5. 삭제
6. 삭제

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