KR102054263B1 - 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 대한 피부보호용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rb1 또는 이의 화장품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물로 이용할 수 있다.

Description

진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 대한 피부보호용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising ginsenoside Rb1 for protecting skin against particulate matter}

본 발명은 진세노사이트 Rb1을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물, 의약외품 조성물 및 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 우리 몸의 중요한 기관들을 보호하는 보호막 역할을 할 뿐만 아니라 수분 증발을 조절하고 외부 감염으로부터 몸을 보호하는 역할을 한다. 하지만, 아무리 외부로부터의 바이러스 침투를 막아내는 피부일지라도 과도한 자외선, 오염된 환경 등 외부로부터 받는 스트레스는 피부 자극을 유발하게 되고, 결국에는 피부 노화로 이어지게 된다.

최근 중국의 산업화로 인해 발생하고 있는 중금속 등의 유해물질이 섞인 미세먼지, 황사, 스모그는 피부 노화 및 피부 트러블의 주요 원인으로 인식되고 있다.

미세먼지는 우리 눈에 보이지 않는 아주 작은 물질로 대기 중에 오랫동안 떠다니거나 흩날려 내려오는 직경 10㎛ 이하의 입자상 물질을 말한다. 석탄, 석유 등의 화석연료가 연소될 때 또는 제조업ㆍ자동차 매연 등의 배출가스에서 나오며, 기관지를 거쳐 폐에 흡착되어 각종 폐질환을 유발하는 대기오염물질이다. 환경부에 따르면 2017년 3월 우리나라와 국제적으로 사용하는 미세먼지에 대한 용어가 달라 혼란스럽다는 지적에 따라 지름이 10㎛ 이하인 미세먼지(PM₁₀)는 부유먼지, 지름이 2.5㎛ 이하인 초미세먼지(PM_2.5)는 미세먼지로 정의한다.

미세먼지, 황사 등과 같은 오염 물질들은 피부 내 스트레스를 야기하는데, 이러한 스트레스는 활성산소에 의해 생성된다. 활성산소는 미토콘드리아 내 전자전달체 및 백혈구 세포의 활성화 등 정상적인 세포기능을 유지하는데 중요한 역할을 담당하는 세포 내 신호전달 물질로 작용한다. 그러나 활성산소들은 불안정하고 산화력이 높아 생체물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스(oxidative stress)를 유발하게 된다.

이에 본 발명에서는, 미세먼지에 대한 피부 보호 효과를 가지는 화장료 조성물을 개발하고자 하였다.

대한민국 공개특허 10-2008-0085404호

본 발명의 목적은 진세노사이드 Rb1 또는 이의 화장품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 진세노사이드 Rb1 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 진세노사이드 Rb1을 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 진세노사이드 Rb1 또는 이의 화장품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 유효성분으로, 진세노사이드 Rb1 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.

상기 진세노사이드 Rb1을 포함하는 화장료 조성물은 미세먼지에 대한 피부 보호 효과를 가진다.

본 발명에서 "진세노사이드 Rb1"의 화학식은 다음과 같다.

본 발명의 일실시예에서, 진세노사이드 Rb1은 인간 각질형성세포 세포주(human keratinocyte cell line, HaCaT)를 이용한 실험에서 세포 독성이 확인하였고, 진세노사이드 Rb1가 인간 각질형성세포 세포주에서 미세먼지(PM, particulate matter) 처리에 의해 유발된 산화적 스트레스와 ER 스트레스, 미토콘드리아 손상 및 세포사멸을 억제 하는 것을 확인하였는바, 미세먼지에 대한 피부 보호 효과가 있는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 진세노사이드 Rb1은 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물의 유효성분으로 이용이 가능하다.

따라서, 본 발명에서, 상기 진세노사이드 Rb1은 미세먼지로 인해 발생된 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 소거(scavenging) 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타낼 수 있는 바, 미세먼지에 대한 피부보호 효과와 더불어, 항산화 효과도 가진다.

또한, 본 발명에서, 상기 진세노사이드 Rb1은 미세먼지에 노출된 세포의 미토콘드리아 손상을 억제하는 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 진세노사이드 Rb1은 미세먼지에 노출된 세포의 세포사멸(apoptosis)을 저해(inhibition)하는 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 유효성분으로서 상기 진세노사이드 Rb1 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 염으로는 화장품학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동일한 몰량의 화합물 및 산 수용액 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 화장품학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물은 전체 조성물 중량에 대하여 0.001 내지 100 중량％의 진세노사이드 Rb1 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 0.01 내지 50 중량％의 진세노사이드 Rb1 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 진세노사이드 Rb1 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 의약외품 조성물을 제공한다.

상기 진세노사이드 Rb1, 미세먼지에 대한 피부 보호에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어 "생리학적으로 허용 가능"은 생리학적으로 허용되고 생물체에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않으면서, 투여되는 화합물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있는 통상적으로 사용되는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다.

본 발명의 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 소독 청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드 워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제 등일 수 있다.

본 발명의 조성물을 활성산소종 또는 미세먼지에 대한 피부 보호 목적으로 의약외품에 포함시킬 경우, 상기 조성물을 그대로 포함하여 사용하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있으며, 본 발명에 의한 의약외품 조성물은 상기 진세노사이드 Rb1 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 함유할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 진세노사이드 Rb1 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 피부외용제 조성물을 제공한다.

상기 진세노사이드 Rb1, 미세먼지에 대한 피부 보호, 생리학적으로 허용 가능한 염에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에 의한 피부외용제 조성물은, 예를 들어, 연고, 로션, 가용화상, 현탁액, 에멀젼, 크림, 젤, 스프레이, 파프제, 경고제, 패치제 또는 물파스 등을 들 수 있지만, 이들에만 한정되지 않고, 당업계에 주지된 어떠한 기제에도 배합될 수 있다. 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 상기 진세노사이드 Rb1 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명은 진세노사이드 Rb1 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물로 이용할 수 있다.

도 1은 진세노사이드 Rb1의 농도에 따른 세포독성을 확인한 결과이다.
도 2는 진세노사이드 Rb1의 수퍼옥사이드 음이온 소거 효과를 ER 분광법으로 측정한 결과이다(XO는 xanthine oxidase를 의미하며, control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리를 의미함).
도 3은 진세노사이드 Rb1의 히드록실 라디칼의 소거 효과를 ER 분광법으로 측정한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리를 의미함).
도 4는 진세노사이드 Rb1의 PM_2.5 유도되는 ROS 감소효과를 측정한 결과이다 (control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 5는 진세노사이드 Rb1의 PM_2.5 유도되는 DNA 손상에 대한 보호 효과를 측정한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 6은 진세노사이드 Rb1의 PM_2.5 유도되는 지질과산화 억제효과를 측정한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 7은 진세노사이드 Rb1의 PM_2.5에 의해 유도되는 카보닐 형성에 억제효과를 측정한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 8은 진세노사이드 Rb1의 PM_2.5 유도되는 ER 스트레스에 대한 억제효과를 ER 염색법을 통해 분석한 이미지이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 9는 진세노사이드 Rb1의 PM_2.5 유도되는 ER 스트레스 저해 효과를 Ca²⁺ 레벨로 분석한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 10은 진세노사이드 Rb1의 PM_2.5 유도되는 ER 스트레스 저해 효과를 측정하고자 CHOP, GRP78의 단백질 발현을 측정한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 11은 진세노사이드 Rb1의 PM 유도성 스트레스 관련 단백질의 발현 억제 효과를 측정한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 12는 진세노사이드 Rb1의 PM_2.5 유도되는 미토콘드리아 손상저해 효과를 ROS 측정을 통해 확인한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 13은 진세노사이드 Rb1의 미토콘드리아 손상저해 효과를 Ca²⁺ 레벨측정을 통해 확인한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 14는 양이온 친유성 형광염료 JC-1으로 염색한 세포의 유동 세포 분석 데이터이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리를 의미함).
도 15는 양이온 친유성 형광염료 JC-1으로 염색한 세포의 공초점 현미경 사진이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 16은 진세노사이드 Rb1의 세포 사멸체 형성 억제효과를 측정한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 17은 Bax, Bcl-2, Mcl-1의 단백질 발현을 측정한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 18은 PM 유도성 세포 사멸에서 카스파제의 발현을 확인한 것이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, PM_2.5는 PM_2.5처리, GR+PM_2.5는 진세노사이드 Rb1 및 PM_2.5 처리를 의미함).
도 19는 PERK, IRE1 및 ATF6의 si RNA 간섭으로 PERK, IRE1 및 ATF6 단백질의 발현이 억제됨을 확인한 결과이다.
도 20은 PERK, IRE1 및 ATF6 유전자를 하향 조절한 세포에서 PM_2.5 유도 ER 스트레스에 대한 억제효과를 ER 염색으로 분석한 이미지이다.
도 21은 ER 스트레스-유도제인 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT)에 대한 진세노사이드 Rb1의 ER 스트레스 저해 효과를 ER 염색법을 통해 측정한 결과이다. (control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, DTT는 디티오트레이톨 처리, GR+DTT은 진세노사이드 Rb1 및 디티오트레이톨 처리를 의미함).
도 22는 ER-스트레스 관련 유전자의 siRNA를 주입하여 발현을 억제한 세포에서 PM_2.5에 의해 유도되는 세포 사멸 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 23은 진세노사이드 Rb1의 ER 스트레스-유도제인 DTT에 의해 유도되는 세포사멸 억제효과를 측정한 결과이다(control은 시료 비처리, GR은 진세노사이드 Rb1 처리, DTT는 디티오트레이톨 처리, GR+DTT은 진세노사이드 Rb1 및 디티오트레이톨 처리를 의미함).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<재료와 방법>

세포 배양

인간 HaCaT 각질 형성 세포는 5% 이산화탄소(CO₂) 조건의 배양기에서 37℃로 유지하였다. 10% 열-비활성화된 소태아혈청과 항생제-항균제(100units/mL의 페니실린, 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신 및 0.25 ㎍/mL의 암포테리신 B)를 함유한 DMEM 배지(Dulbecco Modified Eagle Medium)에서 세포를 배양하였다.

세포 생존력 분석

진세노사이드 Rb1의 세포 독성을 평가하기 위해서, 세포를 0.8×10⁵ cells /ml의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하고, 세포를 10, 20, 30, 40 및 50μM의 진세노사이드 Rb1으로 처리하고, 24시간 배양하였다. 각 웰에 MTT 용액을 첨가하고, DMSO에 포르마잔 결정을 용해한　후, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 생존력을 평가하였다. MTT 실험은 3회 반복하였다.

슈퍼옥사이드 음이온 검출

잔틴/잔틴 산화 효소(xanthine/xanthine oxidase) 시스템에 의해 생성된 슈퍼 옥사이드 음이온을 니트론 스핀 트랩인 DMPO와 반응시켰다. 전자 스핀 공명(ESR) 분광계를 사용하여 DMPO/OOH 부가물을 검출하였다. 간단히 말하면, 잔틴 산화효소 (20 μL, 0.25 U/mL)를 잔틴(5 mM), DMPO (1.5 M) 및 진세노사이드 Rb1 (40 μM) 각각 20 μL와 혼합하고 5분이 경과한 후에 ESR 신호를 기록하였다. ESR 분광계 변수는 아래 표와 같이 설정하였다

변수	조건
자기장	336 mT
전력	1.00 mW
주파수	9.4380 GHz
변조 진폭	0.2 mT
증가（ｇａｉｎ）	500
스캔시간	0.5 분
스캔 폭	10 mT
시정수	0.03초
온도	25°C

히드록시 라디칼 (hydroxyl radical)의 검출

펜톤 (Fenton) 반응 (H₂O₂ + 황산 제1철)에 의해 생성된 히드록시 라디칼을 DMPO와 반응시켰다. ESR 분광계를 사용하여 생성된 DMPO/OH 부가물을 검출하였다. 인산염 완충액(pH 7.4)을 0.3M DMPO, 10mM 황산 제1철, 10mM H₂O₂ 및 진세노사이드 Rb1(40μM) 각각 0.2 mL와 혼합하고 2.5분이 경과한 후에 ESR 스펙트럼을 기록하였다. ESR 분광계 변수는 다음　표와 같이 설정하였다．

변수	조건
자기장	336 mT
전력	1.00 mW
주파수	9.4380 GHz
변조 진폭	0.2 mT
증가（ｇａｉｎ）	２００
스캔시간	0.5 분
스캔 폭	10 mT
시정수	0.03초
온도	25°C

활성산소(Reactive oxygen species, ROS) 측정

세포를 2.5 x 10⁵ cells/mL의 밀도로 4-웰 챔버 슬라이드에 접종하였다. 도말 후 16시간이 경과하면 세포를 40μM 진세노사이드 Rb1으로 처리하고, 30분 후 PM_2.5로 처리하였다. 37℃ 배양기에서 30분간 배양한 후, 세포를 세포내 ROS, 또는 미토콘드리아 ROS 프로브인　2',7'-디클로로디하이드로플루오레신 디아세테이트(H2DCFDA; 분자 프로브, Eugene, OR, USA), 또는 디하이드로다민 123(DHR 123, 분자 프로브)을 이용하여 10분간 염색하고, 염색된 세포의 사진을 공초점 현미경으로 관찰하였다.

단세포 겔 전기 영동 (코멧 분석, Comet assay)

세포가 도포되어 있는 슬라이드를 4℃에서 1시간 동안 세포 용해액 (2.5M NaCl, 100mM Na-EDTA, 10mM Tris, 1% Trion X-100 및 10% DMSO, pH 10)에 침지하고, 전기 영동을 수행하고, 에티디움 브로마이드로 염색하고, 이미지 분석 소프트웨어 (Kinetic Imaging, Komet 5.5, UK)가 장착된 형광 현미경으로 관찰하였다. 각 슬라이드마다 50개의 세포에서 코멧 꼬리의 전체 형광 백분율과 꼬리 길이를 기록하였다.

지질 과산화 분석

HaCaT 세포는 형광 프로브 디페닐-1-피레닐포스핀(DPPP, 분자 프로브) 5 μM로 염색하고, FV10-ASW 뷰어 4.2 소프트웨어가 장착된 Olympus FV1200 레이저 주사 현미경을 사용하여 분석하였다.

단백질 카르보닐화

단백질 분해 완충액을 사용하여 전체 세포 단백질을 분리하여, 분광 광도계로 정량하고, OxiSelect™ 단백질 카르보닐 ELISA 키트를 사용하여 단백질 카르보닐화를 측정하였다.

소포체(Endoplasmic Reticulum, ER) 염색

세포는 30분간 ER-TrackerTM Blue-White DPX 염료와 반응시키고，공초점 현미경으로 사진을 촬영하였다.

Ca ²⁺ 수준의 정량화

세포에 10μM 플루오-4-아세톡시메틸 에스테르(Fluo-4-AM) 또는 로드-2 아세톡시메틸 에스테르(Rhod-2 AM)를 30분간 가하여, 세포내 및 미토콘드리아의 Ca²⁺를 각각 검출하고, 공초점 현미경으로 형광을 측정하였다.

웨스턴 블롯팅

세포 용해물을 SDS-PAGE로　전기영동하여　분리된 단백질을 막으로 옮긴　후， CHOP, 포스포-PERK, 포스포-IRE1, 포스포-eIF2, PARP, 카스파아제-3, 카스파아제-9 및 Mcl-1, GRP78, XBP-1, 포스포-eIF2α, ATF6, Bcl-2 및 Bax에 대한 1차 항체로 반응시킨 후, 2차 항체로 반응시켰다. 액틴에 대한 항체는 시그마알드리치(Sigma-Aldrich)사에서 구매하였다. Amersham Enhanced Chemiluminescence Plus Western Blotting Detection 시스템을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다.

미토콘드리아 막전위(Δψ) 측정

미토콘드리아 막전위(Δψ)는 친유성 양이온 형광 염료인 5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤지미다졸일카르보시아닌 아이오다이드(JC-1)로 염색한 후 유세포 분석법과 공초점 현미경으로 분석하였다.

Hoechst 33342로 핵 염색

세포를 DNA 특이적 형광 염료 Hoechst 33342로 10분간 염색하고 CoolSNAP-Pro 컬러 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경으로 시각화하여 핵 응축도와 핵 분열도를 평가하고 사멸 세포의 수를 정량 하였다.

짧은 간섭 RNA (Small RNA interference, siRNA)의 일시적 형질 주입

세포를 24-웰 플레이트에 1.5 × 10⁵ cells/well의 밀도로 접종하여 형질 주입 당일에 세포 밀집도는 약 50%에 이르게 되었다. 사용된 siRNA 구조체는 미스매치된 siRNA 대조군, PERK, IRE1, ATF6 및 CHOP의 siRNA였다. 세포를 lipofectamineTM 2000을 사용하여 10-50nM siRNA로 형질 주입시켰다. 형질 주입 24시간 후, 세포를 PM_2.5로 24시간 처리하고, ER 염색인 Hoechst 33342 염색에 의해 조사하였다.

통계 분석

데이터는 평균 ± 표준오차 (SE)로 나타내었다. 결과는 분산 분석 (ANOVA)과 Tukey’s 사후 검정을 수행하여 그룹 간 차이를 조사하였다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

<결과>

진세노사이드 Rb1의 PM _2.5 유도성 산화 스트레스 저해

진세노사이드 Rb1가 PM_2.5 유도 산화 스트레스에 미치는 영향을 조사하기 위해서 진세노사이드 Rb1의 농도에 따른 독성 시험을 실시하여 진세노사이드 Rb1의 최적 농도를 결정하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rb1은 40 μM 미만의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 따라서, 진세노사이드 Rb1 40 μM을 사용하였다.

우선, 세포가 없는 시스템（cell free system）에서 ESR 분광법으로 진세노사이드 Rb1의 슈퍼옥사이드 음이온 및 히드록시 라디칼 소거 효과를 확인하였다. 잔틴/잔틴 산화 효소 시스템에서 수퍼옥사이드 음이온 신호의 신호 값은 2,224지만, 진세노사이드 Rb1을 처리하면 신호 값은 1,278로 감소하였다(도 2). 진세노사이드 Rb1은 펜톤(Fenton) 반응에 의해 생성된 히드록실 라디칼 신호를 2,590에서 1,871로 감소시켰다(도 3).

H₂DCFDA 형광 염료를 사용하여 PM_2.5에 의해 유도된 세포내 ROS에 대한 진세노사이드 Rb1의 효과를 확인하였다. 공초점 현미경 분석 데이터는 진세노사이드 Rb1로 전처리하면 PM_2.5에 유도된 ROS가 유의하게 감소하는 것을 보여주었다 (도 4).

그 후, PM_2.5에 의해 손상된 세포에 대한 진세노사이드 Rb1의 전처리 효과를 평가하였다. DNA 분해를 평가하기 위한 코멧 분석(comet assay)을 수행하였으며 PM_2.5처리하였을 꼬리 DNA가 30% 증가를 하였지만, 진세노사이드 Rb1를 전처리하면 16% 감소를 초래하는 것을 확인하였다(도 ５).

또한, 지질 과산화 지표인 DPPP 산화물의 형광 강도는 PM_2.5-배양 세포에서는 증가되었으나, 진세노사이드 Rb1 전처리에 의해 유의하게 감소되었다(도 ６). 마찬가지로, 산화 스트레스에 의해 단백질 손상이 유도되면 PM_2.5 처리된 세포에서 바이오마커 단백질의 카르보닐화도는 증가하지만, 진세노사이드 Rb1은 PM_2.5에 의해 유도되는 카르보닐 형성을 방지하였다(도 7).

종합하면, 이러한 결과를 통해 진세노사이드 Rb1이 PM_2.5 유발성 ROS에 의해 유도된 산화성 스트레스를 억제함으로써 세포 내 성분이 손상되지 않도록 보호함을 확인하였다.

진세노사이드 Rb1의 PM _2.5 에 의해 유도되는 ER 스트레스 저해 효과

PM_2.5에 의해 유도된 산화적 손상이 ER 스트레스를 유발하므로, PM_2.5에 의해 유발된 ER 스트레스에 미치는 진세노사이드 Rb1의 효과를 조사하였다. 공초점 현미경 분석 결과, PM_2.5 처리된 세포가 ER-Tracker DPX 염료에 의해 밝은 청색으로 염색되지만, 진세노사이드 Rb1로 전처리된 세포의 밝은 청색 형광은 약하며 PM_2.5에 의한 스트레스는 진세노사이드 Rb1에 의해 유의하게 저해되는 것을 확인하였다(도　8).

ER은 세포 내 주요한 Ca²⁺ 저장소이며, Ca²⁺ 항상성이 파괴되면 ER 스트레스가 활성화된다. 공초점 현미경 분석 결과, Ca²⁺ 형광 강도는 대조군에 비해 PM_2.5로 처리된 세포에서 더 높지만 진세노사이드 Rb1 전처리에 의해 유의하게 약화되었음을 확인하였다(도 9).

ER 스트레스는 세 가지 ER 센서인, 이중가닥 RNA 활성화 단백질 키나아제 유사 ER 키아나제(double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase, PERK), 활성화 전사 인자 6(activating transcription factor 6, ATF6) 및 인노시톨 필수 효소-1(inositol requiring enzyme-1, IRE1)에 의해 매개된다. GRP78은 정상적인 ER 기능을 유지하고 위험한 자극으로부터 ER을 보호하는 중요한 요소이다. 전사 인자인 CCAAT 인핸서 결합 단백질 상동성 단백질(CCAAT enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)은 ER 스트레스 유발성 세포 사멸을 촉진하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 따라서 PM_2.5에 의해 유도된 ER 스트레스에 미치는 진세노사이드 Rb1의 효과를 확인하기 위해서, GRP78과 CHOP의 발현을 확인하였다.

웨스턴 블롯에 의해 검출된 바와 같이, PM_2.5 처리 후에 GRP78 및 CHOP는 증가하였지만, 진세노사이드 Rb1로 전처리한 후 유의한 억제가 관찰되었다(도 10). 마찬가지로, 포스포-PERK, 포스포-eIF2, 포스포-IRE1, XBP-1 및 ATF6을 포함하는 PM_2.5 유도성 스트레스 관련 단백질의 발현은 진세노사이드 Rb1 전처리에 의해 저해되었다(도 11).

진세노사이드 Rb1의 PM _2.5 에 의해 유도되는 미토콘드리아 손상 저해 효과

공초점 현미경 분석을 통해 PM_2.5을 처리하면 미토콘드리아 ROS 생성과 미토콘드리아에서 Ca²⁺ 과부하가 증가되지만, 진세노사이드 Rb1을 전처리하는 경우 Ca²⁺ 과부하가 억제되는 것을 확인하였다 (도 12 및 13). 미토콘드리아 막 투과성은 시토크롬 c 방출과 카스파제 활성화를 통한 세포 사멸과 관련된다. 미토콘드리아 의존성 세포 사멸을 나타내는 미토콘드리아 막전위(ΔΨm)의 변화를 확인하기 위해 양이온 친유성 형광 염료 JC-1을 사용하였다. 유동 세포 분석 데이터는 PM_2.5 처리된 세포는 JC-1 형광 방출에서 적색/녹색 형광 비율의 감소를 초래하여, ΔΨm 탈분극을 나타내는 반면에, 진세노사이드 Rb1을 전처리하면 녹색형광이 감소되는 것을 확인하여 미토콘드리아 손상이 저해되는 것을 확인하였다(도 14). 공초점 현미경 사진도 일관된 결과를 보여 주었다(도 15).

진세노사이드 Rb1의 PM _2.5 에 의한 세포 사멸 저해 효과

PM_2.5가 세포 사멸을 유도하므로 Hoechst 33342 염색에 의해 세포 사멸체의 형성을 확인하였고, 진세노사이드 Rb1을 전처리한 후 PM_2.5에 의해 유도되는 세포 사멸체가 억제되는 것을 확인하였다(도 16).

Bcl-2계 단백질은 미토콘드리아 투과성을 조절하여 세포 사멸을 조절한다. 따라서, PM_2.5가 세포사멸 유도(pro- apoptotic)하는 Bcl-2계 단백질인 Bax의 발현에 영향을 주는지를 확인하였다. 정상 인간 각질 형성 세포에서 PM_2.5에 의해 유도된 세포 사멸은 주로 Bcl-2/Mcl-1의 발현을 저해시킨다. 이렇게 보고된 바와 같이, PM_2.5에 세포가 노출되면 Bcl-2와 Mcl-1의 발현이 크게 감소하였다(도 17). 그러나 진세노사이드 Rb1를 전처리하면 이러한 감소가 방지되었다. 또한 PM_2.5을 처리하면 세포사멸 유도 단백질인 Bax의 발현이 증가하였고, 진세노사이드 Rb1 처리할 경우, 세포에서 PM_2.5에 의해 유도된 Bax 발현이 감소함을 확인하였다(도 17). 따라서, 진세노사이드 Rb1은 PM_2.5 공격으로부터 항-세포사멸 인자(anti-apoptotic effector) 및 세포사멸유도 인자(pro-apoptotic effector)의 발현을 조절하여 세포를 보호함을 확인하였다.

PM 유도성 세포 사멸에서의 카스파제의 잠재적인 관련성을 판단하기 위해서 카스파제 경로에 있어서 주요 조절 단백질의 발현이나 활성화를 변화시킬 수 있는 진세노사이드 Rb1의 성능을 확인하였다. 카스파제-9는 미토콘드리아 막이 파괴되면 활성화된다. 따라서, 활성(절단된) 형태의 카스파제-9 및 이의 표적 카스파제-3을 웨스턴 블럿 분석으로 평가하였다. 진세노사이드 Rb1은 활성 카스파제-9(35 및 37 kDa) 및 활성 카스파제-3(17 및 19 kDa)의 PM 유도성 발현을 억제하였다. 이러한 관찰은 활성 카스파제 기질인 폴리-ADP 리보오스 폴리머라제 (PARP) (89 kDa)의 절단에 의해 확인되었다(도 18).

ER 스트레스를 억제를 통한 PM _2.5 유도성 세포 손상을 저해 확인

siRNA를 이용하여 ER 스트레스의 주요 인자를 하향 조절하여 진세노사이드 Rb1과 PM_2.5가 HaCaT 세포의 ER 스트레스에 미치는 영향을 확인하였다. PERK, IRE1 및 ATF6은 ER 스트레스의 핵심 인자이므로, PERK, IRE1 및 ATF6 발현의 하향 조절이 PM_2.5 유발성 ER 스트레스에 미치는 영향을 확인하였다.

우선, 웨스턴 블럿에 의해 PERK, IRE1 및 ATF6의 siRNA가 주입된 세포에서 PERK, IRE1 및 ATF6 유전자 하향 조절이 이루어짐을 확인하였다(도 19). 그리고, ER-Tracker Blue-White DPX 염색의 공초점 현미경 사진을 통해 PERK, IRE1 및 ATF6 발현을 하향 조절한 세포에서 PM_2.5에 의해 유도된 밝은 청색 형광 강도가 현저하게 감소되는 것을 확인하였다(도 20).

또한, ER 스트레스-유도제인 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT)에 의해 유도되는 밝은 청색 형광 강도가 진세노사이드 Rb1 처리시 현저하게 감소되는 것을 확인하였다(도 21).

Hoechst33342 염료를 이용하여 ER-스트레스 관련 유전자 하향 조절 특징이 있는 형질 주입된 세포에서 PM_2.5에 의해 유도되는 세포 사멸 억제 효과를 다시 확인하였다(도 22). 또한, 진세노사이드 Rb1은 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT)에 의해 유도되는 세포 사멸을 유의하게 저해하였다(도 23).

이러한 결과를 통해 진세노사이드 Rb1이 ER 스트레스를 감소시켜 세포 손상을 억제하는 것을 확인하였다.

Claims (6)

1. 진세노사이드 Rb1 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rb1은 미세먼지로 인해 발생된 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 소거(scavenging) 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타내는 것인, 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rb1은 미세먼지에 노출된 세포의 세포사멸(apoptosis)을 저해하는 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타내는 것인, 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형인 것인, 화장료 조성물.
5. 진세노사이드 Rb1 또는 이의 생리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부 보호용 의약외품 조성물.
6. 삭제

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