CN108430485B

CN108430485B - 包含金盏花油性提取物和水提取物以及白花百合球茎水提取物的抗污染复合物及其应用

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Publication number: CN108430485B
Application number: CN201580084831.4A
Authority: CN
Inventors: 雅克·勒克莱雷
Original assignee: Mp2 Cosmetic Solutions Sarl
Current assignee: Mp2 Cosmetic Solutions Sarl
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2035-11-26
Also published as: EP3380201B8; EP3380201B1; US10695285B2; CN108430485A; EP3380201A1; US20180344626A1; TW201731487A; WO2017089854A1

Abstract

本发明涉及包含金盏花的水提取物、金盏花的油性提取物和白花百合的水提取物的抗污染复合物，包含这种抗污染复合物的局部用化妆品组合物，和用于保护皮肤免受污染的有害影响、特别是废气和重金属的有害影响的化妆方法。

Description

包含金盏花油性提取物和水提取物以及白花百合球茎水提取物的抗污染复合物及其应用

本发明属于局部用化妆品技术领域，具体涉及皮肤用化妆品。

特别地，本发明涉及一种抗污染复合物，其包含金盏花(Calendula officinalis，也被称为金盏菊(pot marigold)；或Calendula arvensis，也被称为野万寿菊(fieldmarigold)或野生万寿菊(wild marigold)；在本申请中，这些金盏花物种被统称为“金盏花”)水提取物、金盏花油性提取物和白花百合(Lilium candidum)(通常被称为圣母百合或白百合)水提取物，本发明还涉及一种包含这种抗污染复合物的局部用化妆品组合物，以及一种化妆方法，该方法用于保护皮肤免受污染的有害影响，特别是废气和重金属的有害影响。

现代环境条件(如暖气和空调、干燥、暴露于阳光、和大气污染)会对皮肤造成严重应激并加速自然老化过程。废气排放是最具破坏性的污染物之一。

主要的空气污染物分为不同的两大类：初级污染物和次级污染物。

初级污染物是由污染源(交通、工业、供暖、农业等)直接排放的。它们由碳氧化物、硫氧化物、氮氧化物、挥发性有机化合物(VOC)、颗粒物(PM)(特别是直径小于10μm(PM10)和小于2.5μm(PM2.5)的PM)和金属(特定是重金属(铅、汞、镉等))组成。

次级污染物不是直接排放到大气中，而是来自诸如臭氧、二氧化氮、二氧化硫、氨等气体与其他次级粒子之间的化学反应。

一些污染物(如二氧化氮或颗粒物)可以既是初级污染物也是次级污染物。

所有这些污染物对皮肤都是非常有害的，皮肤是人体最大的器官，其表面积约为2m²。氧化剂如臭氧或氮氧化物是刺激性物质并产生自由基。颗粒物通常是酸性的并且也具有刺激性，它们可导致皮肤水合作用和组织氧合作用的减少。主要来自废气排放的一氧化碳会产生组织缺氧。二氧化硫引起皮肤皮脂膜改变并有刺激性。金属，特别是重金属，如镉、汞和铅，可以通过改变酶控反应来干扰细胞的新陈代谢。它们降低细胞对自由基的防御手段的活性，并造成DNA氧化损伤和细胞脂质损伤。因此，污染对皮肤的有害作用会影响细胞呼吸，并表现为皮肤加速老化从而导致皱纹、坚挺度和弹性的丧失、老年斑、干燥等。

已经提出了多种化妆品组合物以防止由污染物(废气和/或重金属)引起的有害影响，特别是含有植物提取物的化妆品组合物。

例如，美国专利申请2009/0035235描述了一种化妆品组合物，其能够对抗和防止大气污染对皮肤的影响，其含有两种植物提取物：茶树(Camellia sinensis)(白茶)和欧洲稻槎菜(Lapsana communis)。含有这两种提取物的组合物表现出抗自由基活性，提供保护以抵抗由废气引起的脂质过氧化反应并刺激线粒体呼吸作用。

然而，随着污染程度的增加，仍需要其他制剂以有效对抗污染物对皮肤的有害影响，特别是防止细胞呼吸作用退化和皮肤老化加速。

因此，本发明的目的是提供至少具有这些性质的局部用抗污染化妆品组合物。

本发明的发明人进行的研究已经证明，至少一种金盏花水提取物、至少一种金盏花油性提取物和至少一种白花百合(Lilium Candidum)球茎水提取物的组合对防止污染对皮肤的有害影响具有协同作用，特别地，这种组合对刺激细胞呼吸和防止细胞能量水平下降具有协同作用。另外，这样的组合在防止氧化应激方面具有有效的活性。这些性质对于对抗污染物对皮肤的有害影响特别有用，特别是废气和重金属的有害影响。最后，在该组合中，在测试量下没有出现细胞毒性作用。

金盏花是菊科(Asteraceae)的大约15-20种一年生和多年生草本植物属。它们原产于亚洲西南部、西欧、密克罗尼西亚和地中海地区，非常耐负温度(达-20℃)。该属最常栽培和使用的成员是金盏菊(Calendula officinalis)。植物药理学研究已经表明金盏花提取物在体外具有抗病毒、抗基因毒性和抗炎特性(Jimenez-Medina,E et al，2006,BMCCancer.6:6)。在草药医学中，金盏花悬浮液或酊剂用于局部治疗痤疮、减轻炎症、控制出血和舒缓受刺激的组织(Duran,V et al，Int J Tissue React.,2005,27(3),101–106和Pommier,P.et al，J.Clin.Oncol.,2004,22(8)1447-1453)。最近，据报道，由于金盏花的乙醇提取物中具有酚类和类黄酮物质，因此金盏花提取物显示出抗氧化和抗炎活性，所以金盏花的花以煎剂的形式可以局部用于灼伤、瘀伤和其他皮肤病(Kanlayavattanakul,Mayuree和Nattaya Lourith,“An update on cutaneous aging treatment usingherbs”,Journal of Cosmetic and Laser Therapy,Accepted for publication：1–31,May 2015)。

白花百合(Lilium candidum)是真百合家族中的植物。它原生于希腊、西巴尔干和中东，并被引入欧洲其他地区(法国、意大利、乌克兰等)以及北非、加那利群岛、墨西哥、和其他地区。它在地面形成球茎，与其他百合植物不同，它在冬季具有基生莲座叶丛(basalrosette of leaves)，而该基生莲座叶丛在夏季枯萎。通常高达1.2米的多叶花梗出现在春末，在夏季时会出现甜美而芬芳的花朵。花是白色的，在底部呈黄色。球茎的化学组成(皂苷和多糖)赋予提取物舒缓、抗炎和保护性能。该提取物还具有保湿和润肤特性(多糖)。可溶性多糖在皮肤上具有成膜作用，其促进神经酰胺的产生和皮肤水合(参见例如EP 0 993822)。它们通过保持水分、持续保持角质层中的适当水分水平而发挥作用，这进而提高了皮肤的柔韧性。

然而，本领域未知的是，至少一种金盏花水提取物、至少一种金盏花油性提取物和至少一种白花百合球茎水提物的组合对防止污染对皮肤的有害作用具有协同活性，特别地，这样的组合对于刺激细胞呼吸和防止细胞能量水平下降具有协同活性。

因此，本发明的第一个目的是提供一种抗污染复合物，包含：

-至少一种金盏花花的水提取物，

-至少一种金盏花花的油性提取物，和

-至少一种白花百合球茎的水提取物。

本发明的第二个目的是根据本发明的第一个目的定义的复合物作为化妆品抗污染成分在局部用化妆品组合物中的用途，该抗污染复合物用于对抗和基本上防止污染对皮肤的有害影响。

本发明的第三个目的是包含如本发明第一个目的所定义的抗污染复合物的局部用化妆品组合物。

本发明的第四个目的是一种化妆护理方法，用于对抗和基本上防止污染对皮肤的有害影响，特别是废气和重金属的有害影响，所述方法包括至少一个步骤，该步骤在有需要的人的皮肤上施用有效量的包含如本发明第一个目的所定义的抗污染复合物的局部用化妆品组合物。

最后，本发明的第五个目的是局部用化妆品组合物的非治疗用途，所述局部用化妆品组合物包含如本发明第一个目的所定义的抗污染复合物，该用途用于对抗和基本上防止污染对皮肤的有害影响，特别是废气和重金属的有害影响。

金盏花的花的水提取物可以通过在纯水中在室温下，浸渍金盏花(Calendulaofficinalis或Calendula arvensis)的干花若干小时来制备，通常约10至24小时。浸渍步骤后，将含水浸渍物在约2至8℃的温度下、通常在约4℃的温度下冷却，然后过滤。当100g干花用于1L纯水时，这种金盏花的花的水提取物的干物质含量通常为约2.5至约2.7重量％。金盏花的花的水提取物包含齐墩果酸、香草酸和辛酸以及其他成分。它具有以下特点：

-干物质含量：2.5至2.7重量％

-pH：4.0至6.0

-折射率：1.330至1.380

-密度：0.950至1.050

-异鼠李素-3-O-芸香糖苷：0.1至0.26g/l

金盏花的花的油性提取物可以通过在醇(例如，乙醇)中在室温下，浸渍干花数小时来制备，通常在约10至24小时内。浸渍步骤后，将醇浸渍物过滤。当100g干花用于1L醇时，这种金盏花的花的醇提取物的干物质含量通常为约0.6至约0.8重量％。然后在醇完全蒸发之前将油相加入到滤液中。作为油相的实例，可以提及以例如

或

名称销售的辛酸/癸酸甘油三酯的混合物和油酸葵花油(Aldivia)。金盏花的花的油性提取物包含类胡萝卜素、类黄酮和三萜二醇(特别是款冬二醇和款冬二醇酯)以及其他成分。

白百合球茎的水提取物可以通过在室温下在纯水中浸渍经冷冻然后研磨的白百合球茎数小时(通常约10至24小时)来制备。浸渍步骤后，将含水浸渍物煮沸数小时，通常约10至12小时，然后热过滤。当100g经冷冻和研磨的白百合球茎用于1L纯水时，这种白百合球茎的水提物的干物质含量通常在约1.0至约1.4重量％的范围内。然后浓缩该水提取物直至干物质含量达到约50重量％。白百合球茎的水提取物包含30重量％的多糖(基于干物质的总量)以及其他成分。

根据本发明的一个优选的实施方案，该抗污染复合物包含：

-约0.5至30重量％(w.％)、更优选约15至25重量％的金盏花花的水提取物，

-约0.5至30重量％、更优选约15至25重量％的金盏花花的油性提取物，

-约0.5至30重量％、更优选约15至25重量％的白花百合球茎水提取物，

-约0.1至5重量％、更优选约2至5重量％的增稠剂，以及

-足够量的水以实现总重量达100重量％。

增稠剂可以选自通常用于增加化妆品组合物的粘度并且被本领域技术人员所熟知的组分。在这些增稠剂中，可以提到如聚丙烯酸酯(卡波姆)、聚丙烯酰胺、黄原胶、角叉菜胶、纤维素衍生物(如羟乙基纤维素)等聚合物，以及矿物增稠剂(如二氧化硅)。在这些增稠剂中，聚丙烯酸酯是优选的。

根据本发明的特定且优选的实施方案，所述抗污染复合物包含：

-约20重量％的金盏花花的水提取物，

-约20重量％的金盏花花的油性提取物，

-约20重量％的白花百合球茎的水提取物，

-约2至5重量％的聚丙烯酸酯，如聚丙烯酸钠，

-足够量的水以实现总重量达100重量％。

除了上述成分之外，根据本发明的抗污染复合物还可以包含一种或多种添加剂，例如防腐剂、着色剂、香料等等。

根据本发明的抗污染复合物可以通过(例如)利用机械搅拌器将每种提取物、任选成分和水混合来简单地制备。

在其制备结束时，根据本发明的抗污染复合物可以容易地用作局部用化妆品组合物中的抗污染剂，以用于对抗和基本上防止污染对皮肤的有害影响，或储存用于其他用途。

根据本发明的一个优选的实施方案，构成本发明的第三个目的的局部用化妆品组合物中的抗污染复合物的量为约0.5至5重量％，更优选为约1.5至3重量％。根据本发明的特定且更优选的实施方案，局部用化妆品组合物中的抗污染复合物的量等于约2重量％。

除了抗污染复合物之外，根据本发明的局部用化妆品组合物还可以包含一种或多种能够增强和/或实现抗污染复合物的有利特性的其他活性成分。在此情况下，本领域技术人员会注意，这种(这些)其他活性成分不会干扰或降低抗污染复合物的有利性质。

其他活性成分可以例如选自植物提取物，如绿茶和葡萄籽提取物、大豆异黄酮提取物、维生素(如维生素C(抗坏血酸)、维生素E(生育酚乙酸酯)和维生素B3(烟酰胺))、透明质酸、己基间苯二酚、视黄醇、α羟基酸、白藜芦醇、神经酰胺、脂肪酸(如亚油酸/亚麻酸)和磷脂等等。

皮肤对根据本发明的局部用化妆品组合物的耐受性非常好，它们不显示光毒性，并且将它们施用在皮肤上即使在长时间内也不会导致任何全身毒性作用。

局部用化妆品组合物可以呈现为适于局部应用的各种盖仑制剂，特别是作为凝胶、乳液(例如霜或乳)、水包油或油包水双相乳液、面膜、化妆水(lotion)、浓缩液、精华露(serum)、纳米胶囊、脂质体、唇膏等等的形式，这些盖仑制剂还包含一种或多种与局部化妆用途相容的经典赋形剂和载体。根据本发明的局部用化妆品组合物优选为霜、精华露、化妆水或凝胶的形式。

特别地，根据本发明的局部用化妆品组合物可以进一步包含一种或多种配方剂或添加剂，例如作为非限制性实例的渗透剂(如植烷三醇和辛基十二醇)、增稠剂(如天然树胶和合成聚合物)、表面活性剂、缓和剂(如鲸蜡硬脂基辛酸酯、肉豆蔻酸异丙酯、鲸蜡硬脂基异壬酸酯、聚二甲基硅氧烷、环聚二甲基硅氧烷)、乳化剂(如聚甘油衍生物)、防腐剂(如苯氧乙醇和脱氢乙酸)、油类、UV-A和UV-B过滤剂，颜料(如二氧化钛和二氧化锌)、染料、成膜剂、矿物质(mineral charge)、香料等。

根据本发明第五个目的的化妆护理方法，所述局部用化妆品组合物可以施用于有需要的人的皮肤上，特别是脸上，一天一次或一天两次。

以下实施例作为例子提供，不能解释为限制本发明的范围。它们涉及抗污染复合物的制备、评估根据本发明的抗污染复合物的协同抗细胞毒性性质及其对能量代谢的影响、评估抗污染复合物对ATP合成速率的影响、评估抗污染复合物的抗自由基性质、以及局部用化妆品组合物，它们包括在本申请的范围内。

实施例

实施例1：根据本发明的抗污染复合物的制备

1.金盏花花的水提取物的制备

室温下，将100金盏花(Calendula officinalis)的干花在1L的纯水中浸渍12小时。然后将浸渍物冷却至4℃，然后用滤纸过滤。

获得具有以下特征的金盏花的水提取物：

-干物质含量：2.5至2.7重量％

-pH：5

-折射率：1.350

-密度：1.050

-异鼠李素-3-O-芸香糖苷：0.15g/l

2.金盏花花的油性提取物的制备

室温下，将100金盏花的干花在1L的乙醇中浸渍12小时，然后用滤纸过滤。滤液的干物质含量等于0.8重量％。然后将500mL由BASF公司以商品名

318销售的辛酸/癸酸甘油三酯的混合物加入到滤液中，并在旋转真空蒸发器中在约60℃的温度下从混合物中蒸发乙醇。金盏花花的油性提取物具有以下特征：

-折射率：1.440至1.460

-过氧化值：≤5.00

-酸指数：≤5.00

3.白花百合球茎的水提取物的制备

在研钵中研磨100g新鲜白花百合(Lilium candidum)的球茎，然后在4℃的温度下在1L纯水中浸渍12小时。然后将混合物煮沸12小时并在滤纸上热过滤。滤液的干物质含量为1.4重量％。由此，将所得滤液通过蒸发浓缩直至干物质含量达到50重量％。相对于干物质含量的总量，该浓缩物中多糖的量为30重量％。

4.抗污染复合物的制备

然后制备具有以下组成的根据本发明第一目的抗污染复合物：

利用机械搅拌器将不同的成分混合。

实施例2：评估根据本发明的抗污染复合物对废气的有害影响的协同性质

在该实施例中，在培养物中的人类角质形成细胞暴露于废气后，测试了实施例1中制备的抗污染复合物的抗细胞毒性性质、及其对能量代谢的影响。

2.1细胞毒性研究

本研究的目的是为了证明利用本发明的抗污染复合物处理后，废气的细胞毒性效果的可逆性，所述抗污染复合物包含3种提取物的组合(金盏花花的水提取物、金盏花花的油性提取物和白花百合球茎的水提取物)，并且将结果与单独使用每种提取物的效果进行比较。

该测试使用Formazan蓝色检验(MTT)进行。从由包皮环切术收集的人包皮细胞获得角质形成细胞培养物，并将其在补充有胰岛素、EGF和垂体提取物的KGM2培养基(Clonetics)中进行扩增。

在存在或不存在不同浓度的所研究产品的情况下孵育24小时后，将含有细胞的孔缓慢翻转将其倒空，然后用培养基冲洗细胞层。在所有孔中分配200μL稀释的MTT溶液。然后将平板在37℃下孵育2至4小时。然后可以观察到Formazan蓝色晶体的形成，其量与所获得的琥珀酸脱氢酶成反比。然后将它们缓慢翻转以再次将孔倒空。随后加入200μL的二甲基亚砜(DMSO)使细胞裂解并使Formazan蓝色晶体溶解。通过搅拌使颜色均匀后，使用分光光度计在570nm下观察平板。

废气由发动机产生。使气体与培养物中的角质形成细胞接触2小时，然后与待研究的产品或不与待研究的产品一起，将细胞再孵育22小时。

测试的不同产品如下：

-APC：根据本发明的并如实施例1所制备的抗污染复合物，

-AECF：单独的金盏花花的水提取物：该对照组合物(不构成本发明的一部分)与实施例1中制备的抗污染复合物相同，不同之处在于，将3种提取物的组合替换为60重量％的实施例1的步骤1中制备的金盏花花的水提取物，

-OECF：单独的金盏花花的水提取物：该对照组合物(不构成本发明的一部分)与实施例1中制备的抗污染复合物相同，不同之处在于，将3种提取物的组合替换为60重量％的实施例1的步骤2中制备的金盏花花的油性提取物，

-AELcB：单独的白花百合球茎的水提取物：该对照组合物(不构成本发明的一部分)与实施例1中制备的抗污染复合物相同，不同之处在于，将3种提取物的组合替换为60重量％的实施例1的步骤3中制备的白花百合球茎的水提取物，

批次1：阴性对照：不接受任何产品处理，

批次2：阳性对照：将细胞暴露于废气中，

批次3：将细胞暴露于废气中，然后用1.0重量％的APC处理，

批次4：将细胞暴露于废气中，然后用2.0重量％的APC处理，

批次5：将细胞暴露于废气中，然后用1.0重量％的AECF处理，

批次6：将细胞暴露于废气中，然后用2.0重量％的AECF处理，

批次7：将细胞暴露于废气中，然后用1.0重量％的OECF处理，

批次8：将细胞暴露于废气中，然后用2.0重量％的OECF处理，

批次9：将细胞暴露于废气中，然后用1.0重量％的AELcB处理，

批次10：将细胞暴露于废气中，然后用2.0重量％的AELcB处理。

对于每个批次，进行了6次检测。通过比较暴露于废气但没有用产品处理(阳性对照-批次2)之后的细胞的活力与暴露于废气并用各测试产品处理后的细胞活力，从而计算废气效果的可逆性。

2.2.细胞毒性研究的结果

结果在下表1中示出。

表1

产品	光密度	活性(％)
			批次1：阴性对照	0.510±0.012	100
批次2：阳性对照	0.281±0,019	-45<sup>*</sup>
			批次3废气APC 1.0％	0.324±0,013	+15<sup>**</sup>
批次4废气APC 2.0％	0.360±0,020	+28<sup>**</sup>
			批次5废气AECF 1.0％	0.296±0,013	+5(ns)
批次6废气AECF 2.0％	0.312±0,008	+11<sup>**</sup>
			批次7废气OECF 1.0％	0.312±0,010	+17<sup>**</sup>
批次8废气OECF 2.0％	0.328±0,017	+17
			批次9废气AELcB 1.0％	0.306±0,012	+9(ns)
批次10废气AELcB 2.0％	0.319±0,013	+13<sup>**</sup>

ns：不显著

*：与阴性对照相比显著不同，p<0.05

**：与阳性对照相比显著不同，p<0.05

这些结果表明，当用1重量％的复合物(+15％)或2重量％的复合物(+28％)处理细胞时，根据本发明的抗污染复合物(即，含有金盏花花的水提取物、金盏花花的油性提取物和白花百合球茎的水提取物的组合)对废气诱导的细胞毒性的可逆性具有协同活性。细胞活力的增加高于用等量的各单独提取物处理细胞所获得的细胞活力，这证明了3种提取物组合的协同效应。当抗污染复合物以2重量％的浓度使用时，这种协同效应特别显著(+28％vs.单独使用相同浓度的提取物时分别为+11％、+17％和+13％)。

2.3抗污染复合物对呼吸速率的影响的研究

呼吸速率是每数百万个细胞每分钟的皮原子(picoatoms)氧消耗量。

从由包皮环切术收集的人包皮细胞获得角质形成细胞培养物，并在补充有胰岛素、EGF和垂体提取物的KGM2培养基(Clonetics)中进行扩增。

废气由发动机产生。将细胞与气体接触2小时，然后与待测试的产品或不与待测试的产品一起，将细胞再孵育20分钟。该研究在两种不同的条件下进行：

i)在葡萄糖的存在下在非透性细胞中对基础细胞呼吸速率的影响，

ii)在丙酮酸盐-苹果酸盐底物的存在下对可渗透性细胞的线粒体呼吸速率的影响。

这项研究是对胰蛋白酶解离的培养物中的角质形成细胞进行的。将培养物中的500万至1000万个角质形成细胞置于含有20mM葡萄糖(基础呼吸)或丙酮酸盐(10mM)和苹果酸盐(10mM)(线粒体呼吸)的30℃的1mL Hanks-Hepes培养基悬液中。实时监测呼吸作用，并以每分钟每10⁶个细胞所消耗的皮原子氧示出。将不同数量的产品添加到测氧描记器(oxygraph)的罐中以显示可能的呼吸刺激或抑制。

使用Clark电极测定溶解在培养基中的氧量。扩散通过

膜的氧在-0.8V下在极化铂阴极处被还原。在这些条件下，在该阴极和银阳极之间通过的电流与溶液中的氧浓度成比例。离子桥由KCl的半饱和溶液提供。由微型计算机(IBM-PC)提取测量值并处理。

在此，还检测了与上述实验2.1中相同的批次1至10。对每个批次进行4次检测。

2.4.抗污染复合物对呼吸速率的影响结果

对基础呼吸的结果见下表2：

表2

ns：不显著

*：与阴性对照相比显著不同，p<0.05

**：与阳性对照相比显著不同，p<0.05

这些结果表明，当用1重量％的复合物(+27％)或2重量％的复合物(+38％)处理细胞时，根据本发明的抗污染复合物(即含有金盏花花的水提取物、金盏花花的油性提取物和白花百合球茎的水提取物的组合)对废气对基础呼吸的影响具有协同活性。上述效果高于用等量的每种提取物单独处理细胞时所获得的效果，这表明3种提取物组合具有协同效应。当抗污染复合物以2重量％的浓度使用时，这种协同效应特别显著(+38％vs.单独使用相同浓度的提取物时分别为+13％、+21％和+16％)。

对线粒体呼吸的结果在下表3中示出：

表3

ns：不显著

*：与阴性对照相比显著不同，p<0.05

**：与阳性对照相比显著不同，p<0.05

这些结果表明，当用1重量％的复合物(+21％)或2重量％的复合物(+25％)处理细胞时，根据本发明的抗污染复合物(即含有金盏花花的水提取物、金盏花花的油性提取物和白花百合球茎的水提取物的组合)对废气对线粒体呼吸的影响具有协同活性。上述效果高于用等量的每种提取物单独处理细胞时所获得的效果，这表明3种提取物的组合具有协同效应。当抗污染复合物以2重量％的浓度使用时，这种协同效应特别显著(+25％vs.单独使用相同浓度的提取物时分别为+13％、+16％和+18％)。

实施例3：评估根据本发明的抗污染复合物对基础ATP和线粒体ATP合成的影响

从由包皮环切术收集的人包皮细胞获得角质形成细胞培养物，并将其在补充有胰岛素、EGF和垂体提取物的KGM2培养基(Clonetics)中进行扩增，之后对其进行测试。

本研究的目的是评估根据本发明的抗污染复合物对培养基中的角质形成细胞的基础ATP合成速率和线粒体ATP合成速率的影响，所述复合物包含3种提取物的组合(金盏花花的水提取物、金盏花花的油性提取物和白花百合球茎的水提取物)。这通过使用荧光素/荧光素酶试剂盒的生物发光法来确定。通过在以下ATP消耗反应期间发射的光来测量各等分试样中新合成的ATP和基础ATP的量：

使用得自Boehringer Mannheim的ATP监测剂(ATP生物发光检验试剂盒HS II)，利用光度计(Luminoscan)测量在该反应期间发出的光的强度。该装置将反应过程中发出的光转换为相对光度单位(RLU)。根据标准ATP量表将测量的RLU转换成ATP的摩尔数。ATP合成速率以nmoles/分钟/10⁶个细胞示出。在二氧化碳培养箱中，将培养物中的角质形成细胞在ADM培养基(Clonetics)中以每轮10⁶的速率培养。

废气由发动机产生。将细胞与气体接触2小时。然后与待测试的产品或不与待测试的产品一起将细胞在以下两种条件下再孵育20分钟：

i)在葡萄糖存在下对非透性细胞的基础合成速率的影响，

ii)在丙酮酸盐-苹果酸盐底物存在下对可渗透性细胞的线粒体合成速率的影响。

该处理包括将如上述实施例1制备的抗污染复合物以所需浓度直接施加到测氧描记器罐中的悬浮细胞中。将浓度为10⁶细胞/mL的细胞置于具有恒温器(设为30℃)的测氧描记器罐中的“呼吸缓冲液”(Hanks-Hepes葡萄糖20mM)的悬浮液中，并进行搅拌。为了确定线粒体合成速率，使用毛地黄皂苷使细胞透化。添加呼吸底物(对于基础合成速率，20mM的葡萄糖/对于线粒体合成速率，10mM的丙酮酸盐和10mM的苹果酸盐)以观察氧消耗速率(根据Chance为状态2)。以规律的时间间隔将不同量的抗污染复合物(最终浓度为1重量％和2重量％)添加到测氧描记器的罐中后，从测氧描记器的罐中取出一等份以根据上述方法滴定其ATP。因此，将根据本发明的不同量的抗污染复合物添加到测氧描记器的罐中使得可以显示可能的ATP合成的激活或抑制

对于每个测试浓度，进行了4次测定。

结果在下表4和5中示出：

表4

表5

这些结果表明，根据本发明的抗污染复合物(即含有金盏花花的水提取物、金盏花花的油性提取物和白花百合球茎的水提取物的组合)刺激了暴露于废气后的角质形成细胞中的ATP的合成(当用1重量％的复合物处理细胞时为+20％和+19％，用2重量％的复合物处理细胞时为+25％和+26％)。

实施例4：评估根据本发明的抗污染复合物的抗自由基性质

本研究的目的是评估根据本发明的抗污染复合物的抗自由基性质。

从由包皮环切术收集的人包皮细胞获得角质形成细胞培养物，并在补充有胰岛素、EGF和垂体提取物的KGM2培养基(Clonetics)中进行扩增，然后进行该测试。

废气由发动机产生。使细胞与气体接触2小时。然后与待测试的产品或不与待测试的产品一起将细胞再孵育24小时。

在如实施例1所制备的抗污染复合物与不同浓度(0.5重量％、1重量％和2重量％)的细胞接触24小时后，一式三份进行测试。

该测试基于丙二醛的滴定。自由基在生物体内产生脂质过氧化过程。丙二醛(MDA)是细胞中多不饱和脂肪酸过氧化的最终产物之一。自由基的增加会导致MDA的过度产生。

丙二醛的提取(MDA)

在复合物与细胞接触24小时后，将后者在含有下列成分的培养基中重悬成悬浮液：

-250μL的Tris缓冲液，50mM，pH8，含有NaCl 0.1M和EDTA20mM，

-25μL的7％的十二烷基硫酸钠(SDS)，

-300μL的HCl 0.1N

-38μL的溶于水的1％磷钨酸，

-300μL的溶于水的0.67％硫代巴比妥酸(TBA)。

在50℃的黑暗中孵育1小时并在冰冷水中冷却后，向每个管中加入300mL的正丁醇。在0℃以10,000g离心10分钟。回收上层相用于滴定MDA。

MDA的滴定

通过HPLC分离MDA-TBA复合物之后，通过测量荧光来滴定MDA：

-Bischoff泵型号2.200

-自动Alcoot进样器型号788自动进样器

-Ultrasep C18色谱柱(30cm x 0.18cm)孔隙率为6mm

-荧光检测器，Jasco 821-F1。

在515nm激发和553nm发射下进行荧光检测。使用的洗脱液由甲醇:水，40:60(v/v)组成，使用KOH 1M将pH调节至6.3±0.5。使用与样品进行相同处理的标准品(0.125、0.25、0.5和1mM)，利用ICS软件应用程序(Pic 3)(装置，Consommable Service)进行定量。

蛋白质滴定

用分光光度计通过Bradford法进行蛋白质的滴定。595nm处吸光度的增加与蛋白质浓度成比例。

结果在下表6中给出：

表6

*：与阴性对照相比显著不同，p<0.05

**：与阳性对照相比显著不同，p<0.05

这些结果表明，根据本发明的抗污染复合物(即含有金盏花花的水提取物、金盏花花的油性提取物和白花百合球茎的水提物的组合)在3个测试浓度下都具有显著的对抗自由基的保护效果。

实施例5：保湿乳液

通过本领域普通技术人员熟知的常规技术制备具有以下组成的保湿乳液：

该乳液具有抗污染性能，可以在皮肤上每天施用一次或两次。

实施例6：抗污染面霜

通过本领域普通技术人员公知的常规技术制备具有以下组成的面霜：

-由Gattefossé以商品名Carbopol ETD 2001

销售的卡波姆0.100g

这种面霜具有抗污染性能，可以在皮肤上每天施用一次或两次。

Claims

1.一种抗污染复合物，包含：

-15至25重量％的金盏花花的水提取物，

-15至25重量％的金盏花花的油性提取物，所述金盏花花的油性提取物可以通过以下方法制备：在醇中浸渍干花，将醇浸渍物过滤，在醇完全蒸发之前将油相加入到滤液中，

-15至25重量％的白花百合球茎的水提取物，

-2至5重量％的增稠剂，和

-足够量的水以实现总重量达100重量％。

2.根据权利要求1所述的抗污染复合物，其中所述抗污染复合物包含：

-20重量％的金盏花花的水提取物，

-20重量％的金盏花花的油性提取物，

-20重量％的白花百合球茎水提取物，

-2至5重量％的聚丙烯酸钠或其他聚丙烯酸酯，

-足够量的水以实现总重量达100重量％。

3.一种局部用化妆品组合物，其包含如权利要求1或2所述的抗污染复合物。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述抗污染复合物的量在0.5至5重量％的范围内。

5.根据权利要求3或4所述的组合物，其中所述抗污染复合物的量在1.5至3重量％的范围内。

6.根据权利要求3所述的组合物，其中所述抗污染复合物的量等于2重量％。

7.根据权利要求3所述的组合物，其中所述组合物包含选自植物提取物、视黄醇或其他维生素、透明质酸、己基间苯二酚、α羟基酸、白藜芦醇、神经酰胺、脂肪酸和磷脂中的一种或多种其他成分。

8.根据权利要求3所述的组合物，其中所述组合物为凝胶、水包油或油包水双相乳液或其他乳液、面膜、化妆水、浓缩液、精华露、纳米胶囊、脂质体、唇膏的形式。

9.根据权利要求3所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种配方剂或添加剂。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述配方剂或添加剂选自渗透剂、增稠剂、表面活性剂、缓和剂、聚二甲基硅氧烷、环甲硅油或其他油类、乳化剂、防腐剂、UV-A和UV-B过滤剂、颜料、染料、成膜剂、矿物质和香料。

11.一种如权利要求3至10中任一项所述的局部用化妆品组合物的非治疗用途，其用于对抗和防止污染对皮肤的有害影响。